close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Нарушение гипоталамической регуляции репродуктивных циклов при воздействии неблагоприятных экологических факторов

код для вставкиСкачать
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
КОРЕНЕВСКИЙ Андрей Валентинович
НАРУШЕНИЕ ГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ
РЕПРОДУКТИВНЫХ ЦИКЛОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ
НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
03.03.01 – физиология
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург 2015
2
Работа выполнена в лаборатории биохимии с клинико-диагностическим отделением
ФГБУ «Институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта» СЗО РАМН.
Научный консультант:
заслуженный деятель науки РФ,
доктор биологических наук, профессор
Арутюнян Александр Вартанович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, доцент
Чернышева Марина Павловна,
профессор кафедры общей физиологии ФГБОУ ВПО «СанктПетербургский государственный университет»
доктор биологических наук, профессор
Розенгарт Евгений Викторович,
руководитель
группы
функциональной
биохимии
беспозвоночных
ФГБУН
«Институт
эволюционной
физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН
доктор медицинских наук, профессор
Долго-Сабуров Валерий Борисович,
ведущий
научный
сотрудник
ФГБУН
«Институт
токсикологии
Федерального
медико-биологического
агентства»
Ведущая научная организация:
ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова»
РАН
Защита диссертации состоится «____» _______________ 2015 г. в ____ часов на заседании
диссертационного совета Д 212.232.10 по защите диссертаций на соискание ученой степени
кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском
государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9
(аудитория 90).
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького СанктПетербургского государственного университета по адресу: 199034, Санкт-Петербург,
Университетская наб., 7/9. Автореферат размещен на сайте www.spbu.ru.
Автореферат разослан «____» _______________ 2015 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
Ляксо Е.Е.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Современный этап развития цивилизации характеризуется все большим вмешательством
человека в состояние биосферы. В ней появляются и накапливаются несвойственные природе
соединения, называемые ксенобиотиками. Их присутствие даже в относительно небольших
количествах при длительном воздействии способно вызывать нарушения различных функций
живого организма, в том числе репродуктивной.
Важнейшая роль в ее координации у млекопитающих принадлежит процессам
центральной регуляции, которые осуществляет единая нейроэндокринная система,
использующая в качестве химических посредников половые гормоны [Угрюмов М.В., 1998].
Процессу овуляции, характерному для женского организма, предшествует ряд гормональных
изменений в организме, среди которых важнейшим является резкое повышение в крови уровня
гонадотропных гормонов гипофиза, вызываемое у самок крыс гиперсекрецией гонадолиберина.
Для осуществления преовуляторного пика секреции этого нейрогормона необходимо
взаимодействие двух сигналов – гормонального, заключающегося в повышении в крови уровня
синтезируемых яичниками стероидов в период, предшествующий овуляции, и циркадианного
сигнала, ежедневно поступающего из супрахиазматических ядер гипоталамуса (СХЯ)
к нейрональным структурам, ответственным за синтез и секрецию гонадолиберина [Palm I.F.
et al., 2001; Butler M.P., Kriegsfeld L.J., Silver R., 2009]. Оба эти сигнала передаются
к гонадолиберинергическим нейронам опосредованно, через нейромедиаторные системы.
Активность этих систем регулируется эндокринным путем, в первую очередь половыми
гормонами яичников, и посредством нейрональных связей с различными функциональными
отделами мозга.
Имеются данные, свидетельствующие также и о важной роли катехоламинергических
и пептидергических систем в нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции
[Chappell P.E., 2005]. Однако по-прежнему малоизученными остаются вопросы, связанные
с изменением в течение суток содержания нейромедиаторов в гипоталамических структурах,
ответственных за синтез (медиальная преоптическая область) и секрецию (срединное
возвышение с аркуатными ядрами) гонадолиберина. Недостаточно изучена роль пинеальной
железы и продуцируемого ею мелатонина в регуляции репродуктивных циклов и их возрастных
нарушениях.
В последние десятилетия были получены данные о том, что процесс передачи
циркадианного сигнала к нейромедиаторным системам, участвующим в гипоталамической
регуляции репродуктивной функции, отличается особой чувствительностью к различным
естественным и техногенным воздействиям. Так, у самок крыс наиболее ранним маркером
возрастных нарушений эстральных циклов служит исчезновение околосуточных ритмов
активности моноаминергических и опиоидергических систем гипоталамуса [Wise P.M. et al.,
1997; Goldman J.M. et al., 2008]. Поэтому исключительно актуальной представляется задача
исследования содержания и суточной динамики биогенных аминов в гипоталамических
структурах как индикатора ранних нарушений репродуктивной функции при воздействии
нейротоксикантов.
Вследствие увеличения средней продолжительности жизни человека женский организм
в течение более 20 лет пребывает в условиях возрастных изменений гормонального
4
гомеостазиса, обусловленных прекращением циклических процессов в женской репродуктивной
системе. В связи с этим актуальным является изучение механизмов регуляции репродуктивной
функции, ее возрастных изменений с целью разработки мер, направленных на осуществление
контроля и возможное продление репродуктивного периода. Исследования, проведенные
в последние десятилетия, были посвящены раскрытию сложных механизмов развития
нормального функционирования репродуктивной системы и ее естественного угасания
с возрастом. Несмотря на то, что она является одной из наиболее чувствительных к изменению
окружающей среды систем живого организма, отмечается неспецифический характер ее
реакции на воздействие различных химических и физических факторов. Это свидетельствует
об определенных нарушениях центральных механизмов регуляции репродуктивной функции
под действием неблагоприятных экологических факторов вне зависимости от их природы
[Arutjunyan A.V. et al., 2001; Арутюнян А.В. и др., 2003].
К числу эндогенных неблагоприятных факторов, способствующих развитию системного
окислительного стресса в тканях, в том числе и в головном мозге, следует отнести
цитотоксичную аминокислоту L-гомоцистеин и продукт его спонтанного окисления
гомоцистеиновую кислоту, уровень которых в кровяном русле резко возрастает при нарушениях
мозгового кровообращения [Yap S., 2003; Зорилова И.В. и др., 2005], а также
при недостаточности в организме витаминов группы В, и прежде всего фолиевой кислоты
[Miller J.W., 2013]. До настоящего времени влияние гипергомоцистеинемии на гипоталамогипофизарное звено регуляции репродуктивной функции было изучено недостаточно. Ответ
на вопрос о том, какими могут быть механизмы воздействия L-гомоцистеина
на преовуляторную секрецию лютеинизирующего гормона, по-видимому, могут дать
исследования, направленные на изучение влияния экспериментальной гипергомоцистеинемии
на нейромедиаторные системы гипоталамуса, ответственные за регуляцию репродуктивных
циклов.
Многочисленными исследованиями было показано, что, помимо химических факторов
[Губский Ю.И., Долго-Сабуров В.Б., Храпак В.В., 1993], световое излучение, естественное
и искусственное, его продолжительность и интенсивность также влияют на различные
биологические объекты [Bullough J.D., Rea M.S., Figueiro M.G., 2006; Анисимов В.Н.,
Виноградова И.А., 2008]. Основную роль в поддержании физиологических функций организма
играет пинеальная железа, активность которой изменяется в зависимости от времени суток
и уровня освещенности. Вместе с СХЯ гипоталамуса пинеальная железа исполняет роль
биологических часов, которые регулируют физиологические ритмы и функции живого
организма [Arendt J., 2005; Чернышева М.П., 2014]. Нарушение функционирования пинеальной
железы сказывается на цикличности продукции мелатонина, что приводит к гормональнометаболическим сдвигам, способствующим преждевременному старению организма.
Воздействие повышенного светового фона на организм человека и животных по-прежнему
остается малоизученным, отсутствуют данные о влиянии этого неблагоприятного фактора
внешней среды на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной системы.
Актуальной также является задача поиска соединений, способных предохранить
моноаминергические системы гипоталамуса от различных неблагоприятных химических
и физических факторов, а также нормализовать нарушенные процессы передачи информации
о суточном периодизме к этим нейромедиаторным системам. В этой связи представляется
перспективным использование гормона пинеальной железы мелатонина, а также препаратов
5
пинеальной железы либо синтетических пептидных аналогов, разработаннных на основе
анализа их аминокислотной последовательности. Нами была выдвинута гипотеза о том,
что хроническое введение мелатонина или пептидных биорегуляторов (препаратов пинеальной
железы) самкам крыс способно предохранить их репродуктивную систему от преждевременного
старения, вызванного окислительным стрессом, индуцированным внешним (нейротоксические
ксенобиотики, избыточный световой фон) или внутренним (пренатальная, возрастная или
алиментарная гипергомоцистеинемия) негативными факторами.
Цель и задачи исследования
Цель диссертационного исследования – изучить влияние различных неблагоприятных
экзогенных (1,2-диметилгидразин, толуол, постоянное освещение) и эндогенных
(гипергомоцистеинемия) факторов, а также старения, на моноаминергические структуры
гипоталамуса самок крыс, ответственные за регуляцию репродуктивной функции, и оценить
возможность коррекции выявленных нарушений с помощью мелатонина и пептидных
биорегуляторов.
Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие
задачи:
1.
Изучить суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции,
на различных стадиях эстрального цикла.
2.
Выяснить, имеют ли суточные изменения содержания биогенных аминов в структурах
гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции, циркадианную
природу.
3.
Оценить влияние экзогенных и эндогенных нейротоксических факторов на суточную
динамику и среднесуточное содержание гонадолиберина и биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции.
4.
Выяснить, существует ли взаимосвязь между содержанием биогенных аминов
и показателями окислительного стресса в структурах гипоталамуса, ответственных
за регуляцию репродуктивной функции, в норме, а также после нейротоксического
воздействия.
5.
Изучить воздействие мелатонина и пептидных биорегуляторов эпиталамина, эпиталона
и пинеалона на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию репродуктивной функции,
в экспериментальных моделях преждевременного старения репродуктивной системы
и гипергомоцистеинемии.
6.
Изучить возрастные изменения суточной динамики и среднесуточного содержания
биогенных аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию
репродуктивной функции.
7.
Оценить влияние мелатонина и пептидного препарата пинеальной железы эпиталона
на динамику эстральных циклов самок крыс разного возраста при различных световых
режимах.
6
Научная новизна
Проведено детальное исследование нарушения моноаминергического звена
гипоталамической регуляции репродуктивных циклов самок крыс под влиянием
нейротоксических факторов экзогенной и эндогенной природы, а также при различных
световых режимах и старении.
Впервые особое внимание уделено регистрации времени изменения содержания
биогенных аминов в гипоталамусе, имеющего важное значение для формирования
преовуляторного пика секреции гонадолиберина, обусловливающего нормальное течение
репродуктивных циклов. Установлено, что снижение уровня норадреналина в медиальной
преоптической области (МПО) гипоталамуса и повышение уровня дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами (СВ-Арк) гипоталамуса происходит на стадии проэструса
в узком временном интервале между 9:30 ч и 11 ч циркадианного времени (ЦВ).
Впервые проведена оценка зависимости изменений содержания биогенных аминов
в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции синтеза и секреции гонадолиберина,
от циркадианного и овариального сигналов, оказывающих специфическое действие
на моноаминергические системы гипоталамуса. Показано, что обнаруженная суточная динамика
содержания норадреналина в МПО гипоталамуса и дофамина в СВ-Арк гипоталамуса не зависит
от уровня половых стероидов в крови. Отмечено сохранение нормальной суточной динамики
содержания норадреналина в МПО гипоталамуса в условиях световой депривации,
что доказывает ее зависимость от центрального осциллятора циркадианных ритмов.
Получены новые данные о роли биогенных аминов в процессах возрастного изменения
и выключения циклических процессов в репродуктивной системе самок крыс. Впервые
показано, что с возрастом начальные этапы угасания репродуктивной функции сопровождаются
изменением нормальной суточной динамики содержания норадреналина и дофамина
в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции синтеза и секреции гонадолиберина;
обнаруженное изменение связано с предполагаемым нарушением функционирования
центрального осциллятора циркадианных ритмов.
Впервые установлено, что однократное введение обладающего нейротоксическими
свойствами энтеротропного канцерогена 1,2-диметилгидразина снижает среднесуточное
содержание гонадолиберина в СВ-Арк гипоталамуса, принимающем участие в регуляции
секреции нейрогормона.
Впервые изучено воздействие 1,2-диметилгидразина и нейротоксического ксенобиотика
толуола на суточные ритмы и среднесуточное содержание биогенных аминов
в гипоталамических структурах, участвующих в регуляции репродуктивной функции.
Установлено, что однократное введение 1,2-диметилгидразина, подобно двухмесячной
ингаляции толуола, воздействует на суточную динамику и среднесуточное содержание
биогенных аминов в исследованных структурах гипоталамуса, приводя к полному
исчезновению нормальных суточных изменений, а также значительно изменяя среднесуточные
показатели.
Впервые установлено, что экспериментальная гипергомоцистеинемия вызывает
в гипоталамусе эффекты, схожие с эффектами, вызываемыми нейротоксическими
ксенобиотиками, что представляет дополнительное подтверждение неспецифического характера
реакции центрального звена регуляции репродуктивной функции на различные
7
неблагоприятные факторы внешней среды и ставит эндогенно образующийся в организме
L-гомоцистеин в один ряд с экзогенными ксенобиотиками.
Получены новые данные о влиянии ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола,
а также экспериментальной гипергомоцистеинемии на показатели окислительного стресса.
Показано, что суточная динамика образования активных форм кислорода (АФК) в структурах
гипоталамуса, ответственных за регуляцию эстральных циклов, может служить маркером
нормального функционирования механизмов передачи к этим структурам информации
о суточном периодизме, а также их нарушения при различных неблагоприятных воздействиях
на организм.
Впервые обнаружен нейропротекторный эффект эпиталамина и эпиталона на суточную
динамику содержания норадреналина и дофамина в МПО и СВ-Арк гипоталамуса, нарушенную
при воздействии 1,2-диметилгидразина. Показано, что введение мелатонина на фоне нарушения
в гипоталамусе суточных ритмов содержания норадреналина и дофамина приводит
к нормализации их суточной динамики. Также впервые установлено, что пинеалон, подобно
эпиталамину, восстанавливает суточную динамику содержания норадреналина в МПО
гипоталамуса, нарушенную под влиянием экспериментальной гипергомоцистеинемии.
Особое внимание уделено изучению влияния различных световых режимов на такие
показатели репродуктивной функции молодых, зрелых и стареющих животных, как средняя
продолжительность
эстрального
цикла,
количество
эстральных
циклов
разной
продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фаз эстрального
цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. Показано, что постоянное
освещение способствует изменению гипоталамической регуляции репродуктивной системы,
что может быть одной из причин того, что нарушения эстрального цикла наступают в более
раннем возрасте по сравнению с животными, находившимися в условиях стандартного
фиксированного освещения. Впервые установлено, что мелатонин и эпиталон при постоянном
освещении и при стандартном фиксированном освещении замедляют развитие возрастных
изменений эстрального цикла. Показано, что короткие эстральные циклы сохраняются до более
зрелого возраста, а длинные эстральные циклы и иррегулярные циклы появляются позже,
чем в контрольных группах животных, причем наибольшее влияние на эстральный цикл
препараты
оказывают
при
постоянном
освещении,
что,
возможно,
связано
с моноаминергическим звеном регуляции эстральных циклов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Экспериментальное исследование роли биогенных аминов в процессах центральной
регуляции репродуктивных циклов и изучение молекулярной организации этого процесса
способствует пониманию сложных механизмов выключения репродуктивной функции
в процессе старения женского организма и ее нарушений при действии неблагоприятных
факторов внешней среды.
Проведенные исследования расширяют представления о роли циркадианной системы
организма в процессах гипоталамической регуляции репродуктивной функции. Установлено,
что нарушение суточной динамики содержания норадреналина и дофамина и генерации АФК
в структурах гипоталамуса, участвующих в регуляции эстральных циклов, служит одним
из наиболее ранних и чувствительных маркеров нарушений гипоталамического звена регуляции
репродуктивной функции под воздействием таких нейротоксикантов, как 1,2-диметилгидразин
8
и толуол. Измерение этих показателей может применяться для оценки нарушений
гипоталамических механизмов регуляции репродуктивной функции после воздействия других
нейротоксических соединений. Показано также, что гипергомоцистеинемия, вызванная
метиониновой нагрузкой, приводит к результатам, схожим с полученными после воздействия
на организм экзогенных ксенобиотиков, а постоянное освещение вызывает нарушение
регуляции эстральных циклов. Выявление ранних функциональных нарушений центральной
регуляции репродуктивной функции, которое удается обнаружить лишь экспериментальным
путем, имеет важное практическое значение при разработке профилактических мер,
способствующих устранению или ослаблению действия повреждающих факторов на организм в
неблагоприятных экологических условиях.
Полученные результаты о защитном действии мелатонина и пептидных биорегуляторов
при нарушении гипоталамической регуляции репродуктивных циклов под влиянием
ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола, в условиях гипергомоцистеинемии, а также
при постоянном освещении являются перспективными в практическом отношении с точки
зрения использования этих нейропротекторных соединений для коррекции нарушений
гипоталамической регуляции репродуктивной функции.
1.
2.
3.
4.
5.
Положения, выносимые на защиту
Моноаминергические
системы
гипоталамуса
участвуют
в
формировании
неспецифической реакции организма самок крыс на воздействие неблагоприятных
экологических факторов.
Воздействие
неблагоприятных
экзогенных
(ксенобиотики)
и
эндогенных
(гипергомоцистеинемия) факторов выражается в изменении суточной динамики
содержания норадреналина в медиальной преоптической области гипоталамуса
и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса.
Неблагоприятные факторы нарушают механизм передачи информации о суточном
периодизме, поступающей от супрахиазматических ядер гипоталамуса к медиальной
преоптической области и срединному возвышению с аркуатными ядрами.
Нарушение суточной динамики содержания норадреналина в медиальной преоптической
области и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ядрами является одним
из наиболее ранних признаков возрастного угасания репродуктивной функции.
В регуляции репродуктивных циклов, наряду с супрахиазматическими ядрами,
принимает участие пинеальная железа. Эпифизарный гормон мелатонин и пептидные
препараты, способствующие его синтезу и секреции, устраняют нарушения
репродуктивной функции, вызванные неблагоприятными экологическими факторами.
Связь с научно-исследовательской работой Института
Диссертационное исследование проведено в соответствии с планом НИР ФГБУ «Научноисследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН» по теме:
«Нарушения нейрохимических механизмов центральной регуляции репродуктивных циклов
и их коррекция (экспериментальное исследование)».
Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ 2000-2002 №00-04-48967-а «Роль
мелатонина при нарушениях центральной регуляции репродуктивной функции под влиянием
неблагоприятных экологических факторов нейротоксической природы»; РФФИ 2004-2006 №04-
9
04-49204-а «Изучение механизмов нарушения суточных ритмов биогенных аминов,
участвующих в гипоталамической регуляции репродуктивной функции, под влиянием
нейротоксических ксенобиотиков»; РФФИ 2010-2012 №10-04-00749-а «Механизмы нарушения
регуляции репродуктивной функции женского организма при гипергомоцистеинемии».
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов
исследования, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения,
выводов, практических рекомендаций, списков наиболее часто встречающихся сокращений
и литературы. Текст диссертации изложен на 253 страницах, содержит 11 таблиц
и иллюстрирован 53 рисунками. Список литературы содержит 657 источников, из которых
отечественных – 126, зарубежных – 531.
Публикации
По материалам исследования опубликована 51 печатная работа, в том числе 19 статей
в научных журналах и сборниках научных трудов (из них 13 – статьи в журналах, включенных
в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ) и 32 тезисов докладов. Все результаты
и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях.
Апробация и реализация диссертации
Основные материалы диссертации доложены на X Международном симпозиуме
«Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2001 г.), IX Международном
катехоламиновом симпозиуме (Киото, Япония, 2001 г.), Всероссийской научной конференции
«Биохимия – медицине» (Санкт-Петербург, 2002 г.), 4-й Всероссийской научно-практической
конференции «Актуальные вопросы эндокринологии» (Пермь, 2002 г.), XI Международном
симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации» (Москва, 2003 г.),
LIV Мосбаховском коллоквиуме «Ритм жизни: молекулярные механизмы циркадианных часов»
(Мосбах, ФРГ, 2003 г.), научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные
аспекты» (Москва, 2005 г.), I съезде физиологов СНГ (Москва, 2005 г.), международном
симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005 г.),
VI Европейском конгрессе международной ассоциации геронтологов и гериатров (СанктПетербург, 2007 г.), VIII Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения»
(Харьков, Украина, 2008 г.), конгрессе «Экотоксины и здоровье» (Санкт-Петербург, 2008 г.),
научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы
к исследованию мозга» (Ростов-на-Дону, 2011 г.), VIII Всероссийской конференции
с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения акад. К.М. Бэра,
«Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012 г.),
XXXVIII Конгрессе Федерации Европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург,
2013 г.), ХХII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013 г.),
II Российском симпозиуме с международным участием «Световой режим, старение и рак»
(Петрозаводск, 2013 г.), научной конференции с международным участием, посвященной
20-летию со дня основания Геронтологического общества при РАН, «Фундаментальные
проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2014 г.), Всероссийской конференции
с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных
10
и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2014 г.), IV съезде физиологов СНГ
«Физиология и здоровье человека» (Сочи, 2014 г.).
Личный вклад автора
Личный вклад автора в диссертационное исследование состоял в планировании,
проведении экспериментов, статистической обработке и анализе данных о влиянии различных
неблагоприятных экологических факторов на центральное звено регуляции репродуктивных циклов. Автором
была определена цель и сформулированы задачи исследования, изучены данные литературы,
составлена программа исследования, разработаны учетные статистические документы,
выполнен сбор и обработка материалов, проведено их обобщение и осуществлен анализ
результатов исследования. В ходе выполнения исследования автором была отработана
и стандартизована методика определения содержания биогенных аминов и их метаболитов
в структурах гипоталамуса крыс.
Исследование
влияния
нейротоксикантов
на
гипоталамическую
регуляцию
репродуктивной системы и изучение роли геропротекторных пептидов пинеальной железы
и мелатонина в коррекции нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции,
вызванных воздействием 1,2-диметилгидразина, были выполнены автором в сотрудничестве
с Керкешко Г.О. и Милютиной Ю.П., что нашло отражение в совместных публикациях
[Керкешко Г.О. и др., 2001; Arutjunyan A.V. et al., 2001; Арутюнян А.В. и др., 2001;
Арутюнян А.В. и др., 2005; Милютина Ю.П. и др., 2010; Арутюнян А.В. и др., 2012;
Arutjunyan A. et al., 2012a; Korenevsky A.V. et al., 2012; Кореневский А.В. и др., 2013;
Арутюнян А.В., Кореневский А.В., 2014; и др.].
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные
Экспериментальная работа была выполнена на 1080 половозрелых самках крыс линии
Wistar с массой тела 180-220 г и четырехдневным эстральным циклом (питомник «Рапполово»
РАМН, Санкт-Петербург, Россия).
Лабораторные животные содержались в стандартных помещениях вивария
с искусственной вентиляцией, в клетках размером 62х44х25 см по 5 животных
в каждой клетке при температуре окружающего воздуха в зависимости от времени года 22±2 0С.
Крысы получали стандартный готовый лабораторный корм (ЗАО «Волосовский комбикормовый
завод», Волосово, Ленинградская обл.) и имели неограниченный доступ к пище и отстоянной
водопроводной воде в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией
по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных
целей (Страсбург, 1986 г.). Все опыты на лабораторных животных выполнялись в соответствии
с положениями Хельсинкской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации о гуманном
отношении к животным (ред. 2000 г.), принципами гуманности, изложенными в директиве
Европейского Сообщества №86/609 ЕС, и «Руководством по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.).
11
Общая схема эксперимента
В различных сериях экспериментов в виварии поддерживались следующие световые
режимы: стандартное фиксированное освещение (12 ч – день, 12 ч – ночь), световая депривация
(24 ч – ночь) и постоянное освещение (24 ч – день). Для измерения освещенности помещений,
в которых содержались животные, использовали люксметр «Ф-107» (Россия). Помещения
вивария освещали люминесцентные лампы (освещенность 750 лк на уровне клеток на 1 м2
площади). Окна в помещениях отсутствовали.
Решение задач, поставленных в диссертации, осуществлялось в семь последовательных
этапов:
1) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина (МПО
и СВ-Арк) на различных стадиях эстрального цикла и в условиях световой депривации;
2) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов
в МПО и СВ-Арк гипоталамуса при хроническом и остром воздействии
нейротоксических ксенобиотиков (1,2-диметилгидразин, толуол);
3) исследование суточной динамики и среднесуточного содержания биогенных аминов
в МПО и СВ-Арк гипоталамуса в условиях экспериментальной гипергомоцистеинемии
(метиониновая нагрузка);
4) исследование
нейротоксических
воздействий
(1,2-диметилгидразин,
толуол,
метиониновая нагрузка) на уровень гонадолиберина в МПО и СВ-Арк гипоталамуса
и показатели окислительного стресса в сыворотке крови;
5) исследование влияния мелатонина и пептидных биорегуляторов (пинеалон, эпиталамин,
эпиталон) на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов
в
МПО
и
СВ-Арк
гипоталамуса
при
нейротоксических
воздействиях
(1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка);
6) исследование возрастных изменений суточной динамики и среднесуточного содержания
биогенных аминов в МПО и СВ-Арк гипоталамуса;
7) исследование влияния мелатонина и пептидного препарата пинеальной железы эпиталона
на динамику эстральных циклов у молодых и старых животных при различных световых
режимах (стандартное фиксированное освещение, постоянное освещение).
На отдельных этапах работы дополнительно определяли уровень половых стероидов
(эстрадиол, прогестерон) и общего L-гомоцистеина в сыворотке и плазме крови, соответственно,
а также моноаминооксидазную активность в вышеупомянутых гипоталамических структурах
(МПО и СВ-Арк). В некоторых случаях содержание биогенных аминов определяли
также и в других гипоталамических структурах, в СХЯ и сером бугре.
Декапитацию животных производили на стадии проэструса или диэструса с началом в 5 ч,
9:30 ч и 11 ч ЦВ или, в зависимости от условий эксперимента, в другое время (ЦВ отсчитывали
от начала дневной фазы экспериментальных суток, искусственно поддерживаемых в виварии).
Стадии эстрального цикла животных в день декапитации определяли по соотношению клеток
трех типов, присутствующих во влагалищных мазках [Marcondes F.K., Bianchi F.J., Tanno A.P.,
2002]. Правильность определения стадий эстрального цикла подтверждали post mortem, измеряя
массу яичников и визуально оценивая степень обводненности матки.
12
Нелетучий
ксенобиотик
1,2-диметилгидразин,
растворенный
ex
tempore
в физиологическом растворе, вводили внутрибрюшинно, однократно, утром (в 3 ч ЦВ),
накануне дня проэструса, в дозе 21 мг/кг массы (в расчете на основание).
Для проведения ингаляции толуола животных помещали в специальные затравочные
камеры, сконструированные на базе блоков типа 1КА-НЖ (Россия). Емкость камер – 400 л.
Скорость подачи воздуха в камеры – 30 л/мин. Животные подвергались воздействию паров
ксенобиотика на заданном уровне в течение 4 ч в день по 5 дней в неделю на протяжении 2 мес.
Концентрацию толуола в камерах поддерживали на уровне предельно допустимой
концентрации (ПДК), установленной гигиенистами для воздуха рабочей зоны промышленных
предприятий (50 мг/м3). Дозировку ксенобиотика осуществляли весовым методом.
Во
время
ингаляции
было
обеспечено
продувание
камер,
достаточное
для поддержания концентрации кислорода и углекислого газа на физиологическом уровне.
При проведении экспериментов фиксировалась температура, влажность и давление воздуха
внутри камер. Животных контрольной группы помещали в такие же камеры, но без подачи
в них ксенобиотика. После каждого сеанса ингаляции животных возвращали в виварий.
Мелатонин вводили вечером (в 10 ч ЦВ) в дозе 1 мг/кг массы. Пептидные биорегуляторы
эпиталамин, эпиталон и пинеалон [Хавинсон В.Х., 2001] вводили днем (в 6 ч ЦВ) в дозе 1 мг/кг
массы, 2 мкг/кг массы и 10 мкг/кг массы, соответственно. Все препараты растворяли
в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно, ежедневно в течение 4 дней,
предшествовавших дню декапитации, в объеме 0,25 мл. Дозы и режим введения пептидных
препаратов были ранее разработаны и изучены [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1996;
Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., 2001; Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н., 2003].
Водный раствор L-метионина вводили перорально, ежедневно в течение 30 дней,
в количествах, необходимых для достижения суточной дозы 0,12-0,15 г в расчете на животное.
Исходя из полученных нами ранее данных о том, что принудительное пероральное введение
L-метионина самкам крыс приводит к более выраженному повышению уровня общего
L-гомоцистеина в сыворотке крови, чем потребление L-метионина с питьевой водой
[Арутюнян А.В. и др., 2012], в настоящем исследовании была выбрана экспериментальная
модель гипергомоцистеинемии с пероральным введением L-метионина.
Исследование влияния на экспериментальных животных световой депривации проводили,
как описано ниже. Животные, первоначально содержавшиеся достаточно длительное время
(2-3 нед.) в условиях стандартного фиксированного освещения, помещались на трое суток
в условия световой депривации. Длительность пребывания животных в этих условиях была
выбрана в соответствии с описанными в литературе подходами к изучению циркадианной
природы суточных ритмов [Cagampang F.R., Okamura H., Inouye S., 1994; Jamali K.A., Tramu G.,
1999]. Считается, что в течение трех суток в условиях световой депривации суточные ритмы,
связанные с изменением освещенности, полностью исчезают, но при этом еще не происходит
сдвига фазы эндогенных циркадианных ритмов, что наблюдается при помещении животных
в темноту на более длительный срок.
Исследование влияния на экспериментальных животных постоянного освещения
в сочетании с применением мелатонина и эпиталона проводили следующим образом.
В эксперименте использовали животных в возрасте 3, 5, 8, 11, 14, 17, 20 и 23 мес. Исследование
проводили до естественной гибели животных. В данной экспериментальной серии изучали
следующие показатели: средняя продолжительность эстрального цикла, количество эстральных
13
циклов разной продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фаз
эстрального цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами. Стадии
эстрального цикла в этих исследованиях определяли, начиная с трехмесячного возраста, каждые
3 мес. ежедневно в течение 2 недель.
В 25-дневном возрасте все животные данной серии были рандомизированно разделены
на две группы: первая находилась в условиях стандартного фиксированного освещения, вторая
содержалась при круглосуточном постоянном освещении.
В возрасте 4 мес. животных каждой из групп рандомизированно делили на три равные
подгруппы. Животные первой подгруппы получали на протяжении всей последующей жизни
в течение 5 дней в неделю в ночное время суток (с 19.00 ч до 07.00 ч) вместе с питьевой водой
мелатонин в дозе 10 мг/л [Pierpaoli W., Maestroni G.J., 1987]. Животным второй подгруппы
ежемесячно курсами по пять дней в неделю подкожно утром (в 3 ч ЦВ) вводили эпиталон
в количестве 0,1 мкг на животное в 0,1 мл физиологического раствора. Животные третьей
подгруппы являлись контрольными. В этой подгруппе выделялись две части: одни контрольные
животные получали инъекцию физиологического раствора в те же часы, когда производилась
инъекция эпиталона, другие – питьевую воду в ночное время суток.
Исследование влияния старения экспериментальных животных на содержание биогенных
аминов в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина,
включало в себя четыре возрастные группы. Первую группу составили животные в возрасте
1,5 мес. Данный возраст характеризуется открытием влагалища и формированием эстральных
циклов. Вторая группа животных состояла из половозрелых, регулярно циклирующих самок
в возрасте 7-8 мес. В третьей группе животных находились самки в возрасте 13-14 мес.,
при котором еще встречаются отдельные эстральные циклы, но уже наблюдается удлинение
стадий диэструса и (или) эструса. Четвертую группу животных составили самки в возрасте
24 мес. и старше, в котором половая цикличность полностью прекращается и животные
находятся в состоянии персистирующего эструса или диэструса.
Препарирование структур мозга, осуществляющих регуляцию
эстральных циклов
Из мозга декапитированных животных выделяли гипоталамические структуры (МПО,
СВ-Арк, СХЯ, серый бугор). Топографическая идентификация анатомических образований
осуществлялась с использованием атласов анатомии мозга крыс [Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л.,
2001; Paxinos G., Watson C., 2007]. После выделения структуры замораживали в жидком азоте
и хранили при температуре –70 0С до начала анализа.
После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0,3 мл 0,1 М
хлорной кислоты, содержащей 0,05% калия метабисульфита, центрифугировали (10 000 g,
15 мин., +4 0С), осадок отбрасывали, а от супернатанта отбирали 0,05 мл для измерения
интенсивности хемилюминесценции. Супернатант переносили в прибор для микрофильтрации
и фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0,2 мкм; фильтрат подвергали
хроматографическому анализу в тот же день.
Для определения моноаминооксидазной активности ткань гомогенизировали в 0,32 М
растворе сахарозы, приготовленном в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,4), и центрифугировали
(1 000 g, 10 мин., +4 0С). Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для проведения
моноаминоксидазной реакции.
14
Для
определения
содержания
гонадолиберина
гипоталамические
структуры
0
гомогенизировали в 0,3 мл 0,1 М уксусной кислоты при температуре, близкой к 0 С, после чего
подвергали термической обработке (10 мин., +100 0С) и центрифугировали (13 000 g, 15 мин.,
+4 0С). От супернатанта отбирали 90 мкл (в случае МПО) либо 20 мкл (в случае СВ-Арк,
с последующим десятикратным разведением 0,1 М раствором уксусной кислоты, v/v).
Полученные аликвоты осторожно нейтрализовали 1 М раствором натрия гидроксида
и разбавляли буфером из тест-системы для стандартизованного иммуноферментного
определения содержания гонадолиберина в биологических образцах (в соотношении 1:5, v/v).
Из полученных растворов отбирали 50 мкл, которые использовали непосредственно
для иммуноферментного определения содержания нейропептида в гипоталамических
структурах.
Определение уровня гонадолиберина в структурах мозга иммуноферментным методом
Использована тест-система фирмы Peninsula Laboratories, LLC (США) предназначенная
для
стандартизованного
определения
содержания
гонадолиберина
(люлиберина)
в биологических образцах (ткань, плазма и сыворотка крови) методом иммуноферментного
анализа.
Определение уровня половых стероидов в сыворотке крови радиоиммунологическим
методом
В качестве радиоактивных лигандов использовали препараты гормонов, меченные тритием
по четырем положениям стероидного кольца (1, 2, 6, 7) с удельной активностью 3,2-3,5
ТБк/моль. Рабочие титры антисывороток подгоняли таким образом, чтобы в холостой пробе
связывалось 30-50% активности. Неспецифическое связывание в пробе без антисыворотки
составляло 2-4% от общей активности.
Уровень эстрадиола в сыворотке крови определяли после предварительной экстракции
диэтиловым эфиром. Водную часть замораживали, эфир сливали в пробирку для тестирования
и выпаривали. К сухому остатку добавляли фосфатный буфер (рН 7,4) и использовали
в радиоиммунологической реакции.
Уровень прогестерона в сыворотке крови определяли безэкстракционным методом.
Для этого в радиоиммунологическом методе использовали кислый ацетатный буфер (pH 4,0),
который инактивирует кортикостеронсвязывающий белок. Ввиду высокого содержания
прогестерона в сыворотке в анализ брали 5 мкл биологического образца, добавляли 0,1 мл
ацетатного буфера и проводили радиоиммунологическую реакцию.
К испытуемой пробе добавляли равные объемы антисыворотки в рабочем титре и раствора
меченого гормона с общей активностью 8 000-10 000 имп./мин. на пробу. Содержимое пробирок
тщательно перемешивали и инкубировали в течение 45 мин. при +37 0С. Адсорбцию меченого
гормона, не связавшегося с антисывороткой, проводили декстран-угольной смесью
(0,25% активированного угля и 0,025% декстрана с молекулярной массой 110 кДа).
После инкубации уголь осаждали центрифугированием (3 500 g, 10 мин.). Для подсчета
радиоактивности надосадочную жидкость сливали в виалы со сцинтилляционной жидкостью
(0,4 г дифенилоксазола, 0,04 г 1,4-ди-(5-фенил-2-оксазолилбензола), 1 л толуола).
15
Определение содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием
Хроматографическое разделение биогенных аминов и их метаболитов осуществляли
на металлической колонке Reprosil 80 ODS-2 (1004 мм, 3 мкм; Dr. Maisch GmbH, ФРГ).
Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100А Coulochem II (ESA, США)
при потенциале +0,65 В.
Подвижная фаза содержала 6 мМ цитратного буфера, 2 мМ натрия
этилендиаминтетраацетата, 1,1 мМ натрия октилсульфоната и 7% ацетонитрила (v/v), рН 5,1.
Расход элюента – 0,75 мл/мин, температура колонки – +30 0С.
Количественные характеристики хроматографических пиков измерялись автоматически
системой регистрации и обработки спектрометрической информации UniChrom 4.4
(ООО «Новые Аналитические Системы», Беларусь).
Определение уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови иммуноферментным методом
Использована тест-система фирмы Axis Homocysteine EIA (Великобритания)
предназначенная для стандартизованного определения концентрации общего L-гомоцистеина
в крови методом иммуноферментного анализа.
Определение уровня генерации активных форм кислорода в структурах мозга
методом люминолзависимой хемилюминесценции
Супернатант, отобранный после гомогенизирования исследуемых микроструктур мозга,
разводили фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 60 мМ калия фосфата однозамещенного
и 105 мМ калия хлорида. К 100 мкл разведенного супернатанта добавляли 650 мкл фосфатного
буфера и 50 мкл 10 мМ люминола. Для инициации свечения в пробу вносили 0,2 мл раствора
водорода пероксида. Свечение измеряли в течение 2 мин. при +37 0С и определяли светосумму
в относительных единицах.
Определение содержания малонового диальдегида в сыворотке крови
спектрофотометрическим методом
К 0,2 мл сыворотки крови прибавляли 3 мл 2% раствора ортофосфорной кислоты (рН 1,3)
и 1 мл 0,8% раствора 2-тиобарбитуровой кислоты. Пробы выдерживали в течение 45 мин.
при +100 0С. Затем смесь охлаждали и экстрагировали окрашенный продукт 3 мл бутанола-1.
Разделения водной и органической фаз достигали центрифугированием (1 000 g, 10 мин.).
Образующийся в результате реакции между малоновым диальдегидом и 2-тиобарбитуровой
кислотой триметиновый комплекс имеет характерный спектр поглощения с максимумом
при 535 нм.
Определение содержания нитритов в сыворотке крови спектрофотометрическим методом
Для осаждения белка к образцам сыворотки крови добавляли 30% раствор цинка сульфата
(20:1, v/v). После инкубации в течение 30 мин. при комнатной температуре пробы
центрифугировали (2 000 g, 15 мин). С супернатантом проводили реакцию Грисса, для чего
к пробам последовательно добавляли сначала 1% раствор сульфаниловой кислоты
в 2 М соляной кислоты, а затем, через 10 мин., 0,02% водный раствор 1-нафтилэтилендиамина
16
гидрохлорида. Через 30 мин. развивалась розовая окраска. Оптическую плотность окрашенных
продуктов измеряли при 540 нм.
Определение моноаминооксидазной активности в структурах мозга
спектрофотометрическим методом
К 0,73-0,75 мл раствора кинурамина (0,192-0,198 мМ) в 0,05 М фосфатном буфере (рН 7,8)
добавляли супернатант гомогената ткани до получения общего объема 0,76 мл с конечной
концентрацией общего белка 0,016-0,375 мг/мл и тщательно перемешивали. В холостую пробу
вместо биологического материала вносили раствор сахарозы в фосфатном буфере,
использовавшийся для приготовления гомогенатов. Инкубацию проводили при +37 0С,
периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм.
Определение содержания общего белка в структурах мозга и в реакционной смеси
турбидиметрическим методом
Использование турбидиметрического метода определения содержания общего белка
в биологических материалах, известного как метод Вера [Vera J.C., 1988], вызвано
необходимостью концентрирования анализируемой пробы и внесения практически всего
супернатанта, полученного при предварительной обработке гомогенатов микроструктур мозга,
в хроматографическую колонку или в реакционную среду для определения ферментативной
активности.
В основу метода положено измерение при 340 нм оптической плотности, развивающейся
в результате добавления к щелочному раствору белка равного объема 30% раствора
трихлоруксусной кислоты.
Содержание общего белка в реакционной смеси, в которой оценивали
моноаминооксидазную активность, определяли после окончания инкубации, регистрируя
оптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствия
кинурамина при более коротких длинах волн. При этом широко используемый метод Лоури
не позволяет исследовать содержание белка в реакционной смеси по причине взаимодействия
кинурамина с реактивами, применяемыми в вышеупомянутом методе, с развитием синего
окрашивания.
Статистическая обработка результатов исследования
Статистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных пакетов
статистических программ STATISTICA 5.0 и EXCEL общепринятыми методами вариационной
статистики. Данные представлены в следующем виде: среднее арифметическое  средняя
ошибка среднего арифметического (Мm). Для определения статистической значимости
полученных результатов были использованы: параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест),
непараметрический U-критерий Манна-Уитни (U-тест), критерий согласия Пирсона (2-тест).
Достоверно различающимися признавали значения при р<0,05; при 0,05<р<0,10 говорили
о тенденции к изменению; при p>0,1 различия считали недостоверными. Наличие суточных
ритмов исследуемых показателей оценивали при помощи непараметрического Н-критерия
Крускала-Уоллиса (Н-тест).
17
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Содержание гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединном
возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса, а также уровень половых гормонов
в крови на различных стадиях эстрального цикла
Анализ содержания гонадолиберина в областях гипоталамуса, ответственных за синтез
и секрецию этого нейрогормона, не показал достоверных различий между его уровнями
в утреннее и дневное время. Однако важно отметить, что в случае СВ-Арк была заметна
тенденция роста содержания нейрогормона ко времени его преовуляторной секреции. Можно
предположить, что отсутствие при этом достоверных изменений обусловлено значительным
разбросом данных в период формирования преовуляторного пика секреции гонадолиберина
(9:30 ч ЦВ).
Несмотря на то, что на всех этапах данного исследования стадия эстрального цикла
экспериментальных животных определялась по влагалищному мазку и после декапитации
по состоянию маточных труб, нами также проводилась оценка фона половых гормонов в крови.
Полученные данные, подтверждая результаты других исследований, указывают
на достоверно (p<0,01) повышенный фон эстрадиола на стадии проэструса с максимальным
пиком в 9:30 ч ЦВ (рисунок 1).
120
0,5
#
0,45
0,35
Проэструс
0,25
Диэструс
0,2
нМ
80
0,3
нМ
#
100
0,4
*
0,15
Диэструс
40
**
0,1
Проэструс
#
60
20
0,05
0
*
*
9:30
11
0
5
9:30
5
11
циркадианное время, ч
циркадианное время, ч
#
– различие с показателем в 5 ч циркадианного
времени на той же стадии эстрального цикла
достоверно (p<0,01; U-тест); *, ** – различия
с показателем на стадии проэструса в то же время
достоверно (*р<0,05; **р<0,001; U-тест)
#
– различия с показателем в 5 ч циркадианного
времени на той же стадии эстрального цикла
достоверны (p<0,001; U-тест); * – различия
с показателем на стадии проэструса в то же время
достоверны (р<0,001; U-тест)
Рисунок 1 – Содержание эстрадиола
в сыворотке крови самок крыс
на различных стадиях эстрального цикла
(M±m, n=9-13)
Рисунок 2 – Содержание прогестерона
в сыворотке крови самок крыс
на различных стадиях эстрального цикла
(M±m, n=7-12)
Уровень же прогестерона на обеих стадиях эстрального цикла, по нашим данным,
достоверно не отличался в 5 ч ЦВ и не изменялся на протяжении всего дня на стадии диэструса,
но начинал достаточно резко возрастать и достигал своего максимума к 11 ч ЦВ на стадии
проэструса (рисунок 2).
18
Таким образом, у животных, использованных в настоящем исследовании, наблюдалась
характерная для стадий диэструса и проэструса картина изменений в крови уровня половых
стероидов.
Суточная динамика и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной
преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса
на различных стадиях эстрального цикла
В проведенном нами исследовании суточной динамики содержания биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, в которых происходят синтез и секреция гонадолиберина, было
обнаружено, что на стадии проэструса содержание норадреналина в МПО гипоталамуса
в период времени с 9 ч до 11 ч ЦВ имеет место достоверное (р<0,05) снижение содержания
этого нейромедиатора, а к 14 ч ЦВ уже отмечается тенденция к его повышению (рисунок 3).
Содержание же дофамина в той же гипоталамической структуре в указанном временном
интервале изменялось без достоверно значимых различий, что носило характер тенденций:
к снижению в период с 9 ч до 11 ч ЦВ и к повышению в период с 11 ч до 14 ч ЦВ. В СВ-Арк
гипоталамуса достоверной суточной динамики содержания норадреналина выявлено не было.
Однако уровень дофамина в этой структуре достоверно (р<0,05) повышался в период времени
с 9 ч до 11 ч ЦВ и имел тенденцию к снижению в период с 11 ч до 14 ч ЦВ (рисунок 4).
25
7
6
нг/мг белка
нг/мг белка
20
15
10
*
5
*
5
4
3
2
1
0
0
8
10
12
14
циркадианное время, ч
8
10
12
14
циркадианное время, ч
* – различие с показателем в 9 ч циркадианного
времени достоверно (p<0,05; U-тест)
* – различие с показателем в 9 ч циркадианного
времени достоверно (p<0,05; U-тест)
Рисунок 3 – Суточная динамика
содержания норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс на стадии
проэструса (M±m, n=7-9)
Рисунок 4 – Суточная динамика
содержания дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс на стадии
проэструса (M±m, n=5-7)
Выяснение
природы
суточных
изменений
содержания
биогенных
аминов
в гипоталамических областях, участвующих в синтезе и секреции гонадолиберина, способствует
пониманию роли этих нейромедиаторов в регуляции эстральных циклов в норме,
что позволяет установить причины нарушений центральной регуляции репродуктивной
функции при различных патологических состояниях и воздействии неблагоприятных факторов
внешней среды, а также в процессе старения.
19
Обнаруженные нами а) резкое снижение содержание норадреналина в МПО гипоталамуса
и б) достоверный подъем содержания дофамина в СВ-Арк гипоталамуса совпадают по времени
с завершением преовуляторного пика секреции гонадолиберина Подобное изменение
содержания норадреналина в МПО и дофамина в СВ-Арк гипоталамуса именно в этом,
достаточно узком, временном интервале может формировать тот самый нейромедиаторный фон,
который необходим для реализации пика секреции гонадолиберина на стадии проэструса.
Было также установлено, что в исследованных областях гипоталамуса наблюдается
различная суточная динамика содержания биогенных аминов в зависимости от стадии
эстрального цикла. В МПО гипоталамуса как на стадии проэструса, так и на стадии диэструса,
при котором уровень половых гормонов в крови остается относительно стабильным,
наблюдались сходные суточные изменения содержания норадреналина (рисунок 5). Независимо
от уровня половых стероидов в крови, содержание этого нейромедиатора подвержено
постоянным ежедневным изменениям с характерным снижением в узком временном интервале
с 9:30 ч до 11 ч ЦВ (р<0,01). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена
зависимость содержания норадреналина в данной гипоталамической области от временного
показателя (p<0,001). Так, содержание нейромедиатора при объединении данных по стадиям
цикла (диэструс и проэструс) составило: 10,01,3 нг/мг белка (5 ч ЦВ), 10,30,5 нг/мг белка
(9:30 ч ЦВ) и 6,80,4 нг/мг белка (11 ч ЦВ) (рисунок 6). При этом максимальной величины
уровень содержания норадреналина в этой гипоталамической структуре достигал в интервале
времени с 5 ч до 9:30 ч ЦВ, что соответствует времени оптимального проявления
преовуляторного пика секреции гонадолиберина.
12
14
12
**
*
8
6
*
4
нг/мг белка
10
10
нг/мг белка
*
8
6
4
2
2
0
5
9:30
циркадианное время, ч
Проэструс
11
Диэструс
0
5
9:30
11
циркадианное время, ч
* – различия с показателем в 9:30 ч циркадианного
времени в той же группе достоверны
(p<0,01; U-тест)
*, ** – различия с показателем в 11 ч
циркадианного времени достоверны
(*p<0,05; **p<0,001; U-тест)
Рисунок 5 – Суточная динамика
содержания норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс на различных
стадиях эстрального цикла
(M±m, n=6-7)
Рисунок 6 – Суточная динамика
содержания норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс (объединенные
данные по стадиям диэструса и проэструса;
M±m, n=13-14)
Другой нейромедиатор, дофамин, не претерпевал достоверных суточных изменений в этой
гипоталамической структуре. Отмечена лишь тенденция к снижению его уровня в период с 5 ч
20
до 11 ч ЦВ на стадии диэструса и к повышению его содержания в 9:30 ч ЦВ на стадии
проэструса.
В СВ-Арк гипоталамуса также наблюдались изменения в содержании биогенных аминов,
отличные от динамики их уровня в МПО гипоталамуса. Так, в этой гипоталамической структуре
не было обнаружено суточных ритмов содержания норадреналина. На обеих стадиях
эстрального цикла фиксировался практически постоянный уровень нейромедиатора
на протяжении всего дня. Содержание же дофамина в СВ-Арк гипоталамуса, напротив, имело
выраженную суточную динамику, с повышением уровня биогенного амина в вечерние часы
(рисунок 7). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена зависимость
содержания дофамина в данной гипоталамической области от временного показателя (p<0,01).
Так, при объединении данных по стадиям цикла (диэструс и проэструс) содержание
нейромедиатора в исследуемой области гипоталамуса составило: 6,90,7 нг/мг белка (5 ч ЦВ),
8,11,3 нг/мг белка (9:30 ч ЦВ) и 12,01,0 нг/мг белка (11 ч ЦВ) (рисунок 8). Можно полагать,
16
14
*
12
12
10
*
10
8
6
**
4
2
нг/мг белка
нг/мг белка
14
8
*
**
6
4
2
0
5
9:30
циркадианное время, ч
Проэструс
11
Диэструс
* – различия с показателем в 5 ч циркадианного
времени в той же группе достоверны (p<0,05;
U-тест); ** – различие с показателем в 11 ч
циркадианного времени в той же группе достоверно
(p<0,05; U-тест)
Рисунок 7 – Суточная динамика
содержания дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс на различных
стадиях эстрального цикла
(M±m, n=6-8)
0
5
9:30
11
циркадианное время, ч
*, ** – различия с показателем в 11 ч циркадианного
времени достоверны (*p<0,01; **p<0,001; U-тест)
Рисунок 8 – Суточная динамика
содержания дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс (объединенные
данные по стадиям диэструса и проэструса;
M±m, n=12-14)
что именно суточная динамика содержания норадреналина в МПО и дофамина в СВ-Арк
гипоталамуса играет важную роль в формировании преовуляторного пика секреции
гонадолиберина. Суточное изменение активности норадренергической и дофаминергической
нейромедиаторных систем может быть тем самым механизмом, благодаря которому создается
«интервал чувствительности» гонадолиберинергических нейронов к стимулирующему
циркадианному сигналу, поступающему из СХЯ гипоталамуса.
Полученные нами данные о суточной динамике содержания дофамина в МПО
гипоталамуса не выявили достоверных различий в уровне нейромедиатора, однако
21
варьирующиеся тенденции его суточных изменений на стадиях диэструса и проэструса
снижение его среднесуточного содержания на стадии проэструса, а также противоречивые
данные литературы о роли этого катехоламина в процессе синтеза гонадолиберина позволили
выдвинуть предположение о том, что дофамин в МПО гипоталамуса, возможно, играет роль
не столько активного нейромедиатора, сколько предшественника норадреналина
в норадрененергических нейронах. В результате исследований, проведенных в нашей
лаборатории, было установлено, что суточная динамика содержания норадреналина в МПО
гипоталамуса не связана с соответствующим изменением моноаминоксидазной активности,
поэтому можно предположить, что она опосредована либо активностью катехол-Ометилтрансферазы, либо снижением активности дофамин--гидроксилазы.
Для оценки участия дофамин--гидроксилазы в наблюдаемых изменениях суточной
динамики содержания катехоламинов был использован коэффициент соотношения уровней
норадреналин/дофамин. В МПО гипоталамуса было выявлено достоверное (p<0,05) снижение
данного показателя на стадии проэструса в период с 5 ч до 11 ч ЦВ, что вероятно, характеризует
уменьшение активности дофамин--гидроксилазы, которое в свою очередь может обеспечивать
резкое снижение уровня норадреналина в вечерние часы, при этом изменения коэффициента
норадреналин/дофамин, наблюдаемого на стадии проэструса, на стадии диэструса выявлено
не было. Это наблюдение позволяет предположить, что изменение содержания норадреналина
в МПО гипоталамуса контролируется как сигналами, поступающими из СХЯ гипоталамуса,
так и уровнем половых гормонов в крови. Вполне вероятно, что МПО гипоталамуса выполняет
релейную функцию, передавая гонадолиберинергическим нейронам от СХЯ гипоталамуса
циркадианный сигнал, который может либо ингибироваться, либо активироваться в зависимости
от уровня половых гормонов в крови.
В другой структуре гипоталамуса – СВ-Арк – характер суточных изменений коэффициента
норадреналин/дофамин сходен на стадиях диэструса и проэструса, но наиболее выражен
на стадии проэструса и также снижается в интервале времени с 5 ч до 11 ч ЦВ (p<0,05),
что подтверждает активное участие дофамина в регуляторных процессах на уровне СВ-Арк
гипоталамуса, которое реализуется за счет вечернего повышения содержания нейромедиатора
в этой структуре. Относительное постоянство уровня норадреналина в этой области
гипоталамуса в течение дня, при снижении коэффициента норадреналин/дофамин, вероятнее
всего, связано с изменением активности ферментов метаболизма норадреналина.
В дополнение к исследованию суточной динамики содержания биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, и влияния
на нее уровня половых стероидов в крови, нами также было изучено их воздействие
на среднесуточное содержание исследуемых нейромедиаторов в гипоталамусе. U-тест МаннаУитни не выявил влияния стадии эстрального цикла на среднесуточное содержание
норадреналина в МПО гипоталамуса. Однако в СВ-Арк гипоталамуса на стадии проэструса
среднесуточный уровень нейромедиатора оказался достоверно (р<0,01) выше такового
на стадии диэструса (таблица 1). Это указывает на зависимость норадренергической системы
от изменяющегося фона половых гормонов в крови и возможной вовлеченности ее в механизмы
реализации овариального сигнала на уровне секреции гонадолиберина.
22
Таблица 1 – Среднесуточное содержание норадреналина, дофамина
и 5-оксииндолилуксусной кислоты в супрахиазматических ядрах,
медиальной преоптической области, срединном возвышении с аркуатными ядрами
и сером бугре гипоталамуса самок крыс на различных стадиях эстрального цикла
(M±m, нг/мг белка; n=18-22)
НА
Структуры
ДА
5-ОИУК
диэструс
проэструс
диэструс
проэструс
диэструс
проэструс
СХЯ
5,4±0,6
4,7±0,5
1,1±0,5
1,2±0,4
6,1±0,4
7,7±0,5*
МПО
9,3±0,9
8,7±0,6
5,3±0,8
3,3±0,5*
9,3±0,9
9,1±1,1
СВ-Арк
6,0±0,5
8,2±0,6**
8,7±1,0
9,2±1,0
7,7±0,8
7,6±0,6
СБ
3,8±0,3
3,4±0,2
1,4±0,2
2,0±0,4
12,0±0,7
12,7±0,7
Примечание: *, ** – различия с показателем на стадии диэструса в той же гипоталамической структуре
достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест).
Подобным же образом была подтверждена независимость от половой цикличности
изменения среднесуточного содержания дофамина в СВ-Арк гипоталамуса. Однако в МПО
гипоталамуса содержание дофамина подчинялось зависимости иного рода и определялось
стадией эстрального цикла. Среднесуточное содержание этого моноамина на стадии проэструса
было достоверно (р<0,05) ниже его среднесуточного уровня на стадии диэструса (таблица 1).
Было также обнаружено, что в МПО и СВ-Арк гипоталамуса среднесуточное содержание
метаболита серотонина 5-оксииндолилуксусной кислоты не зависит от фона половых стероидов
в крови, тогда как в СХЯ гипоталамуса отмечается иная динамика изменений, с достоверным
(р<0,05) повышением среднесуточного содержания этого метаболита на стадии,
предшествующей овуляции (таблица 1). На основании данных об изменении среднесуточного
содержания этого метаболита серотонина в гипоталамических структурах в зависимости
от стадии эстрального цикла, можно с известной степенью достоверности судить о повышении
активности серотонинергической системы в СХЯ гипоталамуса при изменении уровня половых
гормонов в крови.
Кроме того, для сравнения полученных данных также было проанализировано влияние
меняющегося фона половых стероидов на среднесуточное содержание вышеупомянутых
нейромедиаторов в структуре гипоталамуса, не связанной с регуляцией репродуктивной
функции, а именно в сером бугре (СБ).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об избирательном характере
изменений среднесуточного содержания исследуемых биогенных аминов в различных
структурах мозга, участвующих в регуляции овариальных циклов, в зависимости от стадии
эстрального цикла.
23
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
25
*
*
20
нг/мг белка
нг/мг белка
Циркадианный характер динамики содержания биогенных аминов
в медиальной преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса
При исследовании изменения в течение суток содержания биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, были
получены данные о том, что наблюдаемая у самок крыс на стадии диэструса суточная динамика
содержания норадреналина в МПО гипоталамуса сохраняется в условиях световой депривации
(рисунок 9). Отмечено, что содержание этого нейромедиатора достоверно (p<0,05) снижается
в период с 5 ч до 11 ч ЦВ, сохраняясь на низком уровне до 18 ч ЦВ и, возможно, даже до более
позднего времени, а уже к 23 ч ЦВ наблюдается резкий подъем содержания нейромедиатора
до уровня, приблизительно равного тому, который регистрировался в утренней временной
точке. Подобный характер изменений свидетельствует о том, что суточный ритм содержания
норадреналина в МПО гипоталамуса носит циркадианный характер. Н-тест Крускала-Уоллиса
подтвердил зависимость содержания норадреналина в данной гипоталамической области
от временного показателя (p<0,05). Между тем, суточный ритм содержания дофамина в СВ-Арк
гипоталамуса в условиях световой депривации нами обнаружен не был (рисунок 10),
что позволяет предположить отличие механизмов гипоталамической регуляции при участии
этих нейромедиаторов в зависимости от уровня освещенности.
15
10
5
0
5
11
18
23
циркадианное время, ч
* – различие с показателем в 11 ч и 18 ч
циркадианного времени достоверно
(p<0,05; U-тест)
Рисунок 9 – Суточная динамика
содержания норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс на стадии
диэструса в условиях световой депривации
(M±m, n=9-10)
5
11
18
23
циркадианное время, ч
Рисунок 10 – Суточная динамика
содержания дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс на стадии
диэструса в условиях световой депривации
(M±m, n=9-11)
Таким образом, на основании результатов собственных исследований, а также данных
литературы можно заключить, что суточные изменения содержания НА в МПО гипоталамуса
обладают циркадианной природой и регулируются СХЯ гипоталамуса.
24
Влияние ксенобиотика 1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание
гонадолиберина в медиальной преоптической области и срединном возвышении
с аркуатными ядрами гипоталамуса
Исследование влияния острого воздействия 1,2-диметилгидразина, известного своими
канцерогенными свойствами [Анисимов В.Н., Забежинский М.А., Попович И.Г., 2000],
на среднесуточное содержание гонадолиберина в исследуемых гипоталамических областях
показало, что однократное введение ксенобиотика накануне дня проэструса оказывало
значительный ингибирующий эффект на среднесуточное содержание нейрогормона в СВ-Арк
гипоталамуса (p<0,01). Так, среднесуточный уровень гонадолиберина в контрольной и опытной
группе составил: 47,164,48 нг/мг белка и 27,862,48 нг/мг белка, соответственно (рисунок 11).
60
50
нг/мг белка
40
*
30
20
10
0
физ. р-р
физ. р-р +
ДМГ
* – различие достоверно (p<0,01; U-тест)
Рисунок 11 – Влияние однократного введения
1,2-диметилгидразина на среднесуточное содержание
гонадолиберина в срединном возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса на фоне введения
физиологического раствора (M±m, n=15)
Вместе с тем однократное введение 1,2-диметилгидразина оказывало сходное влияние
и на среднесуточный уровень гонадолиберина в МПО гипоталамуса, однако различие
между опытной (0,410,04 нг/мг белка) и контрольной (0,540,05 нг/мг белка) группами
отмечалось лишь на уровне тенденции.
Полученные данные свидетельствуют о токсическом действии 1,2-диметилгидразина,
которое выражается в снижении под влиянием ксенобиотика среднесуточного содержания
гонадолиберина в обеих гипоталамических структурах, ответственных за синтез и секрецию
нейрогормона, при этом наиболее выраженный эффект нейротоксиканта наблюдался именно
в структуре, отвечающей за секрецию гонадолиберина. Учитывая то, что гипоталамус является
одной из мишеней воздействия 1,2-диметилгидразина [Лихачев А.Я., 1980], можно
предположить, что нейротоксическое действие ксенобиотика на гипоталамо-гипофизарное звено
регуляции репродуктивной функции может осуществляться посредством его влияния
на нейромедиаторные системы гипоталамуса.
25
Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина и толуола на суточную динамику
и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области
и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса
Однократное введение экспериментальным животным 1,2-диметилгидразина на фоне
введения физиологического раствора приводило к нарушению на стадии проэструса
нормальных суточных изменений содержания норадреналина в МПО гипоталамуса, причем
уровень нейромедиатора сохранялся практически постоянным во всех трех исследованных
временных точках (таблица 2). Установлено, что при введении ксенобиотика содержание
нейромедиатора в утреннее и вечернее время было сходным с его содержанием
в соответствующих временных точках в контроле, однако присущего контрольной группе
достоверного снижения содержания нейромедиатора во временном интервале с 9:30 ч до 11 ч
ЦВ не наблюдалось в группе, получившей однократную инъекцию 1,2-диметилгидразина.
При введении ксенобиотика также отмечалось исчезновение нормальных суточных изменений
содержания дофамина в СВ-Арк гипоталамуса, наблюдаемого у контрольных животных
(таблица 2).
Таблица 2 – Содержание норадреналина в медиальной преоптической области
и дофамина в срединном возвышении с аркуатными ялрами гипоталамуса самок крыс
на стадии проэструса после однократного введения 1,2-диметилгидразина
на фоне введения физиологического раствора (M±m, нг/мг белка; n=9-16)
Циркадианное
НА в МПО
ДА в СВ-Арк
время, ч
физ. р-р
физ. р-р + ДМГ
физ. р-р
физ. р-р + ДМГ
5
20,3±1,4
18,7±1,2
5,2±0,4
13,8±1,1
9:30
24,3±1,5
18,4±2,1
8,4±0,8**
13,2±1,5
11
20,9±0,9
20,3±1,6
8,2±1,1*
14,0±1,6
Примечание:  – различие с показателем в 11 ч циркадианного времени в той же группе достоверно (p<0,05;
U-тест); *, ** – различия с показателем в 5 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05;
**p<0,01; U-тест).
В ходе дальнейшего исследования было обнаружено, что введение 1,2-диметилгидразина
в утренние часы (3 ч ЦВ) на фоне введения физиологического раствора достоверно (р<0,01)
снижало среднесуточный уровень норадреналина в МПО гипоталамуса на 12,1% относительно
группы животных, получавших только физиологический раствор (19,10,9 нг/мг белка
и 21,80,7 нг/мг белка, соответственно) (рисунок 12). Анализ данных о среднесуточном
содержании дофамина в СВ-Арк гипоталамуса показал, что его уровень значительно, на 86,7%,
возрастал при введении ксенобиотика на фоне введения физиологического раствора
(13,70,8 нг/мг белка и 7,30,6 нг/мг белка, соответственно). Сочетанное введение
1,2-диметилгидразина и физиологического раствора не приводило к достоверному изменению
среднесуточного содержания норадреналина в СВ-Арк и дофамина в МПО гипоталамуса
(рисунок 12).
Как показали дальнейшие исследования, ингаляция толуола в дозах на уровне ПДК
вызывала достоверное (p<0,01) повышение уровня норадреналина в МПО гипоталамуса
26
30
25
нг/мг белка
20
*
**
15
10
5
0
НА в МПО
НА в СВАрк
физ. р-р
ДА в МПО
ДА в СВАрк
физ. р-р + ДМГ
*, ** – различия с соответствующим показателем в группе животных, получавших только
инъекции физиологического раствора, достоверны (*p<0,01; **p<0,001; U-тест)
Рисунок 12 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина
на среднесуточное содержание норадреналина и дофамина в медиальной
преоптической области и срединном возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс на фоне введения физиологического раствора
(M±m, n=31-40)
Таблица 3 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах на уровне предельно допустимой
концентрации на суточную динамику содержания норадреналина, дофамина, серотонина и его
метаболита 5-оксииндолилуксусной кислоты в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс (M±m, нг/мг белка; n=6-10)
НА
ДА
5-ОТ
5-ОИУК
Группа
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
31,32,1 11,22,6 7,31,6
2,81,1 17,41,9 8,41,7
5,70,6
3,80,9
Контроль
***
*
*
30,61,4 27,63,2 8,21,4
7,21,8 11,31,7 10,31,3 5,10,3
5,10,3
Толуол



Примечание: *, *** – различия с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе достоверны (*p<0,05;
***p<0,001; U-тест); ,  – различия с показателем в контрольной группе в то же время достоверны (p<0,05;

p<0,01; U-тест).
Таблица 4 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах на уровне предельно допустимой
концентрации на суточную динамику содержания норадреналина, дофамина
и метаболита серотонина 5-оксииндолилуксусной кислоты в срединном возвышении
с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс (M±m, нг/мг белка; n=7-10)
НА
ДА
5-ОИУК
Группа
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
3 ч ЦВ
9 ч ЦВ
Контроль
Толуол
17,91,8
14,91,9
16,71,6
23,51,2
21,52,8
21,13,7

11,81,3
*
23,82,5
2,40,5
2,00,6
2,50,2
3,80,5

Примечание: * – различие с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе
достоверно (p<0,05; U-тест); ,  – различия с показателем в контрольной группе в то же время
достоверны (p<0,05; p<0,01; U-тест).
27
в дневное время (9 ч ЦВ) по сравнению с контролем (таблица 3), что приводило к исчезновению
характерной для контрольной группы суточной динамики содержания этого нейромедиатора.
В отношении же содержания норадреналина в СВ-Арк гипоталамуса было обнаружено
достоверное (p<0,05) повышение утреннего (3 ч ЦВ) уровня этого нейромедиатора
под воздействием ксенобиотика (таблица 4). Как и в контрольной группе, после воздействия
толуола содержание норадреналина в этой гипоталамической структуре не претерпевало
достоверных суточных изменений.
При воздействии толуола в дозах на уровне ПДК происходило достоверное (p<0,01)
повышение уровня дофамина в СВ-Арк гипоталамуса в дневное время (таблица 4),
что сопровождалось исчезновением характерной для контрольной группы животных суточной
динамики содержания этого нейромедиатора. В МПО гипоталамуса воздействие ксенобиотика
также вызывало достоверное (p<0,05) повышение дневного уровня нейромедиатора по сравнению
с соответствующим контрольным значением.
Содержание серотонина в МПО гипоталамуса в утренние часы достоверно (p<0,05)
снижалось при ингаляции толуола (таблица 3), что приводило к исчезновению нормальной
суточной динамики уровня этого нейромедиатора. Содержание же метаболита серотонина
5-оксииндолилуксусной кислоты в обеих гипоталамических структурах в утренние и дневные
часы не отличалось от соответствующих контрольных значений после воздействия
ксенобиотика.
Обнаруженное в контрольной группе животных достоверное снижение по сравнению
с утренними значениями дневных уровней норадреналина, дофамина и серотонина в МПО,
а также дофамина в СВ-Арк гипоталамуса, не наблюдалось в группах, подвергшихся ингаляции
толуола. Подобное нарушение суточной динамики содержания биогенных аминов под влиянием
ксенобиотика может свидетельствовать о его нейротоксическом воздействии на процессы
синаптической передачи в тех нейрональных структурах, которые передают в МПО и СВ-Арк
гипоталамуса информацию о суточном периодизме. Данные, полученные в настоящем
исследовании, позволяют предположить, что суточные ритмы содержания биогенных аминов
в МПО и СВ-Арк гипоталамуса являются чувствительным маркером нарушений механизмов,
обеспечивающих связь циркадианной системы организма с катехоламинергическим звеном
регуляции репродуктивной функции, при остром и при хроническом воздействии на организм
нейротоксических ксенобиотиков.
Помимо воздействия на суточную динамику содержания нейромедиаторов, толуол
изменял также и среднесуточный уровень биогенных аминов в исследуемых структурах
гипоталамуса. Так, ингаляция ксенобиотика в дозах на уровне ПДК оказывала значительный
эффект на среднесуточное содержание норадреналина и дофамина в СВ-Арк гипоталамуса,
при этом на уровне тенденции также отмечалось влияние нейротоксиканта на среднесуточный
уровень норадреналина в МПО гипоталамуса. Значительный эффект толуола обнаруживался
и в случае показателя активности серотонинергической системы коэффициента
5-оксииндолилуксусная кислота/серотонин в МПО гипоталамуса. В отношении же
среднесуточного содержания дофамина в МПО гипоталамуса заметного эффекта ксенобиотика
не наблюдалось (рисунок 13).
Наблюдавшееся нами повышение среднесуточного содержания дофамина в СВ-Арк
гипоталамуса после однократного введения 1,2-диметилгидразина и после хронической
28
35
30
нг/мг белка
25
Контроль
**
Толуол
**
20
15
10
5
0
НА в СВ-Арк
ДА в СВ-Арк
0,6
10
*
0,5
8
0,4
6
ед.
нг/мг белка
НА в МПО
4
0,3
0,2
0,1
2
0
0
ДА в МПО
5-ОИУК/5-ОТ
в МПО
*, ** – различия с соответствующим показателем в контрольной группе
достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест)
Рисунок 13 – Влияние хронической ингаляции толуола в дозах
на уровне предельно допустимой концентрации на среднесуточное
содержание норадреналина и дофамина в медиальной
преоптической области и срединном возвышении с аркуатными
ядрами гипоталамуса самок крыс, а также на показатель
5-оксииндолилуксусная кислота/серотонин в медиальной
преоптической области гипоталамуса самок крыс (M±m, n=12-19)
ингаляции толуола, а также разнонаправленные изменения уровня норадреналина в МПО
гипоталамуса после применения указанных воздействий могут свидетельствовать о сложной
реакции гипоталамо-гипофизарного звена регуляции репродуктивной функции на экзогенно
вводимые ксенобиотики. При этом отличие в эффектах введения 1,2-диметилгидразина
на уровне МПО и СВ-Арк гипоталамуса может быть обусловлено различным воздействием
ксенобиотика на околосуточные ритмы содержания биогенных аминов и других
нейромедиаторов в областях гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию
гонадолиберина. Для дальнейшего выяснения вопроса о наличии или отсутствии специфичности
воздействия ксенобиотиков на катехоламинергическое звено регуляции эстральных циклов
нами было исследовано влияние на изучаемые показатели хронического потребления
аминокислоты L-метионина, которая сама по себе не является ксенобиотиком,
но образует в процессе своей деградации цитотоксичную аминокислоту L-гомоцистеин и еще
более токсичную L-гомоцистеиновую кислоту, а также АФК.
29
Влияние метиониновой нагрузки (гипергомоцистеинемии) на суточную динамику
и среднесуточное содержание биогенных аминов в медиальной преоптической области
и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса
Наличие гипергомоцистеинемии при хроническом принудительном потреблении
экспериментальными животными L-метионина было во всех случаях подтверждено путем
прямого измерения содержания общего L-гомоцистеина в сыворотке крови. При этом
отмечалось достоверное (p<0,01) повышение содержания общего L-гомоцистеина в период
формирования и терминации преовуляторного пика секреции гонадолиберина (9:30 ч и 11 ч ЦВ,
соответственно).
В результате проведенных исследований было обнаружено влияние алиментарной
гипергомоцистеинемии на суточную динамику и среднесуточное содержание биогенных аминов
в структурах гипоталамуса, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина.
Так, при исследовании содержания норадреналина в МПО гипоталамуса в контроле была
обнаружена сходная с описанной выше динамика изменений уровня этого нейромедиатора
с характерным достоверным (p<0,05) повышением его содержания в дневное время (9:30 ч ЦВ)
и снижением в вечерние часы (11 ч ЦВ). Обнаруженная динамика исчезала на фоне
одномесячного курса перорального введения L-метионина. В этих условиях уровень
норадреналина сохранялся практически одинаковым во всех трех временных точках (рисунок
14).
35
20
#
*
16
25
нг/мг белка
нг/мг белка
30
*
20
15
10
12
8
4
5
0
0
5
9:30
11
циркадианное время, ч
контроль
L-метионин
* – различие с показателем в 11 ч циркадианного
времени в той же группе (контроль) достоверно
(p<0,05; U-тест)
Рисунок 14 – Влияние хронического
воздействия L-метионина на суточную
динамику содержания норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс на стадии
проэструса (M±m, n=9-12)
5
9:30
11
циркадианное время, ч
контроль
L-метионин
* – различие с показателем в 9:30 ч циркадианного
времени в той же группе (контроль) достоверно
(p<0,05; U-тест);  – различие с показателем в то же
время в контрольной группе достоверно
(p<0,05; U-тест)
Рисунок 15 – Влияние хронического
воздействия L-метионина на суточную
динамику содержания дофамина
в срединном возвышении с аркуатными
ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии
проэструса (M±m, нг/мг белка; n=9-13)
При исследовании суточной динамики содержания дофамина в СВ-Арк гипоталамуса
было установлено, что в контроле наблюдается суточное изменение уровня нейромедиатора
с характерным повышением в вечерней временной точке (p<0,05). При введении L-метионина
30
наблюдалось исчезновение нормальной суточной динамики содержания нейромедиатора,
при этом имели место достоверное (p<0,05) по сравнению с контролем повышение уровня этого
моноамина в 9:30 ч ЦВ и тенденция к снижению этого показателя к 11 ч ЦВ (рисунок 15).
Исследование уровня дофамина в МПО и норадреналина в СВ-Арк гипоталамуса
не выявило суточной динамики содержания этих нейромедиаторов ни в группе контроля,
ни в группе животных, подвергшихся метиониновой нагрузке.
Определение же среднесуточного содержания норадреналина в МПО гипоталамуса
при объединении данных, полученных во всех трех временных точках (5 ч, 9:30 ч и 11 ч ЦВ),
показало, что после принудительного перорального введения L-метионина в течение месяца
происходит достоверное (p<0,05) повышение содержания нейромедиатора по сравнению
с контролем. В группе животных, получавших L-метионин, оно составило 27,2±1,0 нг/мг белка,
а в контрольной группе – 23,7±0,9 нг/мг белка.
В результате изучения среднесуточных уровней дофамина и 5-оксииндолилуксусной
кислоты в МПО гипоталамуса статистически значимые различия при сравнении контрольных
и опытных животных выявлены не были. Так, среднесуточное содержание дофамина в этой
гипоталамической структуре в группе животных, потреблявших L-метионин, достоверно
не отличалось от содержания нейромедиатора в группе контроля и составило: 27,0±0,9 нг/мг
белка и 24,9±1,1 нг/мг белка, соответственно. Имела место лишь тенденция к повышению
содержания среднесуточного уровня этого биогенного амина при введении L-метионина.
Также при объединении данных, полученных во всех трех временных точках, нами
не было выявлено статистически значимых различий в среднесуточном содержании
норадреналина, дофамина и 5-оксииндолилуксусной кислоты в СВ-Арк гипоталамуса
между контрольной и опытной группами животных. Так, например, среднесуточное содержание
норадреналина в этой гипоталамической структуре в группе животных, потреблявших
L-метионин, достоверно не отличалось от уровня нейромедиатора в группе контроля
(27,0±0,9 нг/мг белка и 24,9±1,1 нг/мг белка, соответственно). Имела место лишь тенденция
к повышению содержания данного биогенного амина при введении L-метионина.
Отмеченное в данном исследовании изменение суточной динамики и среднесуточного
содержания катехоламинов при метиониновой нагрузке в структурах гипоталамуса,
ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, подтверждает адекватность
использования для создания гипергомоцистеинемии модели принудительного кормления
животных L-метионином. Можно предположить, что исчезновение суточных ритмов
содержания норадреналина и дофамина в данной модели гипергомоцистеинемии связано
с изменениями в работе СХЯ гипоталамуса и является характерным начальным признаком
нарушений нормального функционирования репродуктивной функции.
Приведенные результаты указывают на то, что повышенное содержание общего
L-гомоцистеина вызывает нарушение катехоламинергической регуляции эстральных циклов
у самок крыс, оказывая влияние на норадренергическую систему в МПО гипоталамуса
и дофаминергическую систему в СВ-Арк гипоталамуса, что свидетельствует о негативном
действии гипергомоцистеинемии на процессы синтеза и секреции гонадолиберина, находящиеся
под контролем этих нейромедиаторных систем. Полученные данные дают основание
рассматривать повышенное содержание общего L-гомоцистеина в качестве фактора, одним
из проявлений нейротоксичности которого является нарушение гипоталамической регуляции
31
овариальных циклов, что ставит его в один ряд с другими ранее изученными нами
ксенобиотиками.
Влияние ксенобиотиков 1,2-диметилгидразина, толуола и метиониновой нагрузки
на образование активных форм кислорода в медиальной преоптической области
и срединном возвышении с аркуатными ядрами гипоталамуса и продуктов перекисного
окисления липидов в сыворотке крови
Помимо суточных изменений содержания биогенных аминов в структурах гипоталамуса,
ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, в МПО гипоталамуса также были
обнаружены суточные изменения генерации АФК. Образование АФК в этой структуре
в дневное время существенно (p<0,05) превосходило значения данного показателя в утренние
и ранние ночные часы (рисунок 16). С помощью Н-теста Крускала-Уоллиса была подтверждена
зависимость уровня люминолзависимой хемилюминесценции в этой гипоталамической области
от временного показателя (p<0,05). Необходимо отметить, что суточная динамика генерации
АФК в МПО гипоталамуса имела характер, противоположный соответствующим изменениям
содержания биогенных аминов в той же структуре (таблица 3).
отн. ед./мг белка
18000
*
16000
*
14000
12000
10000
8000
#
6000
4000
2000
0
3
9
17
3
9
17
3
циркадианное время, ч
физ. р-р
физ. р-р + ДМГ
* – различие с показателями в 3 ч и 17 ч циркадианного времени в той же группе достоверно
(р<0,05; U-тест);  – различие с показателем в группе животных, получивших инъекцию
физиологического раствора, в то же время достоверно (р<0,05; U-тест)
Рисунок 16 – Влияние однократного введения 1,2-диметилгидразина
на генерацию активных форм кислорода (уровень люминолзависимой
хемилюминесценции) в медиальной преоптической области гипоталамуса
самок крыс на фоне введения физиологического раствора (M±m; n=5-6)
Введение 1,2-диметилгидразина достоверно (p<0,05) снижало дневной уровень
образования АФК до значений, характерных для утреннего и раннего ночного времени,
что приводило к исчезновению наблюдаемой в контрольной группе суточной динамики
генерации АФК (рисунок 16).
Хроническая ингаляция толуола в дозах на уровне ПДК вызывала достоверное (p<0,05)
повышение утреннего уровня генерации АФК в МПО гипоталамуса по сравнению с контролем,
что приводило к исчезновению наблюдаемых в норме суточных изменений интенсивности
свободнорадикального окисления (рисунок 17).
Таким образом, в МПО гипоталамуса при различных воздействиях, также как и
32
18000
отн. ед./мг белка
16000
*
14000
12000
#
10000
8000
6000
4000
2000
0
Контроль
3 ч ЦВ
Толуол
9 ч ЦВ
* – различие с показателем в 3 ч циркадианного времени в той же группе достоверно
(р<0,05; U-тест);  – различие с показателем в то же время в контрольной группе достоверно
(р<0,05; U-тест)
Рисунок 17 – Влияние хронического воздействия толуола на генерацию
активных форм кислорода (уровень люминолзависимой
хемилюминесценции) в медиальной преоптической области гипоталамуса
самок крыс (M±m; n=6-10)
в нормальных физиологических условиях, наблюдалась взаимосвязь между уровнем биогенных
аминов и свободнорадикальными процессами.
Полученные нами данные позволяют предположить, что суточные ритмы генерации АФК
в МПО гипоталамуса связаны с суточными изменениями в содержании биогенных аминов
в этой богатой моноаминергическими окончаниями гипоталамической структуре. Вместе с тем
уровень генерации АФК может рассматриваться как интегральный показатель, не только
свидетельствующий об изменении активности моноаминергических систем, но и дающий
представление об интенсивности множества различных биохимических процессов, связанных
с образованием АФК.
Таким образом, изучение суточной динамики образования АФК в структурах
гипоталамуса, ответственных за регуляцию эстральных циклов, может служить маркером
нормального функционирования механизмов передачи к этим структурам информации
о суточном периодизме, а также нарушения таких механизмов при различных неблагоприятных
воздействиях на организм.
Данные об увеличении уровня общего L-гомоцистеина в плазме крови при пероральном
введении L-метионина согласуются с полученными нами результатами о содержании продуктов
перекисного окисления липидов (ТБК-реактивных продуктов), а также нитритов в сыворотке
крови, при этом влияние потребления L-метионина на уровень Fe2+/H2O2-индуцированной
хемилюминесценции в сыворотке крови в ходе экспериментов нами обнаружено не было.
Так, при исследовании в сыворотке крови уровня вторичного продукта перекисного окисления
липидов малонового диальдегида было обнаружено его достоверное (p<0,01) повышение
при метиониновой нагрузке, указывающее на активацию перекисных процессов в крови
(рисунок 18).
В настоящем исследовании нами также была выявлена суточная динамика содержания
нитритов в сыворотке крови контрольных животных, с достоверным (p<0,05) повышением
уровня этого показателя к 11 ч ЦВ (рисунок 19). Н-тест Крускала-Уоллиса подтвердил
зависимость содержания нитритов от временного показателя (p<0,05). Пероральное введение
33
L-метионина приводило к достоверному (p<0,05) снижению содержания нитритов в вечернее
время с нарушением их нормальной суточной динамики.
16
10
*
14
мкмоль/л
мкмоль/л
*
8
12
10
8
6
4
6
2
4
0
2
контроль
0
контроль
L-метионин
5 ч ЦВ
L-метионин
9:30 ч ЦВ
11 ч ЦВ
* – различие с показателем в контрольной
группе достоверно (p<0,01; U-тест)
* – различие с показателями в 5 ч и 9:30 ч циркадианного
времени в той же группе достоверно (p<0,05; U-тест)
Рисунок 18 – Влияние хронического
воздействия L-метионина
на содержание малонового
диальдегида в сыворотке крови
самок крыс на стадии проэструса
(M±m, n=36-46)
Рисунок 19 – Влияние хронического
воздействия L-метионина на cодержание нитритов
в сыворотке крови самок крыс на стадии
проэструса
(M±m, n=10-13)
Снижение уровня нитритов может быть обусловлено усилением взаимодействия
с супероксидным радикалом и косвенно свидетельствовать об интенсификации процесса
образования пероксинитрита в этих условиях.
Коррекция с помощью мелатонина и пептидных биорегуляторов нарушения
катехоламинергической регуляции эстральных циклов, вызванного нейротоксическим
воздействием (1,2-диметилгидразин, метиониновая нагрузка)
Последующие эксперименты показали, что при введении 1,2-диметилгидразина на фоне
инъекций мелатонина, эпиталамина и эпиталона наблюдается реакция гипоталамических
структур, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина, проявляющаяся в изменении
содержания в них катехоламинов (таблица. 5). Так, среднесуточное содержание норадреналина
в МПО гипоталамуса в группе животных, получавших 1,2-диметилгидразин на фоне введения
мелатонина, достоверно не отличалось от соответствующего контрольного значения, то есть
от среднесуточного содержания нейромедиатора в группе животных, получавших только
мелатонин. У животных же, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения
эпиталамина, отмечалось достоверное (р<0,01) увеличение на 17,9% уровня норадреналина
по сравнению с группой животных, получавших только эпиталамин. При введении
1,2-диметилгидразина на фоне инъекций эпиталона была отмечена лишь тенденция
к повышению среднесуточного содержания этого нейромедиатора.
Анализ полученных данных по среднесуточному содержанию дофамина в МПО
Таблица 5 – Среднесуточное содержание норадреналина и дофамина в медиальной преоптической области и срединном возвышении
с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после однократного введения 1,2-диметилгидразина
на фоне введения физиологического раствора, мелатонина, эпиталамина и эпиталона (M±m, нг/мг белка; n=28-40)
Показатель
физ. р-р
мелатонин
эпиталамин
эпиталон
физ. р-р
мелатонин
эпиталамин
эпиталон
+ ДМГ
+ ДМГ
+ ДМГ
+ ДМГ
НА в МПО
21,8±0,8
19,1±0,9*
21,6±1,2
21,5±1,2
17,8±0,8
21,0±0,7*
17,7±0,9
19,1±1,1
ДА в МПО
5,1±0,5
3,9±0,3
5,0±0,6
8,2±1,1*
3,4±0,4
7,9±0,8**
4,2±0,6
7,5±1,1*
НА в СВ-Арк
24,3±1,4
24,6±1,2
22,8±1,3
24,2±1,7
25,2±1,5
24,9±1,1
21,0±1,5
30,7±1,7**
ДА в СВ-Арк
7,3±0,6
13,7±0,8**
10,8±0,6
8,6±0,4*
12,0±0,9
12,8±1,3
9,2±0,5
15,8±0,9**
Примечание: *, ** – различия между показателями в группе животных, получивших инъекцию 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического
раствора или дополнительного соединения (мелатонин, эпиталамин, эпиталон), и в соответствующей контрольной группе достоверны (*p<0,01; **p<0,001;
U-тест).
гипоталамуса позволил установить, что однократное введение 1,2-диметилгидразина
при фоновом введении всех трех исследованных соединений достоверно (р<0,01; р<0,001)
повышает уровень дофамина на 64,7% (мелатонин), 131,9% (эпиталамин) и 76,7% (эпиталон).
В СВ-Арк гипоталамуса достоверное (р<0,001) увеличение среднесуточного содержания
норадреналина (на 46,4%) наблюдалось только при введении 1,2-диметилгидразина на фоне
четырехдневного курса введения эпиталона. Анализ данных о среднесуточном содержании
дофамина в СВ-Арк гипоталамуса показал, что его уровень значительно (на 71,3%) возрастал
при введении ксенобиотика на фоне введения эпиталона, тогда как при сочетанном введении
1,2-диметилгидразина и эпиталамина изменения были недостоверными, а на фоне введения
мелатонина наблюдалось даже достоверное (р<0,01) снижение среднесуточного содержания
нейромедиатора на 19,8%.
В группе животных, которые получали курс введения гормона пинеальной железы
мелатонина, наблюдалась нормальная суточная динамика содержания норадреналина в МПО
гипоталамуса, характерная для контрольных животных (таблица 6). Установлено,
что при введении 1,2-диметилгидразина на фоне инъекций мелатонина нормальные суточные
изменения содержания норадреналина в МПО гипоталамуса сохранялись, при этом
наблюдалось достоверное (р<0,05) снижение уровня данного нейромедиатора во временном
интервале с 9:30 ч до 11 ч ЦВ; подобный же положительный эффект отмечался
и при сочетанном введении 1,2-диметилгидразина и эпиталамина, который в МПО гипоталамуса
оказался более эффективным по сравнению с эпиталоном.
Таблица 6 – Суточная динамика содержания норадреналина в медиальной преоптической
области гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после однократного введения
1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора, мелатонина,
эпиталамина и эпиталона (M±m, нг/мг белка; n=6-16)
Циркадианное
время, ч
физ. р-р
физ. р-р
+ ДМГ
мелатонин
мелатонин эпиталамин эпиталон
+ ДМГ
+ ДМГ
+ ДМГ
5
20,3±1,4
18,7±1,2
19,1±1,8**
19,1±1,9*
20,3±1,2
21,1±2,4
9:30
24,3±1,5
18,4±2,1
25,8±1,7
24,6±2,0
23,4±1,0
17,2±1,1
11
20,9±0,9*
20,3±1,6
20,0±1,4*
18,7±1,9*
19,5±1,1*
19,2±1,8
Примечание: *, ** – различия с показателем в 9:30 ч циркадианного времени в той же группе достоверны
(*p<0,05; ** p<0,01; U-тест).
При сочетанном введении 1,2-диметилгидразина и мелатонина была обнаружена суточная
динамика содержания дофамина в СВ-Арк гипоталамуса, сходная с ритмом уровня
нейромедиатора, наблюдаемым в контрольной группе, а также в группе животных, получавших
только инъекции мелатонина (достоверное повышение уровня нейромедиатора в дневные
и вечерние часы по сравнению с его уровнем в утренней временной точке) (таблица 7).
Кроме того, в СВ-Арк гипоталамуса достаточно эффективным оказался эпиталон, который
предотвращал нарушение суточной динамики содержания дофамина, вызываемое воздействием
36
ксенобиотика, сохраняя при этом низкий уровень катехоламина в 5 ч ЦВ с достоверным (р<0,05)
повышением его содержания к 9:30 ч и 11 ч ЦВ.
Таблица 7 – Суточная динамика содержания дофамина в срединном возвышении
с аркуатными ядрами гипоталамуса самок крыс на стадии проэструса после однократного
введения 1,2-диметилгидразина на фоне введения физиологического раствора,
мелатонина, эпиталамина и эпиталона (M±m, нг/мг белка; n=8-13)
Циркадианное
время, ч
физ. р-р
физ. р-р
+ ДМГ
мелатонин
мелатонин эпиталамин эпиталон
+ ДМГ
+ ДМГ
+ ДМГ
5
5,2±0,4
13,8±1,1
7,7±0,5
9:30
8,4±0,8**
13,2±1,5
12,3±0,8** 9,5±0,4***
11
8,2±1,1*
14,0±1,6
6,5±0,4
16,4±2,3
12,4±0,6
13,0±2,5
16,5±1,3*
11,5±1,0* 10,0±0,2*** 8,2±0,9**
17,7±2,0*
Примечание: *, **, *** – различия с показателем в 5 ч циркадианного времени в той же группе
достоверны (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001; U-тест).
То, что суточные ритмы содержания норадреналина в МПО и дофамина в СВ-Арк
гипоталамуса претерпевают изменения под действием 1,2-диметилгидразина, указывает
на нарушение связи между циркадианной системой организма и гипоталамическим звеном
регуляции эстральных циклов, так как установлено, что суточная динамика содержания
норадреналина в МПО и дофамина в СВ-Арк связана с работой центрального осциллятора
циркадианных ритмов, СХЯ гипоталамуса [Sellix M.T. et al., 2004], и, вероятнее всего, участвует
в реализации «циркадианного сигнала» запуска пика секреции гонадолиберина на стадии
проэструса. Также велика вероятность того, что суточный ритм содержания дофамина в СВ-Арк
гипоталамуса зависит от изменений в течение суток уровня мелатонина в крови, одной
из мишеней прямого действия которого является собственно СВ гипоталамуса [Коркушко О.В.,
Хавинсон В.Х., Шатило В.Б., 2006]. Таким образом, можно предположить,
что восстанавливающий нарушенные под воздействием ксенобиотика суточные изменения
содержания нейромедиаторов эффект мелатонина и пептидных препаратов реализуется через
способность этих соединений предотвращать нарушение процессов передачи информации
о суточном периодизме от СХЯ гипоталамуса к нейромедиаторным системам МПО и СВ
гипоталамуса, участвующим в регуляции эстральных циклов. Однако достаточно сложно судить
о механизмах, вызывающих этот эффект, поскольку сначала необходимо проанализировать
возможные механизмы, посредством которых однократное введение экспериментальным
животным 1,2-диметилгидразина приводит к нарушению суточных ритмов содержания
норадреналина в МПО и дофамина в СВ-Арк гипоталамуса.
Последующие эксперименты показали, что введение пинеалона, но не мелатонина на фоне
метиониновой нагрузки восстанавливает нарушенный суточный ритм содержания
норадреналина в МПО гипоталамуса. Так, уровень нейромедиатора в опытной группе
достоверно (p<0,05) повышался и затем резко снижался во второй половине дня проэструса
(рисунок 20). Полученные нами данные о положительном влиянии пинеалона на суточную
динамику содержания норадреналина в МПО гипоталамуса в условиях экспериментальной
37
гипергомоцистеинемии подтверждают имеющиеся в литературе сведения о том, что данный
биорегулятор обладает выраженными нейропротекторными свойствами, что проявляется
в защите нервных клеток от воздействия окислительного стресса, развивающегося в результате
метиониновой нагрузки [Arutjunyan A. et al., 2012].
45
40
нг/мг белка
35
30
25
*
**
*
20
15
10
5
0
контроль
L-метионин
5 ч ЦВ
L-метионин +
мелатонин
9:30 ч ЦВ
L-метионин +
пинеалон
11 ч ЦВ
*, ** – различия с показателем в 9:30 ч циркадианного времени в той же группе
достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест)
Рисунок 20 – Суточная динамика содержания норадреналина
в медиальной преоптической области гипоталамуса самок крыс
на стадии проэструса после введения мелатонина и пинеалона
на фоне перорального введения L-метионина (M±m, n=7-12)
Изменение катехоламинергической регуляции эстральных циклов у животных
различных возрастных групп
В результате исследования, проведенного на 1,5-месячных и 24-месячных животных, было
установлено, что с возрастом, к 24 мес., когда половая цикличность полностью прекращается
и животные находятся в состоянии персистирующего эструса или диэструса, содержание
норадреналина в МПО гипоталамуса достоверно (p<0,01) снижается. Так, среднесуточное
содержание нейромедиатора составило: 25,90,7 нг/мг белка – у 1,5-месячных животных
и 19,71,0 нг/мг белка – у 24-месячных.
В последующих экспериментах было установлено, что у 13-14-месячных животных,
у которых еще встречались отдельные эстральные циклы, но при этом уже наблюдалось
удлинение стадии диэструса и (или) эструса, нарушается нормальная суточная динамика
содержания норадреналина в МПО гипоталамуса, характерная для нормально циклирующих
7-8-месячных самок с повышением содержания нейромедиатора к 9:30 ч ЦВ и снижением этого
показателя к 11 ч ЦВ (рисунок 21). Однако, несмотря на исчезновение суточного ритма
содержания нейромедиатора в этой гипоталамической структуре у средневозрастных животных,
его среднесуточное содержание достоверно не отличалось от такового у молодых животных
(рисунок 22).
Анализ данных о содержании дофамина в СВ-Арк гипоталамуса у животных разного
возраста показал, что суточный ритм содержания этого биогенного амина с повышением его
уровня в вечернее время, характерный для 7-8-месячных животных, у 13-14-месячных самок
38
отсутствует (рисунок 23). Кроме того, согласно полученным нами данным, среднесуточное
содержание этого биогенного амина у животных данной возрастной группы снижается (рисунок
24).
28
25
*
26
20
нг/мг белка
нг/мг белка
24
22
20
18
15
10
16
5
14
5
9:30
11
0
циркадианное время, ч
7-8-мес.
7-8-месячные
13-14-мес.
* – различие с показателем в 11 ч циркадианного
времени в той же группе (7-8 мес.) достоверно
(p<0,05; U-тест)
Рисунок 21 – Суточная динамика
содержания норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс различных
возрастных групп на стадии проэструса
(M±m, n=9-16)
Рисунок 22 – Среднесуточное
содержание норадреналина
в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс различных
возрастных групп на стадии проэструса
(M±m, n=29-40)
10
9
9
8
8
*
6
5
4
3
2
нг/мг белка
нг/мг белка
7
**
7
13-14-месячные
6
*
5
4
3
2
1
0
1
5
9:30
11
циркадианное время, ч
7-8 мес
13-14 мес
*, ** – различия с показателем в 5 ч
циркадианного времени в той же группе
достоверны (*p<0,05; **p<0,01; U-тест)
Рисунок 23 – Суточная динамика
содержания дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс различных
возрастных групп на стадии проэструса
(M±m, n=8-13)
0
7-8-месячные
13-14-месячные
* – различие между показателями достоверно
(p<0,001; U-тест)
Рисунок 24 – Среднесуточное
содержание дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами
гипоталамуса самок крыс различных
возрастных групп на стадии проэструса
(M±m, n=27-32)
39
Таким образом, естественное старение организма животного сопровождается нарушением
характерной суточной динамики содержания норадреналина и дофамина, а также снижением
среднесуточного содержания этих нейромедиаторов в областях гипоталамуса, ответственных
за синтез и секрецию гонадолиберина.
Влияние мелатонина и эпиталона на динамику эстральных циклов у молодых
и старых животных при различных световых режимах
В проведенном нами исследовании впервые было уделено особое внимание изучению
влияния различных световых режимов, в частности постоянного освещения, на такие показатели
репродуктивной функции молодых, зрелых и стареющих животных, как средняя
продолжительность
эстрального
цикла,
количество
эстральных
циклов
разной
продолжительности и их процентное соотношение, процентное соотношение фаз эстрального
цикла, относительное число животных с иррегулярными циклами.
В группе крыс, находившихся в условиях стандартного фиксированного освещения
и получавших мелатонин, существенных возрастных изменений в соотношении фаз эстрального
цикла зафиксировано не было: соотношение стадий эструсы/диэструсы колебалось в пределах
от 1/1,04 до 1/1,08. Длинные эстральные циклы появлялись только в возрасте 11 мес. Короткие
циклы сохранялись до 14-месячного возраста включительно. Возрастные изменения эстрального
цикла у крыс, получавших мелатонин, появлялись, начиная с 17-месячного возраста, при этом
достоверных изменений в продолжительности эстральных циклов на протяжении первых
14 мес. жизни не наблюдалось. В контрольной же группе животных достоверное (p<0,05)
увеличение данного параметра было установлено на 3 мес. раньше.
У самок, получавших эпиталон, соотношение фаз эстрального цикла изменялось в течение
жизни от 1/1,17 до 1/0,80. Достоверное увеличение продолжительности цикла наблюдалось,
также как и в случае с мелатонином, в возрасте 17 мес., что на 3 мес. позже, чем в контрольной
группе. Короткие эстральные циклы исчезали у экспериментальных животных только
в 20-месячном возрасте, а длинные эстральные циклы появлялись в возрасте 14 мес.
У всех животных до 11-месячного возраста сохранялись регулярные циклы (рисунок 25),
35
29
30
25
25
%
19
20
21
20
17
контроль
мелатонин
15
эпиталон
10
5
0
0
0
0
5
11
20
возраст, мес.
Рисунок 25 – Количество иррегулярных циклов у самок крыс,
получавших мелатонин и эпиталон, при стандартном
фиксированном освещении (%, n=6)
40
а в возрасте 11 мес. во всех экспериментальных группах появлялись иррегулярные циклы,
причем достоверных различий между группами не наблюдалось: иррегулярные циклы
составляли: 19% в контрольной группе, 21% в группе животных, получавших мелатонин, и 17%
в группе животных, получавших эпиталон. В дальнейшем, в 20-месячном возрасте, у крыс,
получавших препараты, иррегулярные циклы встречались реже, чем в контрольной группе,
однако достоверные различия отсутствовали.
У животных контрольной группы, находившихся в условиях постоянного освещения,
соотношение стадий эструсы/диэструсы менялось с возрастом от 1/1,6 до 1/0,7 в сторону
преобладания стадии эструса. В группе животных, получавших мелатонин, соотношение стадий
эструсы/диэструсы менялось с возрастом от 1/1,6 до 1/1,3. Таким образом, колебания
соотношения фаз эстрального цикла у разновозрастных крыс становились менее выраженными
под воздействием мелатонина. Применение гормона пинеальной железы у животных,
находившихся в условиях постоянного освещения, улучшало все исследуемые показатели
эстрального цикла, замедляя тем самым развитие возрастных изменений. Достоверное (p<0,05)
увеличение продолжительности эстрального цикла у животных, получавших мелатонин,
наблюдалось лишь в 20-месячном возрасте, при этом длинные эстральные циклы появлялись,
а короткие исчезали, когда животные достигали возраста 14 мес.
У крыс, получавших эпиталон в условиях постоянного освещения, соотношение фаз
эстрального цикла подвергалось наименьшему колебанию – от 1/1,6 у молодых животных
до 1/1,4 у старых. Короткие циклы сохранялись до 14-месячного возраста, в этом же возрасте
появлялись длинные эстральные циклы. Продолжительность эстрального цикла достоверно
(p<0,05) увеличивалась только к 17-месячному возрасту. В отличие от контрольной группы,
у крыс, получавших препараты, эстральные циклы средней продолжительности сохранялись
даже в 23-месячном возрасте, тогда как в контрольной группе к 2-летнему возрасту у всех самок
наблюдались только длинные эстральные циклы.
Иррегулярные циклы в контрольной группе животных появлялись уже в возрасте 5 мес.,
тогда как иррегулярные циклы в экспериментальных группах появлялись намного позднее –
в возрасте 11 мес. (рисунок 26). В этом возрасте иррегулярные циклы встречались с частотой
всего 20% и 10% в экспериментальных группах против 42% в контрольной группе.
В 20-месячном возрасте различия между группами становились все более значимыми,
и значения, полученные в группах животных, получавших препараты, достоверно (p<0,01)
отличались от таковых в контрольной группе.
Согласно полученным нами данным, постоянное освещение способствует ускоренному
старению репродуктивной системы, о чем свидетельствует тот факт, что нарушения эстрального
цикла у крыс в условиях постоянного освещения наступают в более раннем возрасте
по сравнению с животными, находившимися в условиях стандартного фиксированного
освещения.
Как показывают результаты данного исследования, применение мелатонина и эпиталона
при любом световом режиме замедляло в той или иной степени развитие возрастных изменений
эстрального цикла. Короткие эстральные циклы сохранялись до более зрелого возраста,
а длинные эстральные циклы и иррегулярные циклы появлялись позже, чем в контрольных
группах животных, причем наибольшее влияние на эстральный цикл препараты оказывали
в условиях постоянного освещения, то есть при световом режиме с нарушенным
41
80
70
70
*
60
50
% 40
*
42
40
*
30
20
10
8
*
контроль
мелатонин
эпиталон
*
20
*
50
*
*
10
*0 *0
*
0
5
11
20
возраст,мес.
* – различия с показателем в контрольной группе в том же возрасте достоверны
(p<0,01; 2-тест)
Рисунок 26 – Количество иррегулярных циклов у самок крыс,
получавших мелатонин и эпиталон, при постоянном освещении
(%, n=6)
фотопериодизмом, что, возможно, связано с катехоламинергическим звеном регуляции
эстральных циклов.
Полученные нами результаты представляют еще одно доказательство важной роли
пинеальной железы в формировании циркадианного сигнала, необходимого для реализации
преовуляторного пика секреции гонадолиберина, и указывают на защитное действие
мелатонина и эпиталона, проявляющееся в способности сглаживать неблагоприятные
экологические воздействия на репродуктивную функцию молодого, зрелого и стареющего
женского организма.
1.
2.
3.
ВЫВОДЫ
У самок крыс в структурах гипоталамуса, ответственных за регуляцию синтеза и секреции
гонадолиберина, обнаружены суточные ритмы содержания биогенных аминов.
В медиальной преоптической области наблюдается не зависящий от стадии эстрального
цикла суточный ритм содержания норадреналина с выраженным снижением его уровня
в узком временном интервале с 9:30 часов до 11 часов циркадианного времени. Суточный
ритм содержания дофамина характерен для срединного возвышения с аркуатными ядрами,
причем он не зависит от стадии эстрального цикла и характеризуется повышением уровня
содержания нейромедиатора. Содержание норадреналина в срединном возвышении
с аркуатными ядрами и дофамина в медиальной преоптической области зависит от стадии
эстрального цикла, определяемой уровнем половых гормонов в крови.
Суточный ритм содержания норадреналина в медиальной преоптической области,
в отличие от суточного ритма содержания дофамина в срединном возвышении
с аркуатными ядрами, сохраняется при световой депривации самок крыс и имеет
циркадианную природу.
При остром и хроническом воздействии на самок крыс нейротоксических ксенобиотиков
(1,2-диметилгидразин, толуол) происходит нарушение суточных ритмов содержания
42
4.
5.
6.
7.
8.
норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами. Введение животным 1,2-диметилгидразина вызывает
снижение среднесуточного содержания гонадолиберина в медиальной преоптической
области и, особенно, в срединном возвышении с аркуатными ядрами, сопровождающееся
снижением среднесуточного содержания норадреналина в медиальной преоптической
области и увеличением среднесуточного содержания дофамина в срединном возвышении
с аркуатными ядрами.
Пероральное введение L-метионина самкам крыс вызывает нарушение суточной динамики
содержания норадреналина в медиальной преоптической области и дофамина в срединном
возвышении с аркуатными ядрами. Метиониновая нагрузка также вызывает увеличение
среднесуточного содержания норадреналина в медиальной преоптической области.
В медиальной преоптической области обнаружены суточные изменения уровня генерации
активных форм кислорода, противоположные по направленности суточным ритмам
содержания биогенных аминов в той же структуре. Нарушение суточных ритмов
содержания биогенных аминов под воздействием нейротоксических ксенобиотиков
(1,2-диметилгидразин, толуол) сопровождается исчезновением суточной динамики
генерации активных форм кислорода. Метиониновая нагрузка вызывает повышение
уровня малонового диальдегида в крови и нарушает обнаруженную в ней суточную
динамику содержания нитритов.
При использовании пептидных биорегуляторов с целью коррекции нарушенных
под влиянием нейротоксических воздействий (1,2-диметилгидразин, метиониновая
нагрузка) суточных ритмов содержания биогенных аминов в гипоталамусе самок крыс
пинеалон и эпиталамин, восстанавливая нормальную суточную динамику содержания
норадреналина, наиболее эффективно действуют на уровне медиальной преоптической
области. Эпиталон оказывает протекторное действие в срединном возвышении
с аркуатными ядрами, сохраняя суточный ритм содержания дофамина. Мелатонин
восстанавливает нормальную суточную динамику содержания норадреналина и дофамина
в обеих гипоталамических структурах при воздействии 1,2-диметилгидразина,
но оказывается не столь эффективным при метиониновой нагрузке.
Начальные этапы угасания с возрастом репродуктивной функции самок крыс
сопровождаются постепенным исчезновением нормальной суточной динамики содержания
норадреналина в медиальной преоптической области на фоне сохранения среднесуточного
уровня этого нейромедиатора, снижение которого отмечается позднее, к 22-24 месяцам.
Снижение среднесуточного содержания дофамина в срединном возвышении с аркуатными
ядрами происходит раньше, уже в 13-14-месячном возрасте, одновременно с нарушением
суточного ритма содержания этого нейромедиатора.
Постоянное освещение способствует ускоренному старению репродуктивной системы
самок крыс: нарушения эстрального цикла у исследуемых животных в этих условиях
наступают в более раннем возрасте по сравнению с животными, находившимися
в условиях стандартного фиксированного освещения. Применение мелатонина и эпиталона
при любом световом режиме замедляет в той или иной степени развитие возрастных
изменений эстрального цикла, причем наибольшее влияние на эстральный цикл названные
биологически активные вещества оказывают в условиях постоянного освещения.
43
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Полученные результаты о протекторном действии мелатонина и пептидных
биорегуляторов (пинеалон, эпиталамин, эпиталон) при нарушении регуляции репродуктивных
циклов создают предпосылки использования данных соединений для коррекции возрастных
изменений репродуктивной функции, а также нарушений тонких механизмов регуляции
репродукции, вызванных различными нейротоксическими факторами и избыточным
освещением.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ
Керкешко, Г.О. Влияние мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной
функции крыс при хроническом воздействии ксенобиотиков / Г.О.Керкешко.,
М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, В.М.Прокопенко, А.В.Арутюнян // Нейрохимия. – 2001. –
Т. 18, №1. – С. 84-91.
Арутюнян, А.В. Нейротропные эффекты канцерогена 1,2-диметилгидразина: нарушение
суточных ритмов гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс /
А.В.Арутюнян,
Г.О.Керкешко,
В.Н.Анисимов,
М.Г.Степанов, В.М.Прокопенко,
Н.В.Поздеев, А.В.Кореневский // Нейрохимия. – 2001. – Т. 18, №3. – С. 234-241.
Арутюнян, А.В. Роль биогенных аминов в гипоталамической регуляции репродуктивной
функции / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, Э.К.Айламазян
// Журнал акушерства и женских болезней. – 2004. – Т. 53, №1. – С. 98-106.
Арутюнян, А.В. Роль биогенных аминов в гипоталамической регуляции репродуктивной
функции / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, М.Г.Степанов, А.В.Кореневский, Э.К.Айламазян
// Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2004. – Т. 3, №1. –
С. 15-23.
Арутюнян, А.В. Экспериментальное изучение механизмов нарушений гипоталамической
регуляции репродуктивной функции / А.В.Арутюнян, Г.О.Керкешко, М.Г.Степанов,
А.В.Кореневский, Э.К.Айламазян // Журнал акушерства и женских болезней. – 2005. –
Т. 54, №1. – С. 57-63.
Кореневский, А.В. О взаимосвязи циркадианных и овариальных циклов
в гипоталамической регуляции репродукции (экспериментальное исследование) /
А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина, М.Г.Степанов, Г.О.Керкешко, А.В.Арутюнян // Журнал
акушерства и женских болезней. – 2007. – Т. 56, №4. – С. 24-30.
Милютина, Ю.П. Воздействие мелатонина и пептидов эпифиза на катехоламинергическое
звено гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс / Ю.П.Милютина,
А.В.Кореневский, М.Г.Степанов, А.В.Арутюнян // Нейрохимия. – 2010. – Т. 27, №3. –
С. 221-229. (Milyutina, Yu.P. Effects of melatonin and epiphysis peptides on the catecholamine
link of hypothalamic regulation of the reproductive function of rats / Yu.P.Milyutina,
A.V.Korenevskii, M.G.Stepanov, A.V.Arutyunyan // Neurochemical Journal. – 2010. – Vol. 4,
No. 3. – P. 196-203.)
Разыграев, А.В. Динамика содержания катехоламинов в гипоталамических структурах
самок крыс в преовуляторный период / А.В.Разыграев, Ю.П.Милютина, А.В.Кореневский,
И.В.Залозняя, М.Г.Степанов, А.В.Пустыгина, А.В.Арутюнян // Журнал акушерства
и женских болезней. – 2010. – Т. 59, №4. – С. 76-80.
44
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Арутюнян,
А.В.
Использование
различных
экспериментальных
моделей
гипергомоцистеинемии
в
нейрохимических
исследованиях
/
А.В.Арутюнян,
Ю.П.Милютина, И.В.Залозняя, А.В.Пустыгина, Л.С.Козина, А.В.Кореневский //
Нейрохимия. – 2012. – Т. 29, №1. – С. 83-88. (Arutyunyan, A.V. The use of different
experimental models of hyperhomocysteinemia in neurochemical studies / A.V.Arutyunyan,
Yu.P.Milyutina, I.V.Zaloznyaya, A.V.Pustygina, L.S.Kozina, A.V.Korenevskii // Neurochemical
Journal. – 2012. – Vol. 6, No. 1. – P. 71-76.)
Милютина, Ю.П. Влияние гипергомоцистеинемии на катехоламинергическое звено
гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс / Ю.П.Милютина,
А.В.Кореневский,
М.Г.Степанов,
А.В.Пустыгина,
Т.И.Опарина,
И.В.Залозняя,
А.В.Арутюнян // Журнал акушерства и женских болезней. – 2012. – Т. 61, №1. – С. 41-46.
Кореневский, А.В. Защитное влияние мелатонина и эпиталона на гипоталамическую
регуляцию репродуктивной функции самок крыс в модели ее преждевременного старения
и на эстральные циклы стареющих животных при разных режимах освещения /
А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина, А.В.Букалев, Ю.П.Баранова, И.А.Виноградова,
А.В.Арутюнян // Успехи геронтологии. – 2013. – Т. 26, №2. – С. 263-274.
Арутюнян, А.В. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивных
циклов и их коррекция / А.В.Арутюнян, А.В.Кореневский // Успехи геронтологии. – 2014.
– Т. 27, №2. – С. 275-283.
Кореневский,
А.В.
Пинеалон
восстанавливает
нарушенный
в
результате
гипергомоцистеинемии суточный ритм содержания норадреналина в гипоталамусе самок
крыс / А.В.Кореневский, А.В.Арутюнян, Ю.П.Милютина, И.В.Залозняя, Л.С.Козина //
Нейрохимия. – 2014. – Т. 31, №3. – С. 236-239. (Korenevskii, A.V. Pinealon corrects
hyperhomocysteinemia-induced disturbances of the diurnal dynamics of hypothalamic
norepinephrine content in female rats / A.V.Korenevskii, A.V.Arutyunyan, Yu.P.Milyutina,
I.V.Zaloznyaya, L.S.Kozina // Neurochemical Journal. – 2014. – Vol. 8, No. 3. – P. 205-207.)
Статьи в других журналах/сборниках статей
Arutjunyan, A.V. Disturbances of diurnal rhythms of biogenic amines contents in hypothalamic
nuclei as an evidence of neurotropic effects of enterotropic carcinogen 1,2-dimethylhydrazine /
A.V.Arutjunyan,
G.O.Kerkeshko,
V.N.Anisimov,
M.G.Stepanov,
V.M.Prokopenko,
N.V.Pozdeyev, A.V.Korenevsky // Neuroendocrinology Letters. – 2001. – Vol. 22. – P. 229-237.
Арутюнян, А.В. Циркадианные ритмы биогенных аминов, участвующих в регуляции
репродукции / А.В.Арутюнян, М.Г.Степанов, Г.О.Керкешко, А.В.Кореневский,
Э.К.Айламазян // Мат. межд. симп. «Молекулярные механизмы регуляции функции
клетки». – Тюмень, 2005. – С. 216-219.
Korenevsky, A.V. On the interrelationship between circadian and ovarian cycles in hypothalamic
regulation of reproduction (experimental study) / A.V.Korenevsky, Yu.P.Milyutina,
M.G.Stepanov, G.O.Kerkeshko, A.V.Arutjunyan // J. Envir. Neurosci. Biomed. – 2008. – Vol. 2.
– P. 220-229.
Arutjunyan, A. Melatonin and pineal gland peptides are able to correct the impairment
of reproductive cycles in rats / A.Arutjunyan, L.Kozina, Yu.Milyutina, A.Korenevsky,
M.Stepanov, V.Arutyunov // Current Aging Science. – 2012. – Vol. 5, No. 3. – P. 178-185.
45
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Кореневский, А.В. Суточные ритмы биогенных аминов в гипоталамусе самок крыс
в экспериментальной модели преждевременного старения репродуктивной функции,
вызванного введением канцерогена 1,2-диметилгидразина, и их коррекция мелатонином
и пептидными препаратами пинеальной железы / А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина,
И.В.Залозняя, Г.О.Керкешко, А.В.Арутюнян // Сб. науч. трудов II Рос. симп. с междун.
участием «Световой режим, старение и рак». – Петрозаводск, 2013. – С. 165-174.
Korenevsky, A.V. The protective effect of melatonin and epithalon on hypothalamic regulation
of the reproductive function in female rats in a model of its premature aging and on the estrous
cycles of aging animals in different lighting conditions / A.V.Korenevsky, Yu.P.Milyutina,
A.V.Bukalyov, Yu.P.Baranova, I.A.Vinogradova, A.V.Arutjunyan // Advances in Gerontology. –
2014. – Vol. 4, No. 1. – P. 67-77.
Главы в руководстве
Korenevsky, A.V. Circadian and diurnal rhythms of catecholamines in hypothalamic areas
responsible for regulation of reproduction in female rats are disturbed by neurotoxicants
and corrected by melatonin / A.V.Korenevsky, Yu.P.Milyutina, M.G.Stepanov, A.V.Arutjunyan,
L.S.Kozina // L.Golovkin, A.Maliszkewicz (Eds.) Circadian Rhythms: Biology, Cognition
and Disorders. – N.Y.: Nova Science Publishers, 2012. – P. 187-208.
Основные тезисы докладов
Kerkeshko, G.O. Neurotropic xenobiotics and melatonin effect on reactive oxygen species
formation and catecholamines contents in the preoptic area of hypothalamus in rats /
G.O.Kerkeshko, V.M.Prokopenko, M.G.Stepanov, A.V.Korenevsky, A.V.Arutjunyan // Physiol.
Res. – 2003. – Vol. 52. – 7P.
Korenevsky, A.V. The effect of neurotoxic xenobiotics and exogeneous melatonin on diurnal
rhythms of biogenic amines in hypothalamic structures responsible for LH-RH secretion /
A.V.Korenevsky, G.O.Kerkeshko, M.G.Stepanov, A.V.Arutjunyan // 54. Mosbacher
Kolloquium. The rhythm of life: molecular mechanisms of circadian clocks: Abst. – 2003. –
P. 37.
Arutjunyan, A.V. Circadian rhythms of biogenic amines responsible for regulation
of reproduction in hypothalamus / A.V.Arutjunyan, M.G.Stepanov, G.O.Kerkeshko,
A.V.Korenevsky, L.S.Kozina // J. Neurochem. – 2005. – Vol. 94 (Suppl. 2.) – P. 172.
Milyutina, Yu.P. The role of melatonin and peptide preparations from the pineal gland
in preventing disturbances of the hypothalamic regulation of reproduction in female rats /
Yu.P.Milyutina, A.V.Korenevsky, M.G.Stepanov, A.V.Arutjunyan // Adv. Gerontol. – 2007. –
Vol. 20, No. 3. – P. 56.
Разыграев, А.В. Влияние 1,2-диметилгидразина и биологически активных соединений
эпифиза на активность моноаминооксидазы в медиальной преоптической области
гипоталамуса самок крыс / А.В.Разыграев, Ю.П.Милютина, М.Г.Степанов,
А.В.Кореневский, В.М.Прокопенко, А.В.Арутюнян // Вестник Российской военномедицинской академии (приложение 2, часть I). – 2008. – №3. – С. 91-92.
Кореневский, А.В. Нарушение суточных ритмов катехоламинов, регулирующих
репродуктивную функцию самок крыс, под влиянием нейротоксикантов и их коррекция
с помощью мелатонина и пептидных препаратов пинеальной железы / А.В.Кореневский,
46
27.
28.
29.
30.
31.
32.
Ю.П.Милютина, М.Г.Степанов, Г.О.Керкешко, И.В.Залозняя // Мат. VIII Всерос. конф.
с междун. участием, посвященной 220-летию со дня рождения акад. К.М.Бэра,
«Механизмы функционирования висцеральных систем». – Санкт-Петербург, 2012. –
С. 113-114.
Arutjunyan, А. Mechanisms of prenatal hyperhomocysteinemia neurotoxicity: the effect
on the offspring / A.Arutjunyan, L.Kozina, Yu.Milyutina, A.Korenevsky // FEBS Journal. –
2013. – Vol. 280 (Suppl. 1). – P. 347.
Милютина, Ю.П. Нарушение центральных механизмов регуляции репродуктивной
функции при гипергомоцистеинемии / Ю.П.Милютина, А.В.Кореневский, М.Г.Степанов,
А.В.Пустыгина, Т.И.Опарина, А.В.Арутюнян // Мат. ХХII Съезда Физиологического
общества им. И.П. Павлова. Волгоград, 2013.
Арутюнян, А.В. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивных
циклов и их коррекция / А.В.Арутюнян, А.В.Кореневский // Успехи геронтологии. – 2014.
– Т. 27, №2 (приложение). – С. 21.
Кореневский, А.В. Протекторное влияние мелатонина и пептидного препарата эпиталона
на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции самок крыс и на эстральные
циклы стареющих животных при разных режимах освещения / А.В.Кореневский,
Ю.П.Милютина,
М.Г.Степанов,
А.В.Арутюнян,
А.В.Букалев,
Ю.П.Баранова,
В.А.Арутюнов, И.А.Виноградова // Успехи геронтологии. – 2014. – Т. 27, №2
(приложение). – С. 42.
Кореневский, А.В. Коррекция пинеалоном нарушенного в условиях экспериментальной
гипергомоцистеинемии суточного ритма содержания норадреналина в гипоталамусе самок
крыс / А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина, И.В.Залозняя, М.Г.Степанов, А.В.Арутюнян //
Тез. докл. Всерос. конф. с междун. участием «Нейрохимические механизмы формирования
адаптивных и патологических состояний мозга». – Санкт-Петербург–Колтуши, 2014. –
С. 76.
Арутюнян, А.В. Роль мелатонина и пептидов пинеальной железы в регуляции
репродуктивных циклов / А.В.Арутюнян, А.В.Кореневский, Ю.П.Милютина, Л.С.Козина //
Науч. труды IV съезда физиологов СНГ. Сочи–Дагомыс, 2014. – С. 160.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДА
ДМГ
МПО
НА
5-ОИУК
5-ОТ
ПДК
СБ
СВ-Арк
СХЯ
ЦВ
дофамин
1,2-диметилгидразин
медиальная преоптическая область
норадреналин
5-оксииндолилуксусная кислота
5-окситриптамин, серотонин
предельно допустимая концентрация
серый бугор
срединное возвышение с аркуатными ядрами
супрахиазматические ядра
циркадианное время
47
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Анисимов В.Н., Виноградова И.А. Старение женской репродуктивной системы и мелатонин. – СПб.: Система. – 2008. – 44 с.;
Анисимов В.Н., Забежинский М.А., Попович И.Г. Мелатонин угнетает канцерогенез толстой кишки, индуцируемый
1,2-диметилгидразином у крыс: эффекты и возможные механизмы // Вопр. онкол. – 2000. – Т. 46, №2. – С. 136-148;
Арутюнян А.В. и др. Нейротропные эффекты канцерогена 1,2-диметилгидразина: нарушение суточных ритмов
гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс // Нейрохимия. – 2001. – Т. 18, №3. – С. 234-241; Арутюнян А.В.,
Степанов М.Г., Айламазян Э.К. Нарушение гипоталамической регуляции репродуктивной функции при воздействии
нейротоксических соединений и мелатонина // Журн. акуш. и женск. бол. – 2003. – Т. 52, №2. – С. 77-85; Арутюнян А.В.
и др. Экспериментальное изучение механизмов нарушений гипоталамической регуляции репродуктивной функции // Журн.
акуш. и женск. бол. – 2005. – Т. 54, №1. – С. 57-63; Арутюнян А.В. и др. Использование различных экспериментальных моделей
гипергомоцистеинемии в нейрохимических исследованиях // Нейрохимия. – 2012. – Т. 29, №1. – С. 83-88; Арутюнян А.В.,
Кореневский А.В. Возрастные нарушения гипоталамической регуляции репродуктивных циклов и их коррекция // Успехи
геронтол. – 2014. – Т. 27, №2. – С. 275-283; Губский Ю.И., Долго-Сабуров В.Б., Храпак В.В. Химические катастрофы
и экология. – Киев: Здоровья, 1993. – 220 с.; Зорилова И.В. и др. Наследственно обусловленная гипергомоцистеинемия
в патогенезе ишемического инсульта у лиц молодого возраста // Неврологический журнал. – 2005. –Т. 10, №2. – С. 14-18;
Керкешко Г.О. и др. Влияние мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции крыс при хроническом
воздействии ксенобиотиков // Нейрохимия. – 2001. – Т. 18, №1. – С. 84-91; Кореневский А.В. и др. Защитное влияние
мелатонина и эпиталона на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции самок крыс в модели ее преждевременного
старения и на эстральные циклы стареющих животных при разных режимах освещения // Успехи геронтол. – 2013. – Т. 26, №2. –
С. 263-274; Коркушко О.В., Хавинсон В.Х., Шатило В.Б. Пинеальная железа: пути коррекции при старении. – СПб.: Наука,
2006. – 204 с.; Лихачев А.Я. Молекулярно-биологические основы тканеспецифического канцерогенного действия
диметилгидразина // Экспер. онкол. – 1980. – Т. 2, №6. – С. 3-7; Милютина Ю.П. и др. Воздействие мелатонина и пептидов
эпифиза на катехоламинергическое звено гипоталамической регуляции репродуктивной функции крыс // Нейрохимия. – 2010. –
Т. 27, №3. – С. 221-229; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального
и клинического изучения). – СПб.: Наука, 1996. – 74 с.; Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. – СПб.: Лань, 2001. –
464 с.; Угрюмов М.В. Механизмы нейроэндокринной регуляции. – М.: Наука, 1998. – 236 с.; Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н.
Пептидные биорегуляторы и старение. – СПб.: Наука, 2003. – 223 с.; Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса
в регуляции старения. – СПб.: Фолиант, 2001. – 160 с.; Хавинсон В.Х. Способ получения пептидов, обладающих
тканеспецифической активностью, и фармацевтические композиции на их основе // Патент РФ №2161501. – 2001;
Чернышева М.П. Временная структура биосистем и биологическое время. – СПб.: Написано пером, 2014. – 189 с.; Arendt J.
Melatonin: characteristics, concerns, and prospects // J. Biol. Rhythms. – 2005. – Vol. 20, No. 4. – P. 291-303; Arutjunyan A.V. et al.
Disturbances of diurnal rhythms of biogenic amines contents in hypothalamic nuclei as an evidence of neurotropic effects of enterotropic
carcinogen 1,2-dimethylhydrazine // Neuroendocrinol. Lett. – 2001. – Vol. 22, No. 4. – P. 229-237; Arutjunyan A. et al. Pinealon protects
the rat offspring from prenetal hyperhomocysteinemia // Int. J. Clin. Exp. Med. – 2012. – Vol. 5, No. 2. – P. 179-185; Arutjunyan A.
et al. Melatonin and pineal gland peptides are able to correct the impairment of reproductive cycles in rats // Curr. Aging Sci. – 2012а. –
Vol. 5, No. 3. – P. 178-185; Bullough J.D., Rea M.S., Figueiro M.G. Of mice and women: light as a circadian stimulus in breast cancer
research // Cancer Causes Control. – 2006. – Vol. 17, No. 4. – P. 375-383; Butler M.P., Kriegsfeld L.J., Silver R. Circadian regulation
of endocrine functions // Pfaff D.W., Arnold A.P., Fahrbach S.E., Etgen A.M., Rubin R.T. (Eds.) Hormones, Brain and Behavior (second
edition). – San Diego: Academic Press, 2009. – 4393 p. – P. 473-507; Cagampang F.R., Okamura H., Inouye S. Circadian rhythms
of norepinephrine in the rat suprachiasmatic nucleus // Neurosci. Lett. – 1994. – Vol. 173, No. 1-2. – P. 185-188; Chappell P.E. Clocks
and the black box: circadian influences on gonadotropin-releasing hormone secretion // J. Neuroendocrinol. – 2005. – Vol. 17, No. 2. –
P. 119-130; Goldman J.M. et al. Suppression of the steroid-primed luteinizing hormone surge in the female rat by sodium
dimethyldithiocarbamate: relationship to hypothalamic catecholamines and GnRH neuronal activation // Toxicol. Sci. – 2008. – Vol. 104,
No. 1. – P. 107-112; Jamali K.A., Tramu G. Control of rat hypothalamic pro-opiomelanocortin neurons by a circadian clock that is
entrained by the daily light-off signal // Neuroscience. – 1999. –Vol. 93, No. 3. – P. 1051-1061; Korenevsky A.V. et al. Circadian
and diurnal rhythms of catecholamines in hypothalamic areas responsible for regulation of reproduction in female rats are disturbed
by neurotoxicants and corrected by melatonin // Golovkin L., Maliszkewicz A. (Eds.) Circadian Rhythms: Biology, Cognition
and Disorders. – New York: Nova Science Publishers, 2012. – 396 p. – P. 187-208; Marcondes F.K., Bianchi F.J., Tanno A.P.
Determination of the estrous cycle phases of rats: some helpful considerations // Braz. J. Biol. – 2002. – V. 62, No.4a. – P. 609-614;
Miller J.W. Folic Acid // Caballero B. (Ed.) Encyclopedia of Human Nutrition (third edition). – Academic Press, 2013. – 2190 p. –
P. 262-269; Palm I.F. et al. The stimulatory effect of vasopressin on the luteinizing hormone surge in ovariectomized, estradiol-treated
rats is time-dependent // Brain Res. – 2001. – Vol. 901, No. 1-2. – P. 109-116; Pierpaoli W., Maestroni G.J. Melatonin: a principal
neuroimmunoregulatory and anti-stress hormone: its anti-aging effects // Immunol. Lett. – 1987. – Vol. 16, No. 3-4. – P. 355-361;
Sellix M.T. et al. Ovarian steroid hormones modulate circadian rhythms of neuroendocrine dopaminergic neuronal activity // Brain Res. –
2004. – Vol. 1005, No. 1-2. – P. 164-168; Vera J.C. Measurement of microgram quantities of protein by a generally applicable
turbidimetric procedure // Analyt. Biochem. – 1988. – Vol. 174, No. 1. – P. 187-196; Wise P.M. et al. Aging of the female reproductive
system: a window into brain aging // Recent Prog. Horm. Res. – 1997. – Vol. 52. – P. 279-303; Yap S. Classical homocystinuria: vascular
risk and its prevention // J. Inherit. Metab. Dis. – 2003. – Vol. 26, No. 2-3. – P. 259-265.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа