close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Эколого-физиологические особенности кровососущих и хищных пиявок (Hirudinea Hirudinidae)

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Черная Людмила Владимировна
ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КРОВОСОСУЩИХ
И ХИЩНЫХ ПИЯВОК (HIRUDINEA, HIRUDINIDAE)
03.02.08 – экология (биология)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Тюмень − 2015
1
Работа выполнена в лаборатории эволюционной экологии Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института экологии растений и
животных Уральского отделения РАН
Научный консультант:
доктор биологических наук, доцент
Ковальчук Людмила Ахметовна
Официальные оппоненты:
Романова Елена Михайловна,
доктор биологических наук, профессор,
заслуженный работник высшей школы РФ,
зав. кафедрой биологии, ветеринарной
генетики, паразитологии и экологии
Ульяновской государственной
сельскохозяйственной академии
им. П.А. Столыпина
Гашев Сергей Николаевич,
доктор биологических наук, профессор,
зав. кафедрой зоологии и эволюционной
экологии животных
Тюменского государственного университета
Тряпицына Галина Александровна,
доктор биологических наук,
профессор кафедры радиационной биологии
Челябинского государственного
университета
Ведущая организация:
Оренбургский государственный университет
Защита диссертации состоится «24» июня 2015 г. в 10-00 час. на заседании
диссертационного совета Д 220.064.02 при Государственном аграрном университете
Северного Зауралья по адресу: 625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7; тел./факс:
(3452) 46-87-77; e-mail: disstgsha@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГАУ Северного Зауралья и на
сайте университета http://www.tsaa.ru
Автореферат разослан «____» апреля 2015 г.
Ученый секретарь
Литвиненко
диссертационного совета _______________________ Наталья Владимировна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Оценка устойчивости организмов в изменяющихся
условиях среды, их адаптации к экологическим факторам остается одной из
центральных проблем биологии (Большаков, 1972; Одум, 1975; Шварц, 1980; Федоров,
Гильманов, 1980; Слоним, 1982; Соромотин, 1991; Тимофеев-Ресовский, 1996; Озернюк,
2004; Шибкова, Аклеев, 2006; Ковальчук, 2008; Северцов, 2008; Вершинин, 2009;
Романова, Спирина, 2010; Алехина и др., 2010; Голованова, 2011; Пряхин и др., 2012;
Литвиненко и др., 2013). Особое внимание уделяется исследованию адаптационнокомпенсаторных механизмов, формирующихся при сочетанном влиянии природных и
антропогенных факторов, поскольку прогрессирующее загрязнение экосистем
токсикантами, в том числе тяжелыми металлами, оказывает на них воздействие,
сопоставимое с естественными изменениями среды обитания (климатические
особенности, сезонные колебания температуры, трофическая обеспеченность и др.), а
зачастую превосходит их (Филенко, 1988; Леонова, 2004; Немова, Высоцкая, 2004;
Петухова, 2005; Северцова, Северцов, 2007; Моисеенко, 2009; Большаков, Моисеенко,
2009; Яковлев и др., 2012; Гашев, Моисеенко, 2012; Микшевич, Ковальчук, 2014).
Несомненна актуальность исследований, направленных на поиск и установление
взаимосвязи между особенностями механизмов адаптации животных к стрессирующим
факторам среды и эколого-физиологическими характеристиками отдельных видов. Все
это в полной мере относится и к гидробионтам.
Научный интерес представляют экологически контрастные группы гидробионтов,
интегрирующие негативные эффекты экстремальных природных и антропогенных
воздействий, и используемые в качестве индикаторов состояния водных экосистем
(Hochachka, Somero, 2002; Яковлев, 2002; Цветков, 2009; Тимофеев, 2010; Данилин,
2010; Черкесова, 2013). К числу таких организмов относятся представители бентосной
фауны – пиявки (Hirudinea), характеризующиеся многообразием жизненных форм и
стратегий и зачастую являющиеся модельными объектами научных исследований
(Petrauskiene, 2003; Siddal et all., 2007; Utevsky et al., 2009; Kazlauskine et al., 2010;
Романова, Климина, 2009; 2010; Kaygorodova, 2012).
Наиболее изученные виды класса Hirudinea – медицинские пиявки (Hirudo)
принадлежат к семейству Hirudinidae Whitman, 1886 (челюстные или гирудиниды),
являются гематофагами, довольно чувствительны к химическим загрязнениям и
представляют практическую ценность для медицины, ветеринарии, фармацевтики и
косметологии (Баскова, Исаханян, 2004; Каменев, Барановский, 2006; Рассадина, 2006;
Никонов, 2007). К настоящему времени медицинские пиявки находятся под угрозой
исчезновения, что обусловлено браконьерским отловом их из природных водоемов и
усиливающейся антропогенной нагрузкой на пресноводные экосистемы (Кустов и др.,
2005; Каменев, 2007; Elliot, Kutschera, 2011). В силу указанных причин, для лечебных
целей медицинских пиявок выращивают в контролируемых условиях на биофабриках,
используя технологию ускоренного роста и развития, разработанную профессором МГУ
Г.Г. Щеголевым с сотрудниками (Синева, 1944; Щеголев, Федорова, 1955). Несмотря на
достаточную изученность биологии развития медицинских пиявок и их целебных
свойств, практически без внимания остается вопрос об их эколого-физиологических
3
особенностях, как в естественной среде обитания, так и в искусственно созданных
условиях.
Еще один вид гирудинид, привлекающий внимание исследователей – большая
ложноконская пиявка Haemopis sanguisuga (Linnaeus, 1758), которая, в отличие от
медицинских пиявок, является хищником, обладает более широким ареалом и
достаточно высокой резистентностью к экотоксикантам (Лукин, 1976; Флеров, 1989).
Несмотря на имеющийся большой фактический материал по биологии челюстных
пиявок, они остаются специфической и наименее изученной группой водных
беспозвоночных в плане их способности к поддержанию гомеостаза и формированию
адаптивных стратегий к стресс-факторам различного генеза. До настоящего времени
проблема влияния экстремальных природных и антропогенных факторов на обменные
процессы экологически и физиологически контрастных видов и групп пиявок
систематически не исследовалась. Вместе с тем трофическая и видовая специфика
пиявок, а также экологические особенности обитания могут существенно сказываться на
их физиологическом статусе. Известно, что в экстремальных условиях среды в
организме животных активизируются механизмы аварийного регулирования систем
поддержания гомеостаза и усиливаются затраты важнейших биологически активных
соединений, в том числе эссенциальных микроэлементов (МЭ) и свободных
аминокислот (АК) (Prasad, 1979; Eichhorn, 1984; Schrauser, 1994; Агаджанян, Скальный,
2001; Каранова, 2006; Ковальчук, 2008; Оберлис и др., 2008; Нохрина, 2010; Нотова и
др., 2011; Морузи и др., 2012; Лебедев и др., 2013; Скальный и др., 2014). Учитывая
ключевую роль биогенных МЭ и свободных АК в регуляции основных метаболических
процессов, оценка физиологического состояния гирудинид с позиции оптимального
микроэлементного и аминокислотного баланса в их организме, наблюдаемого в
нативных условиях среды, позволит выявить их адаптивные возможности при
воздействии экстремальных факторов.
Цель диссертационной работы: изучение эколого-физиологических особенностей
кровососущих и хищных пиявок в естественных условиях и при действии
экстремальных факторов (в природе и в лабораторном эксперименте).
Задачи исследования:
1. Определить видовые, трофические и популяционные особенности
микроэлементного и аминокислотного состава тканей кровососущих (Hirudo medicinalis
Linnaeus, 1758 и H. verbana Carena, 1820) и хищных (Haemopis sanguisuga Linnaeus,
1758) пиявок.
2. Исследовать характер сезонной динамики биологически активных металлов и
свободных аминокислот в тканях хищных и кровососущих гирудинид.
3. Изучить возрастные особенности биоэлементной структуры тканей хищных и
кровососущих гирудинид различных эколого-физиологических групп.
4. Исследовать специфику микроэлементного и аминокислотного метаболизма
хищных пиявок H. sanguisuga, обитающих в водных экосистемах с высокой
антропогенной
нагрузкой
и
подверженных
персистентному
воздействию
экотоксикантов.
5. Оценить влияние искусственно созданных условий разведения биофабрики на
микроэлементный и аминокислотный обмен медицинских пиявок.
4
6. Экспериментально изучить влияние хронического голодания на состояние
минерального и азотистого обменов H. sanguisuga и H. verbana различных экологофизиологических групп.
7. В модельном эксперименте провести сравнительный анализ хронического
воздействия тяжелых металлов на динамику их накопления и состояние
аминокислотного пула в тканях медицинских пиявок H. verbana из природных
популяций и выращенных на биофабрике и хищной пиявки H. sanguisuga.
Научная новизна. Впервые на единой методологической основе проведены
комплексные натурные и лабораторные исследования микроэлементного и
аминокислотного обменов пиявок, принадлежащих к одному семейству, но
отличающихся, как трофической спецификой (хищники и кровососы), так и
особенностями роста и развития (природные водоемы и биофабрики). Исследована
видовая, трофическая, географическая, сезонная и возрастная изменчивость
микроэлементного профиля и аминокислотного спектра тканей хищных и кровососущих
гирудинид. Установлено влияние антропогенных факторов на формирование
микроэлементного спектра и аминокислотного пула в биосредах H. sanguisuga, H.
medicinalis и H. verbana. У медицинских пиявок выявлена барьерная функция слюнных
желез и депонирующая роль тканей по отношению к экотоксикантам, что обеспечивает
содержание последних на уровне сотых и тысячных долей процента в секрете слюнных
желез. Показано негативное влияние хронического голодания и токсической нагрузки на
микроэлементный и аминокислотный обмен больших ложноконских и медицинских
пиявок. Установлена регуляторная роль эссенциальных металлов и свободных
аминокислот в поддержании гомеостатических реакций организма пиявок при влиянии
экстремальных природных и антропогенных факторов.
Теоретическая значимость работы. Результаты исследований носят
фундаментальный характер и являются крупным вкладом в разработку теории
адаптации и механизмов аварийного регулирования в организме при сочетанном
воздействии экстремальных природных и антропогенных факторов среды обитания. На
основе полученных результатов сформулирована концепция участия микроэлементов и
свободных аминокислот в формировании адаптивных стратегий челюстных пиявок
экологически контрастных групп к экстремальным факторам среды и установлено
наличие когерентности между эссенциальными микроэлементами и свободными
аминокислотами.
Практическая значимость работы. Полученные нами данные по экологофизиологическим особенностям кровососущих и хищных гирудинид будут
использованы при решении ряда научно-прикладных задач. Определение фоновых
концентраций эссенциальных и токсичных микроэлементов в тканях хищных и
кровососущих гирудинид для различных регионов России, Украины и Казахстана
служит методической основой для научной организации экологического мониторинга
при использовании пиявок в качестве биоиндикаторов загрязнения водных объектов
тяжелыми металлами.
Результаты, полученные по видовым и региональным особенностям
биоэлементного спектра тканей H. medicinalis и H. verbana, выращенных на
биофабриках России, планируется использовать в гирудофармакотерапии и
5
косметологии для направленного подбора приоритетных МЭ и АК с учетом их
специфических свойств. Оценка физиологических потребностей медицинских пиявок
H. verbana в эссенциальных МЭ и свободных АК на разных сроках роста и развития
позволяет оптимизировать технологию их разведения в искусственных условиях на
биофабриках. Для промышленного разведения медицинских пиявок с целью
использования гомогенатов их тканей практическое значение имеет установленный
нами оптимальный срок голодания, которому соответствуют максимальные тканевые
концентрации свободных АК, высокий уровень биофильных МЭ и пониженное
содержание экотоксикантов.
Результаты исследований внедрены в производственные процессы искусственного
выращивания медицинских пиявок на биофабриках «Международный центр
медицинской пиявки» (Московская область), «Гирудо-Мед.Юг» (Краснодарский край),
в практическую работу межведомственной лаборатории «Проблемы адаптации» (г.
Екатеринбург); используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре биологии и
медицинской генетики Уральской государственной медицинской академии г.
Екатеринбурга.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Биоэлементный состав тканей хищных и кровососущих гирудинид обусловлен
видовой, трофической и возрастной спецификой, сочетанным влиянием природных и
антропогенно-модифицированных факторов (климат, сезоны года, искусственные
условия разведения на биофабриках, голодание, токсическая нагрузка).
2. Стратегия приспособления медицинских пиявок к искусственно созданным
условиям разведения на биофабриках характеризуется как неспецифическая реакция,
обеспечивающая адаптивный статус в условиях длительного воздействия стрессфакторов различного генеза.
3. Тесная сопряженность микроэлементного и аминокислотного обменов,
участвующих в гомеостатических процессах организма, способствует формированию
адаптивных стратегий хищных и кровососущих гирудинид к воздействию
экстремальных факторов и обусловливает экологическую пластичность видов.
Апробация работы. Результаты диссертационного исследования представлены на
научных форумах: Всероссийские конференции молодых ученых ИЭРиЖ УрО РАН
(Екатеринбург, 2000-2010); 6-я Пущинская конференция молодых ученых «Биология –
наука 21 века» (Пущино, 2002); Международная конференция «Экологические
проблемы горных территорий» (Екатеринбург, 2002); Международная конференция
«Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, 2004); I и
III Съезды физиологов СНГ (Сочи, 2005; Ялта, 2011); Международные конференции
«Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006;
2011); Международные конференции «Горные экосистемы и их компоненты» (Нальчик,
2007; 2014); Международная конференция «Адаптация биологических систем к
естественным и экстремальным факторам среды» (Челябинск, 2008); Международные
симпозиумы «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2009; 2012);
Первые Международные Беккеровские чтения (Волгоград, 2010); XX-XXII Съезды
Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010; Волгоград,
6
2013); Международная конференция «Наука, природа и общество» (Миасс, 2010); IV
Международная конференция «Hirudinea: biology, taxonomy, faunistics» (Wierzba, Poland,
2011); III Международная научно-практическая конференция «Биоэлементы»
(Оренбург, 2011); Международная конференция «Сучаснi проблеми бiологii, екологii та
хiмii» (Запорожье, 2012); Х Международная Конференция Ассоциации гирудологов
(Харьков, 2012); IV и V Международные конгрессы Федерации европейских обществ по
изучению микроэлементов и минералов (FESTEM) «Trace Elements and Minerals in
Medicine and Biology» (Санкт-Петербург, 2010; Avignon, France, 2013); IV и V Съезды
физиологов Урала (Екатеринбург, 2009; 2014).
Декларация личного участия автора. Диссертационная работа является
обобщением 15-летних полевых и лабораторных исследований соискателя по изучению
эколого-физиологических особенностей представителей класса Hirudinea, что
обосновано научным направлением лаборатории эволюционной экологии ФГБУН
Института экологии растений и животных УрО РАН. Автором лично проведены все
этапы диссертационного исследования: постановка цели и задач; сбор биологического
материала; получение, обработка и анализ экспериментальных данных; систематизация
и интерпретация результатов; написание научных статей. Часть исследований выполнена
в соавторстве с к.б.н. Нохриной Е.С., что отражено в совместных публикациях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 90 работ, в том числе 18 статей в
рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 365 страницах и
включает введение, 8 глав, заключение, выводы, практические рекомендации,
библиографический список, 2 приложения со справками о внедрении результатов
исследования. Работа иллюстрирована 77 рисунками и 99 таблицами. Список
используемой литературы включает 607 работ, из них 199 – на иностранном языке.
Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность за оказанную помощь при сборе
и обработке биологического материала моим коллегам: к.б.н. Нохриной Е.С., к.б.н.
Ивановой Н.Л., к.б.н. Кузнецовой И.А., д.б.н. Утевскому С.Ю., М.Е. Гребенникову. Автор
глубоко признателен академику Большакову В.Н., д.б.н. Хохуткину И.М., д.б.н. Вершинину
В.Л., д.б.н. Гилеву А.В., к.б.н. Николаевой Н.В. за профессиональный интерес к моей
работе, и за их ценные советы при обсуждении результатов данного исследования.
Искреннюю признательность выражаю руководителям биофабрик: «Международный центр
медицинской пиявки» – д.б.н. Никонову Г.И., «Гирудо-Мед.Юг» – Н.Т. Казиеву,
«СибМедПиявка» – М.П. Дегунцу за предоставленный материал и многолетнее
сотрудничество. Я глубоко благодарна моему научному консультанту доктору
биологических наук Людмиле Ахметовне Ковальчук за общее руководство работой, за
повседневную неоценимую помощь при проведении исследований и обработке полученных
результатов, за ценные советы и критические замечания.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 Современное состояние проблемы (Литературный обзор)
Проведен аналитический обзор мировой литературы по изучаемой проблеме. Дана
сравнительная эколого-физиологическая характеристика хищных и кровососущих пиявок.
7
Освещены современные представления о биологических функциях эссенциальных и
токсичных МЭ и свободных АК и их гомеостатической роли в оптимальных условиях
среды и при экстремальных нагрузках.
Глава 2 Материалы и методы исследования
Общая характеристика экспериментального материала. В диссертацию
включены материалы многолетних (1999-2013 гг.) собственных натурных и
лабораторных исследований. В исследованиях использованы особи трех видов
челюстных пиявок: кровососущих Hirudo medicinalis (Linnaeus, 1758) и H. verbana
(Carena, 1820) различных физиологических групп (из природных популяций и
выращенных на биофабрике) и хищных Haemopis sanguisuga (Linnaeus, 1758). Пиявки
отловлены в 25-ти водных объектах Европейской и Азиатской частей России, Северного
Казахстана и Восточной Украины. Отлов проводили в литоральной зоне водных
объектов, в дневное время, с помощью гидробиологического сачка или вручную.
Выращенные медицинские пиявки приобретены: H. verbana – на биофабриках «ГирудоМед.Юг» (Краснодарский край), «Международный центр медицинской пиявки»
(«МЦМП», Московская область), «СибМедПиявка» (Алтайский край); H. medicinalis –
на производствах «ГирудИ.Н.» (Саратовская область) и «СибМедПиявка». Отлов и
содержание животных, доставленных в лабораторию, осуществляли в соответствии с
правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите животных, используемых
для экспериментальных и научных целей (Европейская конвенция …, 1986). Всего в
исследованиях использовано 1965 особей пиявок, в том числе: 140 особей H. medicinalis
(80 из природных популяций и 60 выращенных на биофабрике), 1105 – H. verbana (395
из природы и 710 выращенных), 720 – H. sanguisuga. Для оценки содержания ТМ в
среде обитания гирудинид в 24-х водных объектах проведен отбор донных отложений
(260 проб) из верхнего 10-см слоя дна на участках, где толщина водного слоя составляла
50-100 см.
При исследовании межвидовой и популяционной изменчивости микроэлементного
и аминокислотного обменов использованы пиявки из 13-ти водных объектов различных
регионов России, Украины и Казахстана, в 12-ти из которых отловлены особи H.
sanguisuga: оз. Горелое (Харьковская обл.1), р. Уды (Харьковская обл.2), оз. Глубокое
(Луганская обл.), р. Лесной Воронеж (Тамбовская обл.), ерик Судомойка (Волгоградская
обл.), р. Челбас (Краснодарский край), р. Бобровка (Свердловская обл.1), р. Сысерть
(Свердловская обл.2), оз. Еловое (Челябинская обл.), оз. Дамба (Алтайский край 1), р.
Нура (Акмолинская обл.1), оз. Боровое (Акмолинская обл. 2); в 6-ти – H. medicinalis: оз.
Горелое, р. Уды, оз. Глубокое, р. Лесной Воронеж, оз. Дамба и р. Тогул (Алтайский край
2); в 3-х – H. verbana: оз. Горелое, ерик Судомойка, р. Челбас. Степень биологической
аккумуляции ТМ гирудинидами оценивали коэффициентами биологического
накопления (КБН), рассчитанными как отношение тканевых концентраций МЭ к их
концентрациям в донных отложениях. При сравнительном анализе биоэлементного
спектра тканей H. medicinalis и H. sanguisuga, обитающих в водных экосистемах
различных климатогеографических зон, использовали термины европейские (регионы
8
восточной части Украины и европейской территории России) и азиатские (регионы
Урала, Сибири и северной части Казахстана) формы (экотипы).
Сезонную и возрастную изменчивость содержания в тканях гирудинид МЭ и
свободных АК, а также влияние хронического голодания (в течение 7 месяцев у
гематофагов и 5 месяцев у хищников) на обменные процессы изучали с использованием
особей H. verbana, отловленных в р. Челбас (Краснодарский край) и H. sanguisuga из
водохранилища Белоярское (Свердловская обл.).
Для исследования микроэлементного и аминокислотного обменов на разных этапах
развития и роста H. verbana («нитчатки», вышедшие из коконов, и пиявки в возрасте 1,
3, 5, 7 и 9 месяцев) последние были предоставлены администрацией биофабрики
«МЦМП». Секрет слюнных желез отбирали у взрослых особей H. verbana, выращенных
на биофабрике «МЦМП» и у пиявок этого же вида из природных популяций
Краснодарского края, доставленных на данное производство для размножения. Влияние
хронического голодания (в течение 3, 5, 7 и 12 месяцев) на динамику содержания
эссенциальных и токсичных МЭ и свободных АК в тканях H. verbana исследовали у
особей, выращенных на предприятии «Гирудо-Мед.Юг».
При изучении влияния антропогенного загрязнения на формирование
микроэлементного профиля и аминокислотного спектра в тканях пиявок использованы
взрослые особи H. sanguisuga из 11-ти водных объектов Уральского региона,
расположенных, как на ненарушенных антропогеном фоновых территориях
(Ильменский государственный заповедник (оз. Большой Таткуль и оз. Б. Миассово),
Висимский биосферный заповедник (р. Сулем и вдхр. Сулемское), Нижне-Сергинский
р-н Свердловской обл. (р. Бардым)), так и в зоне действия металлургических,
горнодобывающих, металлообрабатывающих, химических предприятий (в черте
промышленных городов: Миасс (оз. Ильменское), Екатеринбург (оз. Шарташ и р.
Исеть), Верхний Тагил (р. Тагил), Нижние Серьги (вдхр. Нижнесергинское),
Краснотурьинск (р. Турья)).
В токсикологическом эксперименте использовали взрослых особей H. sanguisuga и
H. verbana из природных популяций (р. Челбас, Краснодарский край) и пиявок H.
verbana, выращенных на биофабрике («Гирудо-Мед.Юг», Краснодарский край).
Методика отбора секрета слюнных желез (ССЖ) медицинских пиявок. ССЖ
получали по общепринятой методике: для стимуляции слюноотделения на головной
конец зафиксированной пиявки клали кристаллики хлористого натрия и по истечении 12 мин. вводили в ротовую полость силиконированную пипетку, содержащую
физиологический раствор, и отсасывали секрет, повторяя процедуру несколько раз
(Патент…, 1995).
Методика проведения токсикологического эксперимента. Содержания ТМ и
свободных АК в тканях экспериментальных особей пиявок оценивали на 7-е, 14-е и 21-е
сутки экспозиции их в водных растворах экстремально высоких концентраций ТМ и их
смеси (сТМ): Cu (0.05 мг/л), Zn (0.5 мг/л), Cd (0.025 мг/л), Pb (0.03 мг/л). Рассчитывали
коэффициент накопления (КН) – соотношение концентраций ТМ, аккумулированных
тканями пиявок в опыте к их исходным (контрольным) тканевым концентрациям.
9
Методика определения микроэлементов. Концентрации Cu, Zn, Fe, Mn, Ni, Cd, Pb
в тканях и ССЖ пиявок и в донных отложениях водных объектов определяли методом
атомной абсорбции на спектрофотометре AAS-3 в пламени пропан-бутан и на приборе
Analist-100 фирмы Perkin Elmer (Хавезов, Цалев, 1983; Никаноров, Жулидов, 1991;
Майстренко и др. 1996; Другов, Родин, 2009). В биосубстратах выращенных особей H.
verbana дополнительно определяли содержание Ca, Mg, Co, Sr. Пробы донных
отложений и кожно-мышечной ткани пиявок готовили способом мокрой минерализации
в смеси азотной (HNO3) и хлорной (HСlO4) кислот (Никаноров и др., 1985).
Концентрацию МЭ выражали в мкг/г (сухой или сырой массы), мкг/100мл.
Подготовлено 1010 проб, проведено 6665 элементо-определений.
Анализ аминокислотного состава кожно-мышечной ткани и ССЖ пиявок. Пул
свободных аминокислот в биосредах пиявок определяли методом ионообменной
хроматографии (Козаренко, 1975) с помощью автоматического анализатора
аминокислот ААА-339М (Микротехна, Чехия). Концентрацию свободных АК выражали
в мкмоль/100г, в мкмоль/100мл и в % от суммарного содержания. Подготовлено 747
биопроб, выполнено 16440 элементо-определений.
Экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета лицензионных
прикладных программ «Microsoft Excel 2003» и «Statistica v. 6.0.» (StatSoft, Ink., 19842001). Для расчета статистически значимых различий между группами применены Uкритерий Манна-Уитни, H-критерий Краскела-Уоллеса, F-критерий Фишера (ANOVA).
Для оценки взаимозависимости использовали ранговый корреляционный анализ
Спирмена (rS), сходство биоэлементных спектров тканей оценивали посредством
кластерного анализа. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05; p < 0.01 0.0001.
Глава 3 Межвидовые и внутривидовые особенности биоэлементного
спектра тканей кровососущих и хищных пиявок, обитающих в водных
экосистемах естественных ландшафтов
Межвидовые особенности биоэлементного спектра тканей H. sanguisuga, H.
medicinalis и H. verbana изучали на примере пиявок, отловленных в озере Горелое
(Харьковская обл. 1) – единственном водоеме, где нами была отмечена исключительно
редкая синтопия двух видов медицинских пиявок.
Обнаружено, что ткани большой ложноконской пиявки (БЛП), в сравнении с
медицинскими пиявками (МП), содержат существенно больше Cu, Zn, Mn, Pb, но
значимо меньше Fe, Cd, Ni (p < 0.05), что обусловлено, в первую очередь, трофической
специализацией изучаемых видов гирудинид (рис. 1). Вместе с тем и у кровососущих
пиявок выявлены межвидовые различия: в тканях H. verbana, в сравнении с H.
medicinalis, содержится существенно больше Zn, Fe, Cd (p < 0.05), отмечены тенденции
к повышенному содержанию Ni, Pb и к пониженному – Cu (p > 0.05) (рис. 1) (Черная и
др., 2012).
10
мкг/г
H. medicinalis
H.verbana
H. sanguisuga
60
Рисунок 1 – Видовая и
трофическая специфика
микроэлементного спектра
тканей H. sanguisuga,
H. medicinalis, H. verbana
(оз. Горелое, Харьковская обл.1)
40
20
Условные обозначения:
концентрации МЭ: * уменьшены в
10 раз, ** – в 100 раз;
*** - увеличены в 10 раз
0
Cu
Zn*
Mn
Fe** Cd***
Pb
Ni
В ходе дальнейших исследований было установлено, что выявленная нами
трофическая специфика микроэлементной структуры тканей хищных и кровососущих
гирудинид в целом сохраняется на биотопическом уровне (во всех случаях совместного
обитания пиявок H. sanguisuga с H. medicinalis или с H. verbana).
Показано, что для изучаемых видов гирудинид различных географических
популяций характерен широкий диапазон тканевых концентраций всех исследуемых
МЭ, что указывает на определяющую роль экологических факторов в формировании
микроэлементного профиля их тканей. Наибольшая дисперсия тканевых концентраций
отмечена: у H. verbana – для Mn, Fe, Ni, Cd (H2; 30 > 21.0; p = 0.0000); у европейской
формы H. medicinalis – для Fe, Ni, Cd (H3; 40 > 36.0; p = 0.0000), у азиатской H. medicinalis
– для Zn, Fe, Ni, Pb (H1; 20 > 14.2; p = 0.0002); у европейского экотипа H. sanguisuga – для
Fe, Cd, Ni (H5; 60 > 54.0; p = 0.0000), у азиатской формы H. sanguisuga – для Fe, Ni, Zn (H4;
50 > 44.0; p = 0.0000). Общей закономерностью для кровососущих и хищных гирудинид
является высокая степень эколого-географической изменчивости тканевых
концентраций Fe и Ni.
Обнаружено, что, независимо от видовой и биотопической принадлежности,
изучаемые гирудиниды проявляют наибольшую аккумуляционную активность к Zn (КБН
> 2) и наименьшую – к Fe и Mn (КБН < 1); хищные пиявки H. sanguisuga во всех
водоемах и водотоках являются макроконцентраторами по отношению к Cu, а
гематофаги H. verbana – к Cd и Pb (КБН > 2) (табл. 1).
У азиатского экотипа H. medicinalis, обитающего в неблагоприятных
климатических условиях (короткий безморозный период, суровые зимы, глубокое
промерзание грунта), показатели КБН всех изучаемых МЭ, за исключением Cd, в целом
ниже, чем у европейских особей этого же вида. Отмечена пониженная кумулятивная
активность к Cu, Zn, Mn и у азиатской формы H. sanguisuga (табл. 1). Необходимо
отметить тенденцию к изменению баланса микроэлементного обмена у кровососущих и
хищных гирудинид в условиях слабого загрязнения водных экосистем тяжелыми
металлами. В тканях особей H. sanguisuga, H. medicinalis и H. verbana, населяющих
водные объекты некоторых промышленных регионов (Акмолинская 1, Волгоградская,
Луганская области), отмечен дефицит эссенциальных элементов (Cu, Zn, Mn, Fe) на
фоне высокой аккумуляционной активности к токсичным металлам (Ni, Cd, Pb) (табл.1)
(Chernaya et al., 2010).
11
Таблица 1 – Коэффициенты биологического накопления (КБН) у кровососущих и
хищных гирудинид в водных экосистемах России, Украины и Казахстана
Cu
Zn
Mn
Fe
Ni
Cd
Pb
Регион / КБН ТМ
H. verbana (n = 30)
Харьковская обл.1
2.46
12.6
0.29
0.44
1.43
2.75
2.26
Волгоградская обл.
1.90
7.19
0.13
0.52
1.32
3.93
2.43
Краснодарский край
2.16
16.1
0.07
0.72
0.98
3.21
2.58
H. medicinalis, европейская форма (n = 40)
Тамбовская обл.
0.48
8.88
0.06
0.73
0.13
0.13
0.15
Харьковская обл. 1
2.87
11.1
0.30
0.41
1.28
2.57
2.16
Харьковская обл. 2
2.79
14.9
0.28
0.19
1.32
3.32
2.66
Луганская обл.
4.42
9.10
0.65
0.38
2.94
7.95
3.40
H. medicinalis, азиатская форма (n = 10)
Алтайский край 1
0.67
8.73
0.02
0.08
0.73
3.24
0.91
H. sanguisuga, европейская форма (n = 60)
Тамбовская обл.
4.22
17.3
0.41
0.45
0.62
1.47
1.77
Харьковская обл. 1
7.62
19.3
0.68
0.29
1.10
2.09
2.81
Харьковская обл. 2
7.06
24.1
0.88
0.12
1.00
2.77
3.03
Луганская обл.
5.31
15.9
0.93
0.15
2.47
3.86
3.97
Волгоградская обл.
7.03
16.9
0.57
0.18
1.25
3.46
3.35
Краснодарский край
8.27
24.4
0.21
0.34
0.80
2.42
3.01
H. sanguisuga, азиатская форма (n = 50)
Акмолинская обл. 1
2.07
11.5
0.06
0.13
1.57
3.27
2.48
Акмолинская обл. 2
2.18
16.7
0.14
0.14
0.67
2.99
2.55
Челябинская обл.
2.09
15.2
0.11
0.22
1.13
3.74
2.69
Свердловская обл.1
2.16
10.4
0.32
0.17
1.09
3.36
3.39
Свердловская обл. 2
3.69
14.5
0.18
0.29
1.09
3.38
2.64
При изучении связей в корреляционных парах «МЭткань-МЭДО» выявлено, что
уровень содержания Cu, Fe, Ni, Cd, Pb в тканях всех изучаемых экологофизиологических групп пиявок находится в прямой зависимости от концентраций этих
металлов в ДО (p < 0.05) (табл. 2).
Таблица 2 – Корреляционные связи между уровнем содержания микроэлементов в
тканях пиявок и их концентрациями в донных отложениях
H. verbana
H. medicinalis
H. sanguisuga
H. sanguisuga
МЭ
европейская форма европейская форма азиатская форма
p
p
p
p
rS
rS
rS
rS
Cu 0.70
0.004
0.82
< 0.0001
0.80
< 0.0001
0.63
0.0008
Zn 0.02
0.94
-0.05
0.83
0.44
0.015
0.94 < 0.0001
Mn -0.02
0.94
0.07
0.78
0.14
0.19
0.35
0.087
Fe 0.54
0.038
0.45
0.046
0.47
0.013
0.90 < 0.0001
Ni 0.85 < 0.0001 0.94
< 0.0001
0.89
< 0.0001
0.85 < 0.0001
Cd 0.89 < 0.0001 0.95
< 0.0001
0.93
< 0.0001
0.62
0.0010
Pb 0.60
0.014
0.86
< 0.0001
0.74
< 0.0001
0.92 < 0.0001
Медицинские пиявки H. medicinalis и H. verbana способны регулировать в тканях
содержание Mn и Zn, независимо от концентраций этих МЭ в окружающей среде,
12
хищные пиявки H. sanguisuga отличаются такой способностью только по отношению к
Mn (табл. 2).
Показано, что качественный состав аминокислотного паттерна тканей
кровососущих и хищных гирудинид не имеет различий и включает 23 свободных
аминокислоты и их производных. Вместе с тем кластерный анализ показал, что
количественная структура аминокислотного спектра тканей H. sanguisuga, H.
medicinalis, H. verbana имеет видовую, трофическую и климатогеографическую
дифференциацию (рис. 2).
0,14
Рисунок 2 – Трофическая, видовая и
климатогеографическая дифференциация
аминокислотного спектра тканей
H. sanguisuga (H.s.),
H. medicinalis (H.m.), H. verbana (H.v.)
0,12
Linkage Distance
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
H.s. C2
H.s. C1
H.s. Ч
H.s. A2
H.s. Л
H.s. A1
H.s. B
H.s. X2
H.s. K
H.s. X1
H.s. T
H.v. X1
H.m. Aк2
H.m. Ак1
H.m. X1
H.v. K
H.v. B
H.m. Л
H.m. X2
H.m. T
0,00
Условные сокращения: С1 и С2 – Свердловская
обл.; Ч – Челябинская обл., А1 и А2 –
Акмолинская обл., Л – Луганская обл., В –
Волгоградская обл., Х2 и Х1 – Харьковская обл.,
К – Краснодарский край, Т – Тамбовская обл.,
Ак1 и Ак2 – Алтайский край. Курсивом с
подчерком выделены азиатские экотипы
H. sanguisuga, H. medicinalis и H. verbana,
обитающие на северной границе ареала
При детальном изучении трофических и видовых особенностей аминокислотного
обмена пиявок обнаружено, что в одинаковых экологических условиях (оз. Горелое,
Харьковская обл.1) у хищной пиявки H. sanguisuga суммарные концентрации свободных
АК (1944.1 ± 77.7 мкмоль/100г) выше, чем у медицинских пиявок, но значимо отличаются
только от показателей H. medicinalis (1792.1 ± 38.3) (p < 0.05). В тканях H. verbana уровень
суммарного фонда (1882.9 ± 43.6) несколько выше, чем у H. medicinalis, но не значимо (p >
0.05).
Показано, что трофический статус обусловливает количественную специфичность
аминокислотного спектра тканей гирудинид: концентрации практически всех свободных
АК, исключая орнитин, у хищников значимо отличаются от их содержания у гематофагов (p
< 0.05). У хищников, по сравнению с гематофагами, кратно снижены тканевые
концентрации цистеиновой (более чем в 2 раза) и аспарагиновой кислот (более чем в 3
раза) (p < 0.001) и уровень глутамата более низкий, чем у H. medicinalis (p < 0.05).
Концентрации остальных АК в тканях БЛП значимо выше, чем у МП (p < 0.05). Паттерн
незаменимых аминокислот (НАК) у H. sanguisuga (572.6 ± 31.1 мкмоль/100г) превышает
таковой у H. medicinalis (272.8 ± 8.12) и H. verbana (313.2 ± 9.48) в 2 и 1.8 раз,
соответственно (p < 0.05) (Черная, Ковальчук, 2008). У совместно обитающих
медицинских пиявок сопоставимы тканевые концентрации цистеата, валина, метионина,
γ-аминомасляной кислоты, аргинина (p > 0.05). У особей H. medicinalis, по сравнению с
H. verbana, отмечено повышенное содержание глутамата и глутамина, аланина,
цистеина, изолейцина, фенилаланина на фоне низких концентраций аспартата, серина,
пролина, тирозина, орнитина (p < 0.05). Значительный вклад в количественные различия
13
свободных АК у МП вносит пул НАК тканей H. verbana, повышенный за счет треонина,
лейцина, лизина, гистидина (p < 0.05).
Выявлена географическая изменчивость суммарного фонда АК в тканях
европейских пиявок H. medicinalis и H. sanguisuga (p < 0.0001) и ее отсутствие у H.
verbana и у азиатских экотипов H. medicinalis и H. sanguisuga (p > 0.05) (табл. 3).
Таблица 3 – Диапазоны концентраций свободных АК (СТк) и их дисперсия
(H – критерий Краскела - Уоллеса, p – уровень значимости) в тканях кровососущих и хищных
гирудинид из водных экосистем различных регионов России, Украины и Казахстана
H. medicinalis, формы
H. sanguisuga, формы
АК
H. verbana
европейская
азиатская
европейская
азиатская
Мкмоль/100г
n = 30
n = 40
n = 20
n = 60
n = 50
Фонд СТк
1808-1946
1365-1949
2051-2167
1513-2311
2150-2559
АК
H (р)
1.98 (0.3700) 26.8 (0.0000) 4.17 (0.0513) 34.9 (0.0000) 7.42 (0.1150)
НАК СТк
251-313
170-273
358-384
450-614
711-847
H (р)
13.8 (0.0010) 29.4 (0.0000) 2.77 (0.0963) 22.2 (0.0050) 7.42 (0.1153)
ЗАК
СТк
1517-1639
1159-1744
1651-1700
1024-1678
1330- 1612
H (р)
4.11 (0.1284) 33.1 (0.0000) 2.06 (0.1509) 46.3 (0.0000) 6.29 (0.1780)
Сравнительная оценка показала, что пиявки H. medicinalis, обитающие в суровых
климатических условиях (Алтайский край), отличаются от европейских особей своего
вида более высоким уровнем аминокислотного обмена (H1; 60 = 33.1; p = 0.0000). Фонд
свободных АК у азиатской формы МП повышен за счет цистеиновой, аспарагиновой и
глутаминовой кислот, серина, тирозина и незаменимых АК: треонина, валина,
изолейцина, лейцина, фенилаланина, лизина, гистидина и аргинина (p < 0.0001). Вместе
с тем, в тканях сибирских гематофагов наблюдается пониженное содержание пролина,
глицина, γ-аминомасляной кислоты, орнитина (p < 0.05). Отмечено, что обитание H.
medicinalis в экстремальных для нее климатических условиях, на восточной границе
ареала, сопровождается значительным повышением незаменимых АК (H1;60 = 39.2; p =
0.0000). Подобное было отмечено и у H. verbana на северной границе ареала
(Харьковская обл.1).
У азиатских пиявок H. sanguisuga, по сравнению европейскими особями, уровень
аминокислотного обмена повышен (H1; 110 = 43.9; p = 0.0000) в основном за счет
цистеиновой и аспарагиновой кислот, глицина, аланина и незаменимых АК: треонина,
валина, метионина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина, гистидина и
аргинина. В то же время азиатские БЛП испытывают меньшую потребность в серине,
глутаминовой кислоте и глутамине, пролине (p < 0.0001). На основании полученных
результатов можно сделать вывод о том, что адаптация изучаемых видов кровососущих
и хищных гирудинид к неблагоприятным климатическим условиям сопровождается
интенсификацией аминокислотного фонда в основном за счет значительного роста
паттерна незаменимых АК. Кроме того, азиатские экотипы пиявок, независимо от
трофической специфики, отличаются от европейских гирудинид более высоким
тканевым содержанием цистеиновой и аспарагиновой кислот, и пониженным – пролина
(p < 0.05).
Для кровососущих и хищных гирудинид различных географических популяций
содержание большинства свободных АК в тканях в значительной степени зависит от
14
экологических особенностей среды обитания (Черная, 2014). Независимо от видовой
принадлежности, наибольшей географической изменчивости у пиявок подвержены
тканевые концентрации пролина, цистеина и аргинина (H > 14.2; p < 0.001). Следует
отметить, что в тканях пиявок из водных экосистем некоторых промышленных регионов
(Акмолинская 1, Волгоградская, Луганская области) наблюдается нарушение
аминокислотного баланса: повышенный суммарный фонд, снижение показателей
«незаменимые АК/заменимые АК», отклонение значений антитоксического индекса
Фишера (ИФ – «АК с разветвленной углеродной цепью/ароматические АК») от нормы
(3.0 ± 0.5).
Установлена тесная сопряженность микроэлементного спектра и аминокислотного
фонда тканей кровососущих и хищных гирудинид. Высокий уровень отрицательных
связей в корреляционных парах «МЭ-АК», выявленный в тканях H. medicinalis и H.
verbana, свидетельствуют как о негативном влиянии повышенных концентраций ТМ на
состояние аминокислотного обмена медицинских пиявок, так и об участии свободных
АК в детоксикационных процессах. Сочетанное влияние неблагоприятных
климатических и экологических факторов обусловливает подобные тенденции и для
азиатской формы H. sanguisuga. Таким образом, показано, что прогрессирующее
загрязнение водных экосистем тяжелыми металлами может изменить аминокислотный
баланс в тканях гирудинид в направлении разобщения основных метаболических
систем, что в свою очередь будет способствовать развитию патологий как у отдельных
особей H. sanguisuga, H. medicinalis, H. verbana, так и ухудшению здоровья природных
популяций этих видов.
Глава 4 Сезонная и возрастная изменчивость биологически активных
соединений в тканях хищных и кровососущих пиявок
4.1 Сезонная динамика содержаний микроэлементов и свободных аминокислот в
тканях H. sanguisuga и H. verbana
Показано, что содержание всех изучаемых микроэлементов в тканях хищных и
кровососущих гирудинид подвержено сезонной изменчивости (рис. 3).
Из рисунка видно, что хищные пиявки H. sanguisuga нуждаются в эссенциальном
Zn больше всего летом, в период спаривания и откладки коконов (H2;30 = 19.6; p =
0.0001). От весны к осени у БЛП снижается потребность в Mn (H2;30 = 19.6; p = 0.0001) и
Fe (H2;30 = 19.6; p = 0.0001), и накапливается в тканях Pb (H2;30 = 14.0; p = 0.0009) (рис.
3).
H. sanguisuga
100
60
40
весна
лето
осень
30
МЭ, мкг/г
МЭ, мкг/г
80
H. verbana
40
весна
лето
осень
20
10
20
0
0
Cu
Zn*
Mn
Fe**
Ni
Cd
Cu
Pb
Zn*
Mn
Fe**
Ni
Cd
Рисунок 3 – Сезонная динамика концентраций микроэлементов
(МЭ, мкг/г сухой массы) в тканях кровососущих и хищных гирудинид
(концентрации МЭ уменьшены: * – в 10 раз, ** – в 100 раз)
15
Pb
Максимальные концентрации эссенциальной Cu (H2;30 = 17.6; p = 0.0001) отмечены
в тканях весенних, вышедших из зимнего анабиоза особей H. sanguisuga, а токсичных Ni
(H2;30 = 25.1; p = 0.0000), Cd (H2;30 = 25.8; p = 0.0000) – у малоактивных осенних пиявок
(рис. 3).
В тканях кровососущих гирудинид H. verbana специфика сезонной изменчивости
несколько иная: от весны к осени концентрации Zn (H2;30 = 21.8; p = 0.0000), Mn (H2;30 =
21.1; p = 0.0000), Fe (H2;30 = 22.2; p = 0.0000) снижаются, а Ni –повышаются (H2;30 = 22.3;
p = 0.0000) (рис. 3). Максимальные концентрации Cu обнаружены в тканях осенних
особей МП, а минимальные – у летних (H2;30 = 23.9; p = 0.0000). Наибольшее тканевое
содержание экотоксикантов Cd (H2;30 = 19.4; p = 0.0001) и Pb (H2;30 = 13.9; p = 0.001)
характерно для осенних особей H. verbana, а наименьшее – летом (рис. 3).
Обнаружено, что осенью особи H. sanguisuga и H. verbana снижают
биоаккумуляционную активность по отношению к Cu, Zn, Mn, Fe, Pb, но повышают ее к
Cd и Ni. Летом, в период наращивания мышечной массы и откладки коконов, в тканях
хищных и кровососущих пиявок происходит частичная элиминация Cd из организма, на
что указывают минимальные значения КБН этого токсиканта (табл. 4).
Таблица 4 – Сезонная динамика показателей коэффициентов биологического
накопления (КБН) эссенциальных и токсичных МЭ у хищных и кровососущих гирудинид
Сезоны/ КБН
Cu
Zn
Mn
Fe
Ni
Cd
Pb
H. sanguisuga (n = 30)
Весна
3.69
10.4
0.18
0.31
1.09
3.38
2.64
Лето
3.58
15.8
0.11
0.36
1.02
2.04
2.01
Осень
2.22
8.43
0.05
0.15
1.59
3.93
1.81
H. verbana (n = 30)
Весна
2.16
16.1
0.07
0.72
0.97
3.22
2.59
Лето
2.01
15.9
0.05
0.61
1.06
2.43
2.07
Осень
1.96
7.57
0.03
0.40
1.17
3.51
2.04
При оценке характера и степени связи в корреляционных парах «МЭДО-МЭткань» у
БЛП выявлена статистически значимая положительная связь средней силы для Cu (rS =
0.60; р = 0.017) и Cd (rS = 0.55; р = 0.037) и сильная для Pb (rS = 0.87; р = 0.0000) и Ni (rS
= 0.74; р = 0.0018). Сезонная динамика уровня содержания Zn (rS = -0.37; p = 0.173), Mn
(rS = 0.08; p = 0.79) и Fe (rS = 0.08; p = 0.77) в тканях H. sanguisuga не зависит от
изменения концентраций этих МЭ в среде обитания, а обусловлена физиологическими
потребностями БЛП в этих биогенных МЭ на разных этапах биологического цикла.
У H. verbana выявлена значимая положительная связь для Cu (rS = 0.93; p = 0.0000),
Fe (rS = 0.63; p = 0.012), Cd (rS = 0.73; p = 0.0019), Ni (rS = 0.85; p = 0.0000), что говорит о
преимущественном влиянии абиотических факторов на сезонную динамику тканевых
концентраций данных МЭ. Динамика содержания Zn (rS = - 0.40; p = 0.139), Mn (rS = 0.10; p = 0.723) и Pb (rS = 0.41; p = 0.128) в тканях H. verbana не зависит от изменения
концентраций этих ТМ в ДО, а связана, скорее всего, с наличием в организме МП
механизмов регуляции эссенциальных МЭ, детоксикации и элиминации чужеродного
Pb.
Показано, что физиологические процессы, связанные с сезонными особенностями
биологического цикла гирудинид, обусловливают качественные и количественные
16
изменения аминокислотного спектра в их тканях. Суммарные концентрации свободных
АК в тканях H. sanguisuga значимо изменяются по сезонам: осень (3058.6 ± 39.2
мкмоль/100г) > весна (2570.1 ± 51.7) > лето (927.6 ± 26.2) (H2;30 = 26.7; p = 0.0000).
Аминокислотный пул, уходящих в анабиоз H. sanguisuga, превышающий таковой у
весенних и летних особей в 1.2 и 3.3 раз, соответственно, повышен за счет кратного
роста концентраций цистеиновой кислоты, глутамата и глутамина (p < 0.01).
Примечательными отличиями осенних особей ложноконских пиявок являются
полная утилизация пролина, метионина и γ-аминомасляной кислоты, и присутствие в их
тканях цитруллина и незаменимой аминокислоты триптофана, которые у летних и
весенних пиявок H. sanguisuga не обнаруживались. Процентное содержание пула
незаменимых АК (НАК) в тканях БЛП изменяется в ряду: весна (33.1%) > лето (24.4%) >
осень (8.55%). Низкий показатель соотношения НАК/ЗАК у осенних особей H.
sanguisuga (0.10) указывает на аминокислотный дисбаланс в их тканях. О том, что у
пиявок, уходящих в анабиоз, нарушен азотистый обмен свидетельствует и высокое
значение антитоксического индекса Фишера (ИФ = 8.26 при норме 3.0 ± 0.5). Пул ЗАК в
тканях осенних особей H. sanguisuga составляет 82.2 % от суммарного фонда, и на долю
глутаминовой кислоты и глутамина приходится 67.0 %, что, вероятно, является
необходимым условием поддержания процессов жизнеобеспечения при низких
температурах окружающей среды.
У медицинских пиявок H. verbana суммарные концентрации аминокислотного
пула, так же как и у хищных гирудинид, изменяются в ряду времен года: осень (2437.0 ±
66.3 мкмоль/100г) > весна (1807.9 ± 17.8) > лето 808.5 ± 18.2 (H2; 30 = 25.8; p = 0.0000).
Высокий уровень аминокислотного фонда в тканях осенних особей H. verbana
обеспечен максимальными концентрациями цистеиновой и аспарагиновой кислот,
треонина, серина, глутамата и глутамина, цистеина, изолейцина, триптофана, орнитина,
лизина и аргинина (p < 0.05). Процентное содержание пула НАК в тканях МП снижается
в сезонном ряду: весна (13.9%) > лето (11.8%) > осень (10.4%), как и показатели
соотношения НАК/ЗАК (0.17; 0.14; 0.12). В условиях похолодания и переходе в зимний
анабиоз в тканях H. verbana, как и у H. sanguisuga, отмечены признаки эндогенного
токсикоза, объективным критерием которого является высокие значения индекса
Фишера (ИФ = 7.48).
Наблюдаемый биоэлементный баланс в тканях хищных и кровососущих
гирудинид, уходящих в зимний анабиоз, указывает на высокую пластичность их
обменных процессов, что может, по-нашему мнению, способствовать выживанию H.
sanguisuga и H. verbana не только в зимний период, но и при других экстремальных
нагрузках.
4.2 Возрастные особенности микроэлементного и аминокислотного обменов в
тканях хищных и кровососущих пиявок
Показано, что возрастные особенности микроэлементного обмена H. sanguisuga и
H. verbana, несмотря на видовую специфику тканевых концентраций Cu, Pb, Ni,
обладают общими для челюстных пиявок чертами: в тканях взрослых особей, по
сравнению с молодью, повышено содержание Zn и Fe и понижено – Mn и Cd (p < 0.05)
(рис. 4).
17
H. sanguisuga
H. verbana
МЭ, мкг/г влажной ткани
МЭ, мкг/г влажной ткани
10
молодь
взрослые
8
6
4
2
молодь
взрослые
3
2
1
0
0
Cu
Zn*
Mn
Fe*
Cd
Pb
Cu
Ni
Zn*
Mn
Fe**
Cd
Pb
Ni
Рисунок 4 – Содержание биогенных и токсичных МЭ (мкг/г сырой массы) в тканях
молоди и взрослых особей хищных и кровососущих пиявок из природных популяций
(концентрации металлов уменьшены: * – в 10 раз,** – в 100 раз); различия между
группами статистически значимы для всех МЭ (p < 0.05)
У молоди кровососущих и хищных гирудинид отмечен высокий исходный уровень
аминокислотного обмена. Суммарные концентрации свободных АК в их тканях более
чем в два раза превышают эти показатели у взрослых особей: 2060.9 ± 87.5 и 927.6 ±
73.4 мкмоль/100г, соответственно, у H. sanguisuga; 1781.8 ± 87.2 и 808.5 ± 55.1
мкмоль/100г – у H. verbana (p < 0.01). В тканях растущих пиявок обоих видов
обнаружены таурин и триптофан, которые у взрослых особей присутствуют в следовых
количествах, что указывает на их эксклюзивную роль при росте и развитии пиявок.
У молоди хищных пиявок H. sanguisuga особенно высоки тканевые концентрации
аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глутамина, пролина, глицина,
аргинина, превышающие таковые у взрослых особей в 2.3, 2.9, 3.7, 2.3 и 3.4 раз,
соответственно, а содержание незаменимой АК валина, используемого мышечной
тканью в качестве дополнительного источника энергии и обладающего
иммуностимулирующими свойствами, выше в 20 раз (p < 0.01) (Черная, Ковальчук,
2014а). Высокий уровень аминокислотного фонда тканей молоди кровососущих пиявок
H. verbana обеспечивают глицин, цистеин, орнитин, лизин, аргинин, концентрации
которых превышают таковые у взрослых особей в 5.4, 3.1, 3.1, 5.9, 8.5 раз,
соответственно, и невероятно высокий рост (в 50 раз) содержания гистидина,
обладающего противоинфекционными и детоксикационными свойствами (p < 0.01).
Медицинские пиявки, выращенные на биофабрике, являются уникальными
модельными объектами для изучения физиологических особенностей пиявок в
онтогенезе, поскольку возраст на разных этапах развития у них четко определен.
Показано, что рост и развитие медицинских пиявок H. verbana сопровождается
направленным повышением суммарного содержания в их тканях изучаемых макро- и
микроэлементов (табл. 5) (Черная, Ковальчук, 2011).
Корреляционный анализ выявил положительную связь очень высокой силы между
возрастом пиявок и суммарными концентрациями МЭ в их тканях (rS = 0.93; p =
0.0000). Установлено, что с возрастом у особей H. verbana значительно повышается
потребность в Cu (rS = 0.67), Zn (rS = 0.40), Fe (rS = 0.95) (p < 0.05). Концентрации
токсичного Cd, не участвующего в нормальных физиологических процессах, в тканях
растущих пиявок линейно снижаются (rS = -0.84; p = 0.0000), а Ni – повышаются (rS =
18
0.84; p = 0.0000). В процессе развития и роста медицинских пиявок наблюдается
фазовая динамика тканевого содержания Mn, Ca, Mg, Sr, Co, Pb (табл. 5).
Таблица 5 – Возрастная динамика содержания макро- и микроэлементов (МЭ, мкг/г)
в тканях H. verbana, выращенных на биофабрике, M ± SE
МЭ мкг/г
/ возраст
5 суток
1 месяц
3 месяца
5 месяцев
7 месяцев
9 месяцев
(контроль)
n = 25
n = 15
n=5
n=5
n=5
n = 50
1.25 ± 0.01
1.29 ± 0.01
2.13 ± 0.02* 2.08 ± 0.03* 2.03 ± 0.03* 2.06 ± 0.03*
24.4 ± 2.69 8.29 ± 0.51* 8.01 ± 0.18*
20.7 ± 1.66
21.2 ± 1.25
22.4 ± 2.09
1.45 ± 0.05 0.57 ± 0.01* 1.01 ± 0.01* 0.94 ± 0.04* 0.93 ± 0.01* 0.92 ± 0.02*
85.2 ± 4.39 190.5 ± 8.76* 214.3 ± 12.7* 278.9 ± 13.9* 346.8 ± 18.2* 342.6 ± 14.2*
66.4 ± 3.85 42.4 ± 2.39* 52.7 ± 3.08* 50.4 ± 3.11* 50.6 ± 2.97* 47.5 ± 2.76*
137.6 ± 11.6 56.4 ± 2.41* 66.1 ± 1.79* 64.4 ± 3.63* 67.1 ± 2.37* 68.9 ± 2.22*
0.75 ± 0.07
0.71 ± 0.03
0.76 ± 0.03
0.81 ± 0.03* 0.79 ± 0.04* 0.78 ± 0.02*
1.75 ± 0.02 0.43 ± 0.07* 0.23 ± 0.01* 0.35 ± 0.02* 0.31 ± 0.01* 0.32 ± 0.02*
2.53 ± 0.04 2.28 ± 0.04* 2.75 ± 0.08* 2.76 ± 0.07* 2.80 ± 0.07* 2.82 ± 0.02*
0.51 ± 0.01
0.57 ± 0.02
0.52 ± 0.01
0.44 ± 0.02* 0.34 ± 0.02* 0.31 ± 0.02*
1.25 ± 0.01 2.01 ± 0.02* 1.88 ± 0.02* 1.54 ± 0.04*
1.27 ± 0.02
1.26 ± 0.02
323.1 ± 22.9 305.5 ± 14.4 350.4 ± 18.2* 423.3 ± 22.8* 494.2 ± 25.2* 489.9 ± 21.4*
Cu
Zn
Mn
Fe
Ca
Mg
Co
Sr
Ni
Cd
Pb
∑ МЭ
Примечание: * – различия с контролем статистически значимы (p < 0.05)
Сравнительная оценка состояния аминокислотного пула в тканях растущих особей
H. verbana выявила существенные колебания концентраций, как суммарного фонда АК,
так и всех свободных АК. Максимальные суммарные концентрации АК (1918.5 ± 26.6
мкмоль/100 г) отмечены в тканях «нитчаток» – пиявок, вышедших из коконов и еще не
питавшихся кровью (рис. 5).
фонд АК
мкмоль/100г
ЗАК
НАК
Рисунок 5 – Возрастная
динамика суммарных
концентраций фонда АК,
пула заменимых (ЗАК) и
незаменимых (НАК)
аминокислот (мкмоль/100г)
в тканях H. verbana,
выращенных в искусственных
условиях
2000
1500
1000
500
0
0
1
3
5
возраст, месяцы
7
9
Рост и развитие пиявок сопровождаются снижением суммарных концентраций АК
в тканях H. verbana: у девятимесячных особей (650.8 ± 12.6 мкмоль/100г) он в три раза
меньше, чем у «нитчаток» (p < 0.01). Суммарные концентрации пулов заменимых АК и
незаменимых АК в процессе роста МП так же значимо снижаются, однако их
соотношение, напротив, растет – у «нитчаток» коэффициент НАК/ЗАК равен 0.56, у
взрослых особей достигает 0.74.
19
Корреляционный анализ показал, что у H. verbana с возрастом линейно
повышаются концентрации цистеиновой кислоты, треонина, серина, валина, цистеина,
метионина, тирозина и фенилаланина (rS = 0.39-0.89) и снижаются – таурина, глутамата
и глутамина, пролина, глицина, цитруллина, изолейцина, лейцина, триптофана,
орнитина, лизина, аргинина (rS = –0.56 - –0.98) (p < 0.05).
Глава 5 Эколого-физиологические особенности хищных пиявок H. sanguisuga
фоновых и антропогенно-нарушенных водных объектов Уральского региона
Многолетние фаунистические исследования показали, что в водных экосистемах
Уральского региона с усилением антропогенной нагрузки существенно снижается
качественный и количественный состав гирудофауны, и в водоемах, подверженных
прямому воздействию поллютантов, выживают в основном хищные виды пиявок
(Ковальчук, Черная, 2003; Khokhutkin et al., 2008; Черная, Ковальчук, 2007а; 2009).
Сочетанное влияние сурового климата и антропогенного пресса, по-нашему мнению,
ограничивает широкое распространение и высокую численность большой ложноконской
пиявки H. sanguisuga на Урале: обитание этого вида пиявок отмечено только в каждом
втором исследуемом водном объекте (Chernaya, 2012).
Донные отложения водных объектов, расположенных на антропогеннонарушенных территориях Урала, содержат изучаемые ТМ, исключая Zn (H1, 110 = 1.40; p
= 0.237), в больших количествах, чем грунты фоновых водных экосистем (H1, 110 > 14.0;
p < 0.001) (табл. 6). При этом в некоторых природных водоемах, уровень содержания Zn,
Ni, Cd в ДО превышает фоновые показатели, указанные в литературе (Никаноров и др.,
1991), что обусловлено, как геохимическими аномалиями изучаемого региона, так и
атмосферной природой поступления ТМ в водную среду.
Обнаружено, что в тканях H. sanguisuga, обитающих в условиях антропогенной
нагрузки, уровень содержания практически всех изучаемых МЭ, за исключением Ni (H1,
110 = 0.36; p = 0.548), значительно выше, чем у пиявок из фоновых водных объектов (H1,
110 > 48.0; p < 0.0001) (табл. 6) (Черная, Ковальчук, 2007; 2010; 2010а).
Таблица 6 – Основные характеристики микроэлементного обмена H. sanguisuga,
обитающих в фоновых и антропогенно-нарушенных водных экосистемах Урала
Водные объекты
Фоновые
Антропогенно-нарушенные
МЭ
СДО
Сткань
КБН
СДО
Сткань
КБН
rS
rS
n = 50
9.29-20.4
45.3-69.3
215-353
3207-6209
12.4-44.1
1.28-1.64
7.92-8.41
n = 50
19.4-27.3
433-970
9.23-64.3
494-1336
29.5-55.9
1.97-3.33
15.5-20.1
n = 60
1.34-2.08
–
22.9-152*
8.12-14.1 0.72
38.5-345
0.04-0.30 –0.54
395-595*
0.10-0.30 0.48 6549-31204*
1.88-2.43 0.93
22.6-48.6*
1.45-2.45
–
1.75-2.21*
1.91-2.39
–
9.21-17.4*
n = 60
52.7-218*
985-2024*
41.4-117*
990-2354*
25.6-61.3
3.65-8.42*
21.3-31.4*
1.43-3.45 0.59
Cu
5.87-28.4 0.80
Zn
0.07-0.29
–
Mn
0.07-0.23 0.77
Fe
1.03-1.54 0.86
Ni
2.09-3.81 0.92
Cd
1.70-2.56 0.78
Pb
Примечание: диапазоны концентраций МЭ (мкг/г сухой массы) в донных отложениях (СДО),
в тканях H. sanguisuga (Сткань), КБН – коэффициенты биологического накопления; rS –
коэффициенты корреляции, характеризующие степень связи МЭ в парах «ткань пиявок ДО» (p < 0.01), * - различия между группами статистически значимы (p < 0.001)
20
Сравнительный анализ коэффициентов биологического накопления (КБН) показал,
что особи H. sanguisuga, населяющие водные экосистемы промышленных городов,
снижают биоаккумуляционную активность к Fe, Ni и Pb (табл. 6). Данный факт
указывает на присутствие у них эффективных механизмов детоксикации и элиминации
избыточного количества данных ТМ.
Установлено, что уровни содержания Cu, Cd, Pb в тканях H. sanguisuga,
обитающих в фоновых водоемах, не зависят от концентраций этих ТМ в ДО, что
указывает на преимущественно трофический путь поступления этих элементов в
организм пиявок и о наличии у H. sanguisuga механизмов регуляции Cu, Cd, Pb (p >
0.05). Вместе с тем у данной группы пиявок выявлена значимая положительная связь в
корреляционных парах «ТМткань - ТМДО» для Zn, Fe, Ni и отрицательная связь средней
силы для Mn (p < 0.05) (табл. 6).
В условиях персистентного поступления поллютантов в водные экосистемы
промышленных территорий Урала, у населяющих их пиявок уровень содержания в
тканях всех изучаемых МЭ, за исключением Mn, зависит от их концентраций в ДО и
степень связи в корреляционных парах «ТМткань - ТМДО» усиливается (p < 0.01) (табл. 6),
что указывает на принципиальную возможность использования пиявок H. sanguisuga в
качестве биоиндикаторов при мониторинге загрязнения водных экосистем Уральского
региона тяжелыми металлами (Черная, Ковальчук, 2007).
Показано, что суммарные концентрации свободных АК в тканях H. sanguisuga,
обитающих в водных экосистемах промышленных городов в 1.5-2.0 раза выше, чем у
особей из фоновых водных объектов (H1, 110 = 81.1; p = 0.0000) (рис. 6).
2000 мкмоль/100г
фонд АК
ЗАК
НАК
Рисунок 6 – Суммарные
концентрации фонда АК, пула
заменимых (ЗАК) и незаменимых
(НАК) аминокислот в тканях
H. sanguisuga из фоновых и
антропогенно-нарушенных
водных экосистем Урала:
1500
1000
500
0
1
2
3
фоновые
4
5
6
7
8
9
10
антропогенно-нарушенные
11
1– оз. Б. Миассово, 2 – оз. Б. Таткуль,
3 – вдхр. Сулемское, 4 – р. Сулем,
5 – р. Бардым, 6 – оз. Ильменское,
7 – вдхр. Нижнесергинское,
8 – оз. Шарташ, 9 – р. Исеть,
10 – р. Тагил, 11 – р. Турья
водные объекты
Важно, что количественные изменения аминокислотного спектра в тканях этой
группы пиявок происходят в основном за счет пула ЗАК. Уровень паттерна
незаменимых АК в тканях всех исследуемых групп пиявок претерпевает не столь
значительные колебания, что, вероятно, является важным условием поддержания
гомеостаза в их организме, особенно в условиях техногенеза (рис. 6).
Суммарный фонд незаменимых АК в тканях H. sanguisuga фоновых популяций
достаточно высокий (24.6-28.3%), как и показатели НАК/ЗАК (0.34-0.42); значения
21
антитоксического индекса Фишера не превышают норму (1.89-3.18). В тканях пиявок,
обитающих в антропогенно-модифицированных водоемах, на фоне эндогенного
токсикоза, нарушен аминокислотный баланс, на что указывают обеднение процентного
содержания пула незаменимых АК (17.6-20.8%), низкие показатели НАК/ЗАК (0.22–
0.30) и повышенные значения ИФ (4.29-5.31).
Вместе с тем у городских особей H. sanguisuga существенно повышено содержание
АК, обладающих энергообеспечивающими, детоксикационными и репарационными
свойствами – цистеиновая и аспарагиновая кислоты, треонин, серин, глицин, аланин,
цистеин, орнитин, гистидин (рис. 7) (p < 0.05).
А
270
оз. Б.Миассово
оз. Б.Таткуль
вдхр. Сулемское
р. Сулем
р. Бардым
мкмоль/100г
180
оз. Б.Миассово
оз. Б.Таткуль
вдхр. Сулемское
р. Сулем
р. Бардым
мкмоль/100г
40
30
20
90
10
0
Ar
g
Hi
s
Or
n
Ph
e
Ty
r
Ile
et
M
Th
r
Cy
s
CA
Ly
s
u
Le
Va
l
Al
a
Gl
y
Pr
o
+g
ln
Se
r
Gl
u
As
p
0
Б
450
оз. Ильменское
оз. Шарташ
р. Исеть
вдхр. Н-Серг.
р. Тагил
р. Турья
мкмоль/100г
360
270
80
оз. Ильменское
оз. Шарташ
р. Исеть
вдхр. Н-Серг.
р. Тагил
р. Турья
мкмоль/100г
60
40
180
20
90
Ar
g
Hi
s
Ly
s
Ph
e
Ty
r
Ile
Cy
s
M
et
CA
Or
n
u
Le
Va
l
Al
a
Gl
y
+g
ln
Gl
u
Se
r
Th
r
As
p
Pr
o
0
0
Рисунок 7 – Содержание свободных аминокислот (мкмоль/100г) в тканях
H. sanguisuga, обитающих в фоновых (А) и антропогенно-нарушенных (Б)
водных экосистемах Урала
Корреляционный анализ показал, что пиявки H. sanguisuga, обитающие в водных
экосистемах промышленных городов Урала, отличаются от особей из фоновых водных
объектов более высоким уровнем межсистемной кооперации микроэлементного и
22
аминокислотного обменов, обеспечивающим реализацию регуляторных механизмов
детоксикации и элиминации ТМ при хроническом избыточном поступлении их в ткани.
Глава 6 Экологические аспекты формирования микроэлементного спектра и
аминокислотного фонда тканей и секрета слюнных желез медицинских пиявок при
искусственном разведении на биофабриках
Медицинские пиявки, в отличие от хищных гирудинид H. sanguisuga, избегают
мест обитания, подверженных техногенному загрязнению. Достаточно сильным
антропогенным фактором, влияющим на физиологические особенности МП, могут быть
условия их разведения на биофабриках, поскольку, несмотря на отсутствие
естественных врагов и частое кормление, для них экстремальными являются лишение
солнечного света и естественного грунта, температурный режим, не соответствующий
природным условиям, высокая плотность популяции и пространственное ограничение,
отсутствие выбора жертвы и зимнего анабиоза. В таких условиях медицинские пиявки
достигают половой зрелости и размеров, необходимых для гирудотерапевтических
целей, не в три года, как в природе, а за 8-12 месяцев. Вместе с тем, в условиях
искусственного разведения пиявок на биофабриках отмечается их высокая смертность в
первые месяцы жизни.
Показано, что особи H. medicinalis и H. verbana, выращенные в едином режиме
питания и содержания (биофабрика «СибМедПиявка», Алтайский край), сохраняют
видоспецифичность микроэлементного и аминокислотного обменов, характерную для
этих видов МП из природных популяций (Черная и др., 2014). Обнаружено, что,
независимо от региона разведения, в тканях медицинских пиявок четко выражена
видовая специфика микроэлементного и аминокислотного спектров (рис. 8).
0,0020
Рисунок 8 – Видовая специфика
биоэлементного спектра тканей
медицинских пиявок
H. medicinalis (H.m) и
H. verbana (H.v), выращенных на
биофабриках различных регионов
России (А – Алтайский край,
С – Саратовская обл.,
К – Краснодарский край,
М – Московская обл.)
Linkage Distance
0,0015
0,0010
0,0005
0,0000
H.m (А)
H.m (С)
H.v (К)
H.v (А)
H.v (М)
Вместе с тем при изучении внутривидовой изменчивости уровня содержания МЭ и
свободных АК в тканях МП, выращенных на различных фабриках России, было
установлено, что специфика условий разведения и экологические особенности
изучаемых регионов в значительной мере влияют на биоэлементный профиль тканей
пиявок. У H. medicinalis наибольшую дисперсию содержаний в тканях наблюдали для
всех изучаемых МЭ, цистеина, метионина, изолейцина, аргинина (H1; 30 > 21.7; p <
0.0001). У пиявок H. verbana наибольшие региональные различия выявлены для
23
тканевых концентраций Cu, Fe, Ni, орнитина, изолейцина, глицина, метионина, пролина
(H2; 45 > 28.8; p < 0.0001).
Нами показано, что медицинские пиявки при интенсивном росте и развитии на
биофабриках характеризуются высокой способностью аккумулировать эссенциальные и
токсичные металлы (Ковальчук и др., 2007; Черная и др., 2008; Нохрина и др., 2008;
2009; Chernaya, 2010). Интерес к содержанию токсичных металлов в секрете слюнных
желез (ССЖ) пиявок, обусловлен и риском поступления экотоксикантов со слюной
кровососущих гирудинид в организм человека. При анализе содержаний МЭ в
гомогенатах тканей и в слюнной жидкости H. verbana, выращенных на биофабрике,
обнаружено, что суммарное содержание Ni, Cd, Pb в тканях составляет 0.90% от
суммарного пула МЭ, а в слюне – 0.04%, что свидетельствует о барьерной функции
слюнных желез и депонирующей роли тканей в формировании микроэлементного фонда
секрета (Ковальчук, Черная, 2013).
Сравнительный анализ аминокислотного спектра показал его существенные
различия для гомогенатов тканей и ССЖ медицинских пиявок H. verbana. В гомогенатах
тканей МП не обнаружено таурина, цитруллина и триптофана, содержание которых в
ССЖ составило 1.42%, 0.07% и 0.45%, соответственно.
Процентное содержание пула незаменимых АК в ССЖ (32.6%) медицинских
пиявок в 3.3 выше, чем в их тканях (9.9%) (p < 0.01). Наибольший вклад в формирование
паттерна НАК тканей H. verbana вносят треонин, валин, метионин, изолейцин, лейцин,
фенилаланин (рис. 9). Основу фонда НАК в секрете составляют треонин, валин, лейцин,
лизин, при этом процентное содержание всех НАК слюны превышает их доли в тканях.
Наибольшие различия отмечены для гистидина (в 30 раз), лизина (в 8), треонина (в 4.3),
лейцина (в 3.9), валина (в 3.7) (p < 0.01) (рис. 9).
Гомогенаты тканей
THR
VAL
MET
0
0.9
ILE
LEU
0.06 0.43
PHE
ССЖ
TRY
LYS
HIS
ARG
VAL
MET
ILE
1.81
1.39
1.77
THR
LEU
PHE
TRY
0.64
LYS
HIS
ARG
6.02
7.13
1.84
1.12
1.07
0.45
1.32
6.76
2.1
4.38
1.74
1.64
Рисунок 9 – Структура пула незаменимых аминокислот (% от суммарного фонда АК) в
гомогенатах тканей и в секрете слюнных желез (ССЖ) медицинских пиявок
H. verbana, выращенных на биофабрике
Учитывая, что медицинские пиявки, выращенные в искусственных условиях,
являются первым поколением особей-маток из природных популяций, интерес
представляет сравнительная оценка уровней содержания МЭ и свободных АК в
биосредах особей из природных популяций и выращенных на биофабрике.
24
Сравнительный анализ показал, что особи H. verbana, выращенные на биофабрике
Гирудо-Мед.Юг (Краснодарский край), содержат в тканях Cu, Fe, Cd, Ni в более
высоких концентрациях, чем пиявки этого вида из природных популяций (р. Челбас,
Краснодарский край): Cu (25.6 ± 1.27 мкг/г) – в 3.2 раз, Fe (3049.5 ± 17.1) – в 1.4 раз, Cd
(5.04 ± 0.45) – в 1.3 раз, Ni (23.3 ± 1.24) – в 2 раза (p < 0.05). Содержание эссенциального
Zn (273.5 ± 14.9) в тканях пиявок при развитии и росте на биофабрике существенно
снижается в 1.2 раз (p < 0.05). Отмечена тенденция к снижению биофильного Mn (6.08 ±
0.45) и к росту токсичного Pb (14.7 ± 0.82) в тканях выращенных особей H. verbana (p >
0.05) (Ковальчук и др., 2007; Chernaya, 2010).
Суммарные концентрации свободных АК у выращенных пиявок H. verbana (1160.4
± 5.84 мкмоль/100г) значимо выше, чем у природных особей (808.5 ± 18.2) (p < 0.05).
Пиявки с биофабрики содержат в своих тканях в 2 раза больше аминокислот,
обладающих иммуностимулирующими и детоксицирующими свойствами: метионина
(0.64% и 0.32%, соответственно), гистидина (0.12% и 0.06%), цистеина (0.32% и 0.15%),
изолейцина (1.31% и 0.65%), что актуально при высоких плотностях популяций H.
verbana в условиях искусственного разведения и содержаниях ТМ в их тканях (Черная и
др., 2006; Нохрина и др., 2008). В условиях интенсивного роста и развития, при
обильном и частом кормлении, у выращенных на биофабрике пиявок значительно
повышается, относительно особей природных популяций, тканевое содержание
основных метаболических групп АК: незаменимых (17.6% и 11.8%, соответственно), с
разветвленной углеродной цепью (8.3% и 5.6%), ароматических (2.60% и 1.56%),
серосодержащих (1.43% и 1.25%).
В контролируемых условиях на биофабрике у медицинских пиявок формируются
секрет слюнных желез (ССЖ), обильнее насыщенный свободными АК, нежели слюна
пиявок природных популяций (Ковальчук и др., 2011). Суммарные концентрации
свободных АК слюны выращенных особей H. verbana (553.2 ± 3.69 мкмоль/100 мл)
значимо превышают эти показатели ССЖ природных пиявок (452.2 ± 4.07) (p < 0.05).
ССЖ пиявок обеих групп в равных пропорциях содержит только цистеиновую кислоту,
глицин и глутамин (p > 0.05). В слюне выращенных пиявок существенно больше
таурина, аспарагиновой кислоты, серина, аланина, цитруллина, валина, цистеина,
метионина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, триптофана и лизина (p <
0.05). Для МП из природных популяций характерно повышенное содержание в секрете
треонина, глутаминовой кислоты, пролина, орнитина, гистидина и аргинина (p < 0.05).
Аминокислотный фонд ССЖ выращенных H. verbana отличается от такового
природных особей более высоким содержанием важнейших групп АК: незаменимых
(32.7% и 28.5%, соответственно), с разветвленной углеродной цепью (12.9% и 7.86%),
ароматических (3.61% и 3.18%), серосодержащих (4.82% и 2.10%).
Глава 7 Влияние хронического голодания на микроэлементный и
аминокислотный спектр тканей хищных и кровососущих пиявок
Одной из особенностей пиявок, приобретенных в ходе эволюционного развития,
является способность к длительному голоданию.
Показано, что после пятимесячного голодания у опытных особей H. sanguisuga в
тканях значимо повышаются концентрации биогенного Zn и токсичного Cd (p < 0.01) и
25
наблюдается тенденция к повышению Mn (p > 0.05). Одновременно происходит
незначительное снижение тканевых концентраций Pb и Ni (p > 0.05), а содержание Cu и
Fe значимо снижается (p < 0.05). Иная картина наблюдается у голодающих особей H.
verbana из природных популяций: после семимесячного голодания существенно
снижается содержание в тканях только Fe (p < 0.01). В тканях голодных особей H.
verbana, в сравнении с сытыми пиявками, значимо повышается содержание Cu, Zn, Cd и
Pb (p < 0.05), а концентрации Mn и Ni претерпевают несущественные колебания (p >
0.05).
Суммарные концентрации свободных АК в тканях H. sanguisuga после
пятимесячного голодания (1382.6 ± 71.8 мкмоль/100г), в сравнении с сытыми особями
(927.6 ± 53.4), возросли в 1.5 раз, что вызвано катаболизмом мышечных белков
экспериментальных животных (p < 0.05). Основной вклад в высокий суммарный фонд
АК вносят цистеиновая и аспарагиновая кислоты, тканевое содержание которых
возросло в период вынужденной голодовки хищных пиявок в 8.2 и в 7 раз,
соответственно (p < 0.001). Значимо, в 4.4 раз, повысились концентрации незаменимой
АК валина, которая является дополнительным источником энергии при эндогенном
питании, и в данном случае замещает аланин, обвальное снижение которого (в 6.5 раз)
наблюдалось в эксперименте (p < 0.001). Отмечено существенное повышение
содержания глутаминовой кислоты и глутамина (в 2.2 раз) и цистеина (в 1.7 раз) (p <
0.05). Для остальных изучаемых АК отмечено значимое, по сравнению с сытыми
особями, снижение их содержания в тканях (p < 0.05). В тканях голодающих особей H.
sanguisuga расходуются до полной утилизации незаменимые АК изолейцин и аргинин.
Обвальное снижение отмечено для НАК: метионина (в 5.3 раз), лейцина (в 9),
фенилаланина (в 6.8), лизина (в 8.4), треонина (в 2.9) и гистидина (в 3) (p < 0.001). В
итоге, пул незаменимых АК тканей голодных пиявок, на фоне повышения
аминокислотного фонда, сократился в 5.3 раз (от 24.4% до 4.62%). В связи с этим,
соотношение НАК/ЗАК масштабно снизилось от 0.34 до 0.05, что, возможно, является
одной из основных причин начала гибели голодающих животных. После пяти месяцев
голодания БЛП испытывают эндогенный токсикоз, о чем свидетельствует почти
трехкратное повышение антитоксического индекса Фишера (ИФ) от 2.25 до 6.14.
Медицинские пиявки могут существовать без пищи более длительное время, чем
хищные, поскольку кровь в их желудке еще сохраняется и после пяти месяцев
голодания. Однако в последующие месяцы вынужденной голодовки опытные особи H.
verbana, как и H. sanguisuga, переключаются на эндогенное питание с преобладанием
катаболической компоненты, о чем свидетельствуют повышенные в 1.8 раз, по
сравнению с контролем (666.1 ± 54.3 мкмоль/100г), суммарные концентрации
свободных АК (1218.3 ± 101.7) (p < 0.05). Аминокислотный фонд голодных особей МП
повышен за счет роста тканевых концентраций аспартата (в 5.3 раз), серина (в 2.9),
глутамата и глутамина (в 2), аланина (в 1.2), изолейцина (в 1.6) и гистидина (в 1.4) (p <
0.05). Весомый вклад в высокий уровень аминокислотного обмена у голодающих МП
вносит γ-аминомасляная кислота, стимулирующая дыхательную активность тканей,
концентрации которой повышаются у опытных особей в 27 раз (p < 0.001). Наибольший
спад концентраций в тканях голодных особей H. verbana характерен для: цистеиновой
кислоты (в 2.3 раз), пролина (в 5.6), орнитина (в 2.7) и аргинина (в 4.4) (p < 0.01).
26
Хроническое голодание вызывает существенное (в 2.6 раз) снижение процентного
содержания пула НАК в тканях H. verbana (от 20.9% до 8.12%) и соотношения
НАК/ЗАК (от 0.28 до 0.09). Одновременно повышаются значения ИФ (от 3.58 до 5.96),
характеризующие эндогенный токсикоз у медицинских пиявок, содержащихся семь
месяцев без пищи.
Медицинские пиявки, выращенные на биофабрике, способны голодать дольше,
более 12 месяцев, чем особи из природных популяций. Определение содержаний
свободных АК и МЭ в тканях медицинских пиявок, выращенных на биофабрике, на
разных сроках голодания имеет не только теоретический интерес, но и практическую
ценность, поскольку в настоящее время МП используют не только нативно (при
гирудотерапии), но и гомогенаты их тканей служат сырьем для фармацевтической и
косметологической продукции, а основным параметром пиявок в качестве
лекарственного средства является срок голодания, которым определяется наличие в
составе секрета слюнных желез сбалансированного комплекса биологически активных
веществ (Шестаков и др., 2007).
Показано, что хроническое голодание сопровождается существенным изменением
концентраций практически всех изучаемых МЭ в тканях H. verbana (p < 0.05) (табл. 7).
На всех этапах опыта, по сравнению с контролем, отмечено значимое снижение
содержаний Fe и Ni, тогда как концентрации остальных МЭ в тканях пиявок,
значительно повышались или имели фазовую динамику (p < 0.05). В тканях опытных
особей МП наибольшей дисперсии подвержены концентрации Ca, Fe и Cu (H4; 25 > 22.1;
p < 0.001), наименьшей – Ni и Sr (H4; 25 < 20.4; p < 0.001), что свидетельствует о
регулирующей роли эссенциальных МЭ в поддержании гомеостаза при хроническом
голодании (Ковальчук и др., 2011а).
Таблица 7 – Динамика содержания макро- и микроэлементов (МЭ, мкг/г сырой массы) в
тканях H. verbana, выращенных на биофабрике при хроническом голодании, M ± SE
МЭ
Контроль
Продолжительность голодания H. verbana, месяцы
мкг/г
(сытые)
3
5
7
12
Cu
2.01 ± 0.03 2.65 ± 0.01* 3.38 ± 0.02* 3.57 ± 0.08* 2.51 ± 0.01*
Zn
20.5 ± 0.73 47.3 ± 1.49* 58.4 ± 1.84* 72.4 ± 2.54* 32.5 ± 4.01*
Mn
0.83 ± 0.01 1.01 ± 0.02* 0.63 ± 0.03*
0.85 ± 0.01
0.51 ± 0.02*
Fe
346.3 ± 8.77 142.6 ± 4.02* 171.5 ± 1.74* 186.5 ± 2.64* 125.4 ± 1.96*
Ca
51.3 ± 1.39
48.3 ± 1.79 197.3 ± 1.54* 255.1 ± 5.31* 91.9 ± 3.51*
Mg
65.6 ± 1.37 73.2 ± 2.06* 109.5 ± 2.72* 144.7 ± 6.84* 83.2 ± 2.37*
Co
0.83 ± 0.02
0.77 ± 0.02
1.15 ± 0.02* 1.43 ± 0.03* 0.67 ± 0.01*
Sr
0.51 ± 0.01 0.33 ± 0.01* 0.25 ± 0.03* 1.41 ± 0.20* 0.33 ± 0.01*
Ni
2.84 ± 0.05 1.92 ± 0.02* 2.51 ± 0.06* 2.57 ± 0.02* 2.51 ± 0.04*
Cd
0.33 ± 0.02 0.23 ± 0.01* 0.31 ± 0.01* 0.43 ± 0.01* 0.52 ± 0.01*
Pb
1.17 ± 0.02 1.77 ± 0.02* 2.08 ± 0.02* 2.44 ± 0.06* 1.33 ± 0.02*
∑ МЭ 492.2 ± 12.4 320.1 ± 9.47* 547.0 ± 8.03* 671.4 ± 17.7* 341.4 ± 12.0*
Примечание: * - различия c контролем статистически значимы (p < 0.05)
Обнаружено, что при голодании в тканях пиявок, на фоне повышенных
содержаний МЭ, значимо возрастают суммарные концентрации свободных АК (H4; 25 =
23.2; p = 0.0001), достигая максимальных значений после пяти месяцев (рис. 10).
27
Учитывая, что в этот период были отмечены и высокие тканевые концентрации
эссенциальных МЭ (на фоне пониженного содержания токсичных металлов), в качестве
оптимального срока голодания при использовании гомогенатов тканей пиявок в
производстве лекарственных и косметических средств можно рекомендовать пять
месяцев. Многократное повышение суммарных концентраций в тканях голодных МП
обусловлено преобладанием катаболических процессов в их организме. При этом
наблюдается значительная динамика концентраций заменимых АК и стабильный
уровень пула НАК (на 3-й, 5-й и 7-й месяцы), что является существенным фактором
поддержания гомеостаза в организме голодающих животных (рис. 10) (Черная и др.,
2009; Ковальчук и др., 2011).
фонд АК
заменимые АК
незаменимые АК
АК, мкмоль/100 г
2000
Рисунок 10 – Динамика
содержания свободных
аминокислот (АК,
мкмоль/100г) в тканях
H. verbana, выращенных
на биофабрике, при
хроническом голодании
1500
1000
500
0
контроль
3
5
7
12
Продолжительность голодания, месяцы
При хроническом голодании медицинских пиявок наблюдается дефицит
отдельных групп АК и нарушение их оптимального соотношения в организме. Так,
кратно снижается процентное содержание НАК (от 39.5% до 8.54%) и, соответственно,
соотношение НАК/ЗАК (от 0.72 до 0.10).
Хроническое голодание оказывает влияние на уровень содержания всех изучаемых
свободных АК в тканях опытных МП (p < 0.001). Наибольшие различия характерны для
тканевых концентраций цистеиновой кислоты, аспарагиновой кислоты, серина,
глутамата, пролина, глицина, аланина, изолейцина, лейцина, гистидина, аргинина (H4; 25
> 21.9; p < 0.001).
Выявлены высокие корреляционные связи между продолжительностью голодания
пиявок и процентным содержанием некоторых АК в их тканях: положительные для
аспартата (rS = 0.70) и глутамата (rS = 0.91); отрицательные – для аланина (rS = -0.77),
валина (rS = -0.78), изолейцина (rS = -0.84), лейцина (rS = -0.83), тирозина (rS = -0.90) и
фенилаланина (rS = -0.82) (p < 0.0001).
При проведении корреляционного анализа в парах «МЭ-АК» было получено 78
значимых корреляционных связей, 15 из которых отрицательные, 63 – положительные,
что свидетельствует о тесной сопряженности минерального и аминокислотного
обменов, протекающих в организме голодающих МП (p < 0.01). Очень высокие
положительные связи (rS > 0.90) выявлены в корреляционных парах «Ca-CA», «CuGlu+gln», «Zn-Gly» и «Zn-Orn», «Pb-Gly» и «Pb-Orn» (p < 0.001). Очень высокая
отрицательная связь (rS = -0.97) обнаружена между Fe и His (p < 0.001).
28
Глава 8 Влияние экстремально высоких концентраций Cu, Zn, Cd, Pb на
динамику их накопления и состояние аминокислотного спектра тканей хищных и
кровососущих гирудинид в модельном эксперименте
Экспериментально показано, что устойчивость кровососущих и хищных пиявок к
избыточному присутствию ТМ в водной среде изменяется в ряду: H. verbana
(биофабрика) > H. sanguisuga > H. verbana (природные популяции). После 14-ти суток
экспозиции наблюдалась гибель опытных особей: H. sanguisuga – в кадмиевом растворе,
H. verbana из природных популяций – в растворах Cd и смеси ТМ (Нохрина и др., 2009;
Черная, Ковальчук, 2014).
Обнаружено, что динамика концентраций ТМ в тканях интоксицированных
пиявок, зависит, как от их эколого-физиологических особенностей, так и от природы и
сроков экспозиции токсикантов. Фазовый характер динамики тканевых концентраций
Cu, Zn, Cd, Pb указывает на их частичную элиминацию на отдельных этапах
эксперимента.
При изучении специфики биоаккумуляционной активности гирудинид было
обнаружено, что особи всех экспериментальных групп интенсивнее накапливают Cu и
Pb в смеси ТМ, а не в растворах солей одноименных металлов (рис. 11). Опытные особи
H. sanguisuga и H. verbana, выращенные на биофабрике, эссенциальный Zn депонируют
в большей степени в цинковом растворе. Наибольшие различия в характере накопления
выявлены для Cd: H. sanguisuga аккумулируют этот токсичный металл интенсивнее в
смеси ТМ, H. verbana из природных популяций – в одноименном растворе, а
выращенные H. verbana – в равной мере и в растворах Cd и в смеси ТМ (рис. 11).
6
рCu
КН (Cu)
2
рZn
КН (Zn)
Cu+Zn+Cd+Pb
Cu+Zn+Cd+Pb
4
1
2
0
0
H.sanguisuga
25
20
H.verbana,
природные
H.verbana,
биофабрика
H.sanguisuga
КН (Cd)
рCd
H.verbana,
природные
H.verbana,
биофабрика
рPb
9
КН (Pb)
Cu+Zn+Cd+Pb
Cu+Zn+Cd+Pb
6
15
10
3
5
0
0
H.sanguisuga
H.verbana, H.verbana,
природные биофабрика
H.sanguisuga
H.verbana,
природные
H.verbana,
биофабрика
Рисунок 11 – Коэффициенты накопления (КН) у пиявок в растворах одноименных
металлов (р«ТМ») и в смеси ТМ (Cu+Zn+Cd+Pb)
29
Сравнительная оценка способности к накоплению у экспериментальных групп
пиявок показала, что особи H. sanguisuga, в большей степени, чем МП, аккумулируют
Zn и Pb – их содержание в тканях, по сравнению с контрольными значениями,
максимально повысились за время эксперимента в 1.9 и 8.3 раз, соответственно (p <
0.01). Особи H. verbana из природных популяций эффективнее других групп пиявок (в
5.9 раз) накапливают Cu (p < 0.001). При накоплении токсичного Cd наибольшую
активность проявляют МП, выращенные на биофабрике – уровень его содержания
максимально повысился в тканях H. verbana более чем в 20 раз (p < 0.0001) (рис. 11).
Отметим, что все опытные группы пиявок депонируют в своих тканях токсичные
металлы (Pb и Cd) интенсивнее, чем эссенциальные (Cu и Zn).
В модельном эксперименте наибольшая дисперсия характерна для тканевых
концентраций ТМ: Cd и Pb у H. sanguisuga (F11; 76 = 1150.8 и F11; 76 = 1595.8; p = 0.0000),
Cu и Cd у природных особей H. verbana (F7; 56 = 139.5 и F7; 56 = 251.5; p = 0.0000) и Cd у
H. verbana, выращенных на биофабрике (F12; 80 = 405.2; p = 0.0000).
При оценке влияния ТМ на аминокислотный обмен хищных и кровососущих
гирудинид был выявлен значительный рост суммарного фонда свободных АК в тканях
особей всех экспериментальных групп (rS составил от 0.50 до 0.97), что свидетельствует
о катаболических процессах в организме интоксицированных пиявок (рис. 12) (Нохрина
и др., 2009; Черная, Ковальчук, 2014). Максимальное повышение значений пула АК
наблюдали у всех опытных пиявок при их экспозиции в смеси ТМ: у H. sanguisuga – на
7-е сутки эксперимента (в 4.1 раз), у H. verbana обеих физиологических групп – на 14-е
сутки (у природных особей – в 4.3 раз, у выращенных – в 2.5) (рис. 12).
мкмоль/100г
мкмоль/100г
H.sanguisuga
4000
4000
3000
3000
2000
2000
1000
1000
Cu
Zn
Cd
Pb
H.verbana (природные популяции)
сТМ
Cu
Cd
сТМ
Pb
0
0
контроль
мкмоль/100г
7
сутки
H.verbana
14
контроль
21
7
сутки
14
21
(биофабрика)
4000
Рисунок 12 – Влияние тяжелых
металлов на фонд свободных
аминокислот (мкмоль/100г) в тканях
экспериментальных особей хищных и
кровососущих гирудинид
3000
2000
1000
Cu
Zn
Cd
Pb
сутки
14
сТМ
0
контроль
7
21
30
При экспозиции Cu, Pb, Cd, сТМ в тканях особей H. sanguisuga наблюдали
значительное снижение показателей соотношения основных метаболических групп
НАК/ЗАК, наиболее ярко выраженное на 7-е сутки в растворе Cu, на 14-е – в растворе
Cd и на 21-е – в смеси растворов ТМ. Вместе с тем, в цинковом растворе, напротив, на 7е сутки у H. sanguisuga отмечен рост критерия НАК/ЗАК (табл. 8).
Таблица 8 – Показатели соотношения метаболических групп АК в тканях H. sanguisuga
(H.s.), H. verbana из природных популяций (H.v. п/п) и выращенных на биофабрике
(H.v. б/ф) при экспозиции ТМ и их смеси
контроль
АК
H.s
H.v
п/п
H.v
б/ф
H.s
НАК/ЗАК
ИФ
0.42
3.70
0.27
3.24
0.32
3.43
0.19
5.00
НАК/ЗАК
ИФ
0.42
3.70
0.27
3.24
0.32
3.43
0.53
3.41
НАК/ЗАК
ИФ
0.42
3.70
0.27
3.24
0.32
3.43
0.36
4.21
НАК/ЗАК
ИФ
0.42
3.70
0.27
3.24
0.32
3.43
0.31
3.45
НАК/ЗАК
ИФ
0.42
3.70
0.27
3.24
0.32
3.43
0.33
7.28
Сутки экспозиции ТМ
7
14
H.v
H.v
H.s
H.v
H.v
H.s
п/п
б/ф
п/п
б/ф
Cu
0.31 0.20 0.34 0.32 0.25 0.25
4.44 4.18 9.15 5.18 8.52 3.66
Zn
–
0.20 0.42
–
0.17 0.40
–
3.75 3.52
–
4.82 3.47
Cd
0.44 0.39 0.19 0.44 0.35
–
3.31 3.42 8.00 2.52 3.47
–
Pb
0.31 0.20 0.32
–
0.24 0.31
3.56 3.90 3.49
–
4.41 3.51
Cu + Zn + Cd + Pb
0.43 0.22 0.37 0.46 0.14 0.20
7.60 5.32 6.34 16.3 4.52 5.56
21
H.v.
п/п
H.v
б/ф
0.26
3.70
0.30
4.23
–
–
0.28
3.98
–
–
0.34
3.19
0.31
3.19
0.28
3.35
–
–
0.24
6.13
У особей H. verbana, выращенных на биофабрике, снижение значений НАК/ЗАК
выявлено при экспозиции в растворах Cu, Zn, Pb и смеси ТМ на протяжении всего
эксперимента (особенно критично на 14-е сутки в растворах цинка и смеси металлов), в
отличие от медицинских пиявок из природных популяций, у которых наблюдали
стабильность или рост этих показателей. Рост значений НАК/ЗАК в тканях H. verbana из
природных популяций обусловлен уменьшением пула заменимых АК, в основном за
счет обвального падения процентного содержания глутаминовой кислоты и глутамина,
исходные значения которых в контроле достигали 29.4%, а концу эксперимента не
превышали 6.6% во всех модельных растворах. На протяжении опыта у пиявок всех
групп отмечено значительное повышение антитоксического индекса Фишера (ИФ) при
экспозиции в растворах Cu и смеси ТМ. У H. sanguisuga, в отличие от медицинских
пиявок, существенное отклонение от контрольных показателей ИФ наблюдали и при
интоксикации Cd (табл. 8).
Показано, что интоксикация тяжелыми металлами оказывает значимое влияние на
содержание всех свободных аминокислот в тканях пиявок исследуемых
экспериментальных групп. У H. sanguisuga очень высокий уровень дисперсии отмечен
для аспарагиновой кислоты, серина, пролина, цистеина и аргинина (F11; 76 > 215.0; p <
0.0001). У медицинских пиявок из природных популяций наибольшая дисперсия
характерна для содержания цистеиновой кислоты, серина, пролина, валина и орнитина
31
(F6; 52 > 206.0), а у особей H. verbana с биофабрики – аспарагиновой кислоты, треонина,
глутаминовой кислоты и глутамина, пролина, аланина, лейцина (F12; 80 > 292.0) (p <
0.0001). Для всех групп интоксицированных пиявок отмечена высокая изменчивость
содержания пролина в тканях, обладающего репаративными и детоксицирующими
свойствами.
Корреляционный анализ также выявил общие реакции некоторых аминокислот в
тканях всех опытных особей H. sanguisuga и H. verbana на продолжительность
воздействия Cu, Zn, Cd, Pb и смеси ТМ: снижение процентного содержания аргинина
(значения rS составили от -0.51 до -96), глутаминовой кислоты и глутамина (rS – от -0.50
до -0.97) и повышение аланина (rS – от 0.69 до 0.94) (p < 0.01). Аргинин и глутамат
являются активными детоксикантами и их утилизация вполне закономерна. Ожидаем и
объясним рост содержания аланина, участвующего в синтезе глюкозы и являющегося
дополнительным источником энергии в экстремальных ситуациях. У всех экологофизиологических групп пиявок в корреляционных парах «АКткани-ТМэкспозиция» в тех или
иных токсичных растворах выявлена высокая плотность связи (-70 > rS > 0.70; p < 0.001)
для аспарагиновой кислоты, метионина, лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина,
гистидина, что указывает на их активную роль в процессах детоксикации ТМ.
Таким образом, в контролируемых условиях экспериментальной интоксикации
кровососущих и хищных гирудинид H. sanguisuga и H. verbana показано негативное
влияние экстремально высоких концентраций тяжелых металлов на обменные процессы
пиявок и выявлена определяющая роль свободных аминокислот в детоксикационных
процессах.
Заключение
Использование эколого-физиологического подхода впервые позволило дать
оценку микроэлементного обмена и аминокислотного метаболизма у экологически
контрастных групп гирудинид. Показано, что, несмотря на определенную
универсальность формирования неспецифической адаптивной стратегии кровососущих
и хищных пиявок к воздействию природных экстремальных и антропогенных факторов,
степень участия отдельных ее компонентов обладает видовой и трофической
спецификой и зависит от эколого-физиологического статуса особей.
Установлено, что количественный состав микроэлементов и свободных
аминокислот в тканях H. sanguisuga, H. medicinalis и H. verbana видоспецифичен и в
значительной мере зависит от экологических условий мест обитания.
Показано, что качественные и количественные изменения биоэлементного спектра
в тканях гирудинид обусловлены физиологическими процессами, связанными с
сезонными особенностями их биологического цикла. Выявлены общебиологические
возрастные особенности для хищных H. sanguisuga и кровососущих H. verbana
различных эколого-физиологических групп.
Обнаружено, что у хищных пиявок H. sanguisuga, обитающих в водных
экосистемах с высокой антропогенной нагрузкой, важным метаболическим условием
поддержания гомеостаза является интенсификация аминокислотного обмена за счет
высоких тканевых концентраций аминокислот-детоксикантов.
32
Определены видовые и региональные особенности биоэлементного спектра тканей
H. medicinalis и H. verbana, выращенных на биофабриках России. Показано, что условия
искусственного разведения оказывают существенное влияние на адаптивный статус
медицинских пиявок.
Показано негативное влияние хронического голодания на состояние минерального
и азотистого обменов гирудинид различных эколого-физиологических групп и
определена роль биоэлементов в поддержании гомеостаза голодающих особей.
В контролируемых условиях экспериментальной интоксикации кровососущих и
хищных гирудинид (H. sanguisuga и H. verbana) выявлена их специфичная и высокая
способность к аккумуляции тяжелых металлов, наблюдаемая у этих экологофизиологических групп и в нативных условиях (природные водоемы и биофабрика).
Показано участие свободных аминокислот в детоксикационных процессах гирудинид
при формировании резистентности к воздействию экстремально высоких концентраций
тяжелых металлов.
Выводы
1. Экологические условия местообитаний кровососущих и хищных гирудинид в
значительной степени определяют качественную и количественную структуры
микроэлементного профиля и аминокислотного спектра их тканей, обладающих вместе
с тем видовой, популяционной и трофической спецификой. Для хищников H.
sanguisuga, в отличие от гематофагов H. medicinalis и H. verbana, характерно более
высокое содержание в тканях Cu, Zn, Mn, Pb, но меньшее – Fe, Ni, Cd. У больших
ложноконских пиявок, в отличие от медицинских, кратно снижены тканевые
концентрации цистеиновой (более чем в 2 раза) и аспарагиновой (более чем в 3 раза)
кислот, но существенно выше (более чем в 1.8 раз) суммарный пул незаменимых АК. У
симпатричных видов медицинских пиявок отсутствуют значимые различия только
между тканевыми концентрациями Cu, Mn, Ni, Pb, цистеиновой и γ-аминомасляной
кислот, валина, метионина, аргинина. У всех изучаемых видов пиявок географический
фактор определяет высокую изменчивость тканевых концентраций микроэлементов Fe,
Ni и свободных аминокислот: пролина, цистеина, аргинина. Показано, что адаптация
хищных и кровососущих гирудинид к неблагоприятным климатическим условиям
направлена на интенсификацию аминокислотного обмена за счет значительного роста
тканевых концентраций цистеиновой кислоты, аспарагиновой кислоты и суммарного
паттерна незаменимых АК.
2. Хищные и кровососущие гирудиниды, независимо от видовой и биотопической
принадлежности, проявляют наибольшую аккумуляционную активность к Zn (КБН > 2),
наименьшую – к Fe и Mn (КБН < 1). Выявлено, что содержание Cu, Fe, Ni, Cd, Pb в
тканях H. sanguisuga, H. medicinalis и H. verbana напрямую зависит от концентраций
этих металлов в среде обитания (донные отложения) (rS > 0.45).
3. Изменение биоэлементного баланса в тканях H. sanguisuga и H. verbana,
уходящих в зимний анабиоз: дефицит эссенциальных микроэлементов (Cu, Zn, Mn, Fe),
избыток экотоксикантов (Cd, Ni), максимальные концентрации суммарного фонда АК
(3058.6±39.2 и 2437.0±66.3 мкмоль/100г, соответственно), минимальные значения
НАК/ЗАК (0.10 и 0.12), высокие показатели антитоксического индекса Фишера (8.26 и
33
7.48 при норме 3.0±0.5), свидетельствует о высокой пластичности метаболических
процессов, способствующей развитию неспецифической резистентности пиявок к
экстремальным нагрузкам.
4. Общим для возрастных особенностей H. sanguisuga и H. verbana различных
эколого-физиологических групп является то, что: в тканях взрослых особей, по
сравнению с их молодью, существенно повышены концентрации Zn, Fe и понижены –
Mn, Cd, для них характерны более низкие уровни аминокислотного обмена (более чем в
2 раза), следовое содержание таурина и триптофана. Показано, что у медицинских
пиявок H. verbana в процессе интенсивного роста и развития на биофабрике линейно
повышаются тканевые концентрации Cu, Zn, Fe, Ni, цистеиновой кислоты, треонина,
серина, валина, цистеина, метионина, тирозина и фенилаланина (rS = 0.39-0.89) и
снижаются – Cd, таурина, глутамата и глутамина, пролина, глицина, цитруллина,
изолейцина, лейцина, триптофана, орнитина, лизина и аргинина (rS = –0.56 - –0.98).
5. Обнаружено, что хищные гирудиниды, обитающие в антропогенномодифицированных водных объектах Урала, существенно отличаются от особей H.
sanguisuga фоновых территорий по ряду показателей: более высокими концентрациями
Cu, Zn, Mn, Fe, Cd, Pb и аминокислотного фонда (в 1.5-2.0 раза), обеднением
процентного содержания пула незаменимых АК (17.6-20.8% и 24.6-28.3%,
соответственно), повышенными значениями антитоксического индекса Фишера (4.295.31 и 1.89-3.18) в тканях. Вместе с тем значительные тканевые резервы свободных
аминокислот,
обладающих
энергообеспечивающими,
детоксикационными
и
репарационными свойствами (цистеиновая и аспарагиновая кислоты, треонин, серин,
глицин, аланин, цистеин, орнитин, гистидин), на фоне пониженной кумулятивной
активности к тяжелым металлам (Fe, Ni, Pb), обеспечивают большим ложноконским
пиявкам высокий адаптивный потенциал к персистентному воздействию экотоксикантов
и способствуют выживанию в условиях антропогенного пресса.
6. Медицинские пиявки H. verbana, выращенные в искусственно созданных
условиях, отличаются от особей из природных популяций более высоким содержанием
в тканях эссенциальных и токсичных металлов (Cu, Fe, Cd, Ni, Pb), свободных
аминокислот, обладающих иммуностимулирующими и детоксицирующими свойствами:
метионина (0.64% и 0.32%, соответственно), гистидина (0.12% и 0.06%), цистеина
(0.32% и 0.15%), изолейцина (1.31% и 0.65%) и основных метаболических групп АК:
незаменимых (17.6% и 11.8%, соответственно), с разветвленной углеродной цепью
(8.3% и 5.6%), ароматических (2.60% и 1.56%), серосодержащих (1.43% и 1.25%).
Сочетанная интенсификация микроэлементного и аминокислотного обменов в
организме пиявок, выращенных на биофабрике, способствует формированию
неспецифической резистентности особей к экстремальным факторам среды.
7. Биоэлементный спектр секрета слюнных желез медицинских пиявок H. verbana
характеризуется высоким процентным содержанием эссенциальных МЭ (Ca+Mg+Zn =
98.8% от суммарного фонда), незаменимых АК (32.6%) и крайне низким паттерном
тяжелых металлов (Ni+Cd+Pb=0.04%), что обусловлено барьерной функцией слюнных
желез и депонирующей роли мышечных тканей.
8. Установлено, что способность пиявок к длительному голоданию повышается в
ряду: H. sanguisuga < H. verbana (природные популяции) < H. verbana (биофабрика). В
34
условиях хронического голодания общим трендом для тканей хищных и кровососущих
гирудинид является: существенные потери биофильного Fe и повышение концентраций
Zn и Cd, значимый рост (более чем в 1.5 раз) суммарных концентраций свободных АК и
обвальное падение (более чем в 2.6 раз) процентного содержания незаменимых АК. На
модельных популяциях медицинских пиявок H. verbana показано, что способность
поддерживать физиологические функции при хроническом голодании обусловлена
межсистемной кооперацией азотистого и минерального обменов.
9. Экспериментально показано, что устойчивость пиявок к интоксикации
тяжелыми металлами повышается в ряду: H. verbana (природные популяции) < H.
sanguisuga < H. verbana (биофабрика). В опыте максимальной накопительной
способностью к Zn и Pb (КН составили 1.9 и 8.3, соответственно) отличались хищные
гирудиниды, к Cu (КН = 5.9) – медицинские пиявки из природных популяций, к Cd (КН
= 20.7) – особи H. verbana, выращенные на биофабрике. Обнаружено, что комплекс
адаптационно-компенсаторных реакций в организме интоксицированных гирудинид
обладает трофической и внутривидовой спецификой, зависит от природы и сроков
экспозиции экотоксикантов, но имеет общие закономерности – кратный рост
аминокислотного фонда и аланина, активная утилизация аргинина, глутаминовой
кислоты и глутамина в тканях.
10. Результаты проведенных комплексных натурных и экспериментальных
исследований позволили оценить регуляторную роль эссенциальных металлов и
свободных аминокислот в формировании адаптивных стратегий челюстных пиявок
экологически контрастных групп к экстремальным факторам среды. Показано, что
тесная сопряженность микроэлементного обмена и аминокислотного метаболизма в
тканях кровососущих и хищных гирудинид в значительной мере обусловливает их
экологическую пластичность.
Практические рекомендации
1.
Результаты
выполненных
исследований
позволяют
рекомендовать
использование медицинских и больших ложноконских пиявок в качестве биомаркеров
при мониторинге загрязнения водных экосистем тяжелыми металлами (Cu, Fe, Ni, Cd,
Pb) в различных регионах России.
2. Выявленные физиологические потребности H. verbana в эссенциальных макрои микроэлементах и свободных аминокислотах на разных этапах роста и развития могут
способствовать оптимизации технологии разведения медицинских пиявок в
искусственно созданных условиях на биофабриках.
3. Сведения о региональных особенностях биоэлементного спектра тканей
медицинских пиявок H. medicinalis и H. verbana, выращенных на биофабриках России,
могут быть использованы для направленного подбора приоритетных эссенциальных
микроэлементов и свободных аминокислот (с учетом их специфических свойств) в
разработке принципиально новых гирудофармакологических и косметических
препаратов.
4. Оптимальным для использования гомогенатов тканей медицинских пиявок H.
verbana в промышленных целях является пятимесячный срок голодания (высокий
уровень содержания свободных аминокислот и эссенциальных микроэлементов, и
низкие концентрации экотоксикантов).
35
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах из списка ВАК
1.
Ковальчук Л.А. Видовое разнообразие пиявок, обитающих в водоемах Среднего
Урала / Л.А. Ковальчук, Л.В. Черная // Экология. – 2003. – № 2. – С. 158-160.
2.
Черная Л.В. Содержание свободных аминокислот в тканях медицинских пиявок
различных физиологических групп / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Е.А. Басмаджян // Вестник
Уральской медицинской академии науки. – 2006. – № 3-2 (15). – С. 123-124.
3.
Черная Л.В. Пиявки как индикаторы загрязнения водных объектов Свердловской
области тяжелыми металлами / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Водное хозяйство России:
проблемы, технологии, управление. – 2007. – № 3. – С. 85-92.
4.
Чеботина М.Я. Индикация химического загрязнения водоема-охладителя АЭС с
помощью планктонных организмов / М.Я. Чеботина, Л.В. Черная, В.П. Гусева, Л.А. Ковальчук
// Водное хозяйство России: проблемы, технологии, управление. – 2007. – № 2. – С. 34-42.
5.
Ковальчук Л.А. Основной обмен и содержание микроэлементов в тканях
медицинских пиявок (Hirudo medicinalis L.) из природных популяций и выращенных в
искусственных условиях биофабрики / Л.А. Ковальчук, Л.В. Черная, А.Э. Тарханова, Е.С.
Нохрина // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2007. – № 4. – С. 49-53.
6.
Черная Л.В. Свободные аминокислоты пиявок с различной трофической
организацией / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Вестник Оренбургского государственного
университета. – 2008. – № 10(92). – С. 225-229.
7.
Черная Л.В. Оценка состояния аминокислотного пула в тканях медицинской пиявки
Hirudo medicinalis L. при хроническом голодании / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Н.Т. Казиев,
Е.С. Нохрина // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2009. – № 2(25). – С.
240-241.
8.
Черная Л.В. Распространение пиявок в водных экосистемах города Екатеринбурга и
его окрестностей / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Экология. – 2009. – № 2. – С. 122-126.
9.
Нохрина Е.С. Динамика накопления тяжелых металлов в тканях медицинской
пиявки Hirudo medicinalis L. в модельном эксперименте / Е.С. Нохрина, Л.А. Ковальчук, Л.В.
Черная // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2009. – № 2(25). – С. 145146.
10. Черная Л.В. Содержание тяжелых металлов в тканях пиявок, обитающих в озерах
Южного Урала / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Вестник Оренбургского государственного
университета. – 2010. – № 12(118). – С. 65-68.
11. Черная Л.В. Пиявки водных объектов Екатеринбурга и их биоаккумуляционные
возможности / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Экология урбанизированных территорий. – 2010а.
– № 3. – С. 17-21.
12. Ковальчук Л.А. Исследование аминокислотного спектра секрета слюнных желез
медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.) / Л.А. Ковальчук, Л.В. Черная, Г.И. Никонов, Е.А.
Титова // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2011. – № 3(36). – С. 71-73.
13. Ковальчук Л.А. Элементный и аминокислотный состав тканей медицинской пиявки
Hirudo medicinalis L. при хроническом голодании / Л.А. Ковальчук, Л.В. Черная, Е.С. Нохрина
// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2011а. – № 6. – С. 61-64.
14. Черная Л.В. Возрастная динамика макро- и микроэлементов в тканях медицинской
пиявки (Hirudo verbana Carena) / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Вестник Оренбургского
государственного университета. – 2011. – № 12. – С. 169-171.
15. Ковальчук Л.А. Элементный и аминокислотный спектр секрета слюнных желез и
тканей медицинских пиявок. Значение для гирудотерапии / Л.А. Ковальчук, Л.В. Черная //
Вестник восстановительной медицины. – 2013. – № 2. – С. 36-39.
16. Черная Л.В. Влияние тяжелых металлов на состояние аминокислотного пула тканей
пиявок Haemopis sanguisuga (L. 1758) в модельном эксперименте / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук
// Вода: химия и экология. – 2014. – № 9. – С. 69-72.
36
17. Черная Л.В. Аминокислотный фонд тканей медицинских пиявок Hirudo medicinalis
L. 1758 и Hirudo verbana Carena, 1820, выращенных в искусственных условиях региональных
биофабрик России (значение для гирудофармакотерапии) / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С.
Нохрина, Г.И. Никонов, Г.В. Дегунец, М.П. Дегунец // Вестник Уральской медицинской
академической науки. – 2014. – № 3 (49). – С. 65-66.
18. Черная Л.В. Географическая и сезонная изменчивость аминокислотного спектра
тканей большой ложноконской пиявки Haemopis sanguisuga L. / Л.В. Черная // Современные
проблемы науки и образования. – 2014. – №6; URL: http://www.science-education.ru/120-15322
(дата обращения: 11.11.2014).
Публикации в прочих журналах
19. Черная Л.В. Фауна пиявок озер Ильменского заповедника / Л.В. Черная, Л.А.
Ковальчук // Известия Челябинского научного центра УрО РАН: (электрон. журн.). – 2007. –
Вып. 1 (35). – С. 123-124; URL: http://csc.ac.ru/ej/file/3813.
20. Черная Л.В. Оценка микроэлементного обмена медицинских пиявок Hirudo
medicinalis officinalis / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С. Нохрина // Микроэлементы в
медицине. – 2008.– Т. 9. – Вып. 12. – С. 33-34.
21. Нохрина Е.С. Состояние микроэлементного и азотистого обмена при адаптации
медицинских пиявок (Hirudo medicinalis L.) к условиям искусственного разведения на
биофабрике / Е.С. Нохрина, Л.А. Ковальчук, Л.В. Черная, А.Э. Тарханова // Микроэлементы в
медицине. – 2008. – Т. 9. – Вып. 12. – С. 26-27.
22. Chernaya L.V. Macro- and microelements in tissues of the medical leech (Hirudo verbana
Сarena), grown at a biofarm in the starvation dynamics / L.V. Chernaya // Микроэлементы в
медицине. – 2010. – Т. 11. – Вып. 2. – С. 6.
23. Chernaya L.V. Peculiarities of microelement metabolism in the medical leech (Hirudo
medicinalis L.) tissues from natural populations / L.V. Chernaya, L.A. Kovalchuk, E.S. Nokhrina //
Микроэлементы в медицине. – 2010. – Т. 11. – Вып. 2. – С. 6.
24. Chernaya L. Hirudinea fauna of industrial region in the Ural Mountains / L. Chernaya //
Lauterbornia. – 2012. – H. 75. – P. 71-74.
25. Черная Л.В. Возрастные особенности аминокислотного пула в тканях хищной
пиявки Haemopis sanguisuga L. 1758 (Hirudinea: Clitellata) / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук //
Международный журнал экспериментального образования. – 2014а. – № 1. – С. 45-48.
Коллективная монография
26. Khokhutkin I.M., Kovalchuk L.A., Chernaya L.V. Biodiversity end ecology of
hydrobionts in the natural and anthropogenic landscapes // Biodiversity research developments /
Raymund I. Veritas, ed.-New York: Nova Sci. Publ. – 2008. – Chap. 1. – P. 1-19.
Статьи и тезисы, опубликованные в других научных изданиях
27. Черная Л.В. Возможность использования некоторых видов пиявок в качестве
биоиндикаторов на загрязнение водных экосистем тяжелыми металлами / Л.В. Черная, Л.А.
Ковальчук // Экологические проблемы северных регионов и пути их решения: мат. Междунар.
конф. Апатиты. – 2004. – Ч. 1. – С. 221-222.
28. Черная Л.В. Изучение свободных аминокислот в тканях медицинской пиявки Hirudo
medicinalis из природной популяции / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С. Нохрина // Науч. труды
I съезда физиологов СНГ, Сочи, Дагомыс. – М. – 2005. – Т. 2. – С. 15.
29. Черная Л.В. Влияние токсикантов на состояние азотистого метаболизма пиявок /
Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Биоиндикация и мониторинг пресноводных экосистем: тез. докл.
Междунар. конф. – Санкт-Петербург, 2006. – С. 160.
30. Черная Л.В. Сравнительная оценка биоаккумуляционных возможностей пиявок на
заповедных и антропогенных территориях Южного Урала / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук //
Горные экосистемы и их компоненты: тр. Междунар. конф. – Нальчик, 2007. – Ч. 3. – С. 182185.
37
31. Черная Л.В. Физиологические особенности медицинских пиявок (Hirudo medicinalis
L.) из природной популяции и выращенных в искусственных условиях биофабрики / Л.В.
Черная, Л.А. Ковальчук // XX съезд физиологического общества им. И.П. Павлова: тез. докл. –
М.: Русский врач. – 2007а. – С. 473.
32. Черная Л.В. Роль свободных аминокислот в адаптации медицинских пиявок (Hirudo
medicinalis L.) к экстремально высоким концентрациям тяжелых металлов в водной среде / Л.В.
Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С. Нохрина // Эколого-физиологические проблемы адаптации: мат.
XIV Междунар. симп. – М.: РУНД. – 2009. – С. 442-444.
33. Черная Л.В. Аминокислотный спектр тканей медицинских пиявок Hirudo medicinalis
L. из различных природных популяций // Первые Международные Беккеровские чтения. –
Волгоград, 2010. – Ч. 1. – С. 558-560.
34. Черная Л.В. Изучение биоаккумуляционных возможностей пиявок (Hirudinea),
обитающий в водных экосистемах Висимского биосферного заповедника // Биологические
системы: устойчивость, принципы и механизмы функционирования: сб. мат. III Всеросс. науч.практ. конф. с междунар. участием. – Нижний Тагил, 2010а. – Ч. 2. – С. 354-359.
35. Черная Л.В. Сравнительный анализ состояния аминокислотного пула хищных и
кровососущих пиявок / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С. Нохрина // XXI Съезд
Физиологического общества им. И.П. Павлова: тез. докл. – М.; Калуга, 2010. – С. 672.
36. Черная Л.В. Адаптационно-компенсаторные возможности медицинских пиявок к
экстремально высоким концентрациям тяжелых металлов в модельном эксперименте / Л.В.
Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С. Нохрина // Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М.
Кожова: тез. докл. Междунар. науч. конф. – Иркутск, 2010. – С. 479.
37. Chernaya L.V. State of amino acid in the tissues of freshwater leeches Haemopis
sanguisuga (L., 1758) (Hirudinea, Clitellata) of different age / L.V. Chernaya, L.A. Kovalchuk //
Hirudinea: biology, taxonomy, faunistics: 4th Intern. Conf. Wierzba. – 2011. – P. 13.
38. Nokhrina E. Estimation of the physiological state of medical leeches (Hirudo medicinalis
L.) in Lugansk National Reserve / E. Nokhrina, L. Kovalchuk, L. Chernaya // Hirudinea: biology,
taxonomy, faunistics: 4th Intern. Conf. Wierzba. – 2011. – P. 18-19.
39. Черная Л.В. Влияние абиотических и биотических факторов среды на формирование
аминокислотного спектра в тканях пресноводной хищной пиявки Haemopis sanguisuga
(Clitellata: Hirudinea) / Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук // Сучаснi проблеми бiологii, екологii та
хiмii: сб. мат. Междунар. конф. – Запорожье, 2012. – С. 172-173.
40. Черная Л.В. Оценка физиологического состояния медицинских пиявок Hirudo
medicinalis L. и Hirudo verbana Carena, обитающих в водных экосистемах России и Украины /
Л.В. Черная, Л.А. Ковальчук, Е.С. Нохрина // Х Мiжнародна Конференцiя Асоцiацii гiрудологiв
2012: мат. конф. – Харкiв, 2012. – С. 27-28.
41. Ковальчук Л.А. Содержание макро- и микроэлементов и свободных аминокислот в
тканях медицинской пиявки Hirudo verbana Carena на разных этапах развития и роста / Л.А.
Ковальчук, Л.В. Черная, Г.И. Никонов // Х Мiжнародна Конференцiя Асоцiацii гiрудологiв
2012: мат. конф. – Харкiв, 2012. – С. 57-58.
42. Chernaya L.V. Investigation of trace elements in the salivary gland secret and in the tissues
of the medical leech (Hirudo verbana Carena) / L.V. Chernaya, L.A. Kovalchuk // Fifth International
Congress of the Federation of the European Societies for Trace Elements and Minerals. FESTEM –
Avignon. – 2013. – P. 208.
43. Черная Л.В. Сезонная динамика биологически активных соединений в тканях
пресноводной пиявки Haemopis sanguisuga L. 1758, обитающей на Среднем Урале // Горные
экосистемы и их компоненты: мат. Всеросс. конф. – Нальчик, 2014. – С. 131-132.
38
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
10
Размер файла
733 Кб
Теги
особенности, эколог, кровососущих, hirudinidae, физиологические, пиявок, хищные, hirudinea
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа