close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АУТОИММУННЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ «БЕДНОМ» ОВАРИАЛЬНОМ ОТВЕТЕ НА СТИМУЛЯЦИЮ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ВАНЯН
Роза Эдуардовна
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
АУТОИММУННЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
ПРИ «БЕДНОМ» ОВАРИАЛЬНОМ ОТВЕТЕ НА СТИМУЛЯЦИЮ
СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММАХ
ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
14.01.01 – акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
МОСКВА - 2015
2
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении
«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.
Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители:
доктор медицинских наук
Долгушина Наталия Витальевна
кандидат медицинских наук
Менжинская Ирина Владимировна
Официальные оппоненты:
Назаренко Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ МО
"Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и
гинекологии", отделение репродуктологии, главный научный сотрудник
Серебренникова Клара Георгиевна – доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ
ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени
И.М. Сеченова» Минздрава России, кафедра семейной медицины, профессор
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский
медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России
Защита состоится «20» октября 2015 года в 13 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.125.01 на базе федерального государственного
бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и
перинатологии имени академика В.И. Кулакова» по адресу: 117997, г. Москва, ул.
Академика Опарина, д.4
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального
государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства,
гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
http://sciense.ncagp.ru/upfiles/pdf/Avtoref_VanyanRE.pdf
Автореферат разослан « »
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук
2015 г.
Калинина Елена Анатольевна
3
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
«Бедный» овариальный ответ (БОО) - это созревание менее 3-х
фолликулов
при
стимуляции
суперовуляции
большими
дозами
гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки) (ESHRE, 2011). В программах
экстракорпорального
оплодотворения (ЭКО)
распространенность
БОО
составляет 9-24% (Badawy А., 2011). У пациенток с «бедным» ответом
получают мало ооцитов, мало эмбрионов, что снижает шансы наступления
беременности
и
эффективность
программ
ВРТ
(Назаренко
Т.А.,
Краснопольская К.В., 2012).
Этиология развития БОО на стимуляцию суперовуляции неизвестна.
Доказанными факторами риска являются состояния, приводящие к снижению
фолликулярного пула: возраст женщины более 40 лет, операции на яичниках
в анамнезе, ожирение, химио- и рентгенотерапия и т.д. (Kamble L., 2011).
Однако «бедный» овариальный ответ часто наблюдается у пациенток без
наличия этих факторов риска с нормальным овариальным резервом.
Предполагаемыми патогенетическими факторами развития БОО у этих
женщин могут быть некоторые численные и структурные аномалии Ххромосомы, или аутоиммунное поражение тканей яичников (Kokcu A., 2012;
Gleicher N., 2012).
Была отмечена связь неслучайной инактивации Х-хромосомы, а также
структурных изменений в области ее длинного плеча (Хq) с развитием
преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) (Lleo A., 2008; Gleicher
N., 2012). Ген FMR1, расположенный на длинном плече Х-хромосомы в
локусе Xq27.8, может содержать различное число тринуклеотидных CGGповторов. Было установлено, что число CGG-повторов, равное 26-34,
характерно для половины женского населения (Persani L., 2009; Gustin S.,
2014). Более высокое или более низкое число CGG-повторов часто связано с
развитием ПНЯ, снижением овариального резерва и коррелирует с уровнем
4
фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и антимюллерова гормона
(АМГ) (Gleicher N., 2012).
Ген BMP15, расположенный в локусе Хр11.2, ингибирует мРНК,
участвующую в формировании рецепторов ФСГ в гранулезных клетках.
Вследствие этого подавляется поздняя ФСГ-зависимая стадия развития
фолликулов и ФСГ-зависимая продукция прогестерона, в результате чего
предотвращается преждевременная лютеинизация фолликулов. Мутации в
гене BMP15, выявляемые у 4-10% больных с ПНЯ, могут приводить к
повышению
чувствительности
гранулезных
клеток
к
ФСГ
и
преждевременной лютеинизации фолликулов, а также влиять на число
кумулюсных клеток и качество ооцитов (Moore R., 2005; Gilchrist R., 2008).
Роль генов FMR1 и BMP15 в генезе ПНЯ является доказанной, однако
данные об их значении в развитии БОО и эффективности программ ЭКО
практически отсутствуют в мировой научной литературе.
Иммунологические факторы играют существенную роль в развитии БОО
наряду с генетическими причинами. До 30% случаев ПНЯ являются
следствием
аутоиммунных
нарушений
и,
в
основном,
обусловлены
повреждающим действием различных антител на ткани яичников. В группе
анти-овариальных антител (АОА) различают антитела к блестящей оболочке
ооцита, антитела к ФСГ, а также антитела к стероид-продуцирующей ткани
яичника. Данные по влиянию этих антител на развитие БОО противоречивы
(Zou S.H., 2008; Haller-Kikkatalo K., 2012).
Изучение патогенеза развития «бедного» овариального ответа на
стимуляцию суперовуляции в программах ЭКО способствует поиску
предикторов этого состояния. Возможность раннего прогноза ответа
яичников при лечении бесплодия с помощью ВРТ представляет возможность
своевременного планирования семьи и выбора оптимального метода
стимуляции суперовуляции в группах риска развития БОО.
5
Цель исследования
Повышение
эффективности
программ
вспомогательных
репродуктивных технологий у пациенток с «бедным» овариальным ответом
на стимуляцию суперовуляции на основании изучения диагностической
значимости аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого
состояния.
Задачи исследования
1.
Изучить клинико-анамнестические факторы риска развития
«бедного» овариального ответа у пациенток программ вспомогательных
репродуктивных технологий (ВРТ).
2.
Проанализировать влияние различных протоколов стимуляции
суперовуляции на развитие «бедного» овариального ответа и исходы
программ
ВРТ
эмбрионального
(параметры
развития,
фолликулогенеза,
частоту
оогенеза,
наступления
раннего
беременности
и
репродуктивных потерь в I триместре).
3.
Определить связь между наличием различных видов аутоантител,
в том числе к тканям яичника, и снижением овариального ответа в
программах ВРТ.
4.
Оценить
влияние
генетических
факторов
(числа
тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1 и полиморфизмов гена
BMP15) на овариальный ответ пациенток в программах ВРТ.
5.
Разработать
алгоритм
ведения
пациенток
с
«бедным»
овариальным ответом в клинике ВРТ на основании оценки диагностической
значимости
клинико-анамнестических,
факторов в развитии этого состояния.
аутоиммунных
и
генетических
6
Научная новизна
На основании использования современных молекулярно-генетических и
иммунологических методов были расширены представления о генезе
истощения фолликулярного аппарата и развития «бедного» овариального
ответа в программах ВРТ и получены следующие новые знания:
 Выявлены клинико-анамнестические факторы риска и определено
влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие
«бедного» овариального ответа в программах ВРТ.
 Исследована зависимость развития «бедного» овариального ответа в
программах ВРТ от уровня различных аутоантител к тканям яичника,
корреляции содержания различных аутоантител в сыворотке крови и
фолликулярной жидкости, и установлены пороговые уровни аутоантител к
тканям яичника, связанные с развитием БОО в программах ВРТ.
 Изучено влияние числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1и
полиморфизмов гена BMP15 на овариальный ответ при стимуляции
суперовуляции в программах ВРТ. Определено число CGG повторов в гене
FMR1, влияющее на нормальную функцию яичников, и число повторов в
зависимости от наличия или отсутствия аутоиммунного поражения яичников
в этой группе пациенток.
Практическая значимость
Были выявлены аутоиммунные факторы, коррелирующие с развитием
БОО, а также пороговые уровни различных аутоантител к тканям яичника,
связанные с развитием БОО и, как следствие, эффективностью программ
ВРТ. Также были выявлены молекулярно-генетические предикторы развития
БОО, такие как число CGG повторов в гене FMR1 и полиморфизмы гена
BMP15, которые могут быть использованы в качестве диагностических и
прогностических критериев на этапе подготовки к программам ВРТ у
пациенток с риском развития БОО.
7
На основании выявленных клинико-анамнестических, иммунных и
молекулярно-генетических
факторов риска
был
разработан
алгоритм
обследования пациенток, планирующих беременность путем ЭКО, для
своевременного выявления групп риска развития БОО. В результате
определения влияния различных протоколов стимуляции суперовуляции на
исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом был
разработан алгоритм ведения пациенток групп риска развития БОО с
выбором оптимальных схем стимуляции суперовуляции.
Положения, выносимые на защиту
1.
«Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от
клинико-анамнестических
факторов
риска
за
исключением
возраста
пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. При этом
сниженный овариальный резерв не является абсолютным прогностическим
фактором ответа яичников на стимуляцию суперовуляции и выявляется лишь
у 81,5% женщин с «бедным» ответом.
2.
Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого
влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным
ответом, однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона
может оказывать позитивное влияние на число полученных фолликулов и
ооцитов в данной группе пациенток.
3.
«Бедный» овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции
следует рассматривать как доклинический вариант преждевременной
недостаточности яичников, в генезе которого задействованы иммунные и
генетические механизмы. У пациенток программ ВРТ при наличии числа
CGG-повторов в гене FMR1 более 34 «бедный» ответ на стимуляцию
суперовуляции наблюдается в 6 раз чаще, а при наличии полиморфизмов
гена BMP15 – в 2,5 раз чаще. У пациенток с «бедным» ответом определяются
более высокие уровни аутоиммунных антител, в том числе антител к тканям
8
яичника, среди которых особое значение в реализации овариальной функции
имеют антитела к блестящей оболочке ооцита.
4.
При числе CGG-повторов в гене FMR1 от 26 до 34 у пациенток с
«бедным» ответом можно предположить наличие аутоиммунного поражения
тканей яичников, тогда как при нормальном уровне антиовариальных
антител «бедный» овариальный ответ может быть ассоциирован с
генетическими нарушениями (повышением числа CGG-повторов более 34,
наличием полиморфизмов гена BMP15). При наличии аутоиммунного
фактора БОО характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного пула
по сравнению с генетически обусловленным «бедным» ответом.
Личный вклад автора
Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления
исследования, разработке цели и задач исследования, обобщении, анализе,
статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал
участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом
экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ПЭ), в анализе
и научной интерпретации результатов иммунологического и молекулярногенетического исследования пациенток.
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности
Научные
положения
специальности
14.01.01
проведенного
исследования
-
диссертации
«акушерство
и
соответствуют
соответствуют
формуле
гинекология».
Результаты
области
исследования
специальности, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации и результаты работы представлены
и доложены на ХIV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2013),
9-м Международном конгрессе по аутоиммунологии (Ницца, 2014), 7-м
9
Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2014), ХV
Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014). Работа обсуждена на
межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в
лечении бесплодия (23.04.2015) и заседании апробационной комиссии ФГБУ
«НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (18.05.2015, протокол № 5).
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанный на основании полученных результатов алгоритм
проведения программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на
стимуляцию суперовуляции с учетом иммунологических и молекулярногенетических маркеров внедрен в практическую деятельность отделения
вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.
Кулакова» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 5
входят
в
перечень
рецензируемых
научных
журналов
и
изданий,
рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из
оглавления, списка принятых сокращений, введения, обзора литературы, глав
собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов,
практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 29
таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 197
литературных источника, из них 9 работ отечественных авторов, 188 зарубежных авторов.
10
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В соответствии с целью и задачами исследования на базе отделения
вспомогательных
клинической
технологий
иммунологии
и
в
лечении
лаборатории
бесплодия,
лаборатории
молекулярно-генетических
методов исследования ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава
России было проведено проспективное исследование случай-контроль,
включавшее 150 пациенток, обратившихся для проведения программы ЭКО в
связи с бесплодием в период с 2012 по 2014 гг.
Согласно критериям ESHRE (2011 г.) была сформирована группа
случаев из 65 пациенток с БОО и группа контроля из 85 пациенток с
нормальным
овариальным
ответом.
Пациентки
обеих
групп
были
стратифицированы на подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия
снижения овариального резерва. Индукция суперовуляции осуществлялась с
помощью гонадотропинов (Гн) и агонистов гонадотропин-рилизинг гормона
(а-ГнРГ) в «длинном» протоколе, или Гн и антагонистов гонадотропинрилизинг гормона (ант-ГнРг). В каждой группе производилась оценка
параметров оогенеза, эмбриогенеза, частоты наступления беременности и
живорождения.
Критериями
включения
в
исследование
были
отсутствие
противопоказаний к ВРТ, пороков развития внутренних половых органов,
воздействия радиации и химиотерапии в анамнезе у женщин; наличие
нормозооспермии у мужчин; нормальный кариотип у обоих супругов;
информированное согласие на включение в исследование. Критериями
исключения были любые состояния и осложнения, требующие отмены ПЭ в
изучаемом цикле.
Всем пациенткам, включенным в исследование, проводилось определение
различных
видов
аутоантител
в
сыворотке
крови
методом
иммуноферментного анализа (ИФА). Определялись антитела классов IgM и
11
IgG к тканям яичника [антитела к блестящей оболочке ооцита (англ. - zona
pellucida, анти-ZP), общие антиовариальные антитела (АОА), антитела к ФСГ
(анти-ФСГ), и антитела к ГнРГ (анти-ГнРГ)], а также другие виды
аутоиммунных антител [антикардиолипиновые антитела (АКЛ), антитела к
β2-гликопротеину-1
(анти-β2-ГП),
антитела
к
хорионическому
гонадотропину (анти-ХГ)]. Также у пациенток с БОО проводилось
определение
соответствующих
аутоантител
классов
IgA
и
IgG
в
фолликулярной жидкости.
Генетическое исследование включало детектирование гена ВМР15 в
трех позициях: c.202C>T (Arg68Trp, rs104894763), c.538G>A (А180T,
rs104894767) и c.328+905A>G (rs3897937) методом ПЦР с анализом кривых
плавления, а также секвенирование обоих экзонов данного гена. Оценка
числа CGG-повторов в гене FMR1 производилась методом стандартной ПЦР
с
рядом
модификаций,
повышающих
качество
амплификации
и
позволяющих оценить количество повторов как в случае коротких, так и
длинных аллелей.
Статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета
статистических программ STATISTICA 10 (США), «SAS V8» (США) и
«SPSS Statistics V17» (США).
Результаты собственных исследований и их обсуждение
При анализе клинико-анамнестических факторов риска развития БОО
было выявлено, что пациентки с БОО были старше, а менопауза у их матерей
наступала раньше по сравнению с контрольной группой женщин. Также у
пациенток с БОО было больше попыток ЭКО и абортов в анамнезе, и
большая продолжительность бесплодия. Уровень ФСГ был значимо выше, а
АМГ - ниже, чем у пациенток контрольной группы. Другие клиникоанамнестические и лабораторные параметры не отличались значимого между
группами пациенток (Таблица 1).
12
Таблица 1
Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального
ответа у участниц исследования
Факторы риска
Группа 1
n=65
34,7±3,9
48,2±2,1
23,7±4,4
7,06±3,8
9 (13,8%)
45 (69,2%)
36 (55,4%)
2,2±1,1
82
18 (21,9%)
Группа 2
n=85
31,9±3,9
49,7±2,2
23,4±4,2
5,4±3,6
5 (5,9%)
58 (68,2%)
46 (54,1%)
1,7±1,04
73
18 (24,6%)
руровень**
<0,0001
<0,0001
0,7064
0,0078
0,0966
0,8963
0,8772
0,0131
0,2114
0,8019
Возраст пациенток, лет*
Возраст менопаузы у матери, лет*
ИМТ*
Продолжительность бесплодия, лет
Эндометриоз/аденомиоз, %
Перенесенные ВЗОМТ, %
Операции на гениталиях в анамнезе, %
Число попыток ЭКО в анамнезе*
Число беременностей в анамнезе
Число родов в анамнезе,
% от числа беременностей
Число искусственных абортов на 1 пациентку*
0,4±0,8
0,2±0,5
0,0301
Число самопроизвольных выкидышей на 1 0,4±0,6
0,2±0,5
0,0387
пациентку*
Краснуха в анамнезе, %
19 (29,2%) 17 (20%)
0,1896
Паротит в анамнезе, %
4 (6,1%)
7 (8,2%)
0,6279
Аутоиммунные и ревматические заболевания, % 6 (9,2%)
7 (8,2%)
0,6842
*данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; **t-тест или χ2-тест;
ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза
У большинства пациенток с «бедным» ответом был сниженный
фолликулярный резерв, однако у 18,5% пациенток был выявлен нормальный
овариальный резерв. У пациенток с нормальным овариальным ответом в
большинстве случаев был нормальный овариальный резерв, однако у 9,4%
пациенток был выявлен сниженный фолликулярный резерв.
При проведении многофакторного анализа для оценки шансов развития
БОО значимыми факторами риска явились лишь возраст пациенток и возраст
менопаузы у их матерей. Указанные переменные были представлены в виде
бинарных данных с определением порогов отсечки, при которых созданная
модель была максимально достоверной. Скорректированное отношение
шансов (ОШкор) БОО при возрасте пациентки более 34 лет и возрасте
менопаузы у матери менее 48 лет составило 6,2 (95% ДИ=2,4; 15,7).
Остальные факторы риска явились конфаундерами в созданной модели
(площадь под кривой - AUC=75%).
13
«Длинный» протокол с а-ГнРГ был назначен 13,3% пациенток (10 из 65
пациенток с БОО, и 10 из 85 пациенток с нормальным овариальным ответом).
Число полученных фолликулов и ооцитов было выше у пациенток с БОО при
назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ, составив (2,0±0,1) и (1,9±0,3)
фолликулов и (1,9±0,3) и (1,6±0,6) ооцитов соответственно, что, однако, не
было статистически значимо (р>0,05). У пациенток группы контроля,
наоборот, при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ было получено
меньшее число фолликулов и ооцитов, составив (6,4±3,1) и (8,1±3,0)
фолликулов, и (5,8±2,6) и (6,3±2,5) ооцитов соответственно (р>0,05). Все
полученные ооциты были оплодотворены путем инсеминации или с
помощью ИКСИ. Из них было получено 450 эмбрионов: 81 эмбрион в группе
БОО (в среднем (1,2±0,8) эмбриона на 1 пару) и 369 эмбрионов в группе с
нормальным ответом яичников (в среднем (4,3±2,6) эмбриона на 1 пару)
(p<0,0001). В основном все полученные эмбрионы были хорошего качества
(А и В): 93,8% и 94,3% в группах сравнения соответственно.
На 14-15-й день после ПЭ в полость матки в 49 случаях была
диагностирована биохимическая беременность: 15 в группе БОО (23,1%) и 34
в группе сравнения (40,0%) (р=0,0285). Клинически было диагностировано 43
беременности: 12 - в группе БОО (18,5%), 31 - в группе нормального ответа
яичников (36,5%) (р=0,0156). С учетом выявленных конфаундеров (возраст,
характер менструального цикла, длительность бесплодия, уровни ФСГ и
АМГ, число полученных ооцитов и эмбрионов) ОШкор наступления
беременности составило 1,48 (95% ДИ=0,57; 3,85). Частота живорождения
была выше в контрольной группе, составив 12,3% (8 из 65) у пациенток с
БОО, и 29,4% (25 из 85) у пациенток с нормальным ответом яичников
(р=0,0122) (Рисунок 1). При этом протокол стимуляции овуляции не
оказывал значимого значения на исходы программ ВРТ в обеих группах
пациенток.
14
40%
36,5%
29,4%
23,1%
18,5%
12,3%
Биохимические
беременности
Клинические беременности
Группа 1
Живорождения
Группа2
Рисунок 1. Исходы программ ВРТ у пациенток, включенных в исследование.
Уровень общих АОА IgM, анти-ZP IgM и IgG, анти-ГнРГ IgG и анти-β2ГП-1 IgG в крови был значимо выше у женщин с БОО (p<0,05) (Рисунок 2).
0,50
0,45
0,40
ед.ОП
0,35
Среднее значение±СО
АОА IgM
АОАIgG
анти-ZP IgM
анти-ZP IgG
анти-ГнРГ IgM
анти-ГнРГ IgG
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0
1
Группы пациенток: 0 - БОО, 1 - нормальный ответ
Рисунок 2. Коробочный график, отражающий средний уровень различных
аутоантител в группах пациенток с «бедным» и нормальным овариальным
ответом.
15
Другие виды аутоантител не отличались значимо в группах пациенток.
Была выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем антител
к блестящей оболочке и числом полученных фолликулов и ооцитов (r=-0,19,
р=0,02), и уровнем антител к β2-ГП-1 IgG и числом полученных фолликулов
и ооцитов (r=-0,16, р=0,042). Самые высокие уровни аутоантител были
выявлены у женщин с БОО и нормальным овариальным резервом (n=12) по
сравнению с пациентками с БОО и сниженным овариальным резервом
(n=53), а также у женщин с нормальным ответом и нормальным овариальным
резервом (n=77)
по сравнению с пациентками с нормальным ответом и
сниженным резервом яичников (n=8). Отмечалась значимая корреляционная
зависимость между уровнем анти-ZP IgG и анти-ФСГ IgG в крови и
фолликулярной жидкости (r=0,3929 и r=0,4695 соответственно, p<0,05).
С помощью регрессионного анализа с построением ROC-кривых был
определен пороговый уровень антител к блестящей оболочке ооцита при
развитии БОО, который составил для IgM 0,140 ед. ОП, для IgG - 0,152 ед.
ОП. При построении ROC-кривой для анти-Zp IgM чувствительность модели
составила 87,7%, специфичность - 65,9%, AUC - 60,9%. ОШ БОО при
выявлении уровня анти-ZP IgM более 0,140 ед. ОП составило 3,7 (95%
ДИ=1,5;
8,8).
При
построении
ROC-кривой
для
анти-Zp
IgG
чувствительность модели составила 86,2%, специфичность - 62,4%, AUC 61,9%. При выявлении уровня анти-ZP IgG более 0,152 ед. ОП ОШ БОО
составило 3,7 (95% ДИ=1,6; 8,6).
При определении числа CGG-повторов в гене FMR1 было установлено,
что среднее число повторов в аллеле 1 в группе женщин с БОО составило
25,9±4,2 (от 16 до 36), в группе с нормальным ответом – 26,1±3,5 (от 19 до
31) (р=0,8401). Среднее число повторов в аллеле 2 в группе женщин с БОО
составило 32,1±5,1 (от 22 до 49), в группе с нормальным ответом - 29,6±2,3
(от 22 до 38) (р<0,0001) (Рисунок 3).
Фолликулярный резерв не был
статистически значимо связан с числом CGG-повторов в обеих аллелях.
16
38
CGG-повторы аллель 1
CGG-повторы аллель 2
Число CGG-повторов гена FMR1
36
34
32
30
28
26
24
22
20
Ящик: Среднее значение ± ошибка с редней; Ус ы: с тандартное отклонение
0
1
Группы пациенток: 0 - БОО, 1 - нормальный ответ
Рисунок 3. Коробочный график, отражающий среднее число CGG-повторов в
FMR1-гене у женщин с «бедным» и нормальным овариальным ответом
Gleicher N. et al. (2010) и другие исследователи (Chen L.S. et al., 2003)
определили, что число CGG-повторов в диапазоне от 26 до 34 связано с
нормальной функцией яичников. Всего в аллеле 1 число повторов менее 26
и/или более 34 было выявлено у 26 женщин из группы 1 (40%) и 29 - из
группы 2 (34,1%) (р=0,4587). В аллеле 2 число повторов менее 26 и/или более
34 было выявлено у 18 женщин из группы 1 (27,7%) и у 7 из группы 2 (8,2%)
(р=0,0015). Из них более 34 повторов было выявлено у 16 пациенток в группе
1 (24,6%) и 4 пациенток из группы 2 (4,7%) (р=0,0020). У женщин с наличием
большого числа CGG-повторов (более 34) в каком-либо из аллелей гена
FMR1 шансы развития БОО был в 6 раз выше, чем при нормальном числе
повторов (ОШ=6,1; 95% ДИ=1,8; 26,3). При наличии числа CGG-повторов
менее
26
высокого
риска
развитии
БОО
обнаружено
не
было.
Фолликулярный резерв не был статистически значимо связан с числом CGGповторов в обоих аллелях.
17
Анализ аллелей гена BMP15 показал, что почти все выявленные
полиморфизмы гена (англ. - single nucleotide polymorphism, SNP) находились
в гетерозиготном состоянии. Частота минорного аллеля колебалась от 0,007
до
0,526.
Взаиморасположение
выявленных
полиморфных
локусов
представлено на рисунке 4. Результаты генотипирования представлены в
таблице
2.
При
оценке
распространенности
аллеля
использовали
фенотипическую частоту.
Рисунок 4. Схематичное изображение геномной структуры BMP15 с
локализацией выявленных полиморфных локусов.
Таблица 2
Выявленные SNP в гене BMP15
SNP
Позиция*
Расположение Замена
Замена
аминокислоты (транскрибция)
rs41308602
rs138281369
rs104894767
rs104894763
rs3897937
50911091
50910829
50915966
50910985
50912016
50916035
50910775
Экзон1
Экзон1
Экзон2
Экзон1
Интрон 1
Экзон2
Экзон1
*Положение гена согласно NCBI Build 38.1.
Asn103Ser
Val16Met
Ala180Thr
Arg68Trp
----------------------------------------
c.308A>G
c.46 G>А
c.538 G>A
c.202С>Т
c.328+905A>G
c.607 C>T
с.-8delC
Частота
минорного
аллеля
0,020
0,020
0,013
0,007
0,526
0,020
0,040
18
При анализе известных аллелей гена BMP15 была определена
ассоциация между БОО и полиморфизмом гена в экзоне1 rs41308602 (с.308
A>G) с более частым выявлением аллеля G у пациенток с БОО по сравнению
с контрольной группой (0,046 vs. 0,0; р=0,0454).
Частота SNP rs3897937
(c.328+905A>G) в интроне гена также погранично значимо отличалась между
группами с более частым выявлением аллеля G в группе с БОО (0,615 vs.
0,458; р=0,0570). Частота других известных полиморфизмов не отличалась
значимо между группами.
При секвенировании гена в экзоне 2 была обнаружена новая вариация в
положении 656 мРНК с заменой c.607 C>T, которая выявлялась только у
пациенток с нормальным ответом яичников, что может быть связано с
защитной ролью этого SNP в развитии БОО. Также в кодирующей
последовательности гена BMP15 была выявлена не описанная ранее
однонуклеотидная делеция с.-8delC в позиции 42. Эта делеция в 3 раза чаще
выявлялась у пациенток с БОО. В мРНК такая делеция не нарушает рамки
считывания, поскольку находится в 5' - нетранслируемой области, однако
может мешать инициации трансляции белка, то есть нарушать работу гена,
что, возможно, приводит к снижению яичникового резерва и количеству
полученных ооцитов (Таблица 3).
Таблица 3
Частота выявления мутаций гена BMP15 у пациенток с «бедным» и
нормальным ответом яичников на стимуляцию
SNP
Число пациентов
rs41308602
rs138281369
rs104894767
rs104894763
rs3897937
c.607 C>T
с.-8delC
150
150
150
150
150
150
150
Частота минорного аллеля
Группа
1 Группа
2
n=65
n=85
0,046 (n=3)
0
0,015 (n=1)
0,023 (n=2)
0,015(n=1)
0,011(n=1)
0,015(n=1)
0
0,615 (n=40) 0,459 (n=39)
0
0,035 (n=3)
0,061 (n=4)
0,023 (n=2)
Аллельный
χ2
p-уровень
4,003
0,124
0,036
1,316
3,621
2,340
1,385
0,0454
0,7240
0,8481
0,2512
0,0570
0,1260
0,2391
При оценке разницы в суммарном выявлении изученных гаплотипов
гена BMP15 в группах сравнения было выявлено, что у пациенток с БОО в
19
2,7 раз чаще выявлялись изученные SNP по сравнению с группой контроля.
При анализе суммарного выявления SNP, расположенных в экзоне 1 и
областью рядом с экзоном 1 (c.308A>G; c.202С>Т; c.328+905A>G), которые
по данным литературы ассоциируются с овариальным ответом яичников на
стимуляцию овуляции, было выявлено, что у пациенток с БОО данные SNP
встречались в 2,5 раз чаще (Таблица 4).
Таблица 4
Cуммарная частота выявления вариантов гена BMP15 у пациенток с
«бедным» и нормальным ответом яичников на стимуляцию
Сочетание редких
генотипов
c.308A>G; c.46 G>А;
c.538 G>A; c.202С>Т;
c.328+905A>G; c.607
C>T
c.308A>G; c.202С>Т;
c.328+905A>G
Группа 1 n=65
Группа 2 n=85
ОШ (95% ДИ)
0,767
0,550
2,7 (1,25; 5,96)
0,676
0,458
2,47 (1,20;5,14)
Для проведения анализа наличия взимосвязи между уровнем антител к
ткани яичника и числом CGG-повторов пациентки с БОО были разделены на
2 группы: группа 1а – пациентки, у которых число CGG-повторов по обеим
аллелям было в пределах референсных значений (26-34) (n=31), и группа 1б пациентки, у которых число CGG-повторов было больше или меньше
референсных значений по хотя бы одному из аллелей (n=34). Распределение
уровня антител к ткани яичника (АОА и анти-ZP) и антител к
гонадотропинам (анти-ФСГ и анти-ГнРГ) классов IgM и IgG представлено в
таблице 5. Было выявлено, что у пациенток с БОО и нормальным числом
CGG-повторов средний уровень антител к тканям яичника (IgM к ZP) был
выше, чем у пациенток с числом GGG-повторов, выходящим за пределы
нормального диапазона (p=0,0411). Уровень АМГ отличался в группах с
нормальным и повышенным уровнем антител к ZP (IgM или IgG). У
пациенток с уровнем анти-ZP более 75-ой перцентили содержание АМГ было
выше и составило [0,77 (0,40-1,50)] нг/мл по сравнению с [0,44(0,30-0,69)]
нг/мл у женщин с уровнем анти-ZP менее 75-ой перцентили (р=0,0013).
20
Отмечалась прямая корреляционная связь между уровнем АМГ и уровнем
анти-ZP IgM (r=0,28, p=0,0218).
Таблица 5
Уровни аутоантител (ед. ОП) в зависимости от числа
CGG-повторов FMR1-гена у пациенток с «бедным» овариальным ответом
Антитела
Группа 1а n=31
Группа 1б n=34
ZP-IgM
ZP-IgG
AOA-IgM
AOA-IgG
Анти-ФСГ IgM
Анти-ФСГ IgG
Анти-ГнРГ IgM
Анти-ГнРГ IgG
0,178 (0,156-0,193)
0,206 (0,164-0,263)
0,192 (0,146-0,226)
0,150 (0,134-0,174)
0,303 (0,230-0,370)
0,269 (0,233-0,363)
0,181 (0,146-0,256)
0,316 (0,265-0,365)
0,163 (0,147-0,176)
0,192 (0,161-0,232)
0,177 (0,148-0,199)
0,142 (0,124-0,181)
0,292 (0,235-0,402)
0,274 (0,227-0,358)
0,226 (0,166-0,307)
0,292 (0,256-0,319)
Тест Манна-Уитни,
р-уровень
0,0411
0,3969
0,2371
0,4904
0,8695
1,0000
0,0841
0,0612
Данные представлены как медианы с интерквартильным размахом.
У пациенток с числом CGG-повторов менее 26 и/или более 34 по
какому-либо из аллелей FMR1 гена уровень АМГ был ниже по сравнению с
пациентками, у которых число CGG-повторов находилось в пределах 26-34, и
составил соответственно (0,67±0,49) нг/мл и (0,74±0,63) нг/мл (р=0,6322). Это
может быть связано с менее значительным повреждением ткани яичника
аутоиммунными антителами по сравнению с генетически обусловленным
поражением яичников и, как следствие, повышением уровня АМГ.
Выявленные
в
ходе
исследования
клинико-анамнестические,
генетические и иммунологические предикторы были включены в модель
прогноза БОО в программах ВРТ, созданной с помощью метода
логистической регрессии. Модель была разработана на основании включения
в модель бинарных предикторов с применением разделения и калибровки и
использованием теста Хошмера-Лемешева (p=0,9362). Достоверность модели
была проверена путем построения ROC-кривой. AUC составила 89,6%
(Формула 1).
На основании полученных результатов был разработан алгоритм
проведения программ ВРТ у пациенток с риском развития БОО с учетом
21
аутоиммунных и молекулярно-генетических предикторов данного состояния
(Приложение).
Exp(-8,4+1,1*В+2,6*М+3,8*АМГ+1,8*CGG +3,7*Zp_IgM+1,8*Zp_IgG)
Р(БОО)= -------------------------------------------------------------------------------------1+Exp(-8,4+1,1*В+2,6*М+3,8*АМГ+1,8*CGG +3,7*Zp_IgM+1,8*Zp_IgG)
Р(БОО) – вероятность БОО в программах ВРТ, Exp – экспонента, В – возраст пациентки более 34
лет, М – возраст менопаузы у матери пациентки менее 48 лет, АМГ – уровень АМГ менее 1,0
нг/мл, CGG – число CGG-повторов в гене FMR1 более 34 в любом из аллелей гена, Zp_IgM –
уровень IgM к ZP более 0,140 ед. ОП, Zp_IgG – уровень IgG к ZP более 0,152 ед. ОП.
Формула 1. Модель прогноза «бедного» овариального ответа в программах
ВРТ.
ВЫВОДЫ
Показатели овариального резерва не являются абсолютными
1.
прогностическими
маркерами
ответа
яичников
на
стимуляцию
суперовуляции. У 18,5 % женщин с «бедным» ответом выявляется
сохранный яичниковый резерв, тогда как в 9,4% случаев снижения
овариального
резерва
отмечается
нормальный
ответ
яичников
на
стимуляцию суперовуляции.
«Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от
2.
клинико-анамнестических
факторов
риска
за
исключением
возраста
пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. У пациенток в
возрасте менее 34 лет при наступлении менопаузы у их матерей в возрасте
более
48
лет
шансы
развития
«бедного»
ответа
на
стимуляцию
суперовуляции уменьшаются в 6,2 раза.
3.
Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого
влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным
ответом. Однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона по
22
сравнению с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона в протоколах
стимуляции суперовуляции позволяет получить более высокое число
фолликулов и ооцитов в этой группе пациенток.
4.
У пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах
ВРТ в сыворотке крови определяется более высокий уровень аутоантител к
тканям
яичника
(антител
к
блестящей
оболочке
ооцита,
общих
антиовариальных антител), а также аутоантител к ФСГ, ГнРГ и β2-ГП1.
Уровень аутоантител к тканям яичника в фолликулярной жидкости значимо
коррелирует с уровнем аутоантител в сыворотке крови. Наиболее высокий
уровень аутоантител ассоциируется с «бедным» ответом и нормальным
овариальным резервом, что может свидетельствовать о ранней фазе
аутоиммунного поражения яичников в этой группе женщин.
5.
Особое значение в реализации овариальной функции имеют
аутоантитела к блестящей оболочке ооцита. У пациенток с уровнем
аутоантител выше порогового значения (0,140 ед. ОП для IgM и 0,152 ед. ОП
для IgG) шансы развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ
увеличиваются в 3,7 раза.
6.
Численные и структурные аномалии Х-хромосомы, такие как
изменение числа CGG-повторов в гене FMR1 и полиморфизмы гена BMP15,
относятся к возможным патогенетическим факторам развития «бедного»
овариального ответа. Увеличение числа CGG-повторов более 34 в любом из
аллелей гена FMR1 повышает шансы развития «бедного» ответа в
предстоящем протоколе ЭКО в 6,1 раз, что не наблюдается при уменьшении
числа CGG-повторов менее 26.
7.
Полиморфизмы гена BMP15 являются значимыми маркерами
овариального ответа в программах ВРТ. Для пациенток с «бедным» ответом
характерно более частое выявление аллеля G в позиции с.308 A>G
(Asn103Ser) и в позиции c.328+905A>G. Суммарно, у пациенток с «бедным»
ответом полиморфизмы гена BMP15, ассоциированные с овариальной
функцией (c.308A>G; c.202С>Т; и c.328+905A>G), выявляются в 2,5 раза
23
чаще по сравнению с пациентками с нормальным ответом яичников на
стимуляцию суперовуляции.
8.
Развитие «бедного» овариального ответа на фоне повышенной
продукции аутоиммунных антител характеризуется менее выраженными
клиническими проявлениями и лучшей сохранностью фолликулярного пула
по сравнению с «бедным» ответом на фоне генетических нарушений
(удлинение числа CGG-повторов в гене FMR1, наличие полиморфизмов гена
BMP15).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1.
Генетическое исследование играет важную роль в предикции
«бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в программах
ВРТ и должно быть рекомендовано пациенткам группы риска развития
преждевременной недостаточности и «бедного» ответа яичников (ранний
возраст менопаузы у матерей, преждевременная недостаточность яичников у
родственниц). Генетическое исследование должно включать определение
числа CGG-повторов в гене FMR1 и генотипирование BMP15.
2.
При отсутствии генетических нарушений (число CGG-повторов в
гене FMR1 менее 34 и отсутствие полиморфизмов гена BMP15) у пациенток
группы риска развития «бедного» овариального ответа и у пациенток с
развившимся «бедным» овариальным ответом, а также при наличии
сочетанной аутоиммунной патологии можно предположить аутоиммунное
поражение тканей яичников. Таким пациенткам рекомендовано проведение
иммунологического исследования с определением уровня антиовариальных
аутоантител и аутоантител к блестящей оболочке ооцита в сыворотке крови.
3.
Для
овариального
расчета
ответа
в
индивидуального
программах
ВРТ
риска
может
развития
быть
«бедного»
предложена
математическая модель, включающая оценку анамнестических данных,
24
определение уровня АМГ и ФСГ, числа CGG-повторов в гене FMR1, и
уровня аутоантител к блестящей оболочке ооцита классов IgM и IgG.
4.
В случае определения высокого риска развития «бедного»
овариального
рекомендована
ответа
в
ранняя
программах
ВРТ
пациенткам
реализация
репродуктивной
должна
быть
функции,
или
банкирование ооцитов, а также лечение сопутствующей аутоиммунной
патологии при ее наличии.
5.
Пациенткам с высоким риском развития «бедного» овариального
ответа следует персонифицированно подбирать протоколы стимуляции
суперовуляции и более высокие стартовые дозы гонадотропинов с целью
получения максимального числа фолликулов и ооцитов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
«Бедный» овариальный ответ в программах ЭКО / И.В.
Тетерина, Р.Э. Ванян, Е.А. Калинина, Н.В. Долгушина // Акушерство и
гинекология. - 2013. - № 9. - С. 4-12.
2.
Роль аутоиммунных антител в развитии «бедного» овариального
ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор
литературы) / Р.Э. Ванян , И.В. Менжинская, Н.В. Долгушина // Проблемы
репродукции. - 2014. - № 3. - С. 53-57.
3.
«Бедный» овариальный ответ в программах вспомогательных
репродуктивных технологий: связь с аутоиммунным поражением яичников //
Р.Э. Ванян, И.В. Менжинская,
Н.В. Долгушина
// Акушерство и
гинекология. - 2014. - № 9. - С. 51-58.
4.
Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного»
овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных
технологий / Р.Э. Ванян, Н.В. Долгушина // Гинекология. - 2014. - № 5. - С.
73-77.
25
5.
«бедным»
Спектр аутоантител к гормонам и фосфолипидам у пациенток с
овариальным
оплодотворения /
ответом
в
программе
Р.Э. Ванян, И.В.
экстракорпорального
Менжинская, Л.В.
Ванько, Н.В.
Долгушина, Е.А. Калинина // Иммунология- 2015. - № 3. - С. 167-172.
6.
Роль аутоиммунной патологии в генезе «бедного» овариального
ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий Роль
аутоиммунной патологии в генезе «бедного» овариального ответа в
программах вспомогательных репродуктивных технологий / Р.Э. Ванян,
Н.В. Долгушина, И.В. Менжинская, Е.А. Калинина // Мать и дитя: материалы
XIV научного форума. - Москва, 2013. – С. 530-531.
7.
Аутоантитела к гормонам и фосфолипидам у пациенток с
«бедным»
овариальным
ответом
в
программах
репродуктивных технологий / Р.Э. Ванян,
вспомогательных
И.В. Менжинская, Н.В.
Долгушина // Мать и дитя: материалы XV научного форума. - Москва, 2014.
– С. 460-461.
8.
«Бедный» овариальный ответ в программах вспомогательных
репродуктивных технологий: связь с аутоиммунным поражением яичников /
Р.Э. Ванян, И.В. Менжинская, Н.В. Долгушина //Мать и дитя: материалы
VII регионального научного форума. - Геленджик, 2014. – С. 138.
9.
Autoimmune antibodies in infertile patients with poor ovarian
response / R.E. Vanyan , I.V. Menzhinskaya, N.V. Dolgushina // 9th International
Congress on Autoimmunity, Nice, France, March 26-30, 2014.-P. 832.
10.
Determination of antibodies against FSH in infertile patients with poor
ovarian response / R.E. Vanyan, I.V. Menzhinskaya, N.V. Dolgushina // 9th
International Congress on Autoimmunity, Nice, France, March 26-30, 2014.-P.
835.
26
Алгоритм ведения пациенток с бесплодием в программах ВРТ
Наличие аутоиммунной
патологии
Уровень анти-ZP
IgM>0,140ед.ОП и/или антиZP IgG>0,152 ед.ОП, и/или
другие аутоантитела выше
референсных значений
Прогностически более
легкая аутоиммунная форма
«бедного» ответа
Ранний возраст
менопаузы у матерей
(менее 48 лет), ПНЯ у
родственников
Пациентки с бесплодием
Иммунологические исследования: определение АОА, анти –ZP,
анти-ГнРГ, анти-β2-ГП-1 в сыворотке крови
Уровень анти-ZP
IgM<0,140ед.ОП и антиZP IgG<0,152 ед.ОП,
и/или другие
аутоантитела ниже
референсных значений
Лечение сопутствующей
аутоиммунной патологии,
ранняя реализация
репродуктивной функции,
применение а-ГнРГ в
программах ВРТ
Приложение
Генетические исследования: определение CGG- повторов гена FMR1,
исследование полиморфизмов гена BMP 15
Длина
CGG
повторов
FMR1 гена
<34
Отсутствие
SNP BMP15:
c.328+905A>G,
с.308 A>G,
c.202С>Т
Ранняя реализация
репродуктивной функции,
банк ооцитов, применение аГнРГ в программах ЭКО
Длина
CGG
повторов
FMR1 гена
>34
Выявление SNP
BMP15:
c.328+905A>G,
с.308 A>G,
c.202С>Т
Прогностически более тяжелая
генетическая форма «бедного»
ответа
27
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа