close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов ротавирусов группы А циркулирующих в Московском регионе

код для вставкиСкачать
1
На правах рукописи
Бахтояров Георгий Николаевич
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ
РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В МОСКОВСКОМ
РЕГИОНЕ
03.02.02 – вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2016
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном
учреждении «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.
И.И. Мечникова»
Научные руководители:
Кандидат биологических наук
Доктор медицинских наук, профессор
Файзулоев Евгений Бахтиёрович
Каира Алла Николаевна
Официальные оппоненты:
Лаврентьева Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, ФБУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»
Роспотребнадзора, лаборатория детских вирусных инфекций, заведующая
Сергеев Олег Витальевич, доктор биологических наук, Федеральный
НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского,
лаборатория сравнительной вирусологии, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация: ФГУП "Государственный научно-исследовательский
институт
особо
чистых
биопрепаратов"
Федерального
медикобиологического агентства России, г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится 20 октября 2016 г. в 12 часов на заседании
диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБНУ НИИВС им.
И.И. Мечникова по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5А.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФБГНУ
НИИВС им. И.И. Мечникова www.instmech.ru
Автореферат разослан «___» _________________ 2016 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
И.В. Яковлева
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Заболевания, вызываемые ротавирусами, сопровождаются острыми
гастроэнтеритами, что приводит к дегидратации и, нередко, к необходимости
госпитализации. Ротавирусы - высоко контагиозны и способны вызывать
нетипичные, тяжелые формы заболеваний, сопровождаемые длительным
выделением вирусов как от больных, так и от лиц с бессимптомным
вирусоносительством (Reves et al., 1993; Guerin-Danan et al., 1998; Naficy еt
al., 1999). Повсеместность распространения ротавирусной инфекции (РВИ)
подтверждается результатами исследований, проводимых в различных
регионах мира, которые свидетельствуют о существовании значительных
географических
различий
циркулирующих
серотипов
и
генотипов
ротавирусов (Gentsch J.R. et al., 2005). Распространенность этого рода
инфекции в странах с высоким и низким уровнем развития здравоохранения
практически одинакова, а санитарные мероприятия, адекватные для
предупреждения бактериального заражения, в отношении ротавирусов
неэффективны. Ежегодно в мире от ротавирусной инфекции умирают до 450
тыс. детей (данные ВОЗ 2008г.), главным образом в странах с низким
уровнем
развития
экономики
и
здравоохранения.
По
данным
Роспотребнадзора в структуре ОКИ установленной этиологии на территории
Российской Федерации в 2010 году доля ротавирусного гастроэнтерита
составила 45%. В развитых странах гибель людей от РВИ носит
спорадический характер, но затраты, связанные с ней, исчисляются
миллиардами долларов ежегодно.
В
настоящее
время
специфическая
антиротавирусная
терапия
отсутствует, поэтому основным средством предупреждения заболеваний,
вызываемых ротавирусами, является вакцинопрофилактика. По состоянию на
январь 2016 года (данные ВОЗ) ротавирусные вакцины введены в
национальные календари иммунизации (НКИ) в 80 странах мира. Однако
4
высокая генетическая пластичность ротавирусов может вызвать снижение
эффективности вакцинопрофилактики при массовом проведении этих
мероприятий, что отмечено в ряде стран.
Возрастающая
миграционная
активность
во
всем
мире
также
увеличивает вероятность падения эффективности вакцинопрофилактики при
возникновении
и
распространении
новых
эпидемически
значимых
генетических вариантов ротавирусов, включая госпитальные штаммы и
межвидовые
реассортанты.
мегаполисы,
такие
как
Регионы,
г.
Москва,
включающие
являясь
в
себя
центрами
крупные
интенсивных
миграционных потоков, имеют значительно отличающиеся особенности,
поэтому требуют регулярных и детальных наблюдений для выявления
закономерностей циркуляции возбудителей инфекционных заболеваний с
такими
высокими
показателями
контагиозности,
вирулентности
и
генетического потенциала, как у ротавирусов.
Несмотря на то, что в целом успехи по изучению природы этого
возбудителя значительны, знания по ряду аспектов и целостная картина
понимания известных свойств ротавирусов все еще отсутствуют. Пополнение
и анализ данных о региональных особенностях генетической структуры и
динамики генофондов популяций ротавирусов предоставляет сведения
необходимые для успешного прогнозирования и разработки стратегий
противоэпидемических мероприятий, вакцинопрофилактики, служит основой
углубленного познания природы этого возбудителя, успешного поиска
средств
специфической
терапии,
разработки
новых
вакцин
и
диагностических систем.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования являлось определение генетических
характеристик клинически-значимых штаммов ротавирусов группы А,
циркулировавших в Московском регионе в период 2009-2014 гг.
5
Для
достижения
поставленной
цели
необходимо
было
решить
следующие задачи:
1) выбор критериев и методических подходов, необходимых для
определения основных генетических характеристик ротавирусов;
2) адаптация и оптимизация выбранных методов и контролей,
разработка
экспериментальной
ПЦР
тест-системы
генотипирования
ротавирусов группы А и алгоритма проведения исследований;
3) формирование коллекции первично охарактеризованных клинических
образцов, создание внутрилабораторных контролей и эталонов;
4) генотипирование ротавирусов, содержащихся в выборке из образцов
сформированной коллекции;
5) проверка полученных результатов выборочным секвенированием и
методами, рекомендованными ВОЗ, аналитическая обработка эмпирически
полученных данных;
6)
определение
системно-структурных
параметров
генофонда
метапопуляции ротавирусов группы А Московского региона периода 20092014гг. аналитическими методами исследований по наиболее значимым
критериям.
Научная новизна.
Впервые
охарактеризована
генетическая
структура
ротавирусов
Московского региона периода 2009-2014гг. по основным молекулярноэпидемиологически значимым критериям. Выявлены генотипы ротавирусов,
составляющих
ядро
генофонда
метапопуляции
и
соответствующих
критериям, определяющим их как резидентные для Московского региона
периода 2009-2014гг.
Мультилокусным сивенс-типированием впервые выявлены редкие для
Московского региона генотипы ротавирусов «диких» штаммов с аллелями
G6 и P[9].
6
Разработан
и
апробирован
оригинальный
метод
ускоренной
пробоподготовки для секвенирования элементов генома «диких» штаммов
ротавирусов,
выделенных
из
клинических
образцов,
минуя
стадию
накопления генетического материала клонированием в плазмидных векторах.
Эффективность
прогнозирования
определения
принадлежности
филогенетических
отношений
к
таксону
представителей
и
рода
Rotavirus по их геномным последовательностям подтверждена на изолятах
Московского региона. В частности, показана диагностическая ценность
маркерных аллель-специфичных локусов генов, кодирующих белки VP4,
VP6, VP7 ротавирусов человека группы А, в условиях центральной части РФ
в период с 2009 по 2014 годы.
Теоретическая и практическая значимость
1. Результаты исследований генетических характеристик ротавирусов
Московского региона периода 2009-2014гг. могут быть использованы для
построения эпидемиологических прогнозов, при определении стратегий
вакцинопрофилактики, в ретроспективных исследованиях динамических
характеристик популяций ротавирусов и других областях.
2. Разработана и апробирована экспериментальная мультиплексная ПЦР
тест-система с детекцией в режиме реального времени (МП–ПЦР–РВ) для
генотипирования ротавирусов. Показана перспективность разработки на её
основе набора реагентов повышенной эффективности, применимого для
решения научных и практических задач.
3. На основе молекулярно-генетических подходов разработана методика
локус-типирования секвенированием генетических элементов ротавирусов
«диких» штаммов группы А из первичных проб биоматериалов, минуя
стадию накопления ДНК клонированием. Принципы этой методики могут
быть
приняты
мультилокусного
ротавирусов.
за
основу
при
разработке
сиквенс-типирования
и
набора
реагентов
секвенирования
для
геномов
7
4. В ходе исследований разработаны положительные контроли для
детекции 10 аллелотипов методом ПЦР, сформирована коллекция ротавируссодержащих биоматериалов, которые могут быть использованы при
проведении аналогичных исследований. В базе данных GenBank NCBI
депонированы 44 секвенированные последовательности локусов геномов 35
диких штаммов ротавирусов Московского региона.
Положения, выносимые на защиту
1. Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени
является
высокоэффективным
и
высокоспецифичным
средством
генотипирования ротавирусов. Доля расшифрованных генотипов превышает
80% при соблюдении инструкций на всех этапах проведения анализа.
2. Разработанная комбинация методических подходов, адаптированных
для сиквенс-локус типирования ротавирусов диких штаммов из первичных
образцов, минуя стадию клонирования геномных последовательностей в
векторах, не уступает качественно, и превосходит по эффективности
секвенирование с использованием клонирования в векторах, а также может
успешно применятся для секвенирования ротавирусных геномов.
3. По молекулярно-генетическим характеристикам штаммы ротавирусов,
циркулировавшие
в
Московском
регионе
в
период
2009-2014гг.,
представляют собой генетически неоднородную метапопуляцию с ядром из
двух стабильно доминирующих генотипов (G4P[8] - 49% и G1P[8] - 18%),
обладающих признаками резидентных. Штаммы с генотипами G2P[4],
G3P[4], G4P[4], G2P[8], G3P[8], G9P[8] составляют рецессивную (минорную)
часть метапопуляции с нестабильным положением. Аллелофонд гена белка
VP7 представлен аллелями G1, G2, G3, G4, G9 с доминированием аллелей G4
и G1, гена белка VP4 представлен аллелями P[8] и P[4] с доминированием
P[8]. Редкими для региона в период обследования являются выявленные
генотипы с аллелями G6 и P[9], тогда как генотипы G1P[4] и G9P[4] не
выявлены, что характеризует их как экзотические для Московского региона.
8
4. Динамическое равновесие доминирующих генотипов G4P[8] и G1P[8]
резидентных штаммов, аллелофонд, и другие характеристики исследованного
генофонда метапопуляции ротавирусов, позволяют прогнозировать высокую
эффективность рекомендованных ВОЗ вакцин (с учетом их состава) в
условиях Московского региона.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов обеспечена применением современной методологической базы
молекулярной
фактических
вирусологии
данных
и
эпидемиологии.
настоящего
Результаты
исследования
не
анализа
противоречат
современным теоретическим положениям и опубликованным данным других
исследователей. Материалы диссертационной работы представлены на Х
съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов,
микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения
эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (г.
Москва,
2012),
Всероссийской
научно-практической
конференции
с
международным участием «Молекулярная диагностика» (г. Москва, 2014),
VII ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням с
международным участием (г. Москва, 2015).
Апробация диссертации состоялась 1 июля 2015 г. на научной
конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе ФГБНУ НИИВС
им. И.И. Мечникова.
Публикации результатов исследования. По материалам диссертации
опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах,
рекомендованных
ВАК,
и
3
тезисов
в
сборниках
российских
и
международных конгрессов и конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 179
страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 49
рисунками.
Работа
состоит
из
введения,
обзора
литературы,
9
экспериментальной части (материалы и методы, результаты исследования,
обсуждение результатов исследования), выводов, списка литературы,
содержащего 220 источников, включая 40 отечественных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В
работе
представленная
использована
в
виде
лабораторная
10%-х
коллекция
копроэкстрактов,
с
препаратов,
подтвержденным
видоспецифической ПЦР содержанием маркерного локуса 6–го сегмента
ротавирусного генома. Проанализировано 230 клинических проб от детей
возрастом 1-6 лет с симптомами ОКИ, проходивших стационарное лечение в
клинических учреждениях на территории г.Москва и Московской области в
период с 2009 по 2014 г. включительно. В качестве отрицательных контролей
использованы первично охарактеризованные методом ИФА на содержание
ротавирусов группы В фекальные образцы поросят, а также 10%-е
копроэкстракты от здоровых детей, с установленным отсутствием антигенов
и РНК ротавирусов методами ИФА и ПЦР. Репрезентативность получаемых
в исследовании данных обеспечивалась соблюдением принципов метода
случайного
отбора,
информативности
рекомендаций
лабораторных
правил
тестов
оценки
(ГОСТ
Р
клинической
53022.3-2008),
методических указаний РФ и ВОЗ.
Определение таксон-специфических локусов, подбор праймеров и
зондов для ПЦР проводилось анализом множественных выравниваний
последовательностей
генов,
соответствующих
искомому
генотипу
(программа Align X, метод Kimura, Takaguchi 1980). Решение принималось
по суммарной согласованности результатов, полученных с помощью онлайнпрограммы «Rota C», с учетом рекомендаций международной рабочей
группы по таксономии ротавирусов (RCWG), а также собственных расчетов
(метод «ветвей и границ», алгоритм Литтла или «исключения подциклов»).
10
Проектирование пар праймеров и зондов, специфичных аллелям генов
ротавирусов группы А, выполнялось с учетом вероятных контаминантов.
В работе были использованы коммерческие препараты ферментов,
солей, кислот, щелочей, моносахаров и полисахаридов, а также другие
реактивы фирм: «Promega» (США), «Sigma-Aldrich» (США), «Amresco»
(США),
«Fermentas»
(Литва),
НПО
«СибЭнзим»
(Россия),
«Merck»
(Германия), «Serva» (Германия) и другие.
Для выделения геномной РНК ротавирусов были использованы
коммерческие наборы реактивов фирм «Qiagen» («QIAmpViral RNA minikit»)
Германия, («ZymoResearch» «ZR Viral RNA Kit™») США, «Магно-Сорб»
(ООО «ИнтерЛабСервис») Россия. Работы выполнялись как непосредственно
исполнителем с помощью стандартного набора приборов и инструментов,
предусмотренных в рекомендациях и инструкциях, так и с помощью
роботизированной рабочей станции (модель «Xiril AG», Швейцария).
Реакции обратной транскрипции (ОТ), ПЦР–РВ и МП–ПЦР–РВ проводились
с помощью наборов «ОТ-1» и «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦРРВ» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно рекомендациям производителя
наборов, ПЦР и ОТ на приборах «Терцик», ПЦР–РВ и МП–ПЦР–РВ на АНК32 и ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия), а также с использованием
лабораторных модификаций известных методов и протоколов. Праймеры, а
также зонды с флуоресцентными метками для ПЦР–РВ (R6G, ROX)
синтезированы по индивидуальному заказу в ЗАО «Синтол» (Россия).
Для анализа и оценки эпидемиологической ситуации в регионе были
использованы данные эпидемиологического надзора за РВИ, представленные
в документах государственного статистического учета заболеваемости в РФ
за 2009-2013 г.г. «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях»
(форма
№2).
Для
определения
последовательностей
нуклеотидов
ротавирусных геномов применялось секвенирование по методу Сэнгера на
11
приборах CEQ 8000 «Beckman Сoulter» (США), ABI Prism 3100 «Applied
Biosystems»
(США)
соответствующих
и
др.,
с
рекомендациям
использованием
наборов
реактивов
Для
снижения
производителей.
субъективного влияния исследователя, «ошибок оператора» и выявления
ошибок
полимеразы,
применялся
принцип
повторности
(≥3х),
при
необходимости выполняемый в лабораториях независимых друг от друга
профильных организаций.
Определение таксономического положения по сиквенсам 4-го, 6-го и 9го сегментов исследованных образцов, проводилось BLAST-анализом в базах
данных NCBI сети INSDC, инструментами автоматического генотипирования
ротавирусов группы А онлайн-ресурса «Rota C» (Лёвенский университет,
Бельгия), а также по методике, приведенной в «Руководство по детекции и
характеристике ротавирусов ВОЗ», (WHO/V&B/02.15) на основе МП-ПЦР с
электрофоретической
детекцией.
Филогенетические
отношения
исследованных штаммов между собой и внутри группы А ротавирусов,
проводимые по множественным выравниваниям сиквенсов, определялись их
реконструкцией с помощью построений кладо и дендрограмм методами:
"максимальной экономии" (maximum parsimony), «объединения соседей»
(Neighbor-joining method), «складного ножа» (jackknife), UPGMA и др. Выбор
алгоритмов филогенетических построений заложенных в использовавшихся
программах (VNTI, MEGA, DNAstar и др.) осуществлялся по критерию
соответствия
принципам
«наибольшего
правдоподобия»
(Maximum
Likelihood, ML) и минимальных затрат. Надежность внутренних узлов древ
оценивалась
с
помощью
альтернативных древ.
«бутстреп»-анализа
путем
построения
500
12
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оптимизация условий определения генетических характеристик и
разработка лабораторной тест-системы генотипирования исследуемых
штаммов ротавирусов.
Учитывая особенности изучаемого объекта, весь ход исследований
подразделялся на параллельное решение двух основных взаимосвязанных
групп задач:
– разработка системного подхода (критерии и методы) к определению
генетических
характеристик
ротавирусов,
отвечающего
современным
требованиям;
– генетическая характеристика штаммов, циркулирующих в Московском
регионе, по ключевым параметрам.
По результатам проведенного в исследовании анализа на основе данных
Госстатучета (форма №2) за 2012-2013гг., установлено что г.Москва может
быть отнесен к регионам со средними уровнями заболеваемости РВИ, а
Московская область – к территориям с относительно низким уровнем
заболеваемости, приходящимся главным образом на детей до 5 лет.
Коллекция клинических образцов, сформированная с соблюдением правил и
норм,
предусмотренных
исследования.
В
в
результате
нормативных
анализа
актах,
соответствует
опубликованных
данных
цели
для
определения основных генетических характеристик ротавирусов выбраны
гены белков VР7 и VР4. Известно, что 5 комбинаций G/P генотипов (G1P[8],
G2P[4], G3P[8], G4P[8] и G9P[8]) ответственны более чем за 90% всех
случаев ротавирусных заболеваний. Учитывая современное состояние
технологической и методической базы, была разработана лабораторная
экспериментальная тест–система генотипирования ротавирусов группы А на
основе метода МП–ПЦР–РВ, как наиболее отвечающая целям исследования
по сумме показателей. При конструировании тест-системы были определены
13
таксон-специфические локусы аллелей: G1, G2, G3, G4, G9, P[4], P[6], P[8], а
также аллелей I1 и I2 гена VP6 в качестве внутреннего положительного
контроля принадлежности ротавирусов группе А.
При выделении ротавирусной РНК из копроэкстратов оптимальные
результаты были достигнуты набором реагентов «Магно-Сорб» (ООО
«ИнтерЛабСервис»,
Россия),
в
сочетании
с
качеством
и
производительностью выполняемых операций роботизированной рабочей
станцией «Robotic Workstations» («Xiril AG» Швейцария), алгоритм «Lirix 3».
С учетом известных генетических особенностей ротавирусов, и на
основе корреляций между серотипами, нуклеотидными и аминокислотными
последовательностями
были
разработаны
10
генотип-специфичных
подсистем (пары праймеров и зонды) для определения G, Р и I вариантов
соответствующих генов с помощью метода моноспецифической ПЦР – РВ.
Для
определения
оптимальных
параметров
проведения
ПЦР-РВ,
и
сравнительного анализа с вариантами проведения МП–ПЦР–РВ, на
ограниченной выборке были опробованы различные наборы реагентов и
протоколы постановки ОТ и ПЦР–РВ. Сравнивались результаты постановки
ПЦР–РВ в моноспецифическом и мультиплексном вариантах при прочих
одинаковых
условиях.
Оценка
эффективности
течения
реакций
осуществлялась по значениям пороговых циклов и электрофоретическим
контролем размеров и концентрации ПЦР–продуктов. Оптимальный состав
реакционных смесей и режимов амплификации достигнут подбором
соотношений реагентов в МП–ПЦР–РВ смесях. Серией проведенных
экспериментов влияния конкуренции на течение мультиплексной ПЦР–РВ в
значимых величинах не отмечено. Состав лабораторной, экспериментальной
МП–ПЦР–РВ
тест-системы
приведен в таблице 1.
генотипирования
ротавирусов
группы
А
14
Таблица 1. Комбинации (аллелей) дифференциально выявляемых 10
вариантов генов ротавирусов в 5-и реакционных смесях для
мультиплексной ПЦР-РВ
Реакционные
смеси
Зонд
с флуорофором
Q1
Номер смеси и выявляемые варианты генов
(ожидаемый размер ампликона в н.п.)
Q2
Q3
Q4
Q5
G1, P[4]
G2, P[6]
G3, P[8]
G4, I1
G9, I2
ROX
G1 (127)
G2 (208)
G3 (188)
G4 (133)
G9 (197)
R6G
P[4] (152)
(P6] (99)
P[8](227/)
I1 (116)
I2(197/270)
Обозначения: Q – реакционная смесь с соответствующим номером, в круглых скобках
указаны расчетные размеры ампликонов, знаком (/) разделены альтернативные продукты
ПЦР в реакционных смесях, где один из вариантов генов детектируется двумя парами
праймеров, вследствие вырожденности генного кода.
Для оценки эффективности работы МП–ПЦР–РВ тест системы было
проведено выборочное секвенирование исследуемых изолятов ротавирусов.
В
качестве
исследуемой
более
эффективной
ДНК
клонированием
альтернативы
в
методам
бактериальных
накопления
системах
была
разработана лабораторная методика накопления ДНК для секвенирования,
сочетающая несколько вариантов (с «выступающими» и «вложенными»
праймерами) метода ПЦР (2х раундная ПЦР (без учета ОТ)). Пары
праймеров
подбирались
по
принципу
перекрывающихся
последовательностей ампликонов. В результате работ по локус-типированию
секвенированием были определены 44 нуклеотидные последовательности
генов G и P из 35 изолятов ротавирусов Московского региона, периода 20092014гг., которые депонированы в базе данных GenBank (NCBI) под
идентификационными
номерами:
с
КТ000090.1
по
КТ000133.1
включительно.
В условиях отсутствия доступных наборов реагентов была разработана
система
положительных
контролей
генотипирования
на
основе
охарактеризованных (включая сиквенс-типирование) образцов лабораторной
коллекции диких штаммов ротавирусов
15
Рисунок 1. Реконструкция филогенетических связей секвенированных фрагментов
кодирующей области 9-го генного сегмента. Приведена кладограмма исследованных
штаммов ротавирусов, полученная ML методом. Стрелками обозначены штаммы,
принятые в качестве референсных, последовательности которых представлены в базе
данных GenBank NCBI.
Множественными сравнениями с последовательностями штаммов с
установленными свойствами из международных баз данных, с помощью вебресурсов BLAST и «RotaC», определены величины гомологии и установлены
точные
таксономические
положения
секвенированных
штаммов.
Подтверждение результатов, получено реконструкцией филогенетических
16
отношений, установленных по сиквенсам локусов геномов штаммов,
полученных в ходе исследования и референсных (рисунок 1, 2).
Рисунок 2. Реконструкция филогенетических связей секвенированных фрагментов
кодирующей области 4-го генного сегмента использованных в исследовании
штаммов ротавирусов. Приведена кладограмма исследованных штаммов ротавирусов,
полученная ML методом. Стрелками обозначены штаммы, принятые в качестве
референсных, последовательности которых представлены в базе данных GenBank NCBI.
Для
оценки
генотипирования
достоверности
методом
результатов
МП–ПЦР–РВ,
проведенного
определения
в
работе
соответствия
секвенированных образцов к использованию в качестве внутрилабораторных
эталонов сравнения, был проведен сравнительный анализ сопоставлением
данных,
полученных
тремя
разными
методическими
подходами
-
17
секвенирование, МП–ПЦР–РВ, и в качестве дополнительного референсметода
была
принята
методика
из
«Руководства
по
детекции
и
характеризации ротавирусов» (ВОЗ 2009г.) на основе мультиплексной ПЦР с
детекцией в агарозном геле. По результатам комплексных испытаний была
выбрана группа штаммов, принятых в качестве эталонных в рамках
исследования, как отвечающая предъявляемым требованиям. Для аллелей
генов P6 и I2, среди диких штаммов и внешних эталонов, материалов с
необходимыми
исходными
качествами
найдено
положительные ПЦР контроли для аллелей
не
было.
Поэтому
P6 и I2 изготовлены
олигонуклеотидным синтезом.
Определение генетической структуры ротавирусов группы А
Московского региона 2009-2014гг.
Анализом полученных в исследовании данных были определены
параметры
концентраций
наследственная
каждого
гетерогенность,
гена и
внутреннее
его
аллелей,
генетическое
постоянная
единство
и
динамическое равновесие которых определяют структурную организацию
популяций ротавирусов. Результаты оценки характера генотипов и частот их
распространения служат основой при определении генетического равновесия
или
динамичности
и
вариабельности,
которые
являются
важными
критериями оценки эпидемиологических и иммунологических характеристик
возбудителя. Высокие значения вариабельности затрудняют выработку
эффективного иммунного ответа, а сохранение равновесия исходной
генетической структуры на протяжении длительного ряда генераций
свойственно для панмикических популяций.
При определении аллелофонда к учету были приняты все случаи
выявленных в работе G и P аллелей, включая результаты как МП–ПЦР–РВ,
так и индикацию вариантов генов, в моноспецифической ПЦР и ПЦР–РВ
18
(таблица
№2).
Характер
частот
распространенности
аллелей
гена
гликопротеина, определяющего G тип, представлен доминирующими
аллелями G4 - 54% и G1 - 21%, а также слабо представленными аллелями G2
и G9 по 8%, и G3 - 9%, составляющими нестабильную (динамичную) часть
вариантов генов генофонда популяций ротавирусов, и периодически
находящихся под угрозой элиминации.
Таблица 2. Частотные характеристики встречаемости (%), G и P
аллелей в генофонде метапопуляции ротавирусов.
Эпидсезон
Ген Аллель
2008/2009
2009/2010
2010/2011
2011/2012
2012/2013
2013/2014
G
G1
G2
G3
G4
G9
23
16
23
38
0
18
0
9
70
3
21
0
17
62
0
29
6
0
53
12
12
8
2
53
25
26
17
2
48
7
P
P4
P8
8
92
4
96
6
94
6
94
6
94
20
80
Занимают стабильный уровень, но меньшую распространенность аллели
G1 и G2. Аллели G3 и G9 имеют в популяциях низкие частоты
встречаемости, с нестабильными позициями, периодически сменяя друг
друга в лидерстве низкого уровня и снижая свою численность до критически
малых величин. По критерию P наблюдается стабильное динамическое
равновесие двух аллелей с доминированием P[8] - 92% и находящаяся в
рецессивном состоянии P[4] - 8%. Единичные случаи выявления аллелей G6
и P[9] указывает на их практическое отсутствие в генофонде метапопуляции
ротавирусов, позволяя
экзотических,
не
отнести
оказывающих
эти случаи
заметного
к разряду редких
влияния
на
или
генофонд
метапопуляции и эпидемическую обстановку в регионе.
В целом, с учетом 6 случаев смешанной инфекции (с разными
вариантами гена G одновременно), варианты по критерию G выявлены в
19
91,4% исследованных проб (G1 - 18%, G2 - 10%, G3 - 11%, G4 - 52%, G9 - 9%
от выявленных). По критерию Р варианты гена (P[4] – 8%, P[8] – 92%) всего в
87,1% проб от исследованных. По критерию I1 выявлено 81,5%, I2 – 7,5% от
всех генотипированных образцов. Доля проб c генотипами неопределенными
по отдельным генам, составила для G – 8,6%, P – 12,9%, I–11%. В 6 пробах
биоматериала были выявлены одновременно 2 или 3 варианта одного и того
же гена ротавирусов (4 образца G1+G4+P[8], 1 образец – G2+G4+P[8]+P[4], 1
образец – G1+G3+G4+P[8]) - случаи смешанной инфекции, а также
единичные штаммы с редкими для региона аллелями. Таким образом,
генетический
потенциал
региональной
метапопуляции
ротавирусов
определяется как способный образовывать десять (10) генотипов (G1P[4],
G1P[8], G2P[4], G2P[8], G3P[4], G3P[8], G4P[4], G4P[8], G9P[4], G9P[8]) по
принятым в исследовании G и P критериям, что больше чем циркулирует в
существенных долях (количествах) в действительности (Таблица №3).
Таблица 3. Значения долей G/P генотипов за период обследования (%).
Эпидсезон
G2P[4]
G3P[4]
G4P[4]
Генотип
G1P[8] G2P[8]
G3P[8]
G4P[8]
G9P[8]
2008/2009
8
8
8
17
17
25
17
0
2009/2010
0
0
0
19
0
4
74
3
2010/2011
0
0
2
15
0
20
63
0
2011/2012
6
0
0
29
0
0
53
12
2012/2013
2
0
0
12
5
2
48
31
2013/2014
14
0
5
26
9
2
39
5
сводные
данные 20085
2
3
18
5
9
49
9
2014гг.
Приведены усредненные данные (округленные до целых) распространенности в % G/P
генотипов в метапопуляции ротавирусов Московского региона.
При определении характеристик генофонда метапопуляции ротавирусов
по составу циркулирующих в регионе G/P генотипов к учету принимались
пробы с положительным результатом МП–ПЦР–РВ генотипирования по
обоим критериям теста. Из 8 выявленных генотипов по G/P критериям,
стабильно доминируют штаммы с генотипом G4P[8] - 49%, и штаммы с
20
генотипом G1P[8] - 18%, составляя ядро генофонда региональной
метапопуляции ротавирусов. Штаммы с генотипами: G3P[8] и G9P[8] по 9%,
G2P[4] и G2P[8] по 5%, G4P[4] - 3% и G3P[4] - 2% присутствуют в
метапопуляции
показателями
эпизодически,
колебаний
с
экстремальными
численности,
составляя
(неустойчивыми)
рецессивную
часть
популяции.
При сравнении распределения частот генотипов во времени по
непараметрическому критерию различия – «G критерию», значения
доминирующих генотипов G1P[8] в 2014г. и G4P[8] в 2010, 2011, 2013,
2014гг. и рецессивного генотипа G9P[8] в 2013г., принимают экстремальные
значения для этого распределения. Долевой состав генотипов G1P[8] и
G4P[8], также включает периоды возрастания, достижения экстремально
высоких
значений
последующими
(относительно
спадами.
общего
Сопоставление
состава
этих
генотипов)
данных
с
позволяет
предполагать цикличность динамических процессов (колебаний долевого
состава генотипов G1P[8] и G4P[8]), а также существование подциклов для
рецессивного генотипа G9P[8], с их длительностью более 6 лет. Вместе с тем,
штаммы с комбинацией генетических аллелей G1P[4], G9P[4] не выявлены
ни в одной из анализируемых проб биоматериалов. Отсутствие среди
выявленных генотипов, штаммов с сочетаниями аллелей G1P[4] и G9P[4],
которые закономерно должны были бы образовываться в заметных долях,
свидетельствует о наличии в регионе элиминирующих или лимитирующих
факторов для этих генотипов.
Сравнительным анализом опубликованных данных по РФ и глобального
распределения генофондов популяций ротавирусов по данным ВОЗ 2010г,
проведенного в настоящем исследовании, показано, что характерным для
североамериканского континента является доминирование G1P[8] и G2P[4],
для стран Евросоюза G1P[8] и G4P[8] типов, для стран Ближнего Востока
G2P[4] со значительной частью нетипируемых штаммов. В европейской
21
части Российской Федерации в близкие периоды времени преобладают
G1P[8] и G4P[8] типы, что коррелирует с географической близостью со
странами ЕЭС. Доминирование G1P[8] и G4P[8] генотипов вероятно
обусловлено общими географическими условиями запада Евразии, также как
и близкие значения долей генотипа G4P[8], доминирующего в Московском
регионе и Нижнем Новгороде (2008-2009 гг.). Наблюдаемые отличия данных
по географически близким регионам РФ за 2005-2007, 2011-12, гг. и данных
по Омску и Омской области за 2005-2007 гг., а также территориально
удаленных Украины, Молдовы (2010-2011 гг.) и стран Евросоюза (2010 г.), от
результатов, полученных в настоящем исследовании (по Москве и
Московской области 2009-2014 гг.), коррелируют с временными и
географическими дистанциями.
Следует отметить, что при сопоставлении фактов: одновременной смены
позиций доминирования штаммов G4P[8] и G9P[8], изменений клинической
картины
в
стационарах
по
г.Москва,
снижения
показателя
зарегистрированной заболеваемости в г. Москва и на территориях РФ
разного масштаба, в течение 2013 г. в сравнении с 2012г. наблюдаются
общие тенденции (снижение заболеваемости у детей до 1 года, относительно
общего увеличения числа выявленных РВИ в 2013г. по сравнению с 2012г., в
целом по РФ и во всех возрастных группах). В частности в Центральном
федеральном
округе,
при
общем
подъеме,
зарегистрированная
заболеваемость детей до 1 года в 2013г. ниже чем в 2012г. Изменение
структуры генотипов ротавируса группы А с увеличением доли G9P[8] не
сопровождалось более тяжелым течением гастроэнтерита у пациентов,
госпитализированных в стационар. При этом, меньшая частота интоксикации
и кратность дефекаций, течение заболевания на фоне аномалий развития и
патологии ЖКТ могут свидетельствовать о меньшей вирулентности G9P[8],
что необходимо подтвердить, обследованиями большего числа пациентов,
22
включая наблюдающихся в амбулаторных условиях, и не доступными в
настоящем исследовании (Мескина Е.Р. принято в печать в 2015г.).
Таким образом, в результате проведенного исследования ротавирусы,
циркулирующие в Московском регионе в период 2009-2014 гг., можно
генетически охарактеризовать как панмиктическую, полиморфную по
признакам G и P метапопуляцию ротавирусов группы А, находящуюся в
динамически равновесном состоянии доминирующих аллелей I1, G4 и G1,
P[8] и P[4]. Генетическое ядро метапопуляции представлено генотипами
штаммов, с ассоциацией коадаптированных аллелей генов G4P[8] - 49% и
G1P[8] - 18%, постоянно удерживающими лидирующие позиции в общем
генофонде
ротавирусов
региона,
и
находящимися
в
динамическом
равновесии с признаками, определяющими их как резидентные. Штаммы
генотипов: G2P[4], G3P[4], G4P[4], G2P[8], G3P[8] и G9P[8] представлены в
метапопуляции эпизодически, в рецессивных долях и неравновесных
состояниях, что может означать их вероятную транзиторность в регионе.
Метапопуляция
ротавирусов
региона
в
период
наблюдения
имеет
полиморфный характер, состоящий из (8) восьми распространенных
генотипов
и
15%
нетипируемых
изолятов,
что
согласуется
со
среднестатистическими данными при проведении аналогичных исследований
по другим регионам мира.
ВЫВОДЫ
1.
Выявлены
маркерные
аллель–специфичные
диагностически
ценные локусы генов, кодирующих белки VP4, VP6, VP7 ротавирусов
человека группы А, характерных для европейской (центральной) части РФ.
2.
230
На примере экспериментальной тест–системы, испытанной на
пробах
биоматериала,
показаны
высокие
специфичность
и
эффективность использования метода МП–ПЦР–РВ для генотипирования
ротавирусов и перспективность разработки на его основе промышленного
23
образца тест–системы, не уступающей по своим качествам мультилокусному
сиквенс-типированию при мониторинговых и скрининговых исследованиях.
3.
Разработаны
методические
подходы
к
локус
сиквенс-
типированию ротавирусов диких штаммов из первичных образцов, минуя
стадию клонирования генетического материала в плазмидных векторах.
4.
Установлены
основные
параметры
структуры
генофондов
популяций циркулирующих в Московском регионе ротавирусов группы А
периода
2009-2014
гг.
Определено,
что
основные
генетические
характеристики генофондов ротавирусов группы А Московского региона
представлены аллелофондами: G1, G2, G3, G4, G9 с доминированием аллелей
G4 и G1; P[8] и P[4] с доминированием P[8]; I1 и I2 с доминированием I1
аллели. Выявлены рецессивные генотипы G2P[4], G3P[4], G4P[4], G2P[8],
G3P[8], G9P[8], и доминирующие G1P[8] и G4P[8], составляющие
генетическое ядро генофонда метапопуляции ротавирусов.
5.
Динамические
параметры
региональной
метапопуляции
ротавирусов с генотипами G1P[8] и G4P[8] в рассматриваемый период
времени соответствуют характеристикам резидентных штаммов, а также
имеют признаки цикличности изменений долевого состава циркулирующих
генотипов, периодичность которых превышает 6 лет.
6.
За период обследования выявлены единичные штаммы с редкими
для региона аллелями G6 и P[9], не входящими в состав применяемых
ротавирусных вакцин. Характерным признаком метапопуляции ротавирусов
Московского
региона
2009-2014гг.
является
отсутствие
штаммов
с
генотипами G1P[4] и G9P[4] среди выявленных, что позволяет отнести их к
экзотическим для этого региона.
24
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Бахтояров, Г.Н. Молекулярно-генетические аспекты биоразнообразия
локальных популяций ротавирусов // Санитарный врач. – 2014. - № 3. – С. 33-40.
2.
Оценка эффективности применения мультиплексной ПЦР в режиме
реального времени для генотипирования ротавирусов группы А / Г.Н. Бахтояров, И.С.
Киселев, В.В. Зверев, Е.Б. Файзулоев // Журнал микробиологии, эпидемиологии и
иммунобиологии. - 2014. - № 4. - С. 43-59.
3.
Определение
генетической
структуры
ротавирусов
группы
А,
циркулирующих в Московском регионе, методом ПЦР в режиме реального времени //
Г.Н. Бахтояров, С.А. Лободанов, А.А. Марова, Е.Р.
Мескина, В.В. Зверев, Е.Б.
Файзулоев // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2012. - № 6. – С. 35–39.
4.
Генотипирование ротавирусов группы А методом ПЦР с детекцией в
режиме реального времени // Г.Н. Бахтояров, А.А. Марова, С.А. Лободанов, В.В. Зверев,
Е.Б. Файзулоев // Материалы Х съезда Всероссийского научно-практического общества
эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения
эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации». – Москва, 12-13
апреля 2012. – Т. 2. – С. 241.
5.
Особенности структуры G[P]-генотипов ротавирусов, циркулирующих на
территории Московского региона / Е.Б. Файзулоев, В.В. Курносова, Г.Н. Бахтояров, И.С.
Киселев, Е.Р. Мескина, А.Ю. Ушакова, В.В. Зверев // Сборник трудов VIII Всероссийской
научно-практической
конференции
с
международным
участием
«Молекулярная
диагностика 2014». – Москва, 18-20 марта 2014. – Т. 1. - С. 360-361.
6.
Генетическая структура штаммов ротавирусов Московского региона в
период с 2009 по 2014 гг. / Г.Н. Бахтояров, Е.Б. Файзулоев, Н.Н. Филатов, А.В. Линок,
В.В. Курносова, В.В. Зверев // Материалы VII ежегодного Всероссийского конгресса по
инфекционным болезням с международным участием. – Москва, 30 марта – 1 апреля 2015.
– С. 37.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа