close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Исследование К+ каналов К2Р и ВК типов в мезенхимных стромальных клетках

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Тарасов
Михаил Васильевич
ИССЛЕДОВАНИЕ K+ КАНАЛОВ K2P И BK ТИПОВ
В МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
03.01.02 – биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пущино – 2015
Работа выполнена в Лаборатории Молекулярной физиологии клетки
Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института
биофизики клетки Российской академии наук.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Колесников Станислав Сергеевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Негуляев Юрий Алексеевич,
(зав. лаб. Ионных механизмов клеточной
сигнализации ФГБУН Института цитологии РАН,
г. Санкт-Петербург)
доктор биологических наук
Гришин Сергей Николаевич
(доцент кафедры Медицинской и биологической
физики с информатикой и медицинской
аппаратурой
ГБОУ
ВПО
Казанского
государственного медицинского университета
Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации, г. Казань)
Ведущая организация:
Федеральное
государственное
бюджетное
учреждение науки Институт эволюционной
физиологии и биохимии имени И. М. Сеченова
Российской академии наук, г. Санкт-Петербург
Защита состоится «20» января 2016 г. в 15 час. 30 мин. на заседании Совета
Д002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата
наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном
государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и
экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290,
Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по
адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, и на сайте
ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru
Автореферат диссертации разослан «___» ___________ 2015 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
к.ф.-м.н.
Н.Ф. Ланина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) – это недифференцированные
клетки, локализованные в периваскулярном пространстве практически всех
органов взрослого организма (Crisan et al., 2008; Corselli et al., 2010). Они
участвуют в разнообразных биологических процессах, таких как поддержание
гемопоэтических стволовых клеток, регенерация тканей и регуляция локальных
иммунных ответов. Эти биологические функции МСК обеспечиваются тем, что
популяция этих клеток способна самоподдерживаться путем пролиферации и
дифференцироваться в адипоциты, остеобласты, хондроциты и другие клетки.
Кроме того, в недифференцированном состоянии МСК могут экспрессировать
широкий спектр молекул адгезии, секретировать цитокины и факторы роста и
мигрировать в сайты повреждения тканей в ответ на выбрасываемые ими
факторы (Kalinina et al., 2011; Nombela-Arieta et al., 2011; Sohni, Verfaillie, 2013;
Ma et al., 2014).
Исследования МСК ведутся уже более 40 лет. Подавляющее большинство
работ в данной области имеют прикладную направленность и, прежде всего,
касаются разработки вопросов, связанных с использованием МСК с целью
коррекции нейродегенеративных заболеваний и восстановления поврежденных
органов. На сегодняшний день имеются лишь немногочисленные работы в
области молекулярной биологии, биофизики и физиологии МСК, особенно на
уровне одиночных клеток. В целом выполненные исследования формируют
довольно общие и поверхностные представления о рецепторных механизмах,
механизмах внутриклеточной сигнализации и электрогенеза, транспортных и
регуляторных системах МСК, которые детерминируют фундаментальные
физиологические процессы в этих клетках (Ye, 2010; Sun et al., 2007; Sohni,
Verfaillie, 2013; Li et al., 2011).
Имеющиеся экспериментальные факты свидетельствуют о значительной
роли ионных каналов в регуляции ряда клеточных функций, которые
представляются ключевыми в физиологии МСК, такие, как пролиферация,
дифференцировка, миграция клеток и трансдукция химических и
механических стимулов (Prevarskaya et al., 2007; Pla, Gkikka, 2013; Urrego et
al., 2014; Bose et al., 2015). Вполне вероятно, что ионные каналы,
функционирующие в МСК, могут играть существенную роль в клеточном
гомеостазе и поддержании их плюрипотентности. Между тем, мало что
известно о спектре и свойствах ионных каналов, активных в покое и
активирующихся при стимуляции этих клеток. Лишь единичные работы были
посвящены изучению электрической активности МСК (Heubach et al., 2003; Li
3
et al., 2011). С другой стороны, в результате многолетних работ в области
биофизики
и
фармакологии
ионных
каналов
в
различных
дифференцированных клетках и модельных экспрессионных системах в
литературе накоплен огромный объем данных о свойствах большинства
существующих в природе ионных каналов (Kurachi, North, 2004). Самые
разнообразные клетки используют десятки функциональных подтипов ионных
каналов, молекулярная природа которых еще более разнообразна, поскольку
ионный канал – это обычно мультиолигомерный комплекс субъединиц, часто
кодируемых множественными генами. Отсюда ясно, что анализ молекулярных
механизмов электрогенеза в МСК – это актуальная и сложная
фундаментальная задача в рамках физиологии МСК. Учитывая, что в
последнее десятилетие выявлена существенная роль нарушений в структуре и
функции ионных каналов в этиологии определенных клеточных и тканевых
патологий, исследование ионных каналов МСК несомненно важно и в
прикладном отношении. Данная работа представляет собой определенный шаг
в направлении расширения существующих представлений о системах ионного
транспорта в МСК.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было идентифицировать и исследовать ионные
каналы, активные в покоящихся МСК и активирующиеся в ответ на их
стимуляцию, на примере K+ каналов с двумя поровыми доменами и Са2+активируемых K+ каналов.
Решались следующие основные задачи:
1. Оценить базовые электрофизиологические характеристики МСК,
включая потенциал покоя, входное сопротивление и потенциал-зависимость
ионной проницаемости плазматической мембраны.
2. Идентифицировать ионные каналы, принимающие участие в
установлении потенциала покоя в МСК, и, в частности, оценить вклад K+каналов с двумя поровыми доменами (K2P).
3. Идентифицировать ионные каналы, активируемые при повышении Cа2+ в
цитоплазме МСК - внутриклеточного события, инициируемого различными
агонистами - и, в частности, изучить Са2+-активируемые K+ каналы.
Научная новизна
В настоящей работе впервые проанализированы базовые электрические
характеристики МСК на уровне статистически репрезентативной популяции
одиночных клеток. Полученные данные свидетельствуют о функциональной
4
гетерогенности популяции МСК, которые по своим электрофизиологическим
свойствам могут быть отнесены к 4-м группам.
В МСК впервые идентифицированы К+ каналы TREK-1 типа и показано,
что они участвуют в установлении потенциала покоя. Изучена активность
TREK-1 каналов в различных условиях, в том числе, на уровне одиночных
каналов. В частности, установлено, что в МСК поддерживается мода низкой
активности TREK-1 каналов.
Впервые обнаружено, что арахидоновая кислота - универсальный
вторичный медиатор - вызывает гиперполяризацию практически всех МСК
путем активации TREK-1 каналов.
В МСК идентифицированы Са2+-активируемые К+ каналы BK-типа и IKтипа и оценен их вклад в сопряжение внутриклеточных Са2+ сигналов с
поляризацией мембраны. Впервые в МСК продемонстрирована активация BKканалов в ответ на природные агонисты на примере пуринергического агониста
АТФ.
Научно-практическая значимость работы
Полученные в работе данные существенно расширяют существующие
представления об электрофизиологических характеристиках МСК и о ионных
каналах, функционирующих в этих клетках. Модуляторы активности ионных
каналов, функционирующих в МСК, могут составить новый пул
физиологически активных веществ, способных влиять на их способность к
пролиферации, дифференцировке и миграции.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 18-ой
Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2014) и на Международной конференции
«Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015).
По материалам диссертации опубликовано 2 тезиса докладов на
международных конференциях и 2 научные статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы,
материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение,
заключение, выводы, список использованных сокращений, список литературы
и приложение. Работа изложена на 106 страницах, содержит 26 рисунков и 2
таблицы. Список литературы включает 114 источников отечественной и
зарубежной литературы.
5
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. Исследования проводили на первичной культуре
МСК, выделенных из жировой ткани человека. Жировую ткань забирали из
подкожной жировой клетчатки здоровых доноров при проведении плановых
операций (возраст доноров от 31 до 50 лет).
Первичное выделение МСК из жировой ткани проводили сотрудники
кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной
медицины МГУ им. М.В. Ломоносова по стандартной, описанной ранее
методике (Котова и др., 2013; Kotova et al., 2014; Котова и др., 2015).
Подготовка клеток к эксперименту. МСК культивировали в среде
роста: Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100
ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. За сутки перед экспериментом
ростовую среду заменяли на такую же без антибиотика. Затем клетки двукратно
промывались раствором Версена (Sigma). Для отделения от субстрата клетки
инкубировались 3–5 мин в 200 мкл фермента HyQTase (HyClone). Фермент
ингибировался добавлением 800 мкл полной ростовой среды, затем клетки
ресуспендировались. Далее клеточная суспензия пипеткой переносилась в
электрофизиологическую камеру (Kolesnikov, Margolskee, 1998) с базовым
экстраклеточным раствором (см. ниже), инкубировалась там 10 минут для
осаждения клеток на стекло электрофизиологической камеры. После этого
проводились электрофизиологические опыты.
Электрофизиология. Для регистрации мембранных ионных токов в
клетках мы использовали методику patch clamp с применением усилителя
Axopatch 200B, ЦАП-АЦП конвертера Digidata 1322A и пакета лицензионных
программ pClamp 8.0 (все Axon Instruments, США). Для регистрации
интегральных клеточных токов мы использовали конфигурацию Amphotericin B
perforated patch. Базовый экстраклеточный раствор, мМ: 135 NaCl, 5 KCl, 2
CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH, pH 7.4. Базовый пипеточный раствор, мМ:
140 KCl, 1 MgCl2, 0.1 EGTA-NaOH, 10 HEPES-NaOH, Amphotericin B (400
мкг/мл), pH 7.3.
В безнатриевом внешнем растворе 135 мМ NaCl заменялись на 135 мМ
NMDGCl. В бесхлорном внешнем растворе 135 NaCl заменялись на 135 мМ
NaSO3CH3. Внешние растворы с повышенными концентрациями K+ (KCl, мM:
32, 59, 113) получены путем смешения в соответствующих пропорциях двух
экстраклеточных растворов (2 мМ СаСl2) в одном из которых было 140 мМ
KCl, а в другом 140 мМ NaCl, поэтому осмомолярность конечных растворов
остается неизменной.
Регистрация токов одиночных каналов проводилась в конфигурациях cellattached и inside-out в симметричных K+ условиях: 140 мМ [KCl]i / 140 мМ
6
[KCl]o, или ассиметричных K+ условиях: 140 мМ [KCl]i / 135 мМ [NaCl]o + 5 мМ
[KCl]o (условия указаны в тексте). В конфигурации cell-attached
электрофизиологическая камера заполнялась базовым экстраклеточным
раствором (состав см. выше), а регистрирующая пипетка была заполнена
следующими растворами, мМ: 140 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH, pH
7.4, или (в ассиметричных K+ условиях) 140 мМ KCl заменялись на 135 мМ
NaCl и 5 мМ KCl. В конфигурации inside-out регистрирующая пипетка была
заполнена тем же раствором что и в конфигурации cell-attached, а в
электрофизиологической камере (то есть с цитоплазматической стороны
изолированного фрагмента мембраны) был следующий раствор, мМ: 140 KCl, 1
MgCl2, 0.1 EGTA-NаOH, 10 HEPES-NaOH, pH 7.3.
Для регистрации токов одиночных K+ каналов с двумя поровыми
доменами (K2P) в регистрирующую пипетку добавлялся ибериотоксин (IbTX,
250 нM): селективный блокатор Ca2+-активируемых K+ каналов большой
проводимости (BK). В опытах в конфигурации inside-out с пониженным pH
раствора в камере 0.1 мМ EGTA-NaOH в этом растворе заменялся на 0.1 мМ
BAPTA-NaOH. Для повышения концентрации Ca2+ с цитоплазматической
стороны мембраны в inside-out использовалась комбинация, мМ: 0.1 EGTANaOH, 0.1 СаCl2 (концентрация свободного Са2+ равна 3 мкМ).
Микрофотометрия (Ca2+-imaging). Эксперименты по микрофотометрии
проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Axioskop 2 plus
(Zeiss), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20x/0.75 и цифровой ECCD
камерой LucaR (Andor Technology). Помимо осветителя проходящего света
микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем для освещения через
объектив.
Один из входов бифуркационного оптического волокна соединяли с
осветителем на сверхярких диодах (340–535 нм) (Хохлов А.А., 2007) для
возбуждения флуоресценции. МСК нагружали флуоресцентным Ca2+-зондом
Fluo-4, флуоресценцию которого возбуждали на длине волны 480 ± 5 нм, а
эмиссию регистрировали в области 535 ± 20 нм. Каждые 2 секунды
регистрировали последовательные флуоресцентные изображения. Изменение
концентрации цитозольного кальция в индивидуальных клетках оценивали по
относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки
(ΔF/F0). Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли
с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC).
ЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
I. Базовые электрические характеристики МСК
7
Было исследовано 109 клеток и обнаружено, что значения их потенциала
покоя варьируют в пределах -85 - -5 мВ (рис.1а), а значения мембранной
проводимости - в интервале 2 - 280 мкС/пФ (рис.1в). При этом доказано, что
деполяризация потенциала покоя в МСК связана с увеличением вклада
неселективной катионной компоненты в мембранную проводимость покоя (рис.
1б).
Рис.
1.
Базовые
электрические
характеристики
МСК.
а.
–
гистограмма
распределения
клеток
по
значениям
потенциала
покоя
(n=109). б. – корреляция между
плотностью Na+
тока через
неселективные катионные каналы
и потенциалом покоя МСК.
Амплитуда Na+ тока определялась
как разность между током в
контроле и током при удалении
экстраклеточного
Na+.
Экспериментальные
значения
аппроксимированы
гиперболической
зависимостью
(f=-9,97+9,28*(x/(3.58+x)),
f
–
+
плотность Na -тока при -90 мВ
(пА/пФ), x – потенциал покоя (мВ),
R2=0.98, n=21). в. – распределение
клеток по значениям потенциала покоя и мембранной проводимости.
По кинетике активации и типу выпрямления интегральных токов в
популяция МСК было выделено 4 группы клеток: клетки с моментально
активирующимися K+ токами выходящего выпрямления (47%, n=68) (рис. 2а),
клетки с потенциал-независимыми катионными токами (22%, n=68) (рис. 2б),
клетки с K+ токами задержанного выпрямления (19%, n=68) (рис. 2в), клетки c
K+ токами входящего выпрямления (12%, n=68) (рис. 2г).
Определенные типы К+ проводимости выделялись с использованием
соответствующих блокаторов и/или путем изменения ионного состава
экстраклеточного раствора. Так K+ проводимость оценивалась по эффектам
неспецифичного блокатора K+ каналов TEA (20 мМ) (рис. 2а правая панель, 2в
правая панель). Катионная проводимость оценивалась по изменению токов
после замены экстраклеточного Na+ на непроникающий ион NMDG+ (рис. 2б
правая панель). Для доказательства функционирования К+ каналов входящего
выпрямления производилось увеличение концентрации K+ в экстраклеточном
растворе (рис. 2г правая панель).
8
II. TREK-1-каналы МСК
Проведенный анализ (Рис.1а, в) свидетельствовал о том, что потенциал
покоя в значительной части МСК формируется при заметном вкладе К+
каналов, активных в покое. По аналогии с другими клеточными системами,
было вполне вероятно, что среди них ключевую роль играют каналы K+ утечки.
С молекулярной точки зрения эта функциональная группа каналов принадлежат
семейству K2P K+ каналов (two-pore domain K+ channels), которое включает 15
представителей.
Рис. 2. Классификация
МСК по типам интегральных
токов. Левая панель: I-Vхарактеристики нормированных
токов (I/Imax) клеток с K+
токами
выходящего
выпрямления и практически
мгновенной активацией (a),
n=32,
с
потенциалнезависимыми
катионными
токами (б), n=15, с K+ токами
задержанного выпрямления (в)
n=13, c K+ токами входящего
выпрямления (г) n=8 (среднее ±
стандартное отклонение). На
вкладках I-V характеристик –
репрезентативные серии токов в
ответ на импульсную (150 мс)
поляризацию от -100 до 60 мВ
при
поддерживающем
потенциале -60 мВ. Правая
панель: I-V характеристики в
контроле (белые кружки), в
присутствие TEA (a n=4, в n=2) и
NMDG+
(б
n=6)
(черные
треугольники), после отмывки
(белые квадраты). В опыте с
увеличением концентрации [K+]o
(г): 5 мМ – контроль (белые кружки), 32 мМ (черные кружки), 59 мМ (черные квадраты),
113 мМ (черные треугольники), 5 мМ – возвращение (белые квадраты), n=3. (среднее ±
стандартное отклонение).
С целью их идентификации был проведен поиск транскриптов всех генов,
кодирующих K2P-каналы (семейство генов KCNK), в препаратах РНК,
изолированной из МСК, с использованием метода ОТ-ПЦР и ген-специфичных
праймеров. Было обнаружено, что в МСК экспрессируются TREK-1, TWIK-1 и
TASK-5. Согласно литературным данным, канальный белок TASK-5 сам по
9
себе не формирует функциональный ионный канал (Enyedi, Czirják, 2010).
Таким образом, идентификация K2P каналов в МСК свелась к поиску
активности TREK-1 и TWIK-1 каналов.
Блокаторы, специфичные для семейства K2P каналов и/или отдельных
его представителей, на данный момент отсутствуют. Тем не менее, на уровне
одиночных каналов для K2P каналов выявлен ряд отличительных
биофизических и фармакологических свойств, которые позволяют
идентифицировать их функционально. К этим свойствам относятся так
называемый пачечный характер (flickery burst) открываний каналов и
нечувствительность к Cs+ как к блокатору.
При регистрации активности каналов на фрагменте мембраны в составе
клетки (cell-attached-конфигурация) обычно скачки тока, характерные для
одиночного канала, были редки. Однако при отрыве фрагмента мембраны под
пипеткой и переходе в конфигурацию inside-out на каждом из них
активировались токи одиночных каналов с характерной пачечной активностью
(рис. 3).
Рис. 3. Ионные токи
на фрагменте мембраны в
составе клетки и после его
отрыва. a. – регистрация тока
с фрагмента мембраны в
период
перехода
из
конфигурации cell-attached в
конфигурацию inside-out при
потенциале 60 мВ. Белым
треугольником
отмечен
момент отрыва фрагмента
(удар).
Черными
треугольниками
отмечены
участки записи, которые
представлены
при
уменьшенном
временном
масштабе в (б) и (в). г. –
амплитудные гистограммы
cell-attached-токов (верхняя
панель) и inside-out-токов
через 1 минуту после
перехода
в
inside-out
конфигурацию
(нижняя
панель) на одном и том же
фрагменте мембраны при
потенциале 60 мВ. Гистограммы аппроксимированы суммами функций Гаусса (черная
линия). Сдвиг пиков на гистограмме inside-out-токов составляет 2.3 пA. д. – Активность
каналов (NPo) в конфигурациях cell-attached (с-а) и спустя 1 минуту после перехода в
конфигурацию inside-out (i-o (1 мин)) при потенциале
60 мВ NPo в конфигурации cell
10
attached равно 10-4±10-5 ; в inside-out - 0.25±0.12 (среднее ± стандартное отклонение).
В среднем на 15 исследованных фрагментах мембран активность каналов
(NPo) в интактных клетках (cell-attached) была на 3 порядка меньше, чем на
изолированных фрагментах мембран (inside-out) (рис. 3д). На изолированных
фрагментах мембран были обнаружены два типа каналов, отличающиеся по
проводимости (рис. 4). Эти каналы не обладали детектируемой
проницаемостью для Сs+, но не блокировались данным ионом (рис. 5), что
свидетельствовало в пользу их принадлежности к семейству K2P.
Рис. 4. Токи одиночных
каналов
с
пачечной
активностью на изолированных
фрагментах мембран МСК. а. –
репрезентативные регистрации
токов с фрагмента с каналами
низкой
проводимости
при
потенциалах от -60 до 60 мВ. б.
–
репрезентативные
регистрации токов с фрагмента
мембраны с каналами низкой и
высокой проводимости, при
потенциалах от -60 до 60 мВ.
Пунктирными
линиями
показаны два уровня токов,
соответствующих
токам
каналов низкой проводимости и
каналов высокой
проводимости. в. – амплитудные гистограммы токов одиночных каналов низкой
проводимости (верхняя панель) и высокой проводимости (нижняя панель) при потенциале
60 мВ. Гистограммы аппроксимированы суммой двух функций Гаусса (черная линия). г. –
I-V характеристики токов одиночных каналов: черные кружки – каналы низкой
проводимости (обычным шрифтом указаны значения проводимости при потенциалах -60 и
60 мВ), белые треугольники – каналы высокой проводимости (жирным шрифтом указаны
значения проводимости при потенциалах -60 и 60 мВ), n=4 (среднее ± стандартное
отклонение).
На основе выходящего выпрямления токов одиночных каналов обоих
типов и значений проводимостей мы предположили, что данные токи
переносятся через TREK-1 канал. Чтобы подтвердить это, была проведена
серия опытов с целью проверить наличие у K2P каналов МСК других свойств
TREK-1 канала. Было обнаружено, что регистрируемые токи активируются
арахидоновой кислотой, нифлумовой кислотой, внутриклеточным закислением,
при механической стимуляции и блокируются амлодипином (рис. 6).
Таким образом, по совокупности функциональных свойств активные в
МСК K2P-каналы идентичны TREK-1 каналам, которые, согласно
11
литературным
данным,
обладают
двумя
модами
проводимости,
соответствующими двум типам канальных белков, получаемых в результате
альтернативной инициации трансляции (Thomas et al., 2008; Veale et al., 2014).
Рис. 5. Влияние замены
140 мM KCl ([K+]i) на 140 мM
СsCl
([Cs+]i)
с
цитоплазматической
стороны
изолированных
фрагментов
мембраны МСК на пачечную
активность одиночных каналов a,
б. – регистрация токов при
потенциалах 60 и -60 мВ в
контроле (левая панель) и в
присутствие 140 мM СsCl (правая
панель). в. – I-V характеристики каналов низкой (n=6) и высокой (n=3) проводимости в
контрольных условиях (белые кружки) и в присутствие Сs+ с цитоплазматической стороны
(черные треугольники) (среднее ± стандартное отклонение). В присутствие CsCl токи через
одиночные каналы были детектируемы только при отрицательных потенциалах.
Рис. 6. Активность
К
каналов (NPo) на
изолированных фрагментах
мембраны в различных
условиях при потенциалах
60 мВ (левая панель) и -60
мВ
(правая
панель).
Пунктирными
линиями
показаны средние значения
активностей каналов в
контроле.
+
Оба типа TREK-1 каналов, видимо, функциональны в МСК. Поскольку
амлодипин (блокатор TREK-1 каналов) деполяризовал плазмолемму МСК,
можно заключить, что TREK-1 каналы вовлечены в установление потенциала
покоя в этих клетках (рис.7).
Рис. 7. Эволюция относительного мембранного
потенциала покоя, регистрируемого в режиме фиксации
нулевого тока ((V-V0)/V0, V0 – потенциал в момент
начала регистрации) при аппликации 10 мкM
aмлодипина (Amlo) (период аппликации показан
горизонтальной линией), n=4 (cреднее ± стандартное
отклонение).
Отметим,
что
в
согласии
с
функциональными
тестами,
свидетельствующими об активности TREK-1 каналов в МСК, в препаратах
12
РНК, выделенной из клеток культуры МСК, методом ОТ-ПЦР были
идентифицированы транскрипты гена KCNK2 (TREK-1).
Рис.
8.
Влияние
арахидоновой кислоты на
потенциал
покоя
и
интегральные токи МСК. а.
– эволюция потенциала
покоя, регистрируемого в
режиме фиксации нулевого
тока, при аппликации 50
мкМ арахидоновой кислоты
(АА), период аппликации
показан
горизонтальной
линией; n=7 (среднее ±
стандартное отклонение). б.
–
сравнение
значений
потенциала
покоя
в
контроле, через 10 минут
после аппликации 50 мкМ
Так как арахидоновая кислота является одним из универсальных
вторичных медиаторов и способна активировать TREK-1 каналы на
изолированных фрагментах мембран, мы исследовали влияние этого вещества
на потенциал покоя и интегральные токи МСК. Было обнаружено, что
экстраклеточная аппликация 50 мкМ арахидоновой кислоты (АА) вызывала
медленно развивающуюся гиперполяризацию в каждой исследованной клетке
(n=10) (рис. 8а, б). Потенциал покоя через 10 минут инкубации в арахидоновой
кислоте был практически нечувствителен к 10 мМ TEA (блокатор K+ каналов).
В тех же условиях 10 мкМ амлодипина (Аmlo) (блокатор TREK-1 каналов)
вызывали существенную деполяризацию (рис. 8б). Под действием
арахидоновой кислоты в МСК происходило драматическое увеличение токов со
слабым выходящим выпрямлением, которые были малочувствительны к 10 мМ
TEA и в большей степени блокировались 10 мкМ амлодипина (рис. 8в, г).
III. Са2+-активируемые K+ каналы МСК
АА, при добавлении на фоне АА 10 мМ TEA (АА + TEA) и при добавлении на фоне АА 10
мкМ амлодипина (AA+Amlo); (среднее ± стандартное отклонение). в. – I-V-характеристики
13
нормированных токов в контроле (белые кружки)
(n=10) и при аппликации веществ: 50 мкМ
АА (n=10) (черные треугольники), 50 мкм АА + 10 мМ TEA (n=3) (белые квадраты), 50 мкМ
АА + 10 мкМ Amlo (n=5) (белые треугольники); (среднее ± стандартное отклонение). г. –
Ионные каналы, активируемые внутриклеточным Са2+ функционируют
практически во всех клетках и обеспечивают сопряжение внутриклеточных
Са2+ сигналов с изменением мембранного потенциала. В нашей лаборатории
было показано, что целый ряд агонистов гептаспиральных рецепторов способен
стимулировать Са2+ сигнализацию в МСК (Kotova et al., 2014). В этой связи
представляло интерес выяснить, какие Са2+-активируемые каналы
функционируют в МСК.
Рис.
9.
Влияние
иономицина на интегральные
токи
МСК.
а.
репрезентативные
семейства
токов в контрольных условиях
(левая
панель,
протокол
поляризации
показан
над
экспериментальными
кривыми), после аппликации 2
мкМ иономицина (средняя
панель) и после отмыва
иономицина (правая панель). б.
- I-V-характеристики токов,
показанных в (а). в. –
репрезентативная регистрация
потенциала
покоя
клетки,
измеряемого
в
режиме
фиксации нулевого тока до и
после аппликации 2 мкМ
иономицина (момент аппликации показан горизонтальной линией).
В наших экспериментах в ответ на повышение внутриклеточного Ca2+ при
аппликации иономицина происходила гиперполяризация МСК, что
свидетельствовало о преимущественном вкладе Са2+-активируемых K+ каналов.
Гиперполяризация МСК сопровождалась существенным увеличением
проводимости за счет активации заметно флуктуирующих токов выходящего
выпрямления (рис. 9).
Данный эффект присутствовал в 90% клеток (n=40). Биофизические
свойства этих токов позволили предположить, что они переносятся через Са2+активируемые K+ каналы большой проводимости (BK). В подтверждение этому,
селективный блокатор BK-каналов ибериотоксин (IbTX) значительно подавлял
Са2+-индуцированные флуктуирующие K+ токи выходящего выпрямления, что
сопровождалось деполяризацией плазмолеммы (рис. 10).
Помимо этого, на изолированных фрагментах мембран были
зарегистрированы токи через одиночные Са2+-активируемые К+ каналы. На
основе амплитудных гистограмм, полученных для тока через одиночный канал
14
в ассиметричных K+ условиях (140 мМ [K+]i / 5 мМ [K+]o), его проводимость
была оценена в 115 пС – величина, характерная именно для ВК-каналов
(рис.11).
Рис. 10. Эффект
ибериотоксина (IbTX) на
иономицинактивируемый ток в
МСК. а. – семейства
интегральных токов в
контроле,
после
аппликации
5
мкМ
иономицина,
после
аппликации
ибериотоксина
(ibTX
100 нМ), после удаления
ибериотоксина
из
экстраклеточного
раствора (условия и
протокол поляризации
показаны на рисунке). б.
– репрезентативные I-Vхарактеристики токов,
показанных
в
а.
Контроль
–
белые
кружки,
иономицин – черные кружки, иономицин+IbTX – черные квадраты, иономицин-IbTX –
черные треугольники. На вставке – регистрация потенциала покоя в режиме фиксации
нулевого тока в период аппликации 5 мкМ иономицина до и после аппликации 100 нМ
ибериотоксина (IbTX).
Рис. 11. Флуктуации
токов через одиночные BKканалы при потенциале 80 мВ,
регистрируемые
на
изолированных
фрагментах
мембраны
в
контрольных
условиях (левая панель), в
присутствие с цитоплазматической стороны 140 мМ К+ + 3 мкМ Са2+ (средняя панель) и
140 мМ Cs+ + 3 мкМ Са2+ (правая панель).
Нами было показано, что мобилизация внутриклеточного Ca2+ в ответ на
АТФ – агонист P2Y-рецепторов МСК (Kotova et al., 2014) – вызывает
активацию BK-каналов в этих клетках. При обратимой аппликации 10 мкМ
АТФ одновременно с генерацией внутриклеточного Ca2+ сигнала происходила
активация токов выходящего выпрямления (рис. 12 а). На фоне 100 нМ IbTX
АТФ также инициировал Ca2+ сигнал, однако активация токов практически
15
отсутствовала (рис. 12 б). После удаления IbTX происходило восстановление
эффекта АТФ на ионную проницаемость мембраны (рис. 12 в).
Рис.
12.
АТФиндуцированная активация BKканалов в МСК. Производился
одновременный
мониторинг
внутриклеточного
Ca2+
по
флуоресценции Fluo-4 (верхняя
панель) и регистрация мембранных
токов (средняя панель). Клетка
поддерживалась при потенциале -60
мВ. Каждую секунду мембрана
поляризовалась
пилообразным
напряжением в пределах от -100 мВ
до 100 мВ (2 мВ/мс). Моменты
аппликации АТФ (10 мкМ) и
ибериотоксина (100 нМ) показаны
горизонтальными
линиями
на
верхней панели. Нижняя панель - IV-характеристики клетки в контроле
и при аппликации веществ.
Известно, что в глиальных клетках сетчатки (клетки Мюллера) при их
переходе в пролиферирующее и мигрирующее состояние под действием
митогенных факторов происходит драматическое увеличение уровня
экспрессии BK каналов (Bringmann et al., 2000). При этом блокирование
экспрессии этих каналов в глиальных клетках уменьшает интенсивность их
миграции. Поскольку BK каналы функциональны в подавляющем большинстве
МСК, можно думать, что они вовлечены в некие универсальные процессы.
Таковыми для МСК несомненно являются пролиферация, дифференцировка и
миграция. По аналогии с глиальными клетками сетчатки, можно допустить
участие BK каналов именно в этих процессах. В пользу этой возможности
свидетельствует то, что МСК человека экспрессируют множество рецепторов к
ростовым факторам, гормонам и паракринным медиаторам (Ball et al., 2007;
Mahay et al., 2008; Kumar et al., 2010; Bernardo et al., 2013). Ранее было
показано, что BK каналы в нейронах активируются в ответ на фактор роста
нервов (NGF) и нейротрофин-3 (NT-3) (Holm et al, 1997).
Функциональные доказательства активности BK-каналов в МСК были
подкреплены молекулярным анализом с использованием метода ОТ-ПЦР и генспецифичных праймеров. Как и ожидалось, в препаратах РНК, выделенной из
клеток культуры МСК, были идентифицированы транскрипты гена KCNMA1,
кодирующего -субъединицу BK-канала человека. Помимо этого, проводился
16
ОТ-ПЦР анализ экспресии генов Са2+-активируемых K+ каналов малой
(KCNN1-3, SK1-3) и средней проводимости (KCNN4, SK4, IK1). В препаратх
РНК, выделенной из МСК, были обнаружены транскрипты гена KCNN4.
Рис. 13. Са2+-активируемые K+ каналы
средней проводимости (IK1) в МСК. а. –
эволюция потенциала покоя МСК при
аппликации 1 мкМ иономицина (Iono) и
блокатора IK1-каналов TRAM34 (50 нМ). б. –
I-V-характеристики клетки в контроле и в
присутствие иономицина и блокатора.
С целью функциональной идентификации этих каналов мы
регистрировали ионные токи МСК при аппликации иономицина и добавлении
на его фоне селективного блокатора IK1-каналов TRAM34. В 2 из 20
исследованных клеток были обнаружены потенциал-независимые Са2+активируемые K+ токи, которые полностью блокировались 50 нМ TRAM34
(рис. 13).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итак,
в
настоящей
работе
исследовались
некоторые
электрофизиологические характеристики МСК из жировой ткани человека. С
точки зрения электрофизиологических свойств популяция МСК оказалась
весьма гетерогенной. Так, потенциал покоя варьировал в пределах -85 и -5 мВ,
а мембранная проводимость – между 2 и 280 мкС/пФ. Для МСК также была
характерна вариабельность потенциал-зависимых (ПЗ) интегральных ионных
токов. Отметим, что для пролиферирующих клеток других типов было
показано, что прохождение по клеточному циклу сопровождается
периодическим изменением мембранного потенциала (Sundelacruz et al., 2009;
Yang, Brackenbury, 2013; Rao et al., 2015).). Поскольку в наших работах
использовалась несинхронная культура МСК, можно было ожидать, что эта
клеточная популяция содержала клетки, находящиеся на разных стадиях
клеточного цикла, для которых, возможно, характерен специфический спектр
активных ионных каналов. Во всяком случае, используя характерные
особенности ПЗ токов в качестве критерия, нами выделены 4 субпопуляции
МСК.
Вряд ли прохождение по клеточному циклу является единственной
вероятной причиной широкой вариабельности электрофизиологических
характеристик МСК, наблюдавшейся в наших экспериментах. Так, в
соответствии с данными, полученными ранее в нашей лаборатории с
использованием микрофотометрии (Kotova et al., 2014), популяция МСК
17
содержит множественные малочисленные (2-5%) субпопуляции клеток,
способных отвечать лишь на 1-2 природных агониста мобилизацией
внутриклеточного Са2+. Небольшая субпопуляция клеток генерирует
спонтанные Са2+ осцилляции. Такое разнообразие функциональных фенотипов
трудно объяснить лишь клеточным циклом, на основании которого скорее
можно ожидать существование 4 основных функциональных классов.
Думается, что еще одной причиной наблюдаемой функциональной
гетерогенности популяции МСК является ее неоднородность с точки зрения
клеточных фенотипов. Вполне возможно, что в популяции МСК
предсуществуют субпопуляции клеток, в которых генетически заложена
способность дифференцироваться лишь в несколько клеточных типов. Так, для
электрически невозбудимых МСК существование клеток с потенциалами
покоя, близкими к равновесному K+ потенциалу (левее -70 мВ), является
неожиданным результатом. В семействе дифференцированных клеток столь
сильная гиперполяризация в покое характерна для возбудимых клеток,
например, нейронов. Возможно, данный подтип МСК составляет особую
функциональную субпопуляцию. Тоже можно сказать и о популяции клеток c
K+ токами входящего выпрямления. Из литературы известно, что экспрессия
классических K+ каналов входящего выпрямления (подсемейство Kir2)
преимущественно ограничена возбудимыми клетками. Вполне вероятно, что
МСК с Kir-токами могут быть предшественниками возбудимых клеток.
В нашей работе были получены многочисленные доказательства того, что
в МСК человека функционируют K+ каналы TREK-1 типа. Присутствие TREK1 каналов на каждом исследованном фрагменте мембраны свидетельствует о
довольно высоком уровне их экспрессии, причем в подавляющем большинстве
клеток. Кроме того, низкая активность TREK-1 каналов на фрагментах в
составе целой клетки в сравнении с изолированным фрагментом указывает на
то, что в покоящихся МСК TREK-1 канал регулируется некими, пока
неизвестными, внутриклеточными факторами. Последние подавляют
активность TREK-1 канала в покоящейся клетке, но после отрыва фрагмента
мембраны очевидно теряются, что приводит к существенному увеличению
вероятности открытого состояния. Этот факт указывает на то, что установление
потенциала покоя не является единственной функцией TREK-1 в МСК. Повидимому, этот канал также может быть вовлечен в гиперполяризацию клеток в
ответ на определенные стимулы. Одной из возможностей является активация
TREK-1 каналов в МСК под действием внешних сигналов, трансдукция
которых сопровождается увеличением продукции арахидоновой кислоты –
одного из универсальных внутриклеточных регуляторов. В подтверждение
этому нами впервые было обнаружено, что экстраклеточная аппликация
18
арахидоновой кислоты вызывает значительную гиперполяризацию (в среднем
на 40 мВ) практически в каждой МСК.
В ранее опубликованных работах сообщалось об обнаружении в МСК
транскриптов гена KCNMA1 (BK), указывая на то, что K+ каналы BK типа
могут быть функциональны в этих клетках (Heubach et al., 2003; Li et al., 2005;
Bai et al., 2007; Park et al., 2007; Liu et al., 2008). Однако, в этих исследованиях
не была продемонстрирована активация BK каналов внутриклеточным Са2+ и
их активность не анализировалась на уровне одиночных каналов. В нашей
работе были получены физиологически целесообразные ответы МСК при
участии ВК каналов. Так, нами впервые была продемонстрирована Ca2+зависимая гиперполяризация в МСК и показан вклад BK каналов в этот
процесс. По аналогии с другими клеточными системами можно думать, что в
МСК BK-каналы детерминируют Са2+-зависимую гиперполяризацию в ответ на
различные агонисты, инициирующие мобилизацию внутриклеточного Сa2+. В
подтверждение этой идеи нами впервые продемонстрировано, что
экстраклеточный АТФ, стимулирующий Cа2+-сигнализацию в МСК P2Yрецептор опосредуемым образом, способен активировать BK-каналы. Помимо
этого, нами впервые были зарегистрированы токи одиночных BK каналов и
продемонстрировано непосредственное влияние ионов Са2+ на их активность.
С использованием ингибиторного анализа нами было показано, что в
небольшой (~10%) субпопуляции МСК функционируют Са2+-активируемые
каналы как BK, так и IK1-типа. Функциональная экспрессия последних в МСК
впервые показана в нашей работе. Несмотря на присутствие BK каналов, Са2+зависимая гиперполяризация в IK1-положительных МСК опосредуется
преимущественно IK1 каналами.
В завершении отметим, что несмотря на электрофизиологическую
гетерогенность популяции МСК, нами были выявлены два инварианта – это К+
каналы TREK1 и BK типов, которые функциональны фактически в каждой
клетке. Можно думать, что по мере прогресса в дальнейших биофизических и
молекулярных исследованиях МСК группа таких ионных каналов будет
расширена. Это позволит очертить базовый электрофизиологический фенотип
МСК, подобно тому, как это сделано для нейрональных, глиальных и
мышечных клеток.
ВЫВОДЫ
1. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) из жировой ткани человека
являются электрически невозбудимыми. Популяция МСК гетерогенна по своим
электрофизиологическим характеристикам, включая потенциал покоя, входное
сопротивление
и
потенциал-зависимую
проводимость.
На
основе
19
предложенных электрофизиологических критериев выделены 4 субпопуляции
МСК.
2. В МСК К+ канал TREK-1 является доминантным типом каналов с двумя
поровыми доменами. TREK-1 активен практически во всех МСК, где он
функционирует как канал K+ утечки и участвует в установлении потенциала
покоя.
3. В МСК функционирует эндогенная регуляторная система, которая
контролирует активность TREK-1 канала, значительно снижая вероятность
открытого состояния в покое.
4. Универсальный вторичный медиатор – арахидоновая кислота – является
эффективным регулятором электрогенеза в МСК и может вызывать
значительную гиперполяризацию плазмолеммы путем активации TREK-1
каналов.
5. В МСК K+ каналы BK типа являются доминантным типом Ca2+активируемых K+ каналов. Эти каналы могут обеспечивать гиперполяризацию
МСК в ответ на агонисты, стимулирующие мобилизацию внутриклеточного
Ca2+ в цитоплазме МСК.
6. Кальций-активируемые K+ каналы средней проводимости (IK1) активны
в субпопуляции МСК (~10%), где они функционируют совместно с BKканалами. В таких МСК Са2+-зависимая гиперполяризация опосредуется
преимущественно IK1 каналами.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах
1.
Тарасов М.В., Котова П.Д., Рогачевская О.А., Сысоева В.Ю.,
Колесников С.С. Идентификация K+-каналов TREK-2 в мезенхимальных
стромальных клетках человека. // Биологические мембраны. 2014. T.31(3).
C.177–184.
2.
Тарасов М.В. Рогачевская О.А. Сысоева В.Ю. Колесников С.С.
Кальций-активируемые K+-каналы большой проводимости в мезенхимальных
стромальных клетках человека. // Биологические мембраны. 2015. T.32(1).
C.33–40.
3.
Tarasov M.V., Kolesnikova A.S., Bystrova M.F., Kotova P.D.,
Rogachevskaja O.A., Sysoeva V.Y. Tkachuk V.A., Kolesnikov S.S. Calcium-gated
K+ channels of the BK and IK types couple intracellular Ca2+ signals to membrane
hyperpolarization in mesenchymal stromal cells. Submitted to Pflugers Archive European Journal of Physiology.
20
Тезисы докладов:
1.
Тарасов М.В., Котова П.Д., Рогачевская О.А., Сысоева В.Ю.
Идентификация K+ каналов TREK-2 в мезенхимальных стромальных клетках
человека. // 18 Международная Пущинская школа-конференция молодых
ученых «Биология – Наука XXI века». Пущино, Россия 21-25 апреля 2014.
Сборник тезисов. С.120-121.
2.
Тарасов М.В. Колесникова А.С. Рогачевская О.А. Сысоева В.Ю.
Колесников C.С. Кальций-активируемые K+ каналы большой проводимости в
мезенхимальных стромальных клетках человека. // Рецепторы и
внутриклеточная сигнализация. Сборник статей. Том 1. Пущино, 2015.С.195–
200.
Список сокращений:
МСК – мезенхимные стромальные клетки;
K2P – K+ каналы с двумя поровыми доменами;
TREK-1 – TWIK-подобный K+ канал 1;
TWIK – тандем поровых доменов в K+ канале со слабым входящим
выпрямлением;
BK – Ca2+-активируемый K+ канал большой проводимости;
IK1 – Ca2+-активируемый K+ канал средней проводимости;
AA – арахидоновая кислота;
NFA – нифлумовая кислота;
Amlo – амлодипин;
pHi – pH внутриклеточного раствора;
Iono, ионо. – иономицин;
IbTX – ибериотоксин;
TRAM34 – 1-[(2-Хлорфенил)дифенилметил]-1H-пиразол;
ATP – АТФ (аденозин 5'-трифосфат).
21
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
749 Кб
Теги
к2р, стромальных, каналов, типов, исследование, мезенхимных, клетка
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа