close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Комплексная оценка показателей состояния микробиоценоза и паразитоценоза кишечника свиней под влиянием грибов рода Candida

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЗОТОВ ОЛЕГ ГЕННАДЬЕВИЧ
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ СОСТОЯНИЯ
МИКРОБИОЦЕНОЗА И ПАРАЗИТОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА
СВИНЕЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГРИБОВ РОДА CANDIDA
06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
УФА-2016
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего образования «Ульяновский государственный педагогический
университет им. И.Н. Ульянова».
Научный руководитель:
Ильина Наталья Анатольевна,
доктор биологических наук, профессор,
ФГБОУ ВО «Ульяновский
государственный педагогический
университет», проректор по научной
работе.
Официальные оппоненты:
Васильев Дмитрий Аркадьевич,
доктор биологических наук, профессор,
ФГБОУ ВО «Ульяновская государственная
сельскохозяйственная академия имени
П.А. Столыпина», заведующий кафедрой
микробиологии, вирусологии,
эпизоотологии и ветеринарно-санитарной
экспертизы.
Тихомирова Елена Ивановна, доктор
биологических наук, профессор, ФГБНУ
«Саратовский научно-исследовательский
ветеринарный институт», ведущий
научный сотрудник отдела бактериальных,
вирусных и микологических инфекций.
Ведущая организация:
ФГБОУ ВО «Оренбургский
государственный аграрный университет».
Защита диссертации состоится 24 декабря 2016года в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГБОУ ВО «Башкирский государственный
аграрный университет» по адресу: 450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50летия Октября, 34, ауд. 325/2. Тел./факс: +7 (347) 228-08-98.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВО
«Башкирский государственный аграрный университет» http://www.bsau.ru, а с
авторефератом в сети Интернет на официальном сайте Министерства образования и
науки Российской Федерации http://www.vak.ed.gov.ru
Автореферат разослан «___» ___________ 2016 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор сельскохозяйственных наук, профессор
2
Гиниятуллин
Марат Гиндуллинович
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Современное отечественное
свиноводство – динамично развивающаяся отрасль животноводства
России, позволяющая в сравнительно короткие сроки удовлетворить
потребность широких слоев населения в доступном, биологическим
полноценном животном белке (Сафиуллин Р.Т., 1984; Ямщиков В.Н., 2003;
Васильев Е.Н., 2004; Диденко П.П., Зуев Д.В., 2006).
Одними из актуальных вопросов в области ветеринарной
микробиологии, эпизоотологии, микологии с микотоксикологией и
иммунологии являются кишечные микозы свиней, которые имеют
достаточно широкое распространение в регионах с развитым
свиноводством и наносят ощутимый экономический ущерб (Сафиуллин
Р.Т., 1984; Буров В.В., 2001; Кизин Е.К., 2003; Федотов С.Г., 2004; Крылов
В.И., 2004; Глазунов Н.В., 2006, Ильина Н.А. 2012).
Кишечные микозы свиней часто встречаются в виде сочетанных
микробных поражений, что ведет к падежу и вынужденному убою
заболевших животных, снижению продуктивности и качеству продукции,
выбраковке пораженных органов, сырья и снижения племенной ценности
(Сафиуллин Р.Т., 1984; Олехнович Н.И., 1990, Габдулин В.А., 2000;
Ильина Н.А., 2014).
Микрофлора тела сельскохозяйственных животных – это набор
различного рода микроорганизмов, обуславливающий состояние всего
организма в целом. Часто обычная микрофлора - источник тех патогенных
или условно-патогенных микроорганизмов, обуславливающих эндогенное
инфицирование. Присутствие патогенных и условно-патогенных
микроорганизмов в составе микрофлоры приводит к изменению еѐ
количественного и качественного состава, что способно изменить
приспособительно-адаптационные механизмы всего организма животного.
Таким образом, именно обычная микрофлора приобретает большое
значение в возникновении или развитии болезни, способствуя либо
препятствуя ее проявлению.
В настоящее время с нарастающим неблагополучием экологической
ситуации в России наблюдаются патологические изменения микрофлоры
пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных, что ставит
перед микробиологами и ветеринарными специалистами новые сложные
задачи по охране здоровья животных.
В связи с вышеизложенным представляется важной комплексная
оценка показателей состояния микробиоценоза кишечника свиней под
влиянием грибов рода Candida spp.
Степень разработанности темы исследования.
Контаминация кишечника патогенными грибами – одна из наиболее
распространѐнных причин нарушения микрофлоры кишечника животных.
Появление в кишечнике плесневых грибов, а также грибов рода Candida
spp, изменение его количественного и качественного состава
3
свидетельствует о наличии дисбиоза, а, следовательно, дисфункции многих
систем органов. В связи с этим последние годы большое внимание
уделялось изучению взаимоотношений грибов рода Candida с другими
микроорганизмами. Так, например, согласно исследованиям В.Г.
Арзуманян. М.А. Мокроновой, Т.И. Самуиловой, В.Б. Гервазиевой при
атопическом дерматите дрожжеподобные грибы выявлялись на кожных
покровах чаще, чем у здоровых лиц. Вместе, с этим на коже часто
обнаруживались
стафилококки,
что
дало
авторам,
основание
предположить, что продукты метаболизма дрожжеподобных грибов могут
представлять своеобразный катализатор для роста стафилококков.
Было обнаружено, что E.faecalis и Е.соli могут оказывать
антагонистическое действие на дрожжеподобные грибы, угнетая
мицелиальную трансформацию C.albicans при воздействии на гриб
внеклеточных метаболитов этих бактерий (Kaczmarski, 1999).
Изучалось также влияние грибов на течение кишечных инфекций.
Микотическая сенсибилизация организма создавала фон, на котором
тяжелее протекал брюшной тиф и другие кишечные инфекции (Pybiis,
1998). Кроме того, C.albicans в экспериментах in vivo снижали
чувствительность бактерий-ассоциантов к антибиотикам (Бухарин О.В. и
др., 2002; Bailey, 1995).
Вместе с тем обнаруживается недостаточное количество работ,
посвященных оценке степени хронической интоксикации организма при
инвазии Candida spp, изучению иммунного статуса животного.
Целью диссертационной работы являлось разновекторное изучение
особенностей микробиоценоза кишечника свиней при инвазии Candida
spp.
Для реализации поставленной цели исследований были
сформулированы следующие задачи:
1. Определить степень хронической интоксикации организма свиней при
инвазии грибов рода Candida.
2. Оценить структуру микоценоза кишечника свиней в свиноводческих
хозяйствах Ульяновской области в зависимости от степени хронической
интоксикации.
3. Провести сравнительный анализ биологических свойств выделенных
грибов рода Candida.
4. Исследовать структуру кишечного паразитоценоза животных.
5. Выявить зависимость состояния облигатной и транзиторной
микрофлоры кишечника свиней от степени хронической интоксикации
животных и частоты встречаемости Candida spp.
6. Изучить показатели клеточного и гуморального иммунитета при
инвазии Candida spp. в зависимости от степени хронической интоксикации
организма свиней.
Научная новизна исследований. Показано, что наличие в структуре
микробиоценоза кишечника свиней грибов рода Candida, повышает
4
степень хронической интоксикации организма животных. Впервые
установлено, что с ростом степени хронической интоксикации организма
видовое разнообразие паразитоценоза кишечника свиней свиноводческих
хозяйств Ульяновской области значительно расширяется.
Проведена комплексная оценка биологических свойств выделенных
видов, а также комплексный сравнительный анализ состояния
микробиоценоза кишечника свиней при инвазии Candida spp. в
зависимости от тяжести хронической интоксикации. Установлен видовой
спектр простейших, который включает инфузории (Balantidium coli),
саркодовые (Blastocystis sp., E. hartmanni, E. coli, E. nana, Iodamoeba
butschlii), жгутиковые (Lamblia intestinalis) и кокцидии (Cryptosporidium
parvum). Показано, что экстенсивность инвазии свиней простейшими
составляет 81,7 %, из них балантидиями – 18,78 %. Гельминты,
представленные 1 видом трематод (Opisthorchis felineus), 1 видом цестод
(Hymtnolepis nana) и 1 видом нематод (Ascaris lumbricoides), выявлены у
12,18 % обследованных свиней.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные
результаты расширяют теоретические представления о системе
мониторинга микробиоценоза кишечника, включающие комплексную
оценку мико-, протоценоза и микрофлоры кишечника свиней.
Полученные результаты по изучению влияния хронической
интоксикации организма на иммунно-биологические характеристики
микробиоценоза кишечника, позволяют оптимизировать современные
методы профилактики микотических поражений у продуктивных
животных;
Разработаны научно-обоснованные практические рекомендации,
направленные на повышение жизнеспособности и продуктивности
сельскохозяйственных животных, которые могут быть использованы
специалистами АПК в производственной деятельности.
Методология и методы исследования.
При проведении исследований и изложении материала были
использованы как общенаучные (теоретико-методологический анализ
литературы, системный подход, анализ, сравнение, измерение,
эксперимент),
так
и
частно-научные
(микробиологические,
микроскопические,
биохимические,
микологические,
микотоксикологические,
гематологические,
иммунологические).
Использование перечисленных методов и статистический анализ
экспериментальных данных обеспечили объективность и достоверность
полученных результатов.
5
Научные положения, выносимые на защиту:
1. Степень хронической интоксикации организма свиней зависит от
частоты встречаемости и уровня контаминации кишечника грибами рода
Candida.
2. Проявление хронической интоксикации организма различной степени
отражается на количественных и качественных характеристиках
паразитофауны кишечника свиней в свиноводческих хозяйствах
Ульяновской области.
3. Существует причинно-следственная связь проявления хронической
интоксикации организма животных и состава кишечного микробиоценоза.
4. Инвазия Candida spp. сопровождается значительными изменениями
количественных показателей основных эндосимбионтов толстого
кишечника животных и увеличением количества представителей
транзиторной микрофлоры.
5. Хроническая интоксикация различной степени тяжести на фоне
грибковой инвазии сопровождается снижением показателей клеточного и
гуморального иммунитета.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных
результатов
обусловлена
значительным
объемом
экспериментального
материала,
полученного
с
использованием
высокоинформативных методов исследования в лабораторных условиях с
подтверждением данных математической статистикой.
Основные
результаты
и
практические
рекомендации
диссертационных исследований доложены на расширенном заседании
кафедры биологии и химии ФГБОУ ВПО «УлГПУ им. И.Н. Ульянова»
(Ульяновск, 2012, 2013, 2014, 2015, 2016), на 4-й Всероссийской
конференции с международным участием «Медико-физиологические
проблемы экологии человека (Ульяновск, 2011), на 3 съезде микологов
России
(Москва,
2012),
Международной
научно-практической
конференции с элементами научной школы для молодых ученых «48-е
Евсевьевские чтения» (Саранск, 2012), Международной научнопрактической конференции «Наука и образование в 21 веке» (Тамбов,
2013), Международной очной конференция XXX Любищевские чтения
«Современные проблемы эволюции и экологии» (Ульяновск, 2015).
Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в
одиннадцати печатных работах, из них четыре – в изданиях,
рекомендованных ВАК Министерства образовании и науки РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 98 страницах
компьютерной верстки, содержит 19 таблиц и 13 рисунков. Работа состоит
из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования,
результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов,
практических предложений, библиографического списка и приложения.
Библиографический список включает 154 источника, в том числе 37 на
иностранных языках.
6
2 CОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1 Материалы и методы исследования
Забор материала для исследований осуществляли на базе
свиноводческих комплексов ООО «Курортный» и ООО «Стройпластмасс Агропродукт» Ульяновского района Ульяновской области.
Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на базе
центра фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и
биотехнологии ФГБОУ ВО «УлГПУ им. И.Н. Ульянова.
Проведены
две
серии
научно-хозяйственных
опытов
с
использованием 98 откормочных свиней обоего пола, подбиравшихся с
соблюдением принципа аналогов по клинико-физиологическому
состоянию, породе, возрасту, полу, массе тела. 49 здоровых свиней
составили контрольную группу, у которых отсутствовали паразитарные
инвазии.
В течение наблюдений свиней контрольных (клинически здоровых)
и опытных (с дисбиотическими изменениями кишечника по данным
ветеринарного статистического отчета) групп с 240- до 300- дневного
возраста (период заключительного откорма) содержали на основном
рационе, сбалансированном по основным показателям в соответствии с
нормами РАСХН (Калашников А.П. и др., 2003). Исключению влияния
суточных ритмов на результаты экспериментов способствовала
периодичность манипуляций, проводимых в одно и то же время суток,
обычно в утренние часы, как контрольных, так и у опытных животных. Для
проведения исследований были использованы следующие методы:
I. Микробиологические – определение структуры микробиоценозов
кишечника путѐм отбора проб материала, подготовки суспензии
микроорганизмов, посев на селективно-элективные питательные среды,
выделение чистой культуры микроорганизмов, идентификация чистых
культур по морфологическим, тинкториальным, культуральным,
биохимическим и серологическим свойствам.
II. Биологические –
а) определение хронической интоксикации организма по показателю
спонтанной альтерации эритроцитов (Шевченко Т.Ф., Крикунова Н.А.,
1995).
б) подсчет основных классов лимфоцитов и их субпопуляций
производили реакцией спонтанного розеткообразования (Брондз, 1987;
Купер, Керни, Шер, 1987).
III. Биометрические – проведение статистической обработки
полученных результатов исследований с использованием пакета
специальных прикладных программ Microsoft Office Excel 7.0 (Реброва
О.Ю., 2002).
7
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ СОСТОЯНИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗА И ПАРАЗИТОЦЕНОЗА
КИШЕЧНИКА СВИНЕЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ ГРИБОВ РОДА CANDIDA
Объект изучения
Откормочные свиньи обоего пола (эритроциты периферической крови, масса тела, микробиоценоз
кишечника)
Условия экспериментов
Критерии постановки экспериментов (наличие ветеринарных свидетельств, клинико-физиологическое
состояние, пол, порода, возраст, масса тела)
Группа
1
(контрольная)
2
(опытная)
I серия (98 свиней)
II серия (98 свиней)
животные клинически здоровые
животные клинически здоровые
животные с дисбиотическими
изменениями кишечника
животные с дисбиотическими
изменениями кишечника
Методы исследований
Микробиологические
Биологические
Внедрение научных положений в учебный процесс:
ФГБОУ ВПО «УлГПУ им. И.Н. Ульянова»
8
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Определение хронической интоксикации организма по
показателю спонтанной альтерации эритроцитов
Для аргументации влияния грибковой инвазии в ходе развития
адаптивной реакции со стороны организма свиней необходимо изучение
хронической интоксикации организма по показателю спонтанной альтерации
эритроцитов, являющегося целью первого этапа нашей работы.
Исследования показали, что у 97,9 % обнаружено явление хронической
интоксикации различной выраженности. Вариации величины показателя от
2,4±0,6 до 19,6±0,8 %, позволили разделить все пробы на 3 группы (табл. 1).
Таблица 1 - Значения показателя хронической интоксикации
Группы проб
Количество
проб
(абс. число)
Количество
проб, %
Значение
хронической
интоксикации, %
1
(легкая
интоксикация)
25
25,5
2,4±0,6
2
(средняя
интоксикация)
49
50,0
14,2±0,5
3
(тяжелая
интоксикация)
22
22,5
19,6±0,8
4. отсутствие
интоксикации
2
2,0
_
Всего:
98
100,0
−
В 1-й группе степень хронической интоксикации слабо выражена 2,4±0,6 % (25 проб), во 2-й значительно выше – 14,2±0,5 % (49 проб), в 3-й
группе этот показатель ещѐ более увеличился - 19,6±0,8 % (22 пробы), что
соответствовало тяжелой форме интоксикации.
Отмечено, что положительная реакция на хроническую интоксикацию,
вызвавшую
спонтанную
альтерацию
эритроцитов
у
животных,
инвазированных Cаndida spp., обнаружена у 97,9% особей.
Выраженность данного признака позволила разделить по степени
интоксикации все пробы на легкую, среднюю и тяжелую. Проведенный
статистический корреляционный анализ показал наличие прямой
зависимости степени хронической интоксикации организма свиней от уровня
инвазии фекалий спорами грибов рода Candida. У животных с легкой
степенью хронической интоксикации количественное содержание Candida
spp. составляло lg 6,50,3 (КОЕ/г r=0,51), со средней – lg 6,90,6 КОЕ/г,
9
r=0,63, с тяжелой – lg 7,10,1 КОЕ/г, где r=0,69, где r – коэффициент
корреляции.
3.2 Структура микоценоза у свиней с различной степени хронической
интоксикации
Несмотря на общее постоянство нормальной микрофлоры, в
желудочно-кишечный тракт с пищевыми продуктами могут попадать и
другие виды микробов, в частности, споры микроскопических грибов
(Шевченко Т.Ф., 1985). При изучении 98 проб испражнений свиней споры
грибов обнаружены как в окрашенных, так и в неокрашенных мазках, в
последних они обнаруживались редко. Споры грибов в окрашенных мазках
имели вид круглых или овальных образований ярко-красного цвета
(Шевченко Т.Ф., Галикеев Х.Л., 1980). В ходе микологического исследования
было выделено 4 рода грибов: Aspergillus, Penicillium, Mucor и Candida.
Количественное
исследование
обсеменности
фекалий
спорами
микроскопических грибов свиней с различной степенью хронической
интоксикации показало положительную динамику уровня контаминации
грибами рода Aspergillus и Candida. Так, в группе животных с легкой
выраженностью данного признака (25 особей) количество грибов не
превышало lg 2,1±0,8 КОЕ/г и lg 4,30,5 КОЕ/г соответственно, со средней
(49 особей) составило lg 3,6±0,7 КОЕ/г и lg 5,1±0,2 КОЕ/г соответственно, и в
группе с тяжелой степенью хронической интоксикации (22 особей) - lg
4,8±1,1 КОЕ/г и lg 6,50,7 КОЕ/г (в контрольной группе свиней - lg 0,8±0,02
КОЕ/г и lg 2,40,3 КОЕ/г соответственно, р≤0,05). В видовом составе
микоценоза кишечника свиней на всех стадиях хронической интоксикации
доминирующим видом являлся Candida albicans, количество которого
достигало lg 7,20,3 КОЕ/г.
На рисунке 1 показано, что высокий уровень контаминации кишечника
свиней спорами грибов Candida spp. отмечен у 96 животных (97,9 %),
спорами Aspergillus spp. – у 43 (43,9 %). У 25 животных (25,5 %) в фекалиях
отмечено большое количество спор как аспергилл так и кандид.
Aspergillus
Candida spp.-Aspergilluss spp.
Candida spp.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
Рисунок 1 - Уровень контаминации кишечника свиней спорами
микроскопических грибов.
10
3.3 Биологические свойства выделенных грибов рода Candida
Несмотря на изученность влияния присутствия патогенных грибов на
микрофлору кишечника, остается спорным вопрос диагностики,
идентификации штаммов грибов рода Candida, а также определения их
патогенности для организма.
Колонии вида Candida albicans, выделенные у сельскохозяйственных
животных, на плотных агаровых средах были правильной круглой формы,
достигали 1см, имели беловато-желтоватый цвет, гладкую и зернистую
поверхность, тестоватую консистенцию. Колонии C. tropicalis имели
вытянутую форму, общий размер колонии был меньше, чем у C .albicans, они
имели кремовый цвет и сильно изрезанные края. Колонии вида C. crusei
расположены отдаленно друг от друга и носили более разреженный характер,
были сухие, плоские с небольшой зернистостью и имели беловатый цвет.
Форма клеток близка к правильно овальной.
Отмечено, что для выделенных штаммов грибов рода Candida spp.
была характерна активная ферментация углеводов с образованием кислоты и
газа. У Candida albicans и Candida tropicalis участие в этом процессе
принимали глюкоза, мальтоза и лактоза, а у штамма Candida crusei только
глюкоза.
Определение патогенности грибов рода Candida производили при
посеве на рисовый агар (табл. 2).
Таблица 2 - Определение патогенности грибов рода Candida
Вид
C. albicans
C. tropicalis
C. crusei
Филаментация на рисовом агаре
Наличие
хламидиоспор
Псевдомицелий ветвистый, в толще среды
+
древовидный
Псевдомицелий
сильно
развит,
много
бластоспор и псевдоконидий
Псевдомицелий развитый
-
Главный признак патогенности дрожжеподобных грибов –
филаментация, присутствует у всех выделенных видов (образование нитей
псевдомицелия). Псевдомицелий C.albicans был ветвистый, в толще самой
среды древовидный. Отличительной особенностью этого вида является
наличие хламидиоспор. Псевдомицелий C.tropicalis был также сильно развит,
наблюдалось большое количество бластоспор. У C.crusei также
регистрировался развитый псевдомицелий, близкий по структуре к
псевдомицелию C.tropicalis.
Филаментация наблюдавшаяся у всех видов, у C.albicans – наличие
хламидиоспор, говорит о патогенности данного рода.
11
3.4 Результаты изучения паразитоценоза кишечника свиней с различной
степенью хронической интоксикации организма
Обследование паразитоценоза кишечника в свиноводческих хозяйствах
Ульяновской области проводили с применением диагностической системы,
автором которой является Н.А. Ильина (2006). Как и в предыдущих сериях
наблюдений, исследование паразитоценоза проводили исходя из деления
животных по группам проявления хронической интоксикации.
В группе свиней с легкой степенью проявления хронической
интоксикации организма (25 особей) зараженность обследованных животных
простейшими и гельминтами не одинакова. Так, простейшие были выявлены
у 13 особей, тогда как гельминты – у 3 особей (рис. 2).
Рисунок 2 - Инвазированность свиней с легкой степенью хронической
интоксикации организма
В ходе изучения видового состава паразитоценоза кишечника
установлено незначительное видовое разнообразие паразитарной фауны.
Протоценоз был представлен саркодовыми (46,1 %), инфузориями (38,5 %) и
жгутиковыми (15,4%), гельминты – нематодами (6%) и цестодами (6%).
Таким образом, исследование паразитоценоза свиней с легкой степенью
хронической интоксикации показало невысокую зараженность свиней
кишечными паразитами, в том числе простейшими – 24 % и гельминтами –
12 %.
Далее в работе изучен паразитоценоз животных со средней степенью
хронической интоксикации организма (49 особей). В данной группе
12
простейшие обнаружены у 27 свиней (55,1 %), тогда как гельминты – у 16
(32,6 %) животных (рис. 3).
12,3%
55,1%
32,6%
Инвазированность простейшими
Инвазированность гельминтами
Рисунок 3 - Инвазированность свиней со средней степенью
хронической интоксикации организма
Изучение видового состава паразитофауны кишечника свиней данной
группы выявило увеличение видового разнообразия всех видов кишечных
паразитов по сравнению с предыдущей группой животных: саркодовые (28,6
%), инфузории (16,3 %) и жгутиковые (10,2 %). Обнаружен еще один вид
гельминтов - трематоды (2.1%), нематоды и цестоды были обнаружены у
16,3% и 14,2% соответственно. Было выявлено 9 видов кишечных паразитов:
6 видов простейших (4 вида саркодовых, 1 вид жгутиковых, 1 вид инфузорий)
и 3 вида гельминтов (1 вид трематод, 1 вид цестод, 1 вид нематод), что также
согласуется с данными, полученными Е.А. Карпеевой в 2011 году.
В заключительной серии наблюдений изучен паразитоценоз животных
с тяжелой степенью хронической интоксикации организма (22 особи). В этой
группе простейшие были выявлены у 15 свиней (68,2 %), тогда как
гельминты – у 7 (31,8 %) животных (рис. 4).
Изучение состава паразитофауны кишечника свиней с тяжелой
степенью хронической интоксикации организма показало динамику видового
разнообразия простейших по сравнению с предыдущей группой животных.
Так, были выделены представители кишечного протоценоза: саркодовые
(40,9 %), инфузории (13,6 %) и жгутиковые (9,1 %), а также кокцидии (4,5%),
гельминтов обнаружено 4 вида (трематоды – 9,1%, цестоды - 9.1%, нематоды
-13,6%).
В ходе исследования были получены данные, отражающие обильное
видовое разнообразие паразитофауны кишечника обследованных животных.
Выявлено 11 кишечных паразитов, из них 8 видов – простейшие: 1)
саркодовые: Blastocystis sp, Entamoeba hartmanni, Entamoeba coli, Endolimax
13
Не
nana, Iodamoeba butschlii; 2) жгутиковые: Lamblia intestinalis; 3) инфузории:
Balantidium coli и 4) кокцидии: Cryptosporidium parvum.
31,8%
68,2%
Инвазированность простейшими
Инвазированность гельминтами
Рисунок 4 - Инвазированность свиней с тяжелой степенью хронической
интоксикации организма
Из четырех видов гельминтов обнаружены: 1 вид трематод: Opisthorchis
felineus, 1 вид цестод: Hymtnolepis nana, два вида нематод: Enterobius
vermicularis, Ascaris lumbricoides. При этом нами отмечена прямая
зависимость роста встречаемости кишечных паразитов и динамики видового
разнообразия от степени хронической интоксикации организма животных.
В ходе оценки паразитоценоза кишечника были выявлены двухчленные
ассоциации разных видов паразитов: балантидии – грибы рода кандида,
бластоцисты – лямблии, балантидии – бластоцисты. Чаще всего
паразитоценоз был представлен сочетанием инфузорий и грибов (21,6 %),
саркодовыми (18,7 %), жгутиковыми (11,2 %) и гельминтами (9,4 %), реже
сочетанием гельминтов с гельминтами (0,42 %). Кроме того, встречались
трехчленные ассоциации: лямблии – балантидии – грибы (7,4 %),
протозойно-гельминто-грибковые (7,8 %). Обращает на себя внимание
высокая встречаемость дрожжеподобных грибов. Достоверно возрастает
зараженность грибами в сочетании с одним и двумя видами паразитов, чаще с
балантидиями (р<0,0001; р=0,005).
В результате выполнения работы установлена высокая зараженность
свиней кишечными паразитами. Увеличение роста зараженности находилось
в прямой зависимости от степени хронической интоксикации организма
свиней и уровня высеваемости грибов Candida spp. Это подтверждает тот
факт, что у животных с легкой степенью хронической интоксикации видовой
состав гораздо более скудный (6 видов), чем у животных с тяжелой степенью
проявления данного признака - 11 видов кишечных паразитов: 8 видов
простейших (5 видов саркодовых, 1 вид жгутиковых, 1 вид инфузорий, 1 вид
кокцидий) и 4 вида гельминтов (1 вид трематод, 1 вид цестод, 2 вида
14
нематод), что согласуется с данными, полученными Е.А. Карпеевой в 2011
году.
3.5 Сравнительный анализ изменения микробиоценоза кишечника
свиней при различной степени хронической интоксикации организма
3.5.1 Исследование показателей облигатной микрофлоры толстой
кишки свиней при различной степени хронической интоксикации
организма
Следующим этапом нашей работы явилось изучение микробиоценоза
кишечника свиней с различной степенью хронической интоксикации. Так,
было изучено изменение облигатной микрофлоры толстой кишки животных с
легкой степенью хронической интоксикации (25 особей). Результаты
исследования микробиоценоза толстой кишки данной группы животных
показали, что в их фекалиях микробное число бесспоровых облигатных
анаэробов – бифидобактерий оказалось сниженным и составило lg 7,50,32
КОЕ/г (в контрольной группе - lg 8,70,56 КОЕ/г (р0,05)). (рис. 5).
5.1
5.2
Рисунок 5 - Изменение облигатной микрофлоры толстой кишки у
свиней с легкой (5.1)
и средней (5.2) степенью хронической интоксикации организма
Содержание лактобактерий не превышало lg 5,60,44 КОЕ/г (в
контрольной группе lg 7,20,36 КОЕ/г). Кишечные палочки были
обнаружены во всех пробах испражнений в количестве lg 5,93,1 КОЕ/г, в
контрольной группе средняя арифметическая величина данного показателя
составила lg 7,90,58 КОЕ/г (р0,05).
В структуре облигатной микрофлоры свиней со средней степенью
хронической интоксикации (49 особей) выявлены более серьезные
изменения. Так содержание бифидобактерий снизилось до lg 6,20,19 КОЕ/г
15
(р0,001), кишечных палочек до lg 4,70,29 КОЕ/г, лактобактерий - до lg
4,80,24 КОЕ/г.
Максимальные изменения содержания микроорганизмов облигатной
микрофлоры наблюдались нами в группе свиней (22 особи) с высокой
степенью хронической интоксикации (рис. 6). Обсемененность кишечника
бифидобактериями резко снизилась (до lg 1,80,33 КОЕ/г (р0,001)).
Лактобактерии обнаруживались в количестве lg 2,70,34 КОЕ/г, что отражает
более глубокие сдвиги в кишечной микрофлоре (р0,001). Микробное число
кишечных палочек оказалось также сниженным (lg 3,50,34 КОЕ/г, р0,001).
Lg KOE/г
Bifidobacterium
10
8
6
4
2
0
Escherichia
Контрольная группа
Lactobacilla
Животные инвазированные Candida spp.
Рисунок 6 - Изменение облигатной микрофлоры толстой кишки у
животных с высокой степенью хронической интоксикации организма
3.5.2 Динамика транзиторной кишечной микрофлоры свиней при
различной степени хронической интоксикации организма
Следующим этапом нашей работы явилось изучение динамики
транзиторной кишечной микрофлоры в условиях хронической интоксикации
различной степени при инвазии Candida spp. Были проведены исследования
содержания представителей транзиторной микрофлоры в группе животных
со слабой степенью хронической интоксикации (табл. 3).
Так, спороносные анаэробные палочки были обнаружены у животных в
количестве lg 5,20,8 КОЕ/г; бактерии рода Proteus - lg 5,80,8 КОЕ/г;
Klebsiella - lg 5,41,2 КОЕ/г; Enterococcus - lg 6,90,8 КОЕ/г и Staphylococcus
- 5,11,1 КОЕ/г; в контрольной группе данные показатели равнялись lg
4,10,7 КОЕ/г, lg 3,30,2 КОЕ/г и lg 3,40,4 КОЕ/г, lg 5,50,4 КОЕ/г и lg
2,70,2 КОЕ/г соответственно (р0,05).
Исследования микробиоценоза толстой кишки свиней со средней
степенью хронической интоксикации обнаружили увеличение высеваемости
условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с результатами
предыдущей и контрольной групп.
16
Таблица 3 - Состояние транзиторной микрофлоры кишечника в группе
животных с легкой степенью хронической интоксикации
lg КОЕ/г, Мm
Микроорганизмы
Инвазированные
Контрольная группа
Candida spp.
Enterococcus spp.
5,50,4
6,90,8
Proteus spp.
3,30,2
5,80,8
Klebsiella spp.
3,40,4
5,41,2
Staphylococcus spp.
2,70,2
5,11,1
Clostridium spp.
4,10,7
5,20,8
Р
≤0,05
Спороносные анаэробные палочки были обнаружены в количестве lg
6,10,6 КОЕ/г, протеи - lg 6,50,8 КОЕ/г, клебсиеллы - lg 6,10,7 КОЕ/г,
энтерококки - lg 7,30,8 КОЕ/г и стафилококки - lg 5,90,3 КОЕ/г, р0,05
(рис. 7).
Klbsiella
Proteus
Clostridium
Stahpylococcus
Enterococcus
0
2
Контрольная группа
4
6
8
10
12
14
Lg KOE/г
Животные инвазированные Candida spp.
Рисунок 7 - Состояние транзиторной микрофлоры толстой
кишки у свиней со средней степенью хронической интоксикации
организма
Максимальное увеличение условно-патогенных микроорганизмов
отмечались нами в группе свиней с высокой степенью хронической
интоксикации организма (рис. 8). Обсемененность Clostridium spp. составила
lg 6,90,4 КОЕ/г, бактерии рода Proteus, Klebsiella, Enterococcus, и
17
Staphylococcus были выявлены в количестве lg 7,30,1 КОЕ/г, lg 6,71,1
КОЕ/г, lg 7,90,9 КОЕ/г, lg 6,60,2 КОЕ/г, соответственно (р0,05).
Klеbsiella
Proteus
Clostridium
Stahpylococcus
Enterococcus
0
2
Контрольная группа
4
6
8
10
12
14
Lg KOE/г
Животные инвазированные Candida
spp.
Рисунок 8 - Состояние транзиторной микрофлоры толстой
кишки у свиней с высокой степенью хронической интоксикации
организма
Изменения облигатной и транзиторной микрофлоры свидетельствуют о
развитии выраженного дисбиоза, способного сформировать перморбидный
фон для развития тяжелых системных заболеваний различного генеза.
Результаты исследований демонстрируют зависимость степени хронической
интоксикации организма свиней и глубины дисбиотических изменений от
уровня контаминации грибов Candida spp.
3.6 Изменение иммунного статуса свиней на фоне грибковой
инвазии
Для рассмотрения иммунологического ответа организма свиней с
различной степенью хронической интоксикации организма были изучены
следующие показатели: частота перехода лимфоцитов в бластную форму
(РБТЛ), уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК),
цитотоксический индекс (ЦИ). Результаты исследований бластной
трансформации лимфоцитов (РБТЛ) периферической крови в присутствии
лимфоцитарного митогена у свиней, инфицированных грибами рода Candida
spp., указывало на выраженные отклонения этого показателя по сравнению с
контрольной группой.
Так, в группе животных с легкой степенью проявления хронической
интоксикации (25 особей) уровень бластной трансформации снижался до
32,6±3,1, со средней (49 особей) - до 27,4±1,54; у свиней с тяжелой степенью
проявления данного признака (22 особи) опускался до 25,3±1,3; Р<0,01)
(табл. 4).
Следовательно, инвазия грибов рода Candida spp., определяющая
степень хронической интоксикации организма свиней, снижает
18
функциональную способность лимфоцитов периферической крови к
трансформации в бласты под воздействием лимфоцитарного митогена.
Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК)
также выявило его изменение под действием грибов рода Candida spp. Это
изменение заключалось в значительном повышении значений ЦИК.
Так, у животных с легкой степенью хронической интоксикации
концентрация ЦИК составляла 205,2±9,98 (138,0±12,6 в контроле), со
средней – 215,0±10,3 (Р<0,01), и в группе с тяжелой до 287,2±19,2.
Таблица 4 - Иммунологические показатели свиней, с различной
степенью хронической интоксикации, при инвазии Candida spp.
Иммунологические
показатели
Частота перехода
лимфоцитов в
бластную форму
(РБТЛ-%)
ЦИК
ЦПД
(цитотоксический
индекс – ЦИ)
Группы
животных
инвазированные
неинвазированные
Степень хронической
интоксикации организма
легкая
средняя
Тяжелая
32,6±3,1 27,4±1,54
25,3±1,3
48,1±0,2
Р
<0,01
инвазированные
205,2±9,9
неинвазированные
Р
<0,01
инвазированные 0,671±0,1
неинвазированные
Р
<0,01
<0,01
<0,01
215,0±10,
287,2±19,2
3
138,0±12,6
<0,01
<0,01
0,428±0,2 0,252±0,1
0,937±0,02
<0,01
<0,01
В общей характеристике эффекторных реакций клеточного иммунитета
особое место занимают лимфоциты, обладающие повреждающим действием
в культуре ткани. Установлено, что цитотоксический эффект проявлялся у
большинства свиней, инфицированных грибами рода Candida spp. Однако,
показатели его, в зависимости от степени проявления хронической
интоксикации организма значительно варьировали. Так, наиболее
выраженное угнетение цитотоксического эффекта отмечено у животных с
тяжелой степенью хронической интоксикацией организма до 0,252±0,1 (в
контроле 0,937±0,02, р<0,01)., со средней выраженностью хронической
интоксикации активность лимфоцитов была выше 0,671±0,1; (р<0,01), но у
свиней с легкой степенью хронической интоксикации цитотоксический
эффект был гораздо ниже уровня контрольной группы (см. табл. 4).
Изучение аффинности Е-рецепторов Т-лимфоцитов у свиней, показало
равномерное снижение всех фракций Е-РОК, однако статистически
достоверным было снижение средне - и высокоаффинных Е-РОК (р<0,05).
19
Количество Т-лимфоцитов с Е-рецептором средней аффинности в группе
животных с легкой степенью хронической интоксикации организма было в
0,9 раза ниже, чем у контрольных животных (р<0,05). Количество Тлимфоцитов с высокоаффинным Е-рецептором было 1,4 раза ниже, чем в
контроле (табл. 5).
Количество Т-лимфоцитов с Е-рецептором средней аффинности в
группе животных со средней степенью хронической интоксикации организма
было в 1,2 раза ниже, чем у контрольных животных (р<0,05). Количество Тлимфоцитов с высокоаффинным Е-рецептором было в 1,9 раза ниже, чем в
контроле (табл. 5).
Таблица 5 - Аффинность Т-лимфоцитов свиней с различной степенью
хронической интоксикации организма при грибковой инвазии
Группы свиней
Инвазированные
(n=49)
Неинвазированны
е
(n=47)
Р
Низкоаффинные Среднеаффинны Высокоаффинные
Т1-клетки
е Т2-клетки
Т3-клетки
0,325±0,021
0,243±0,023
0,169±0,011
0,360±0,019
0,292±0,025
0,321±0,013
>0,05
<0,05
<0,05
Количество Т-лимфоцитов с Е-рецептором средней аффинности в
группе животных с тяжелой степенью хронической интоксикации организма
было в 1,5 раза ниже, чем у контрольных животных (р<0,05). Количество Тлимфоцитов с высокоаффинным Е-рецептором было в 2,5 раза ниже, чем в
контроле (см. табл. 5).
С целью изучения функционального состояния В-системы иммунитета
определяли уровень иммуноглобулинов А, М, G. В таблице 6 представлено,
что, уровень IgA даже в группе свиней с легкой степенью хронической
интоксикации организма значительно повышен по сравнению с контролем
(181,3±2,3; 174,6±3,4 соответственно).
20
Таблица 6 – Уровень иммунноглобулинов у свиней на фоне грибковой
инвазии
Группы
животных
с легкой
степенью
интоксикации
со средней
степенью
интоксикации
с тяжелой
степенью
интоксикации
контроль
Иммуноглобулины (МЕ/мл)
A
M
G
181,3±2,3*
186,2±2,9
708,9±6,1*
231,4±2,2*
194,3±5,1*
756,4±4,5*
318,4±4,7*
205,6±4,2*
821,7±4,3*
174,6±3,4
181,1±3,8
839,9±2,9
У животных со средней степенью интоксикации уровень IgA повышен
до 231,4±2,2 (р<0,01), а в группе особей с тяжелой формой проявления
данного признака уровень IgA был самым высоким и составил 318,4±4,7.
Уровень IgM также был выше контрольного во всех группах 186,2±2,9,
194,3±5,1, 205,6±4,2; 181,1±3,8 соответственно (р<0,01). Повышение уровня
IgG не отмечалось ни в одной из групп животных.
ВЫВОДЫ
1. Проведена оценка 98 проб крови свиней, инвазированных Candida
spp, из которых 96 дали положительный результат при определении
хронической интоксикации организма. По степени выраженности данного
признака все пробы были разделены на три группы: пробы с легкой, средней
и тяжелой степенью хронической интоксикации.
2. Видовой состав микроскопических грибов и величина контаминации
кишечника свиней находились в прямой зависимости от степени
хронической интоксикации их организма. У животных с легкой степенью
хронической интоксикации видовой состав гораздо беднее на 6 видов, чем у
животных с тяжелой степенью проявления данного признака.
3. Все выделенные из кишечника свиней виды Candida spp. отличаются
морфологическими признаками (цветом, формой и размерами колоний) и
биохимическими признаками (в активной ферментации углеводов с
образованием кислоты и газа) принимали участие у Candida albicans и
Candida tropicalis глюкоза, мальтоза и лактоза, а у штамма Candida crusei
только глюкоза.
4. Встречаемость простейших и гельминтов в группе животных с
тяжелой степенью хронической интоксикации выросла на 44,2 % и 19,8%
соответственно, что свидетельствует о прямой зависимости усиления
21
хронической интоксикации организма свиней и роста встречаемости
кишечных паразитов
5. Выявлена взаимосвязь между проявлением у свиней хронической
интоксикации организма различной степени и снижением количества
облигатной микробиоты до 70% с одновременным увеличением числа
условно-патогенных микроорганизмов в 1,5-2 раза.
6. Угнетение показателей клеточного и гуморального иммунитета
свидетельствует о развитии стойкого вторичного иммунодефицита у
животных на фоне грибковой инвазии, тяжесть которого находится в прямой
зависимости
от
степени
хронической
интоксикации
организма.
Свидетельствующее об этом количество Т-лимфоцитов средней и высокой
аффинности превышало показатели контроля в 1,5 и 2,5 раза соответственно,
а уровень иммуноглобулина IgA – в 2 раза.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. При оценке видового разнообразия микробиоценоза кишечника
свиней следует учитывать степень хронической интоксикации Candida spp.,
поскольку его состав находится в прямой зависимости от уровня
контаминации кишечника дрожжеподобными грибами рода Candida.
2. При применении в лечении кандидоза антимикотических препаратов,
важно учитывать изменение показателей клеточного и гуморального
иммунитета.
3. Научные положения и выводы диссертационной работы
используются при чтении лекций, проведении лабораторно-практических
занятий ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный педагогический
университет имени И.Н. Ульянова» и рекомендуются к использованию
специалистами, а также при написании учебных пособий по ветеринарной
микробиологии, микологии и иммунологии животных студентов высших
учебных
заведений
по
агробиологическим
и
педагогическим
специальностям. Результаты исследования внедрены в практику
деятельности ОГБУ «Карсунский центр ветеринарии и безопасности
продовольствия».
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Карпеева. Е.А., Зотов О.Г., Хуснатдинова Е.А.
Изменение
микрофлоры кишечника свиней при микозах // Вестник ЧГПУ им. И.Я.
Яковлева - 2011. - №4, ч.1. – С.26-28. 300 экз.
2. Зотов О.Г., Ильина Н.А., Карпеева Е.А. Сезонные изменения состава
микрофлоры кишечника свиней при кандидамикозах // «Вестник ЧГПУ
им. И.Я. Яковлева». - 2012. - №2. - С. 67-69. 300экз.
3. Зотов О.Г., Н.А. Ильина. Изменение иммунного статуса свиней при
грибково-протозойной
инвазии
//
Вестник
Чувашского
22
государственного педагогического университета имени И.Я. Яковлева.
– Чебоксары. – 2012. – №2. – С. 74-77. 300 экз.
4. Зотов О.Г., Карпеева Е.А., Ильина Н.А. Чувствительность грибов рода
Candida аlbicans и Candida сrusei к антимикотическим препаратам //
Естественные и технические науки. - Москва, Изд-во «Спутник+», 2013
г. - С. 62-65. 1000 экз.
Публикации в прочих изданиях:
5. Зотов О.Г. Морфологические и биохимические признаки рода Candida,
выделенные у сельскохозяйственных животных // «Медикофизиологические проблемы экологии человека»: Материалы IV
Всероссийской конференции с международным участием (26-30
сентября 2011г.) – Ульяновск: УлГУ, 2011. – С. 86-87. 200 экз.
6. Карпеева
Е.А.,
Зотов
О.Г.
Микрофлора
кишечника
сельскохозяйственных
животных
//
«Медико-физиологические
проблемы экологии человека»: Материалы IV Всероссийской
конференции с международным участием (26-30 сентября 2011г.) –
Ульяновск: УлГУ, 2011. – С. 105-106. 200 экз.
7. Зотов О.Г., Ильина Н.А., Карпеева Е.А. Влияние грибов рода Candida
на микрофлору кишечника свиней // Сборник материалов конференции
«48-е Евсевьевские чтения» Мордов. гос. пед. ин-т. – Саранск. - 2012 г.145с. – С.25-29. 200 экз.
8. Зотов О.Г., Карпеева Е.А., Ильина Н.А. Грибковые поражения
желудочно-кишечного тракта свиней / О.Г. Зотов, Е.А. Карпеева, Н.А.
Ильина // Современная микология в России. Том 3. Материалы 3-го
Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии,
2012. – 528 с. (С. 449-450). 700 экз.
9. Зотов О.Г. Изменение состава микрофлоры кишечника свиней в
присутствии. патогенных Candida. // Наука и образование в 21 веке: сб.,
ч. 33. - Тамбов. Изд-во ТРОО «Бизнес-Наука-Общество», 2013. – 145с.
С. 36-38. 500 экз.
10.Зотов О.Г. Основы лабораторной диагностики микозов: практические
рекомендации. / Ульяновск, УлГПУ им. Ульянова», 2013. - 18с. 100 экз.
23
Зотов Олег Геннадьевич
Комплексная оценка микробиоценоза и паразитоценоза кишечника
свиней под влиянием грибов рода Candida
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003
Подписано в печать
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная.
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа