close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

КОНСТИТУТИВНАЯ И ИНДУЦИБЕЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЭКСПАНСИНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
САФИУЛЛИНА МИЛЯУША ГАЛИМЬЯНОВНА
КОНСТИТУТИВНАЯ И ИНДУЦИБЕЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ
ЭКСПАНСИНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ТАБАКА
03.02.07 – генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Уфа – 2015
2
Работа выполнена на кафедре генетики
ФГБОУ ВПО Башкирского государственного педагогического университета
им. М. Акмуллы и в лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии
ФГБУН Института биохимии и генетики Уфимского научного центра
Российской академии наук
Научный руководитель:
Кулуев Булат Разяпович
Официальные оппоненты:
Боронникова Светлана Витальевна
доктор биологических наук,
профессор
Веселов Дмитрий Станиславович
доктор биологических наук
Ведущая организация:
Кандидат биологических наук
Заведующая кафедрой ботаники и генетики
растений,
заведующая
научноисследовательской лабораторией биологии и
генетики
ФГБОУ
ВПО
«Пермский
государственный
национальный
исследовательский университет»
Ведущий научный сотрудник лаборатории
физиологии растений ФГБУН Уфимского
института биологии Российской академии
наук
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт цитологии и
генетики Сибирского отделения Российской
академии наук (ИЦиГ СО РАН),
г. Новосибирск
Защита диссертации состоится «____» __________ 2015 г. в «____» часов
на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при
Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу:
450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке
Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71
и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru/disovet/zashita
e-mail: molgen@anrb.ru
Автореферат разослан «___» __________ 2015 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Бикбулатова С.М.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. К наиболее важным белкам, обеспечивающим рост клеток
растяжением относятся экспансины, в связи с чем эта группа белков все чаще
становится объектом исследования в области молекулярной генетики и физиологии
растений. Экспансины – это белки, способствующие разрыву водородных связей
между полимерами клеточной стенки, приводящему к ее релаксации, поступлению
воды в центральную вакуоль и увеличению размера клетки (Lee et al., 2001). Данные о
том, что экспансины играют важную роль в росте и развитии растений, подтолкнуло
исследователей к поиску их генов в разных видах растений, определению их роли в
регуляции клеточного растяжения и изучению влияния эктопической экспрессии
данных генов на размеры органов растений.
В растительных организмах идентифицировано четыре класса белков
экспансинов: α-экспансины, β-экспансины, экспансин-подобные белки A и
экспансин-подобные белки В (Шарова, 2007). Каждое растение содержит большое
количество генов экспансинов, например, в геноме Arabidopsis thaliana
идентифицировано 38 генов экспансинов (Li et al., 2002), в рисе (Oryza sativa)
обнаружено 28 α- и β-экспансинов, имеющих разные области экспрессии (Shin et al.,
2005), а в томате (Lycopersicum esculentum) найдено 12 генов экспансинов (Arru et al.,
2008). На данный момент остается неясным функциональное значение наличия такого
большого количества генов экспансинов в геномах растений. Путем использования
трансгенных технологий выявлены корреляции между экспрессией генов экспансинов
и ростом растительных органов (Cho et al., 2000; Choi et al., 2003; Pien et al., 2001; Lee
et al., 2003). Эксперименты показали, что изменяя экспрессию отдельных генов
экспансинов, можно получить трансгенные растения с измененными размерами
вегетативных органов. Хотя исследования генов экспансинов ведутся довольно
интенсивно, основные механизмы регуляции экспрессии отдельных генов до сих пор
не раскрыты. Разгадка функций тех или иных генов экспансинов, а также
молекулярных механизмов регуляции их экспрессии открывает широкие возможности
практического применения этих знаний в генной инженерии и биотехнологии
растений.
Одним из наиболее удобных модельных объектов генетической инженерии при
создании трансгенных растений является табак (Nicotiana tabacum L.). На данный
момент геном табака не секвенирован, однако, у него идентифицировано шесть генов
экспансинов, функции которых остаются до сих пор невыясненными. Разгадка
функций данных генов экспансинов могла бы внести определенную ясность в
особенности регуляции клеточного растяжения. В практическом плане большой
4
интерес представляет изучение экспансинов тополя, так как это пока единственное
древесное растение, геном которого секвенирован, а функции большинства его генов
до сих пор не раскрыты. К тому же различные виды тополя, в частности, тополь
черный (Populus nigra L.), являются модельными объектами в лесной биотехнологии
при создании трансгенных деревьев с измененным уровнем экспрессии различных
генов.
В связи с этим, целью нашего исследования было изучение вклада отдельных
генов экспансинов табака и тополя в регуляцию клеточного растяжения при росте
органов растений и создание трансгенных растений табака с измененными размерами
органов.
Задачи исследования:
1. Определить уровень транскрипции генов экспансинов NtEXPA1, NtEXPA4 и
NtEXPA6 в различных органах табака и под влиянием экзогенных фитогормонов.
2. Создать трансгенные растения табака с индуцибельной экспрессией гена
ARGOS-LIKE A. thaliana и оценить влияние сверхэкспрессии этого гена на уровень
транскрипции генов экспансинов табака.
3. Клонировать в бинарных векторах pCambia 1301, pCambia 1305.1 и pER8 гены
экспансинов AtEXPA10 A. thaliana, PnEXPA1 и PnEXPA3 Populus nigra, NtEXPA1,
NtEXPA5 и NtEXPA6 Nicotiana tabacum.
4. Получить трансгенные растения табака, экспрессирующие гены экспансинов
под контролем конститутивных промоторов каулимовирусов и эстрадиолиндуцибельной транскрипционной системы XVE.
5. Провести сравнительный морфологический анализ полученных трансгенных
растений табака.
Научная новизна. Установлено, что гены экспансинов табака NtEXPA1,
NtEXPA4 и NtEXPA5 экспрессируются, преимущественно, в листьях, а экспансин
NtEXPA6 – в корнях. Цитокинины и ауксины стимулируют транскрипцию генов
экспансинов NtEXPA1, NtEXPA4 и NtEXPA6 табака в верхушке побега и в растущих
растяжением молодых листьях, а брассиностероиды могут негативно и позитивно ее
регулировать в зависимости от органа растения и стадии его онтогенеза. Показано,
что ген-регулятор клеточного растяжения A. thaliana ARGOS-LIKE способен
регулировать транскрипцию генов экспансинов NtEXPA1, NtEXPA4 и NtEXPA5.
Получены и проанализированы трансгенные растения табака со сверхэкспрессией
генов NtEXPA1, NtEXPA5 и NtEXPA6 N. tabacum и PnEXPA1, PnEXPA3 Populus nigra и
с индуцибельной экспрессией гена NtEXPA6. Показано, что конститутивная
экспрессия генов NtEXPA1 и PnEXPA1 способствует, в первую очередь, увеличению
5
размеров листьев, а повышенная экспрессия генов NtEXPA5 и PnEXPA3 влияет, в
основном, на длину стебля.
Практическая значимость работы. Знания о взаимодействии генов, белковые
продукты которых участвуют в регуляции и осуществлении роста растительных
организмов, а также данные об их рецепции, особенностях сигналинга и регуляции
экспрессии могут способствовать разработке стратегии создания хозяйственноценных растений с измененными размерами органов. Полученные в ходе
исследования генно-инженерные конструкции, содержащие гены экспансинов
NtEXPA5 и PnEXPA3, могут быть предложены для создания трансгенных растений с
увеличенной длиной стебля, а гены NtEXPA1 и PnEXPA1 – для увеличения размеров
листьев. Методы создания трансгенных растений с улучшенными ростовыми
характеристиками вносят вклад в развитие сельскохозяйственной и лесной
биотехнологии.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на
Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы генетики и
молекулярной биологии» (Уфа, 2012), Всероссийской школе-конференции молодых
ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и микроорганизмов»
(Уфа, 2012), II и III Всероссийской школе-конференции молодых ученых ВолгоУральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика –
наука ХХ века» (Уфа, 2011; 2012), VI Всероссийской научной INTERNETконференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и
органической химии и биотехнологии (Уфа, 2011), 11-й Международной
междисциплинарной научно-практической конференции «Современные проблемы
науки и образования» (Ялта, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в
том числе 3 в журналах из перечня ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах,
содержит 8 таблиц и 44 рисунка. Включает в себя введение, обзор литературы (глава
1), описание методов исследования (глава 2), результаты исследования и их
обсуждение (глава 3), заключение, выводы и список литературы (144 источника).
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному
руководителю к.б.н. Б.Р. Кулуеву, сотрудникам лаборатории молекулярной биологии
и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. А.В. Князеву, к.б.н. Ю.М. Никонорову, а
также д.б.н., профессору кафедры «Генетика» БГПУ им. М. Акмуллы В.Ю.
Горбуновой за помощь, оказанную при проведении исследований и подготовке
диссертационной работы.
6
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы исследования. Объектами исследования в данной работе являлись
растения табака обыкновенного (Nicotiana tabacum L.) и его гены NtEXPA1, NtEXPA4,
NtEXPA5 и NtEXPA6, а также гены PnEXPA1 и PnEXPA3 тополя черного (Populus
nigra) и AtEXPA10 арабидопсиса (A. thaliana). Целевые гены клонировали из листьев
A. thaliana экотипа Columbia 0, N. tabacum сорта Petit Havana линии SR1, выращенные
в условиях теплицы, и P. nigra, растущего на территории УНЦ РАН.
Методы исследования. Целевые гены NtEXPA1, NtEXPA5, NtEXPA6, AtEXPA10,
PnEXPA1, PnEXPA3 были амплифицированы из полногеномной ДНК растений
табака, арабидопсиса и тополя методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
использованием
смеси
полимераз
Taq/Pfu.
Определение
нуклеотидных
последовательностей амплифицированных генов растений проводили на
автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США),
используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v. 3.0». Компьютерный
анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета
компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США). Электропорацию
компетентных клеток Agrobacterium tumefaciens проводили при помощи
электропоратора фирмы «Bio-Rad» модели Micropulser. Трансгенные формы табака
получали методом агробактериальной трансформации листовых дисков (Gallois,
Marinho 1994). Для проведения агробактериальной трансформации были
использованы листья N. tabacum сорта Petit Havana линии SR1 в возрасте двух
месяцев. Для получения трансгенных форм табака применяли штамм AGL0 A.
tumefaciens. Из плазмид были использованы Т-вектор pKRX, а также бинарные
векторы pCambia 1301, 1305.1 и pER8 с геном устойчивости к гигромицину (Cambia,
Австралия) и с химерным эстрадиол-индуцибельным активатором транскрипции XVE
(Zuo et al.,2000).
Наблюдения за трансгенными растениями поколения Т1 осуществляли от стадии
появления корешков до получения семян в течение 3 – 5 месяцев. Растения в течение
первых 20 дней культивировали в климатостате при температуре 27оС, с
фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота) и освещенностью около 5000 люкс в
вегетационных сосудах объемом 450 мл, заполненных универсальным грунтом
(«Terra Vita», Россия). Далее, вплоть до стадии созревания семян, растения
выращивались на светоплощадке при тех же условиях. Для каждого растения после
посадки на почву проводили по три замера (через 30, 45 и во время цветения). В
каждом варианте было отобрано по шесть растений, у которых измеряли длину трех
нижних крупных листьев (первый, второй и третий настоящие листья), а затем
7
вычисляли среднее значение для каждого растения. Длину стебля измеряли в период
цветения. Площадь клеток нижнего эпидермиса и мезофилла листьев определяли при
помощи универсального флуоресцентного микроскопа модели Axio Imager M1 (Carl
Zeiss, Германия). Для оценки морфометрических различий между выборками
контрольной и опытной групп растений использовали U-критерий Манна – Уитни.
Количественное определение содержания мРНК (после конверсии в кДНК)
целевых генов проводили методом ПЦР в режиме реального времени в присутствии
интеркалирующего красителя SYBR Green I на термоциклере Rotor-GeneTM 6000
(Corbett Research, Австралия). Для определения возможного влияния повышенной
экспрессии генов экспансинов на плоидность трансгенных растений использовали
метод подсчета числа хлоропластов в устьичных клетках (Малецкий и др., 2013). Для
определения влияния экзогенных фитогормонов на уровень транскрипции целевых
генов экспансинов в растениях табака дикого типа использовали следующие
концентрации фитогормонов: 6-БАП (6-бензиламинопурин) – 50 мкМ, НУК
(нафтилуксусная кислота) – 0,5 мкМ, ЭБ (24-эпибрассинолид) – 0,1 мкМ, ГК3
(гибберелловая кислота) – 1 мкМ. Через 1,5 часа после опрыскивания вторые и третьи
от верхушки побега листья табака замораживали в жидком азоте, выделяли из них
тотальную РНК и строили кДНК.
Работа выполнена частично на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение
биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и
УНУ «КОДИНК».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Роль генов экспансинов NtEXPA1 и NtEXPA4 в регуляции клеточного
растяжения при росте органов табака
Геном табака в настоящее время не секвенирован, но у него идентифицировано 6
генов α-экспансинов (Link et al., 1998), которые получили названия NtEXPA, с
порядковыми номерами от 1 до 6, зарегистрированными в GenBank нуклеотидными
последовательностями AF049350 – AF049355. Вначале была поставлена задача по
определению количественного содержания мРНК генов NtEXPA1 и NtEXPA4 в
растениях табака дикого типа. При этом было установлено, что, начиная с третьего от
верхушки побега листа, уровень транскрипции гена NtEXPA1 снижался, а в
прекративших рост зрелых листьях почти не детектировался (рис. 1а). Уровень
транскрипции гена NtEXPA4 был выше, чем гена NtEXPA1 в большинстве
анализируемых органов. Наибольшее содержание мРНК гена NtEXPA4 было
зафиксировано в молодых листьях и в растущих цветках (рис. 1б). Основным
отличием от гена NtEXPA1 явилось то, что даже в зрелых листьях мы всегда
8
регистрировали транскрипцию гена NtEXPA4, хотя и на более низком уровне.
%
%
Рисунок 1. Количественный анализ уровня транскрипции генов NtEXPA1 и
NtEXPA4 в различных органах табака: 1 – верхушка побега с первым листочком; 2 –
верхняя часть стебля без листьев; 3 – второй от верхушки побега лист; 4 – третий от
верхушки побега лист; 5 – пятый от верхушки побега лист; 6 – растущий цветок; 7 –
зрелый цветок; 8 – корни. По оси ординат здесь и далее приведены значения
относительного уровня транскрипции исследуемых генов по отношению к
содержанию мРНК гена α-тубулина, которое принято за 100%.
Из литературы известно, что транскрипция генов экспансинов находится под
контролем фитогормонов, где важная роль принадлежит ауксинам, цитокининам,
брассиностероидам и гиббереллинам (Шарова, 2007). Поэтому большой интерес
представляет определение особенностей регуляции транскрипции генов NtEXPA1 и
NtEXPA4 этими фитогормонами. Как видно из результатов проведенного
эксперимента (рис. 2а) под влиянием 6-БАП и НУК во втором от верхушки побега
листе уровень транскрипции гена NtEXPA1 соответственно повышалась в 1,5 и 3 раза,
по сравнению с контролем. В этих же условиях в третьем листе, закончившем свой
рост, если 6-БАП, НУК и ГК3 практически не оказывали влияние на содержание
мРНК исследуемого гена, то под влиянием ЭБ зарегистрировано, напротив, снижение
уровня содержания транскриптов гена NtEXPA1 в 1,5 раза, по сравнению с контролем
(рис. 2б). Уровень транскрипции гена NtEXPA4 во втором листе под влиянием 6-БАП
и НУК также повышался в 2 и 19 раз соответственно, по сравнению с контролем (рис.
2в). Интересно, что в третьем листе если НУК практически не оказывал влияния на
этот ген (рис. 2г), то он активировался под влиянием 6-БАП и ЭБ. Важно заметить,
9
что при экзогенной обработке ЭБ содержание мРНК гена NtEXPA4 повышалось
приблизительно в 2 раза по сравнению с контролем (рис. 2г).
Рисунок 2. Влияние экзогенной обработки фитогормонами на уровень
транскрипции генов экспансинов в листьях табака. Здесь и далее данные
представлены в виде среднего арифм. ± стандартная ошибка среднего. Достоверность
различий оценивали с помощью U-критерия Манна – Уитни (n=6; * – p < 0,05).
Ранее у A. thaliana был выделен и изучен ген ARGOS-LIKE, участвующий в
регуляции роста клеток растяжением (Hu et al., 2006). Исходя из предположения, что
белок ARGOS-LIKE может принимать участие в регуляции транскрипции генов
NtEXPA1 и NtEXPA4, нами были созданы трансгенные растения табака,
экспрессирующие ген ARGOS-LIKE A. thaliana под контролем эстрадиолиндуцибельной транскрипционной системы XVE (Zuo et al., 2000). Молекулярный
анализ полученных трансгенных растений показал, что в четвертых от верхушки
побега листьях при индуцировании экспрессии гена ARGOS-LIKE, путем экзогенной
обработки эстрадиолом, содержание мРНК гена NtEXPA1 повышалось в 1,7 раза, а
гена NtEXPA4, наоборот снижалось в 1,2 раза (рис. 3) по сравнению с контрольными,
необработанными эстрадиолом, растениями.
10
%
Рисунок 3. Уровень транскрипции генов экспансинов при индуцибельной
экспрессии гена ARGOS-LIKE. EXP1, EXP4 – гены NtEXPA1 и NtEXPA4. Контроль –
растения, обработанные 0,1% раствором ДМСО, эстрадиол – растения, обработанные
0,1% ДМСО с эстрадиолом, 5мкМ.
Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что исследуемые нами
два гена экспансина участвуют в брассиностероид-индуцированной системе
регуляции клеточного растяжениям и выполняют различные функции. В целом,
исходя из наших и литературных данных (Hu et al., 2006; Feng et al., 2011), нами было
выдвинуто предположение, что экспансин NtEXPA1 участвует в инициации роста
клеток растяжением, а экспансин NtEXPA4 необходим, в основном, для более
длительного поддержания клеточного растяжения.
Для доказательства влияния гена NtEXPA1 на рост клеток растяжением, нами
были получены трансгенные растения табака с конститутивной экспрессией
исследуемого гена. Для морфологического анализа трансгенных по гену NtEXPA1
растений табака были отобраны линии под номерами 1, 6, 7, 8, 11, 13, 15 и 20 с
подтвержденным повышенным уровнем экспрессии целевого гена и содержанием
единичной копии трансгена. Удлинение листьев в период цветения было характерно
для линий 1, 7, 15 и 20 (рис. 4а), по площади листьев также многие трансгенные
растения характеризовались их увеличением в среднем от 7% (по сравнению с
контролем) у линии 13 до 51% у линии 7, по сравнению с контролем (рис. 4б).
Достоверное увеличение размеров стебля было зафиксировано для линий 1, 7 и 11
(рис. 4в). Причем степень увеличения размеров стебля достигала 23% по сравнению с
контролем (линия 7). Размеры цветков под влиянием конститутивной экспрессии гена
NtEXPA1 не увеличивались (рис. 4г). Линии 1, 7, 11, 15 и 20 характеризовались
достоверным увеличением размеров клеток эпидермиса листьев, по сравнению с
контролем (рис. 4д). Данные изменения размеров клеток листьев коррелировали с
увеличением размеров листьев в линиях 1, 7, 15 и 20. Площадь клеток эпидермиса
цветков у опытных растений также возрастала по сравнению с контролем (рис. 4е),
11
однако увеличения размеров цветков не происходило. Полученные данные говорят о
функциональной полноценности клонированного нами гена NtEXPA1 и о том, что
полученная нами генно-инженерная конструкция может быть использована для
создания трансгенных растений с увеличенными размерами листьев. Отметим, что
нами были получены также трансгенные растения с индуцибельной экспрессией гена
NtEXPA1, однако морфологический анализ не выявил существенных различий в
размерах органов и клеток контрольных и опытных растений (данные не
представлены). Ген NtEXPA4, несмотря на многочисленные попытки, клонировать
нам не удалось.
Рисунок 4. Морфологические параметры трансгенных растений табака в период
цветения, сверхэкспрессирующих ген NtEXPA1: SR1 – контрольные растения табака
дикого типа. 1301 – контрольные трансгенные растения табака, содержащие Т-ДНК
бинарного вектора pCambia 1301 без целевого гена. EXP1/1-20 – линии опытных
растений табака.
Конститутивная экспрессия гена NtEXPA5 в трансгенных растениях табака
Нами были получены трансгенные растения табака, с конститутивной
экспрессией гена NtEXPA5, которые ни через 30, ни через 45 дней после
12
акклиматизации к условиям почвы практически не отличались по длине листьев от
контрольных растений. Однако в период цветения, через 80 – 100 дней после
акклиматизации, листья у опытных растений были длиннее на 10 – 22%,
соответственно, их площадь также характеризовалась увеличением на 10 – 21%. По
высоте стебля опытные растения были заметно выше контрольных, и разница
составляла у линий 4 и 6 – 24%, а у линии 5 – 46%. По длине цветка различия между
опытными и контрольными растениями были небольшими и, в целом, составили от
1% у линии 4, до 9% у линий 5 и 6. По форме листьев, стебля и цветков опытные и
контрольные растения не различались (рис. 5). Трансгенные по гену NtEXPA5
растения характеризовались увеличенными размерами клеток эпидермиса листьев.
При этом у линии 4 клетки были больше на 57%, у линии 5 – на 51%, а у линии 6 – на
23% крупнее, чем у контрольных растений (рис. 5). Повышенная экспрессия гена
NtEXPA5 в первую очередь влияла на размеры клеток листьев, причем размеры
клеток эпидермиса цветков изменялись в гораздо меньшей степени. Результаты
наших исследований показывают, что ген NtEXPA5 может быть применен для
создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов, и в особенности
для изменения длины стебля, что может иметь практическое значение в
биотехнологии растений.
30 дней после
пересадки на почву
из среды МС
Период цветения
Клетки нижнего
эпидермиса листьев
(увеличение 200x)
контроль
Рисунок 5. Внешний вид
микроскопического исследования.
трансгенные растения с конститутивной
экспрессией гена NtEXPA5
линия 4
линия 5
линия 6
трансгенных растений табака и данные
13
Конститутивная и индуцибельная экспрессия гена NtEXPA6
Для выяснения роли гена NtEXPA6 в регуляции клеточного растяжения и роста
органов растения, нами было определено количественное содержание его мРНК в
органах табака дикого типа. Показано, что уровень мРНК гена NtEXPA6 в несколько
раз меньше по сравнению с генами NtEXPA1 и NtEXPA4. Лишь в корнях наблюдался
довольно высокий уровень мРНК данного гена (рис. 6), однако даже здесь он был
ниже, чем у генов NtEXPA1 и NtEXPA4 (рис. 1, 6).
При определении влияния фитогормонов на регуляцию экспрессии гена
NtEXPA6 было показано, что во втором от верхушки побега листе транскрипция гена
NtEXPA6 повышается лишь под влиянием 6-БАП и НУК (рис. 6). В то же время во
втором листе нами зарегистрировано негативное действие ЭБ на уровень содержания
мРНК гена NtEXPA6 (рис. 6). В третьем от верхушки побега листе уровень
транскрипции гена NtEXPA6 снижается в среднем в три раза по сравнению со вторым
листом.
Рисунок 6. Количественный анализ уровня транскрипции гена NtEXPA6 в
различных органах табака, а также под влиянием экзогенной обработки
фитогормонами. По оси ординат приведены значения относительного уровня
транскрипции гена NtEXPA6 по отношению к содержанию мРНК гена α-тубулина,
которое принято за 100%.
Для изучения вклада гена NtEXPA6 в регуляцию и обеспечение роста органов
табака, нами были созданы трансгенные растения с конститутивной и индуцибельной
экспрессией целевого гена. Для изучения конститутивной экспрессии гена NtEXPA6
его клонировали в векторе pCambia 1301. Трансгенные растения с единичной копией
целевого гена под номерами 2, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14 и 15 использовались для
морфологического анализа. Подсчет количества хлоропластов в устьичных клетках у
опытных и контрольных растений, показал, что трансгенные растения являются
14
диплоидными и несут, как и контрольные, от 14 до 20 хлоропластов на устьичную
клетку.
В среднем для всех линий, длина листьев увеличилась на 7,5% по сравнению с
контрольными растениями, площадь листьев опытных растений в среднем была
больше на 14,1%. Увеличение стебля на 15% было характерно для линии 8, тогда как
среднее значение для всех линий отличалось лишь на 7,5% по сравнению с
контролем. Длина цветков трансгенных растений была меньше длины цветков
контрольной группы – в среднем на 2,2%, а для линии 6 и 12 разница составила 4,2%.
По размерам семенных коробочек особых отличий между контрольными и опытными
растениями не наблюдалось. Что касается микроскопического анализа площади
клеток эпидермиса венчика цветка, то среднее значение составило 19965,9 мкм2, что
несколько превышает показатель контрольной группы (18357,9 мкм2). Эти и другие
данные говорят о том, что экспансин NtEXPA6 хоть и является, вероятнее всего,
минорным белком, тем не менее, он все же активно участвует в обеспечении
клеточного растяжения наземных органов растения.
Исследование индуцибельной экспрессии гена NtEXPA6 осуществляли при
помощи вектора pER8. Трансгенные растения, содержащие целевой ген под
контролем индуцибельного промотора, обрабатывали 20 мкМ раствором эстрадиола
(в 0,1% ДМСО), разведенного в дистиллированной воде с добавлением сильвета
(0,02%). Контрольные растения обрабатывали 0,1% ДМСО, также с добавлением
сильвета, разведенного в дистиллированной воде. Полученные результаты показали,
что размеры вегетативных органов трансгенных растений опытной группы оказались
несколько меньше трансгенных растений контрольной группы. В среднем длина
листьев у опытной группы была меньше на 4,5%, площадь листьев – на 12%, длина
стебля – на 6,3%, размеры цветков – на 9% по сравнению с контрольной группой.
Однако при явном уменьшении размеров наземных органов у опытной группы
трансгенных растений, на микроскопическом уровне довольно часто наблюдалось
увеличение размеров отдельных клеток.
Таким образом, конститутивная и индуцибельная экспрессия гена NtEXPA6
способствовала увеличению размеров клеток нижнего эпидермиса листьев
трансгенных растений табака, однако пропорционального увеличения размеров
листьев не происходило, что может быть связано с функционированием различных
компенсаторных механизмов, направленных на сохранение размеров органов в
пределах физиологической нормы. Таким образом, ген NtEXPA6, в отличие от других
исследованных нами генов экспансинов табака, не может быть рекомендован для
создания трансгенных растений с увеличенными размерами органов, так как его
15
сверхэкспрессия довольно часто, вопреки ожиданиям, способствует уменьшению
размеров листьев, стебля и цветков.
Конститутивная экспрессия гена AtEXPA10 в трансгенных растениях
табака
Дальнейшие наши исследования касались анализа трансгенных растений табака,
сверхэкспрессирующих гены экспансинов в гетерологичных условиях. В первую
очередь, нами была поставлена задача по клонированию генов экспансинов A.
thaliana, сверхэкспрессия которых, по литературным данным, способствует
существенному
увеличению
размеров
органов.
Именно
таким
параметрам
соответствует, прежде всего, ген AtEXPA10 (Cho et al., 2000). Планировалось
получить трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие ген AtEXPA10 с
целью выяснения эффективности его экспрессии в гетерологичных условиях.
Участок молекулы ДНК A. thaliana размером около 1000 п.н., включающий ген
AtEXPA10 был амплифицирован и клонирован в векторе pKRX. Анализ нуклеотидных
последовательностей показал, что выделенная нами копия гена не содержит
нуклеотидных замен и полностью совпадает с теоретически ожидаемой
последовательностью. Затем ген AtEXPA10 был вырезан из вектора pKRX по сайту
BsePI и клонирован в модифицированном векторе pCambia 1301 по сайту рестрикции
SmaI. В ходе агробактериальной трансформации листовых дисков табака целевой
генно-инженерной конструкцией вектора pCambia 1301 с геном AtEXPA10 было
отобрано 44 первичных побега. Из них укоренились на селективной среде 13
растений, у 10 из которых обнаружилась активность репортерного гена GUS в
листьях. Из этих растений шесть были успешно акклиматизированы к условиям
почвы и отобраны для дальнейшей работы. Было показано, что все шесть отобранных
растений содержат в своем геноме как ген AtEXPA10 A. thaliana, так и 35S промотор.
Экспрессия целевого гена в трансгенных растениях табака была доказана при помощи
ОТ-ПЦР. Через 30 дней после пересадки на почву трансгенные растения опережали
контрольные растения по длине листьев в среднем на 85%, через 45 дней – на 83%,
через 60 дней – на 41%, во время цветения – на 33% (рис. 7). Площадь листьев
трансгенных растений была больше, чем у контрольных в среднем на 43%, высота
стебля – на 29%, длина цветка всего лишь – на 9%, сырая масса растения – на 41%. В
целом, наиболее заметным было увеличение размеров листьев у трансгенных
растений по сравнению с контролем. Визуальной разницы между размерами цветков
контрольных и опытных растений не наблюдалось, в отличие от листьев и стеблей.
16
Рисунок 7. Размеры листьев анализируемых линий табака в разные периоды
времени.
При помощи микроскопического анализа было показано, что площадь отдельно
взятых клеток эпидермиса листьев трансгенных по гену AtEXPA10 растений в
среднем была больше на 18%, а средняя площадь листьев больше на 43%, чем у
контрольных растений. Площадь клеток палисадного мезофилла у трансгенных
растений была больше в среднем на 24% по сравнению с контрольными растениями.
Это говорит о том, что причиной увеличения размеров листьев опытных растений
было не только увеличение размеров клеток, но и их количества.
В результате проведенных исследований нами было показано ощутимое влияние
сверхэкспрессии гена AtEXPA10 на размеры вегетативных органов трансгенных
растений табака. Несмотря на то, что данный ген был выделен из A. thaliana, он также
оказался эффективным в трансгенных растениях табака, что объясняется наличием
гомологов гена AtEXPA10 в геноме табака и высоким уровнем консервативности
генов экспансинов. Таким образом, результаты наших исследований показывают, что
ген AtEXPA10 может быть использован в качестве целевого для создания трансгенных
растений с увеличенными размерами листьев.
Клонирование и исследование гена экспансина PnEXPA1 тополя черного
Участок ДНК, содержащий полноразмерный ген PnEXPA1, был
амплифицирован из геномной ДНК тополя черного, и его размер составил около 2000
п.н. Ампликон был клонирован в векторе pKRX и секвенирован, причем было
показано отсутствие замен нуклеотидов (AY4350991). Целевой ген PnEXPA1 был
вырезан из вектора pKRX по сайту BsePI и обработан Т4-ДНК-полимеразой для
формирования «тупых» концов. Далее в бинарный вектор pCambia 1301 по сайту
SmaI осуществили ненаправленное клонирование целевого гена за 3'-концом 35S
промотора. Бинарные векторы с геном PnEXPА1 были внедрены в клетки A.
17
tumefaciens и произведена агробактериальная трансформация листовых дисков табака.
В результате трансформации было получено 63 растения, из которых успешно
укоренились 19, которые окрашивались в синий цвет при инкубации в субстрате xgluc за счет проявления активности репортерного гена GUS. Во время выращивания
на почве было замечено, что, по крайней мере, две линии трансгенных растений
отличались увеличенными размерами листьев, по сравнению с контрольными. Через
30 дней после акклиматизации трансгенные растения в среднем опережали контроль
по длине листьев на 53%, через 45 дней – на 60%, через 60 дней – на 24%, и в период
цветения – на 21% (рис. 8).
Рисунок 8. Размеры листьев трансгенных растений табака в разные периоды
времени.
Площадь листьев трансгенных растений была больше, чем у контрольных в
среднем на 37%, высота стебля – на 16%, длина цветка – на 9%, сырая масса растения
– на 23%. Также следует отметить, что количество цветков у трансгенных растений
было больше, чем у контрольных.
Микроскопическое исследование площади клеток нижнего эпидермиса
листьев трансгенных растений, с повышенной экспрессией гена PnEXPA1, показало
увеличение размеров отдельно взятых клеток на 53% (рис. 9).
18
Рисунок 9. Размеры клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных линий с
конститутивной экспрессией гена PnEXPA1.
В отличие от гена AtEXPA10, в случае с геном PnEXPА1 размеры клеток у
трансгенных растений были гораздо больше, и именно стимулирование роста клеток
растяжением было определяющим в увеличении размеров органов. Увеличение
количества цветков у изученных нами линий трансгенных табаков по сравнению с
контрольными растениями подтверждает тот факт, что экспансины, как это было
показано ранее, участвуют в закладке зачатков органов (Fleming et al., 1997).
Таким образом, ген экспансина тополя черного PnEXPA1 также может быть
использован в качестве целевого при создании трансгенных растений с увеличенными
размерами листьев.
Морфофизиологический анализ трансгенных растений табака, с
повышенной экспрессией гена PnEXPA3
Участок ДНК, содержащий полноразмерный ген PnEXPA3 был амплифицирован
из геномной ДНК тополя черного, размер ампликона составил около 1500 п.н.
Ампликон был клонирован в векторе pKRX и секвенирован. Анализ нуклеотидных
последовательностей показал, что выделенная нами копия гена совпадает с
теоретически ожидаемой (AY435101.1). Клоны, содержащие векторы с целевым
геном в смысловой ориентации использовались для агробактериальной
трансформации табака и получения трансгенных растений. С генно-инженерной
конструкцией pCambia 1305.1/PnEXPA3 было получено 16 первичных трансгенных
побегов, девять из которых были акклиматизированы к условиям почвы. Из данных
растений была выделена геномная ДНК и проведен ПЦР-анализ на наличие гена
PnEXPA3 и 35S промотора. От этих растений были собраны семена с целью
получения второго поколения трансгенных растений и проведения морфологического
анализа. Семена трех линий растений второго поколения были высеяны на
19
селективную среду, а затем пересажены на почву. В качестве контроля использовали
линию трансгенных растений, содержащих Т-ДНК бинарного вектора без целевого
гена (pCambia 1305.1). По длине листьев трансгенные и контрольные растения после
пересадки на почву практически не различались ни через 30, ни 45 дней, ни в период
цветения (рис. 10). По площади листьев трансгенные растения также не превышали
контрольные растения.
Рисунок 10. Размеры листьев трансгенных растений, с повышенной экспрессией
гена PnEXPA3.
В то же время по высоте стебля опытные растения были заметно выше
контрольных, и разница составила для линии 5 – 23%, линии 7 – 20%, линии 9 – 26%
(рис. 11). По длине цветка различий также не наблюдалось.
Рисунок 11. Длина стебля трансгенных растений с повышенной экспрессией
гена PnEXPA3.
20
Трансгенные
по
гену
PnEXPA3
растения
в
отличие
от
контрольных
характеризовались увеличенными размерами клеток эпидермиса листьев. При этом у
линии 5 клетки в среднем были больше на 60%, линии 7 на 62%, линии 9 на 74%
крупнее, чем у контрольных растений (рис. 12).
Рисунок 12. Размеры клеток нижнего эпидермиса листьев трансгенных линий с
конститутивной экспрессией гена PnEXPA3.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что конститутивная экспрессия
гена PnEXPA3 в первую очередь стимулирует рост стебля в длину, а на рост листьев
практически не влияет. Все полученные трансгенные растения отличались
увеличенными размерами клеток эпидермиса и паренхимы листьев. В среднем
размеры клеток увеличивались на 60%, при этом размеры листьев у анализируемых
растений оставались в пределах нормы. Следовательно, ген PnEXPA3 может быть
использован в качестве целевого при создании трансгенных растений с увеличенными
размерами стебля.
***
Таким образом, в ходе проведенных нами исследований было установлено, что
повышенная экспрессия генов экспансинов табака и тополя приводит к увеличению
размеров клеток и вегетативных органов модельных растений табака, при этом
уровень транскрипции отдельных генов экспансинов существенно отличается в
зависимости от органа и регулируется фитогормонами. Полученные данные говорят о
том, что изученные нами гены могут быть использованы в качестве целевых при
создании трансгенных растений с увеличенными размерами органов. Однако следует
отметить, что их влияние может быть ограничено возрастом растения и состоянием
его органов, когда стенки клеток перестают быть чувствительными к действию таких
21
белков, как экспансины. Их воздействие на рост растений также может сдерживаться
внутренними компенсаторными механизмами, направленными на поддержание роста
в целом и размеров органов в частности, в пределах физиологической нормы. В связи
с вышесказанным, в этом направлении исследований существует необходимость
поиска и изучения других генов-регуляторов роста и развития растения,
ответственных,
к
примеру,
за
регуляцию
клеточной
пролиферации,
эндоредупликации и др. Представляется необходимым также при создании
трансгенных растений использование не только конститутивных, но и
тканеспецифичных и индуцибельных промоторов.
ВЫВОДЫ
1. Выявлено, что наиболее высокий уровень транскрипции экспансинов табака
наблюдается в верхушке побега и расположенных рядом наиболее молодых листьях,
при этом ген NtEXPA1 преимущественно экспрессируется в первом и во втором
листе, ген NtEXPA4 в третьем, а ген NtEXPA6 в корнях и верхушке побега.
2. Показано, что цитокинины и ауксины стимулируют транскрипцию генов
экспансинов табака NtEXPA1, NtEXPA4 и NtEXPA6 в верхушке побега и в растущих
растяжением молодых листьях, тогда как брассиностероиды способствуют снижению
уровня транскрипции генов NtEXPA1 и NtEXPA6 в этих молодых листьях, но
стимулируют транскрипцию гена NtEXPA4 в третьих от верхушки побега листьях.
3. Установлено, что конститутивная экспрессия генов экспансинов NtEXPA1,
NtEXPA5, NtEXPA6, AtEXPA10 и PnEXPA1 способствует увеличению размеров
органов трансгенных растений табака.
4. Показано, что трансгенные растения табака, сверхэкспрессирующие гены
экспансинов NtEXPA1, NtEXPA5, NtEXPA6, AtEXPA10, PnEXPA1 и PnEXPA3
отличаются от контрольных существенным увеличением размеров клеток, при этом
конечные размеры органов могут изменяться в меньшей степени за счет
компенсаторных механизмов, направленных на уменьшение количества клеток,
приходящихся на один орган.
5. Установлено, что сверхэкспрессия генов AtEXPA10, PnEXPA1 и NtEXPA1
оказывает наибольшее влияние на рост листьев, а трансгены PnEXPA3 и NtEXPA5
преимущественно способствуют увеличению высоты стебля.
22
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в рецензируемых журналах из перечня ВАК:
1. Кулуев, Б.Р. Влияние конститутивной экспрессии гена ARGOS-LIKE на
размеры клеток и органов трансгенных растений табака / Б.Р. Кулуев, А.В. Князев,
М.Г. Сафиуллина // Генетика. – 2013. – Т.49. – №5. – С. 587-594.
2. Кулуев,
Б.Р.
Морфологический
анализ
трансгенных
растений
экспрессирующих ген PnEXPA3 тополя черного / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина, А.В.
Князев // Онтогенез. – 2013. – Т. 44. – №. 1. – С. 34-41.
3. Кулуев, Б.Р. Влияние эктопической экспрессии гена NtEXPA5 на размеры
клеток и рост органов трансгенных растений табака / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина,
А.В. Князев // Онтогенез. – 2013. – Т. 44. – С. 166-173;
Статьи и тезисы:
1. Сафиуллина М.Г. Создание трансгенных растений табака с эктопической
экспрессией генов AtEXP10 и PnEXPA1 // Материалы 11-й Международной
междисциплинарной научно-практической конференции «Современные проблемы
науки и образования». – Ялта. – 2011. – С. 169-170.
2. Кулуев, Б.Р. Создание трансгенных растений табака экспрессирующих ген
PnEXPA3 тополя черного / Б.Р. Кулуев, М.Г. Сафиуллина, А.В. Князев // Материалы
VI Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего
образования в области био- и органической химии и биотехнологии». – Уфа. – 2011. –
С. 107-108.
3. Сафиуллина. М.Г. Конститутивная экспрессия гена NtEXPA5 под контролем
35S промотора / М.Г. Сафиуллина, Б.Р. Кулуев // Материалы Всероссийской школыконференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, растений и
микроорганизмов». – Уфа. – 2012. – C. 145-147.
4. Сафиуллина, М.Г. Морфологический анализ трансгенных растений табака,
сверхэкспрессирующих экспансины / М.Г. Сафиуллина, Б.Р. Кулуев // Материалы
Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы генетики и
молекулярной биологии» в рамках фестиваля науки». – Уфа. – 2012. – С. 58-59.
5. Кулуев, Б.Р. Морфофизиологическая характеристика трансгенных растений
табака, сверхэкспрессирующих ген ARL арабидопсиса / Б.Р. Кулуев, М.Г.
Сафиуллина, Я.П. Лебедев, Е.В. Михайлова // Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН
«Биомика». – Уфа. – 2011. – Т.2. – №2. – С. 62-63.
6. Сафиуллина, М.Г. Получение трансгенных растений табака с эктопической
экспрессией гена PnEXPA3 тополя черного / М.Г. Сафиуллина, Б.Р. Кулуев, Я.П.
Лебедев // Электронный журнал ИБГ УНЦ РАН «Биомика». – Уфа. – 2011. – Т.2. –
№2. – С. 113-114.
7. Сафиуллина, М.Г. Амплификация и клонирование генов NtEXPA1 и NtEXPA6
табака / М.Г. Сафиуллина, А.М. Хасанова, Л.Р. Хасанова, Б.Р. Кулуев // Электронный
журнал ИБГ УНЦ РАН «Биомика». – Уфа. – 2012. – Т.3. – №1. – С.91
23
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
АБК – абсцизовая кислота
6 - БАП – 6-бензиламинопурин
БР – брассиностероиды
ГК3 – гибберелловая кислота
ДМСО – диметилсульфоксид
ИУК – индол-3-уксусная кислота
НУК – нафтилуксусная кислота
ОТ-ПЦР – полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ЭБ – 24-эпибрассинолид
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
ARGOS-LIKE – ген-регулятор клеточного растяжения Arabidopsis thaliana
AtEXPA10 – ген экспансина A. thaliana
CKX – цитокининоксидаза
ETR1, ETR2, ERS1, ERS2, EIN4 – рецепторы этилена
GID1 – рецептор гиббереллинов
NtEXPA1, NtEXPA2, NtEXPA3, NtEXPA4, NtEXPA5, NtEXPA6 – гены экспансинов
табака (Nicotiana tabacum)
PnEXPA1, PnEXPA2, PnEXPA3 – гены экспансинов тополя черного (Populus
nigra)
TIR1 – рецептор ауксина
XVE – эстрадиол-индуцибельный активатор транскрипции
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
22
Размер файла
778 Кб
Теги
геном, трансгенных, индуцибельная, экспансинов, конститутивная, растения, табак, экспресс
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа