close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Гены WOX и PIN в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago truncatula

код для вставкиСкачать
Санкт-Петербургский государственный университет
На правах рукописи
Творогова Варвара Евгеньевна
Гены WOX и PIN
в регуляции соматического эмбриогенеза
у Medicago truncatula
Специальность: 03.02.07 Генетика
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
д.б.н., проф. Л.А. Лутова
Санкт-Петербург
2016
Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии биологического факультета
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования "Санкт-Петербургский государственный университет"
Научный руководитель:
Людмила Алексеевна Лутова, доктор биологических наук,
профессор кафедры генетики и биотехнологии,
Санкт-Петербургский государственный университет.
Официальные оппоненты:
Нина Борисовна Брач, доктор биологических наук, ведущий
научный сотрудник Федерального исследовательского центра
«Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.
И. Вавилова (ВИР)»
Елена Константиновна Хлесткина, доктор биологических наук,
заведующий
сектором
функциональной
генетики
злаков
Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и
генетики Сибирского отделения Российской академии наук».
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего образования «Московский государственный
университет имени М.В. Ломоносова».
Защита диссертации состоится 19.01.2016 в _____ часов на заседании совета Д.212.232.12.
по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском
Государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб.,
д. 7/9, СПбГУ, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького
Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте Санкт-Петербургского
государственного университета (https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/pmFdqxJV5d.pdf)
Автореферат разослан ___________________ 2016 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д.212.232.12,
доктор биологических наук
Мамон Людмила Андреевна
Актуальность исследования.
Соматический эмбриогенез (СЭ) у растений – это процесс, при котором незиготические
клетки формируют эмбрионы, которые проходят через характерные стадии эмбрионального
развития, в конечном счёте формируя новое растение (Chen, 2009). Многие виды растений
хранят в себе потенциальную способность к СЭ, однако у большинства из них для
образования соматических эмбрионов необходимы специфические условия in vitro,
которые обычно включают в себя обработку гормонами, и развитие эмбриогенного каллуса.
Явление СЭ широко используется для генетической трансформации растений, а также
для получения искусственных семян. Поиск и изучение регуляторов этого процесса важны
для улучшения методик получения соматических эмбрионов.
СЭ имеет множество черт, характерных для обычного, зиготического эмбриогенеза (ЗЭ).
В частности, в ходе развития соматического эмбриона обычно можно различить
морфологические стадии, характерные для ЗЭ. Кроме того, большинство исследованных
генов, работающих в ходе ЗЭ, функционируют и при СЭ.
К числу регуляторов ЗЭ можно отнести транскрипционные факторы (ТФ) из семейства
WUSCHEL-LIKE HOMEOBOX (WOX2, WOX8 и WOX9 и другие) Эти факторы
определяют судьбу отдельных клеток эмбриона, которые в дальнейшем дают начало
различным частям зародыша (Haecker et al., 2004).
Наряду с работой ТФ, крайне важным для развития эмбриона и закладки его полярности
является градиент ауксина, в создании которого принимают участие мембранные
транспортёры семейства PIN-FORMED (PIN). На ранних этапах развития зиготического
эмбриона у Arabidopsis thaliana функционируют транспортёры ауксина PIN1, PIN4 и PIN7,
локализованные на наружной мембране клеток. Они участвуют в формировании
апикально-базальной оси и в закладке семядолей (Friml et al., 2003).
Для ряда генов WOX и PIN показано их участие в процессах СЭ. Например, ген
WUSCHEL является стимулятором СЭ у Capsicum chinense (Solís-Ramos et al., 2009), а PIN1
участвует в процессах закладки и формирования соматических эмбрионов у A. thaliana (Su
et al., 2009). Можно предположить, что и у других видов в СЭ участвуют разные ТФ WOX и
транспортёры PIN, взаимодействуя друг с другом и выполняя разные функции. Изучение
функций этих белков позволит глубже понять механизмы СЭ а также то, каким образом,
через каких посредников влияют на него гормоны и другие факторы, для которых была
показана их значимость для СЭ.
Целью данной работы является поиск и изучение новых регуляторов соматического
эмбриогенеза среди генов семейств WOX и PIN Medicago truncatula
Для достижения цели были сформулированы следующие задачи исследования:
1.Выявление генов семейств WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе СЭ
1.1. Количественный анализ экспрессии генов семейства PIN Medicago truncatula в ЗЭ и СЭ
1.2 Количественный анализ экспрессии генов семейства WOX Medicago truncatula в ЗЭ и СЭ
2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ
2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN
2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии гена STF
2.3. Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией MtWOX9-1
2.4. Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции MtWOX11-like
2.5. Поиск белков, взаимодействующих с исследуемыми ТФ WOX в процессе СЭ
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Экспрессия генов MtWOX9-1, STENOFOLIA, MtWOX11-like, SMOOTH LEAF MARGIN1
и MtLEC1A ассоциирована с процессом СЭ.
2. Сверхэкспрессия STENOFOLIA и MtWOX9-1 в каллусах Medicago truncatula приводит
к повышению эмбриогенности и сопровождается изменениями в уровнях экспрессии генов,
предположительно участвующих в СЭ
3. MtWOX9-1 способен к взаимодействию с транскрипционным фактором MtLEC1A,
участвующим в СЭ
Научная новизна диссертационной работы. Впервые было показано участие в
процессах СЭ генов STENOFOLIA, MtWOX9-1 и SMOOTH LEAF MARGIN1, а также впервые
были получены и описаны растения Medicago truncatula с потерей функции генов
MtWOX11-like и MtLEC1A. Впервые показано, что сверхэкспрессия генов STENOFOLIA и
MtWOX9-1 увеличивает способность к СЭ. Впервые выявлено взаимодействие белков
MtWOX9-1 и MtLEC1A. В ходе работы впервые созданы векторные конструкции для
анализа экспрессии генов MtWOX11-like и SMOOTH LEAF MARGIN1.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в работе результаты позволили выявить два новых гена семейства WOX и
один ген семейства PIN, участвующие в СЭ. Показано, что промоторы этих генов активны
непосредственно в соматических эмбрионах, а также в ассоциированных с ними зонах, а
также показано влияние изменения уровня экспрессии генов MtWOX9-1 и STENOFOLIA на
интенсивность СЭ. Практическая значимость работы определяется тем, что СЭ широко
используется в биотехнологии для трансформации и размножения растений. Выявленные
механизмы регуляции позволят улучшить имеющиеся или разработать новые протоколы
культивирования растений in vitro.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывали на
следующих конференциях: на IV международной школе для молодых учёных
«Эмбриология, генетика и биотехнология» (Пермь, Россия, 2012 год), на международной
конференции «International Symposium on Auxins and Cytokinins in Plant Development»
(Прага, Чехия, 2014), и на годичном собрании общества физиологов растений России
(Санкт-Петербург, Россия, 2016).
Структура и объем диссертации. Текст диссертации состоит из следующих разделов:
“Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты и обсуждение”,
“Заключение”, “Выводы”и “Использованная литература”. Диссертация представлена на
150 страницах и содержит 21 рисунок и 6 таблиц. В “Списке цитируемой литературы”
представлены 227 источников.
Материалы и методы
Растительный материал. В работе использовали растения Medicago truncatula Gaertn
линий A17 и 2HA, полученных из сорта Jemalong, и линии R-108, полученной из экотипа
108-1. Также в работе использовали трансгенные растения M. truncatula линии R-108 со
встроенными в геном конструкциями для сверхэкспрессии гена STENOFOLIA (STF) и для
анализа экспрессии генов STF и MtWOX9-1, трансгенные растения для анализа экспрессии
гена SMOOTH LEAF MARGIN1, а также растения из коллекции инсерционных мутантов
Medicago truncatula Института Сэмюэля Робертса, США, линий NF0075, NF8274 и
NF7292. Кроме того, в работе использовали растения Nicotiana benthamiana (семена
любезно предоставлены доктором Миллионом Тадеге).
Условия выращивания растений. Растения выращивали в условиях in vitro и in vivo при
температуре 21º-23ºС, с продолжительностью дня и ночи 16 и 8 часов и с освещённостью
2500 люкс. Растения in vivo выращивали в вермикулите, который поливали раз в две
недели модифицированным раствором солей Fahraeus (Fahraeus et al., 1957) или в
универсальном питательном грунте Terra Vita (Фарт, Россия). Для культивирования
растений in vitro использовали модифицированные среды Fahraeus (Fahraeus et al., 1957),
SH (Hoffmann et al., 1997) и P4 (Chen et al., 2009). Для получения соматических эмбрионов
использовали протоколы Hoffmann et al., 1997 и Chen, 2009. Оценку интенсивности СЭ у
каллусов линии R-108 проводили на 60 день культивирования.
Штаммы микроорганизмов. В работе использованы бактерии Escherichia coli (штамм
DH5α), Agrobacterium tumefaciens (штаммы AGL1 и GW2260), а также дрожжи
Saccharomyces cerevisiae (штамм Y2H Gold).
Молекулярно-биологические методы. Для клонирования последовательностей ДНК
пользовались системой Gateway (Invitrogen, США). Растительную РНК выделяли с
помощью кита RNeasy Micro Kit (Qiagen, Германия) или с помощью реагента Purezol
(Bio-Rad, США). Обратную транскрипцию РНК проводили с помощью обратной
транскриптазы RevertAid (Thermo Scientific, США). Для ПЦР в реальном времени
(ПЦР-РВ) использовали набор реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя
Eva Green (Синтол, Россия). Количественную оценку экспрессии анализируемого гена
проводили по методу 2-ΔΔСt (Livak, Schmittgen, 2001). В качестве референсных генов
использовали
гены
убиквитина
(XM_003627103/MTR_8g018230)
или
актина
(XM_003602497/MTR_3g095530). Выделение ДНК из растений для клонирования
осуществляли с помощью метода с использованием буфера, содержащего
цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ) (Murray, Thompson, 1980). Выделение плазмидной
ДНК из бактерий осуществляли с помощью набора Plasmid Miniprep (Евроген, Россия).
Эксперименты с использованием дрожжевой двугибридной системы и бимолекулярной
флуоресцентной комплементации проводили согласно Lu et al., 2010.
Визуализация экспрессии генов. Детекцию активности репортерного гена GUS
осуществляли c помощью субстрата X-Gluc (Thermo Scientific) согласно Chen, 2009.
Статистические методы и компьютерные программы, используемые в работе. Для
работы с последовательностями ДНК использовали программы Vector NTI Advance 10
(Thermo Scientific) и ApE (M. Wayne Davis). Для оценки доли видимой поверхности
каллуса, покрытой соматическими эмбрионами, использовали программу ImageJ
(Schneider et al., 2012). Статистическую значимость различий в уровнях экспрессии
оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистическую значимость различий в
процентах площади каллуса, покрытой соматическими эмбрионами, оценивали с помощью
критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
1. Выявление генов WOX и PIN, экспрессирующихся в ходе соматического
эмбриогенеза
Мы решили начать поиск новых регуляторов СЭ среди генов PIN, участвующих в ранних
этапах ЗЭ, а также в развитии тканей, окружающих эмбрион. Исходя из этого, первой
поставленной задачей было выявление генов PIN, которые могут участвовать в развитии
семязачатков и в ЗЭ у M. truncatula.
У M. truncatula выделено всего 10 генов PIN (MtPIN1-MtPIN10), семь из которых
(MtPIN1-5, MtPIN7 и MtPIN10, или SMOOTH LEAF MARGIN1(SLM1)) принадлежат к группе
длинных PIN, т.е., по-видимому, кодируют транспортёры, которые локализованы на
плазмалемме и обеспечивают межклеточный транспорт ауксина. Для выявления тех генов
длинных PIN, которые специфично экспрессируются в семязачатках, мы сравнили уровень
экспрессии генов PIN в семязачатках с их уровнем экспрессии во взрослом растении M.
truncatula (линия 2HA) на вегетативной стадии развития (данную пробу использовали в
качестве контроля), который мы приняли равным единице. Гены MtPIN2, 3, 5 и 7
продемонстрировали более низкий уровень экспрессии в семязачатках по сравнению с
уровнем экспрессии во взрослом растении. У двух генов (MtPIN1 и 4) различие между
двумя пробами было выражено незначительно. У одного гена – MtPIN10 (SLM1) – уровень
экспрессии в семязачатках был значительно выше.
Таким образом, исходя из вышеизложенных данных, мы заключили, что уровень
транскрипции генов MtPIN1, MtPIN4 и MtPIN10 (SLM1) повышен в семязачатках и,
предположительно, эти гены являются участниками ЗЭ у M. truncatula.
Далее мы измерили уровни экспрессии генов длинных MtPIN в ходе СЭ. Данный
эксперимент проводили с эмбриогенной линией 2HA и неэмбриогенной линией A17.
Листовые экспланты культивировали на твёрдой среде с концентрацией НУК 10 мкМ и
БАП 4 мкМ в течение трёх недель — в это время формировались каллусы. С четвёртой по
шестую недели полученные каллусы культивировали на среде без гормонов, и в это время
на каллусах линии 2HA образовывались соматические эмбрионы.
Для генов MtPIN1 и MtPIN4 мы не выявили статистически значимых различий,
связанных с формированием соматических эмбрионов (данные не представлены). Ген
MtPIN10 (SLM1) продемонстрировал повышенный уровень экспрессии у неэмбриогенной
линии A17 по сравнению с линией 2HA в ходе формирования каллуса (1-3 недели), однако
на более поздних сроках (6 недель), которые соответствуют развитию соматических
эмбрионов, было отмечено статистически значимое увеличение уровня транскрипции этого
гена у эмбриогенной линии по сравнению с линией A17 (Рисунок 1).
Таким же образом мы проанализировали экспрессию тех генов MtPIN, для которых не
был выявлен повышенный уровень транскрипции в семязачатках: MtPIN2, 3, 5 и 7. Мы не
выявили значительного повышения уровня экспрессии MtPIN2,3 и 5 в ходе СЭ. Экспрессию
MtPIN7 в данных условиях нам не удалось детектировать (данные не представлены)
Рисунок 1. Изменение относительных уровней
экспрессии гена MtPIN10 (SLM1) в условиях,
способствующих СЭ, у эмбриогенной линии
2HA и неэмбриогенной линии A17 (0,1, 2, 3, 4, 5
и 6 недель). Эксперимент проводился в трёх
биологических
повторностях.
Планки
погрешностей
указывают
доверительные
интервалы, рассчитанные на основании
t-распределения Стьюдента для уровня
значимости 0,05.
Аналогичные
эксперименты
были
проведены и для генов WOX. У M. truncatula
известно 12 генов WOX (Chen et al., 2009), и к настоящему моменту исследовано участие
трёх из них в СЭ. MtWUSCHEL (MTR_5g021930) и MtWOX9-like (MTR_7g026130) являются
важными участниками СЭ и экспрессируются в каллусах и в образующихся соматических
эмбрионах (Chen et al., 2009, Kurdyukov et al., 2014). MtWOX5 (MTR_5g081990) также
активируется в соматических эмбрионах, и его экспрессия в основном ассоциирована с
регенерацией корней (Chen et al., 2009).
Мы выбрали для исследования по два гена WOX из каждой эволюционной ветви
семейства WOX: MTR_1g115315 и MTR_3g115620 (древняя ветвь), MTR_7g086940
(MtWOX11-like) и MTR_2g015000 (MtWOX9-1) (промежуточная ветвь), а также
MTR_1g019130 (MtWOX4-like) и MTR_8g107210 (STENOFOLIA, или STF) (ветвь WUS).
Ранее их роль в СЭ не была изучена. Как и для генов PIN, c помощью ПЦР-РВ мы сравнили
уровень экспрессии генов MtWOX в семязачатках с их уровнем экспрессии во взрослом
растении M. truncatula на вегетативной стадии развития.
У трёх генов WOX (MtWOX4-like, MTR_1g115315, MTR_3g115620) уровень экспрессии в
семязачатках был ниже такового во взрослом растении. У гена MtWOX11-like различия
между двумя этими пробами были небольшими, и, наконец, у двух генов – STF и MtWOX9-1
– уровень экспрессии в семязачатках был значительно выше.
На основании вышеизложенного мы заключили, что в семязачатках повышается уровень
транскрипции генов MtWOX11-like, STF и MtWOX9-1.
Как и для генов PIN, далее мы проверили уровни экспрессии этих генов WOX в условиях,
способствующих развитию соматических эмбрионов. Уровень экспрессии гена MtWOX9-1 в
ходе СЭ значительно повышался (Рисунок 2, а). Гены STF и MtWOX11-like также
продемонстрировали статистически значимое увеличение уровня экспрессии на стадиях,
соответствующих развитию соматических эмбрионов, у эмбриогенной линии (Рисунок 2, б,
в).
Помимо этого, мы проанализировали экспрессию в тех же условиях остальных трёх
исследуемых генов WOX: MTR_1g115315, MTR_3g115620 и MtWOX4-like. Мы не выявили
повышения уровня экспрессии, ассоциированного с СЭ, у этих генов (данные не
представлены).
Рисунок 2. Изменение относительных уровней экспрессии генов MtWOX9-1 (а), STF (б), и
MtWOX11-like (в) в условиях, способствующих СЭ, у эмбриогенной линии 2HA и
неэмбриогенной линии A17 (0,1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель). Эксперимент проводился в трёх
биологических повторностях. Планки погрешностей указывают доверительные интервалы,
рассчитанные на основании t-распределения Стьюдента для уровня значимости 0,05.
Таким образом, согласно нашим данным, из шести генов WOX и PIN с повышенным
уровнем экспрессии в семязачатках четыре (SLM1, MtWOX9-1, STF, MtWOX11-like)
активируются в ходе СЭ. В то же время, из семи генов WOX и PIN со сниженным уровнем
экспрессии в семязачатках ни один не активируется в ходе СЭ. Эти результаты позволяют
предположить, что ранние этапы СЭ и ЗЭ контролируются с участием одних и тех же генов
WOX и PIN.
2. Изучение функций исследуемых генов в СЭ
2.1. Визуализация экспрессии исследуемых генов WOX и PIN
Для локального анализа экспрессии мы использовали растения M. truncatula линии
R-108, трансформированные конструкциями pSTF:GUS (Tadege et al., 2011),
pMtWOX9-1:GUS, а также pSLM1:GUS (Zhou et al., 2011a), в которых промоторы этих
генов регулируют экспрессию репортерного гена GUS (ген β-глюкуронидазы). Семена
растений с конструкциями pSTF:GUS и pMtWOX9-1:GUS были любезно предоставлены
доктором Миллионом Тадеге (Государственный Университет Оклахомы, США). Семена
растений с конструкцией pSLM1:GUS были любезно предоставлены коллегами из
Института Сэмюэля Робертса .
Мы получили каллусы растений с конструкцией pSTF:GUS, на которых образовались
соматические эмбрионы, и подвергли их GUS-окрашиванию.
На начальных стадиях развития каллуса активность промотора гена STF практически
отсутствовала (Рисунок 3, а). Активацию промотора наблюдали в уже развившемся
каллусе, непосредственно перед пересадкой на безгормональную среду. Зоны активации
выглядели как точки на поверхности каллуса (Рисунок 3, б). В ходе дальнейшей
культивации на безгормональной среде зоны активации промотора на поверхности каллуса
становились более обширными. После появления соматических эмбрионов можно было
детектировать интенсивную активность промотора STF непосредственно в зародышах на
стадиях глобулы и сердца; кроме того, активность промотора мы наблюдали в зонах на
поверхности каллуса, находящихся рядом с соматическими эмбрионами (Рисунок 3, в, г).
Следует также заметить, что часть соматических эмбрионов не демонстрировала наличие
экспрессии репортерного гена.
Рисунок 3. Экспрессия конструкции STF:GUS в ходе развития эмбриогенных каллусов.
Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена GUS. (а)
Каллус на ранней стадии развития (14 день культивации). (б) Развившийся каллус (40 день
культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (в)-(г) Каллусы с соматическими
эмбрионами (59-72 день культивации). Чёрными стрелками указаны окрашенные
соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которых присутствует
экспрессия репортерного гена.
Аналогичные результаты были получены и для промотора гена MtWOX9-1: на ранних
этапах развития каллуса активность промотора была близка к нулевой (Рисунок 4, а). В
развившемся каллусе промотор MtWOX9-1 активировался на небольших участках на
поверхности каллуса, при этом зоны активации были более размытыми, чем в случае
промотора STF (Рисунок 4, б). При появлении соматических эмбрионов мы обнаружили
активность промотора непосредственно в зародышах на стадии глобулы, сердца и
семядолей, а также в расположенных рядом зонах (Рисунок 4, в-г). Как и в случае с геном
STF, в некоторых соматических эмбрионах активность промотора MtWOX9-1 не
наблюдалась
Рисунок 4. Экспрессия конструкции MtWOX9-1:GUS в ходе развития эмбриогенных
каллусов. Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена
GUS. (а) Каллус на ранней стадии развития (15 день культивации). (б) Развившийся каллус
(34 день культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (в)-(ж) Каллусы с
соматическими эмбрионами (60-81 день культивации). Чёрными стрелками указаны
окрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которых
присутствует экспрессия репортерного гена.
Промотор гена SLM1 проявлял максимальную активность на этапе формирования
каллуса, когда экспланты культивировали на среде с ауксином. В развившемся каллусе
зоны экспрессии сужались до небольших участков на поверхности, и впоследствии была
заметна активность промотора непосредственно в соматических эмбрионах, а также в
ассоциированных с ними зонах (Рисунок 5).
Рисунок 5. Экспрессия конструкции pSLM1:GUS в ходе развития эмбриогенных каллусов.
Наличие сине-голубого окрашивания указывает на экспрессию репортерного гена GUS. (а)
Развившийся каллус (34 день культивации) перед пересадкой на безгормональную среду. (б)
Каллус после 14 дней культивирования на безгормональной среде (44 день культивации). (в)
Каллус с соматическими эмбрионами (59 день культивации). Чёрными стрелками указаны
окрашенные соматические эмбрионы на стадиях глобулы, сердца и семядолей, в которых
присутствует экспрессия репортерного гена.
Таким образом, результаты локального анализа активности промоторов трёх
исследованных генов (STF, MtWOX9-1 и SLM1) согласуются с результатами анализа
экспрессии с помощью ПЦР-РВ. Согласно локальному анализу, все три гена
экспрессируются в соматических эмбрионах, т.е., как мы и предполагали, являются
участниками СЭ.
2.2. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии
исследуемых генов WOX и PIN
Для изучения влияния исследуемых нами генов на процесс СЭ мы проанализировали
растения со сверхэкспрессией, а также с потерей функции исследуемых генов.
2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии гена
STF
Мы получили каллусы растений со сверхэкспрессией STF и сравнили интенсивность СЭ
с таковой у каллусов растений дикого типа. Было проанализировано 34 каллуса со
сверхэкспрессией STF и 35 каллусов дикого типа.
Эмбрионы, видимые невооружённым глазом, выглядят как зелёные образования на
поверхности жёлтого каллуса (Рисунок 6, а). Оценка количества эмбрионов достаточно
затруднительна, так как их может быть очень много, и они часто сливаются друг с другом.
Поэтому для оценки мы фотографировали каллусы и оценивали долю видимой поверхности
каллуса, окрашенную в зелёный, с помощью программы ImageJ. Анализ показал наличие
статистически значимых различий по этому параметру между каллусами дикого типа и
каллусами со сверхэкспрессией (p<0,01) (Рисунок 6, б).
Рисунок 6. (а) Каллусы с образующимися соматическими эмбрионами. Верхний ряд —
каллусы дикого типа. Нижний ряд — каллусы со сверхэкспрессией STF. (б) Средняя доля
поверхности каллуса, занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа и каллусов со
сверхэкспрессией STF. Ошибки отражают доверительные интервалы, рассчитанные с
помощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).
Таким образом, сверхэкспрессия гена STF приводит к увеличению интенсивности СЭ.
STF является транскрипционным фактором, поэтому, вероятнее всего, увеличивает
эмбриогенность за счёт изменения уровней экспрессии каких-либо генов-мишеней, тем или
иным образом задействованных в СЭ
У Medicago truncatula уже выявлено несколько участников СЭ, например, ген MtSERK1
(Nolan et al.,2009), однако как и в случае других объектов, очевидно, что их список далеко
не полон.
C целью выявления предполагаемых мишеней ТФ STF в СЭ, мы провели поиск новых
участников СЭ у Medicago truncatula среди генов-гомологов известных участников
соматического или зиготического эмбриогенеза у A. thaliana. Для анализа мы выбрали 7
генов A. thaliana: MONOPTEROS (MP), SCARECROW (SCR), SHORT-ROOT (SHR),
CUP-SHAPED COTYLEDON 2 (CUC2) (De Smet et al., 2010), LEAFY COTYLEDON1 (LEC1),
BABYBOOM1 (BBM1) и AGAMOUS-like 15 (AGL15) (Radoeva, Weijers, 2014). С помощью
базы данных Phytozome мы нашли гены M. truncatula, являющиеся близкими гомологами
перечисленных выше генов A. thaliana (MtMONOPTEROS, MtSCARECROW,
MtSHORT-ROOT, MtCUP-SHAPED COTYLEDON 2, MtLEAFY COTYLEDON1A,
MtBABYBOOM1, MtAGAMOUS-like 15. Затем с помощью ПЦР-РВ мы измерили динамику
их экспрессии в ходе СЭ. Как и для генов WOX и PIN, в этом эксперименте мы
воспользовались линиями 2HA и A17, контрастными по признаку эмбриогенности (см.
главу 1 раздела «Результаты и обсуждение».
Для 4 из перечисленных выше 7 генов (MtMP, MtSCR, MtCUC2 и MtBBM1) мы не выявили
значительного увеличения уровня экспрессии, связанного с СЭ (данные не представлены),
однако три других гена (MtSHR, MtLEC1A и MtAGL15) продемонстрировали активацию
экспрессии на этапе формирования соматических эмбрионов (Рисунок 7).
Рисунок 7. Динамика экспрессии MtSHR (а), MtAGL15 (б) и MtLEC1A (в) в ходе культивации
эксплантов эмбриогенной линии 2HA (сплошная линия) и неэмбриогенной линии A17
(пунктирная линия) в условиях, способствующих появлению соматических зародышей.
Эксперимент был проведён в двух биологических повторностях, в них наблюдалась сходная
динамика экспрессии исследуемого гена. На рисунке представлена одна серия проб, планки
погрешностей указывают стандартные отклонения, рассчитанные для трёх аналитических
повторностей.
С целью выявления причин повышенной эмбриогенности каллусов со сверхэкспрессией
STF мы измерили уровни экспрессии этих и некоторых других генов, предположительно
ассоциированных с СЭ, а также генов, участвующих в работе фитогормонов, в каллусах со
сверхэкспрессией STF и сравнили их с таковыми в каллусах дикого типа на стадии
формирования соматических зародышей (60 дней с момента начала культивирования),
когда различия между двумя типами каллусов были наиболее заметны.
В результате мы обнаружили, что в каллусах со сверхэкспрессией STF снижен уровень
экспрессии гена MtGH3.6, регулирующего метаболизм ауксина (Рисунок 8, а) (Yang et al.,
2015).
Рисунок 8. Экспрессия
генов MtGH3.6 и MtHB1 в
каллусах а-б: Экспрессия
MtGH3.6 (а) и MtHB1 (б) в
каллусах дикого типа и в
каллусах
со
сверхэкспрессией
STF,
полученных из листовых
эксплантов. Эксперимент
проводили в двух или трёх
биологических
повторностях.
Планки
погрешностей указывают
стандартные отклонения.
в-г: динамика экспрессии
MtGH3.6 (в) и MtHB1 (г) в
ходе культивации эксплантов эмбриогенной линии 2HA (сплошная линия) и неэмбриогенной
линии A17 (пунктирная линия) в условиях, способствующих появлению соматических
эмбрионов Эксперимент был проведён в двух биологических повторностях, в них
наблюдалась сходная динамика экспрессии исследуемого гена. На рисунке представлена
одна серия проб, планки погрешностей указывают стандартные отклонения, рассчитанные
для трёх аналитических повторностей.
Мы проанализировали динамику экспрессии MtGH3.6 в ходе СЭ. Данный эксперимент
проводили с эмбриогенной линией 2HA и неэмбриогенной линией A17, аналогично
экспериментам с генами WOX и PIN (см. главу 1 раздела «Результаты и обсуждение»). Мы
выявили повышенный уровень экспрессии MtGH3.6 в линии A17 по сравнению с линией
2HA на поздних стадиях культивирования, соответствующих развитию соматических
зародышей у эмбриогенной линии (Рисунок 8, в). Таким образом, пониженный уровень
экспрессии MtGH3.6 ассоциирован с повышением эмбриогенности, как в случае каллусов
со сверхэкспрессией STF, так и в случае каллусов эмбриогенной линии 2HA.
Помимо этого, мы обнаружили, что в каллусах со сверхэкспрессией STF уменьшен
уровень экспрессии гена MtHOMEOBOX PROTEIN1 (MtHB1), кодирующего ТФ,
предположительно, участвующий в сигналинге абсцизовой кислоты (Ariel et al., 2010)
(Рисунок 8, б). Мы также проанализировали динамику экспрессии MtHB1 в ходе
культивирования in vitro в каллусах эмбриогенной линии 2HA и неэмбриогенной линии A17
и обнаружили, что этот ген демонстрирует повышенные уровни экспрессии на поздних
стадиях культивирования каллусов обеих линий. Однако, в каллусах линии A17
наблюдаемое повышение было более существенным по сравнению с каллусами линии 2HA
(Рисунок 8, г). Таким образом, более интенсивная транскрипция MtHB1 ассоциирована с
развитием неэмбриогенного каллуса.
Таким образом, мы провели сравнительный анализ экспрессии 25 предполагаемых
генов-мишеней в каллусах дикого типа и в каллусах с приобретением функции STF на
стадии формирования соматических зародышей. В результате, несмотря на статистически
значимые различия в интенсивности СЭ между каллусами разных генотипов, мы
обнаружили только два гена, уровни экспрессии которых различались в каллусах дикого
типа и в каллусах со сверхэкспрессией STF.
Поскольку оба выявленных гена (MtHB1 и MtGH3.6) связаны с работой фитогормонов,
мы предполагаем, что сверхэкспрессия STF приводит к изменению гормонального баланса
каллуса в целом или к перераспределению тех или иных гормонов внутри каллуса, что и
повышает интенсивность СЭ. При этом изменения в экспрессии других генов,
ассоциированных с СЭ, также имеют место в каллусах со сверхэкспрессией STF, однако
они происходят только на поверхности каллуса – там, где формируются соматические
эмбрионы, поэтому их невозможно выявить, измеряя уровень экспрессии в каллусах
целиком.
Аналогичный эксперимент мы провели, используя каллусы растений с потерей функции
гена STF (генотип stf) (25 шт.) и, в качестве контроля, каллусы дикого типа (29 шт.) К
нашему удивлению, потеря функции STF не снизила эмбриогенность каллусов и даже
привела к небольшому увеличению степени эмбриогенности (p<0,05) (данные не
представлены).
Мы также измерили уровни экспрессии 25 предполагаемых генов-мишеней STF в СЭ в
этих каллусах и сравнили их с таковыми в каллусах дикого типа на стадии 60 дней с
момента начала культивирования, однако различий не выявили (данные не представлены).
Таким образом, в результате анализа интенсивности СЭ у растений со сверхэкспрессией
и с потерей функции гена STF, мы показали, что приобретение функции STF приводит к
увеличению эмбриогенности, а потеря функции STF не снижает эмбриогенность.
Следовательно, хотя STF, вероятнее всего, участвует в СЭ, его функции не являются
необходимыми для этого процесса.
2.2.2. Анализ способностей к СЭ у растений со сверхэкспрессией гена MtWOX9-1
Мы получили каллусы растений со сверхэкспрессией MtWOX9-1 и сравнили
интенсивность СЭ у них с таковой у каллусов растений дикого типа. Было
проанализировано 20 каллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1 и 24 каллуса дикого типа.
Интенсивность СЭ, измеренная аналогично предыдущим экспериментам, у каллусов со
сверхэкспрессией MtWOX9-1 была приблизительно в два раза выше, чем у каллусов дикого
типа (p<0,01) (Рисунок 9).
Рисунок 9. (а) Каллусы с
образующимися
соматическими
эмбрионами
(60
день
культивации).
Верхний
ряд
—
каллусы
со
сверхэкспрессией
MtWOX9-1. Нижний ряд —
каллусы дикого типа. (б)
Средняя доля поверхности каллуса, занимаемая эмбрионами, у каллусов дикого типа и
каллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1. Ошибки отражают доверительные интервалы,
рассчитанные с помощью t-критерия Стьюдента (уровень значимости 0,05).
С целью поиска предполагаемых генов-мишеней MtWOX9-1 в ходе СЭ, мы измерили
уровни экспрессии нескольких генов, экспрессия которых, согласно нашим данным,
ассоциирована с СЭ, на стадиях 30 и 60 дней с момента начала культивации. Мы взяли в
анализ следующие гены: MtWOX11-like, STF, SLM1, MtAGL15, MtSHR и MtLEC1A. В
отличие от каллусов с изменённым уровнем экспрессии гена STF, в данном случае все
анализируемые нами гены изменяли характер экспрессии в каллусах со сверхэкспрессией
MtWOX9-1 (Рисунок 10).
Рисунок 10. Уровни экспрессии генов MtWOX11-like (а), STF (б), SLM1 (в), MtAGL15 (г),
MtSHR (д), MtLEC1A (е) в каллусах дикого типа (серые столбцы) и каллусах со
сверхэкспрессией MtWOX9-1 (белые столбцы) на сроках культивирования 30 дней и 60 дней.
Планки погрешностей указывают стандартные отклонения. Эксперимент проводили в двух
биологических повторностях.
В настоящий момент сложно сказать, является ли какой-либо из исследованных генов
мишенью MtWOX9-1 в ходе СЭ. Скорее всего, изменения уровня экспрессии большинства
их них являются следствием изменённого состояния каллуса, а не непосредственной
активации транскрипции за счёт MtWOX9-1.
Дальнейший более подробный анализ, в частности, полный анализ транскриптома
каллуса со сверхэкспрессией MtWOX9-1, позволит выявить другие гены с изменённой
экспрессией и, возможно, мишени этого ТФ.
2.2.3. Анализ способностей к СЭ у растений с потерей функции гена MtWOX11-like
Для изучения функций гена MtWOX11-like мы приобрели семена растений,
предположительно содержащих вставку транспозона Tnt1 в этом гене, из коллекции
инсерционных мутантов M. truncatula (http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) (Tadege et
al., 2008) – линию NF8274. Затем с помощью генотипирования мы выявили растения,
гомозиготные по потере функции MtWOX11-like
Мы получили каллусы этих растений и сравнили интенсивность СЭ с таковой у каллусов
растений дикого типа. Было проанализировано 60 каллусов mtwox11-like и 17 каллусов
дикого типа. Нам не удалось выявить каких-либо различий в интенсивности СЭ между
мутантными растениями и диким типом (данные не представлены).
Таким образом, несмотря на активацию экспресcии в ходе СЭ, функции MtWOX11-like не
являются необходимыми для этого процесса. Возможно, другие ТФ из семейства WOX
выполняют ту же роль в СЭ и замещают действие MtWOX11-like в случае потери его
функции.
2.3. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторами STF и
MtWOX9-1 и важных для СЭ
С помощью дрожжевой двугибридной системы мы проверили взаимодействие ТФ STF и
MtWOX9-1 с другими ТФ, которые, предположительно, участвуют в эмбриогенезе. Мы
выбрали гены M. truncatula MtBBM1 (Medtr7g080460), MtBBM3 (Medtr4g065370),
MtAGL15A (Medtr4g109830), MtSHR (Medtr4g097080), MtLEC1A(Medtr1g039040),
MtMINI3(Medtr3g009470), MtFUS3(Medtr7g059330), близкие гомологи соответствующих
генов A. thaliana, согласно базе данных Phytozome.
Согласно полученным нами данным, STF и WOX9-1 не взаимодействуют с MtBBM1,
MtBBM3, MtMINI3, MtFUS3, MtSHR и MtAGL15, однако они оба взаимодействуют с
MtLEC1A (Рисунок 11). Наблюдаемое взаимодействие STF и WOX9-1 с MtLEC1A, по
видимому, не является ложноположительным результатом, поскольку аналогичный
эксперимент, проведённый с вектором, содержащим кодирующую область MtLEC1A, и
контрольным вектором (pGBKT7), не привёл к росту колоний дрожжей на селективной
среде (данные не представлены).
Рисунок 11. Результаты анализа взаимодействия белков с использованием дрожжевой
двугибридной системы. Рост колонии S. cerevisiae на селективной среде указывает на
взаимодействие указанных в таблице белков.
Далее мы проверили взаимодействие STF и MtWOX9-1 с MtLEC1A с помощью метода
BiFC (бимолекулярная флуоресцентная комплементация). Для этого мы клонировали
кодирующую последовательность гена MtLEC1A в векторы pEarleygate201-YN и
pEarleygate202-YC, присоединив таким образом к ней последовательность, кодирующую
либо N-терминальный, либо C-терминальный фрагмент флуоресцентного белка YFP.
Плазмиды
pEarleygate201-YN+STF,
pEarleygate202-YC+STF,
pEarleygate201-YN+MtWOX9-1, pEarleygate202-YC+MtWOX9-1, содержащие N- или
С-терминальные фрагменты YFP и кодирующие последовательности генов STF и
MtWOX9-1, были любезно предоставлены доктором Миллионом Тадеге, Государственный
Университет Оклахомы, США).
Затем мы трансформировали листья Nicotiana benthamiana четырьмя сочетаниями этих
плазмид:
1) pEarleygate201-YN+MtWOX9-1 и pEarleygate202-YC+MtLEC1A
2) pEarleygate202-YC+ MtWOX9-1 и pEarleygate201-YN+MtLEC1A
3) pEarleygate201-YN+STF и pEarleygate202-YC+MtLEC1A
4) pEarleygate202-YC+STF и pEarleygate201-YN+ MtLEC1A
Таким образом, в случае взаимодействия анализируемых в клетках табака образовывался
бы полноценный белок YFP, способный к свечению.
Полученные результаты не подтвердили взаимодействие STF и MtLEC1A (данные не
представлены), однако взаимодействие MtWOX9-1 и MtLEC1A подтвердилось в обоих
исследованных
сочетаниях
(MtWOX9-1+С-терминальный
конец
YFP
и
MtLEC1A+N-терминальный конец YFP, и наоборот) (Рисунок 12).
Рисунок 12. Результаты бимолекулярной флуоресцентной комплементации. а. Клетки N.
benthamiana, трансформированные конструкциями pEarleygate201-YN+MtWOX9-1 и
pEarleygate202-YC+MtLEC1A.
б.
Клетки
N.
benthamiana,
трансформированные
конструкциями pEarleygate202-YC+ MtWOX9-1 и pEarleygate201-YN+MtLEC1A. Желтое
свечение ядер указывает на образование функционального белка YFP вследствие
взаимодействия указанных транскрипционных факторов.
Таким образом, MtWOX9-1 взаимодействует с MtLEC1A в клетках растений.
2.3.1. Анализ функций гена MtLEC1A в СЭ
Для изучения функций гена MtLEC1A мы приобрели семена растений,
предположительно содержащих вставку транспозона Tnt1 в этом гене, из коллекции
инсерционных мутантов M. truncatula (http://medicago-mutant.noble.org/mutant/) (Tadege et
al., 2008) – линию NF7292.
С помощью генотипирования имеющихся у нас растений линии NF7292 мы получили два
растения, являющихся гомозиготными мутантами по гену MtLEC1A. Одно из двух
полученных гомозиготных растений было стерильным.
Интенсивность СЭ у растений с потерей функции MtLEC1A была значительно снижена.
Из 17 каллусов с потерей функции MtLEC1A, на 60 день после начала культивации лишь 2
каллуса имели соматические эмбрионы, в то время как из 23 каллусов растений дикого типа
в этом эксперименте на таких сроках соматические эмбрионы наблюдались на 21 каллусе
(Рисунок 13).
Рисунок 13. Оценка способностей к СЭ у растений с
потерей функции гена MtLEC1A (а) Каллусы дикого типа
(65 дней после начала культивации) (б) Каллусы mtlec1a
(65 дней после начала культивации).
Полученные данные позволяют предполагать наличие
важной роли MtLEC1A в СЭ, но не доказывают его.
Растения из используемой нами коллекции мутантов
содержат вставки транспозона Tnt1 во множестве локусов,
и существует возможность того, что мутантный фенотип
опосредован наличием вставки в каком-либо другом месте
генома. Анализ большей выборки мутантов, а также вставка в геном мутантов
функциональной копии MtLEC1A помогут подтвердить или опровергнуть наши
предположения.
Близким гомологом гена MtLEC1A является ген LEC1 A. thaliana, для которого было
показано непосредственное участие в развитии эмбриона.
LEC1 является одним из немногих ТФ, которые определяют не только развитие
определённых органов или тканей у эмбриона, не только конкретные стадии эмбриогенеза,
но и наличие эмбриональных черт в целом. Потеря функции LEC1 приводит к
неустойчивости семян к высыханию, но, кроме этого, проявления этой мутации
наблюдаются и на различных стадиях эмбриогенеза: в частности, у таких мутантов с
высокой частотой наблюдаются аномальные деления клеток суспензора, а семядоли имеют
черты строения, характерные для нормальных листьев. Также LEC1 участвует в этиоляции
(Junker, Bäumlein, 2012). В то же время, сверхэкспрессия LEC1 может приводить к
формированию соматических эмбрионов на вегетативных органах растения (Lotan et al.,
1998).
Эти данные, полученные нами результаты ПЦР в реальном времени (см. Рисунок 10 в
разделе «2.2.1. Анализ способностей к СЭ у растений с изменённым уровнем экспрессии
гена STF»), а также результаты анализа мутантов с потерей функции MtLEC1A, позволяют
утверждать, что MtLEC1A является участником СЭ и, вероятно, играет важную роль в этом
процессе. Поскольку, согласно нашим данным, MtWOX9-1 также участвует в СЭ, мы
предполагаем, что взаимодействие этих ТФ имеет значение в регуляции эмбриогенеза.
Заключение
В нашей работе мы выявили шесть генов из семейств WOX и PIN с повышенным уровнем
экспрессии в семязачатках. В дальнейшем мы показали, что уровень экспрессии четырёх из
них (MtWOX9-1, STF, MtWOX11-like и SMOOTH LEAF MARGIN1) повышается в ходе СЭ.
Таким образом, в нашем случае такой способ поиска новых участников СЭ с
использованием генеративных структур оказался весьма эффективным, несмотря на явную
неточность оценки (уровень экспрессии в семязачатках сравнивали с уровнем экспрессии в
целом растении).
Анализ активности промоторов генов MtWOX9-1, STF и SMOOTH LEAF MARGIN1
подтвердил наличие их экспрессии непосредственно в соматических эмбрионах, а также в
ассоциированных с ними зонах.
Мы показали, что сверхэкспрессия гена STF стимулирует СЭ (вероятно, за счёт
изменения функционирования фитогормонов в каллусе), однако STF не является
необходимым для этого процесса: потеря функции этого гена не уменьшает, а, наоборот,
немного увеличивает эмбриогенность каллуса. Потеря функции гена MtWOX11-like также
не приводит к потере эмбриогенности. Возможно, эти два гена могут замещать друг друга в
ходе СЭ, поэтому возможным следующим шагом в исследовании является анализ
способностей к СЭ у растений с одновременной потерей функции и STF, и MtWOX11-like.
В то же время, сверхэкспрессия MtWOX9-1 приводит к значительному увеличению
эмбриогенности, и к изменению уровня транскрипции множества генов в каллусах, что
позволяет предполагать наличие важной роли в СЭ у этого гена. Исследование
транскриптома каллусов со сверхэкспрессией MtWOX9-1, а также мутантов с потерей
функции MtWOX9-1 поможет выявить механизмы работы этого гена.
Поиск ТФ, взаимодействующих с исследуемыми нами белками WOX, позволил нам
выявить ещё одного участника СЭ у M. truncatula - ген MtLEC1A, продукт которого
взаимодействует с белком MtWOX9-1. Уровень экспрессии MtLEC1A значительно
повышается в ходе СЭ, а потеря функции этого гена с высокой вероятностью приводит к
сильному снижению эмбриогенности.
Полученные данные в очередной раз свидетельствуют о сходстве процессов СЭ и ЗЭ, а
также о сходстве способов регуляции разных типов меристем. В частности, известно, что
гомолог MtWOX9-1 участвует в работе ПАМ (Wu et al., 2005). STF, другой выявленный
нами участник СЭ, поддерживает меристематическую активность клеток листовой
пластинки (Tadege et al., 2011). Ген PIN1 A. thaliana, ближайший в геноме этого растения
гомолог гена SLM1, важен для закладки примордиев листьев в ПАМ (Benková et al., 2003), а
гомологи гена MtWOX11-like стимулируют деление клеток прокамбия при закладке
придаточных корней (Liu et al., 2014).
Многие вопросы, связанные с тематикой настоящей работы, остаются неизученными. На
наш взгляд, наиболее интересными направлениями будущих исследований являются
следующие:
1) Изучение распределения белков PIN, в частности, SMOOTH LEAF MARGIN1,
MtPIN1 и MtPIN4 при формировании соматических эмбрионов
2) Оценка способностей к СЭ у мутантов по генам MtWOX9-1 и SMOOTH LEAF
MARGIN1
3) Поиск транскрипционных факторов, действующих вместе с MtWOX11-like и STF в
ходе ходе СЭ
4) Изучение биологического значения взаимодействия транскрипционных факторов
MtWOX9-1 и MtLEC1A
Полученные результаты могут оказаться полезными как для фундаментальных
исследований СЭ и ЗЭ, так и для разработки новых методов размножения растений с
помощью СЭ.
Выводы
1. У Medicago truncatula выявлены гены семейств WOX и PIN (MtWOX9-1, STF,
MtWOX11-like и SMOOTH LEAF MARGIN1), а также ген транскрипционного фактора
MtLEC1A, экспрессия которых ассоциирована с соматическим эмбриогенезом. Для этих
генов характерен повышенный уровень экспрессии в генеративных органах, что
подтверждает сходство процессов соматического и зиготического эмбриогенеза.
2. При изучении функций выявленных генов показано, что повышенный уровень их
экспрессии (STF, MtWOX9-1) в каллусах Medicago truncatula приводит к повышению
эмбриогенности и сопровождается изменениями экспрессии генов, ассоциированных с
метаболизмом гормонов и с соматическим эмбриогенезом.
3. Поиск белков, взаимодействующих с транскрипционными факторами семейства WOX
(MtWOX9-1, STF), выявил, что MtWOX9-1 способен к взаимодействию с
транскрипционным фактором MtLEC1A.
4. Выявленные особенности работы генов семейств WOX и PIN в ходе соматического
эмбриогенеза подтверждают гипотезу о сходстве механизмов контроля пролиферации и
дифференцировки клеток в различных типах меристем.
Список публикаций по теме диссертации
Статьи:
1. Творогова В.Е. Ген STF в регуляции соматического эмбриогенеза у Medicago
truncatula / В.Е. Творогова, Ю.А.Федорова, F. Zhang, Л.А. Лутова // Физиология
растений. - 2016. - Т. 63, № 6. - С. 823-833. Принята в печать.
2. Творогова В. Е. Экспрессия генов WOX и PIN в соматическом и зиготическом
эмбриогенезе у Medicago truncatula / В.Е. Творогова, М.А. Лебедева, Л.А. Лутова //
Генетика. - 2015. - Т. 51, № 12.- С. 1376-1385
3. Творогова В.Е. Взаимодействие транскрипционных факторов и фитогормонов в
регуляции активности меристем у растений / В. Е. Творогова, М.А. Осипова, И.Е.
Додуева, Л.А. Лутова // Экологическая генетика. - 2012. - T. 10, № 3. — С. 28-40
Тезисы конференций:
1. Творогова В.Е., Федорова Ю.А., Лутова Л.А. Гены WOX и PIN в соматическом
эмбриогенезе у Medicago truncatula // Тезисы годичного собрания общества физиологов
растений России. Сигнальныесистемы растений: от рецептора до ответной реакции
организма. 21–24 июня 2016, С.-Петербург, Россия —Санкт-Петербург, — 2016. — С.
135
2. Tvorogova VY, Osipova MA, Lutova LA Medicago truncatula WOX and PIN genes:
participation in somatic embryogenesis // Book of Abstracts, International Symposium on
Auxins and Cytokinins in Plant Development, June 29 - July 4th 2014, Prague, Czech
Republic — Prague, Czech Republic, — 2014.
3. Осипова М.А., Творогова В.Е., Додуева И.Е., Лутова Л.А. Роль основных
меристем-специфичных транскрипционных факторов в развитии растений // IV
МЕЖДУНАРОДНАЯ ШКОЛА ДЛЯ МОЛОДЫХ УЧЁНЫХ «Эмбриология, генетика и
биотехнология», Пермь, 3-9 декабря — г. Пермь, — 2012. — С. 99-103
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
657 Кб
Теги
pin, wox, truncatula, гены, соматического, medicago, регуляции, эмбриогенеза
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа