close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ И РАЗРАБОТКА АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО И ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Макарова Алёна Сергеевна
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ
И РАЗРАБОТКА АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ
ЭВКАЛИПТА ПРУТОВИДНОГО, ШАЛФЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО
И ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата фармацевтических наук
Самара - 2015
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Казанский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской
Федерации
Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Хазиев Рамиль
Шамилевич
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Мусина Линара
Табрисовна
Официальные оппоненты:
Ханина Миниса Абдуллаевна, доктор фармацевтических наук, профессор,
государственное образовательное учреждение высшего образования Московской
области «Московский государственный областной гуманитарный институт»,
кафедра химии, и.о. заведующей кафедры
Сысоева Мария Александровна, доктор химических наук, профессор;
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Казанский национальный исследовательский
технологический университет», кафедра пищевой биотехнологии, заведующая
кафедрой
Ведущая организация:
государственное
бюджетное
образовательное
учреждение
высшего
профессионального образования «Сибирский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Томск
Защита состоится « » _________ 2015 года в __ часов на заседании
диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Самарский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (443079, г. Самара пр. К.Маркса, 165 Б).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке (443001, г. Самара, ул.
Арцыбушевская, 171) и на сайте (httр://www.samsmu.ru/science/referats)
государственного
бюджетного
образовательного
учреждения
высшего
профессионального образования «Самарский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Автореферат разослан «___» __________2015 года
Учёный секретарь диссертационного совета
кандидат фармацевтических наук,
доцент
2
Петрухина Ирина Константиновна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Эфиромасличные и флавоноидсодержащие растения
составляют основной массив наиболее популярных и широко используемых
лекарственных растений (ЛР). Интенсивное изучение химического состава этих
ЛР привело к открытию в них новых групп природных соединений,
ответственных за те или иные виды биологической активности. К таким ЛР
относятся широко применяемые в медицинской практике эфиромасличные
растения: виды эвкалиптов (в РФ основной используемый вид –
Eucalyptus viminalis Labill.) и шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.).
Открытие японскими учеными в начале 80- х годов прошлого века в
Eucalyptus globulus L., соединений, названных эуглобалями, дало начало
интенсивному изучению этой новой группы природных соединений из класса
терпеноидных фенолальдегидов. В шалфее лекарственном были открыты
биологически активные вещества (БАВ) – дитерпеновые кислоты и производные
розмариновой кислоты. Описанные соединения проявляют различные виды
биологической активности, в том числе и антибактериальную в отношении
грамположительной микрофлоры.
В РФ официнальными являются два вида зверобоя – зверобой
продырявленный (Hypericum perforatum L.) и зверобой пятнистый
(четырехгранный) (Hypericum maculatum Crantz.) [Киселева Т.Л. и др., 2008;
Самылина И.А. и др., 2003; 2010]. Их действующим началом в отечественной
практике признаются флавоноиды, по содержанию которых осуществляется
стандартизация сырья. С другой стороны, именно отечественным ученым
принадлежит приоритет открытия в зверобое продырявленном гиперфорина и его
производных (особого класса ацилфлороглюцинов), проявляющих высокую
антибактериальную активность.
Согласно существующей в настоящее время для указанных видов сырья
нормативной документации (НД) только для листьев эвкалипта прутовидного
предусмотрена стандартизация по фенолальдегидам. Оценка качества листьев
шалфея и травы зверобоя не предусматривает определение целевых веществ –
носителей антибактериальной активности. В связи с этим изыскание новых
подходов к стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея
лекарственного и травы зверобоя продырявленного является актуальным
исследованием с точки зрения усовершенствования оценки качества сырья по
целевым компонентам (носителям антибактериальной активности).
В
разные
годы
отечественными
учёными
были
разработаны
антибактериальные препараты на основе листьев эвкалипта («Эвкалимин»,
«Хлорофиллипт», «Галенофиллипт»), листьев шалфея («Сальвин») и травы
зверобоя продырявленного («Новоиманин»). Однако стандартизация большей
части из них не предполагала оценку содержания действующих веществ,
отвечающих за антибактериальную активность. Стандартизация проводилась по
антибактериальному титру в отношении золотистого стафилококка. К сожалению,
большинство из упомянутых выше растительных антибактериальных препаратов
в настоящее время на рынке отсутствуют. На фармацевтическом рынке РФ
3
представлены и занимают устойчивое положение только антибактериальные
препараты из листьев эвкалипта прутовидного («Хлорофиллипт» и его аналоги),
поэтому расширение исследований по разработке усовершенствованных
антибактериальных препаратов на основе указанных видов сырья является
современной и назревшей задачей.
Степень разработанности темы. Поиск в химическом составе
лекарственного растительного сырья (ЛРС) соединений с антибактериальной
активностью занимает важное место в современной науке, о чём свидетельствует
большой объём публикаций в специализированных научных журналах. В
изучении терпеноидных фенолальдегидов листьев эвкалипта (основных
носителей антибактериальной активности сырья) выделяются группы японских
исследователей (T.Masuda, J.P. Singh, M. Мurata и др.). Изучением
фенолальдегидов в СССР занималась группа исследователей ВИЛАРа под
руководством А.А. Савиной. Разработке препаратов антимикробного действия на
основе листьев эвкалипта посвящены работы Н.М. Крутиковой, В.Л. Надтока,
И.Н. Зилфикарова. Антибактериальный препарат на основе листьев шалфея
лекарственного был разработан научной группой под руководством
И.А. Дербенцевой; впервые было показано, что ответственными за
антимикробную активность сырья являются дитерпеновые кислоты (кислота
карнозоловая). Вопросами стандартизации листьев шалфея лекарственного, а
также разработке препаратов на их основе с контролируемыми показателями
качества активно занимаются в ЗАО «Вифитех» под руководством
И.Н. Зилфикарова. В результате исследования антимикробных веществ
зверобоя продырявленного
группой
научных
сотрудников
Института
микробиологии АН УССР В.Г. Дроботько, Б.Е. Айзенман, П.И. Киселем,
М.О. Швейгер и С.И. Зелепухой был изучен и внедрен в медицинскую практику
антимикробный препарат иманин (гиперфорин и его производные). Изучением
антимикробных свойств препаратов на основе травы зверобоя продырявленного
занимались С.И. Зелепуха, Н.А. Дербенцева, А.С. Рабинович и другие. Однако,
несмотря на многолетний опыт исследований в области изучения описанных
видов ЛРС, задачи по стандартизации сырья и получению усовершенствованных
препаратов на его основе решены не в полной мере.
Цель диссертационного исследования. Целью настоящего исследования
является совершенствование методов определения групп соединений,
обладающих антибактериальной активностью, в листьях эвкалипта прутовидного,
шалфея лекарственного и траве зверобоя продырявленного и их выделения для
получения антибактериальных препаратов.
Задачи исследования. При достижении поставленной цели необходимо
было решить следующие задачи:
1. Провести аналитический обзор данных литературы по современному
состоянию исследований в области анализа листьев эвкалипта прутовидного,
шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного и методов
стандартизации лекарственных препаратов, разработанных на их основе.
4
2. Разработать методы стандартизации листьев эвкалипта прутовидного, шалфея
лекарственного и травы зверобоя продырявленного с позиций определения
основной группы БАВ, отвечающей за антибактериальную активность.
3. Оценить уровень антибактериальной активности извлечений из листьев
эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя
продырявленного в отношении грамположительных микроорганизмов (на
примере
S. aureus)
для
изучения
возможности
получения
новых
антибактериальных препаратов.
4. Разработать оптимальные условия экстракции БАВ, отвечающих за
антибактериальную активность, из изучаемых видов ЛРС.
5. Предложить методы анализа полученных препаратов с антибактериальной
активностью.
6. Изучить возможность комплексной переработки ЛРС, обладающего
антибактериальным действием.
Научная новизна. Была показана возможность целевой экстракции
действующих веществ эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного, зверобоя
продырявленного липофильными растворителями.
Впервые для интерпретации экспериментальных данных, полученных при
экстракции дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного, была
сформулирована математическая модель взаимодействия целевых соединений с
внутриклеточными структурами сырья. В результате апробации модели показано,
что общая схема экстрагирования может быть сведена к рассмотрению
«свободной» и «связанной» фракций целевых соединений.
Впервые обоснована целесообразность проведения стандартизации листьев
шалфея по двум группам природных соединений – дитерпеновым и
гидроксикоричным кислотам.
На основании целевой экстракции действующих веществ разработаны
спектрофотометрические
методики
стандартизации
листьев
эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя продырявленного.
Предложен рациональный способ получения антибактериального препарата
из листьев эвкалипта прутовидного на основе целевой экстракции
фенолальдегидов, активного в отношении грамположительных микроорганизмов,
в том числе и антибиотикорезистентных штаммов золотистого стафилококка.
Подана заявка на изобретение (№ заявки 2014139368/15, дата подачи
заявки: 29.09.2014). Разработаны методы стандартизации препарата по
конкретной группе БАВ, отвечающей за антибактериальную активность –
фенолальдегидам.
Впервые в рамках изучения возможности комплексного использования травы
зверобоя продырявленного предложена схема переработки сырья, включающая в
себя две основные стадии: первая – получение антибактериального препарата из
травы зверобоя продырявленного на основе целевой экстракции производных
гиперфорина; вторая – получение из оставшегося шрота настойки, содержащей
соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).
5
Практическая значимость. Разработанные методы стандартизации листьев
эвкалипта прутовидного (по терпеноидным фенолальдегидам), шалфея
лекарственного (по дитерпеновым кислотам) и травы зверобоя продырявленного
(по производным гиперфорина) используются в учебном процессе на кафедре
фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и
ботаники ГБОУ ВПО «КГМУ» при изучении подходов к стандартизации
указанных ЛР (акт внедрения ГБОУ ВПО «КГМУ» от 20.02.2015), апробированы
в процессе работы Казанского филиала ФГБУ «Информационно-методического
центра по экспертизе, учёту и анализу обращения средств медицинского
применения» Росздравнадзора (акт внедрения от 20.02.2015) и предприятия
ОАО «Татхимфармпрепараты» (акт внедрения от 26.02.2015).
Предложен способ получения антибактериального препарата на основе
листьев эвкалипта прутовидного, показатели качества и методы их оценки.
Установлен уровень антибактериальной активности препарата, превосходящий
таковую у растительных препаратов – «Хлорофиллипт», «Галенофиллипт».
Научно-исследовательский проект «Разработка антибактериального препарата на
основе листьев эвкалипта прутовидного» был отмечен Венчурным фондом РТ в
рамках проводимого конкурса «50 инновационных идей для РТ» как
перспективный для решения проблемы эффективной и рациональной
антибактериальной терапии инфекционных заболеваний, особенно заболеваний,
индуцированных микрофлорой, резистентной к большинству часто применяемых
антибактериальных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследований по разработке методов стандартизации листьев
эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя
продырявленного по основным группам БАВ, отвечающих за антибактериальную
активность.
2. Математическая модель экстрагирования дитерпеновых кислот из листьев
шалфея лекарственного.
3. Экспериментальные данные по разработке препаратов на основе изучаемых
видов ЛРС при рассмотрении фенолальдегидов (листья эвкалипта прутовидного),
дитерпеновых и гидроксикоричных кислот (листья шалфея лекарственного) и
производных гиперфорина (трава зверобоя продырявленного) в качестве
основных веществ, ответственных за антибактериальную активность.
4. Методы, используемые для стандартизации антибактериальных препаратов из
листьев эвкалипта прутовидного и травы зверобоя продырявленного.
5. Результаты по оценке антибактериальной активности препарата из листьев
эвкалипта прутовидного в отношении штаммов S. aureus, в том числе
антибиотикоустойчивых.
6. Схема комплексной переработки травы зверобоя продырявленного.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на 86-ой
Всероссийской студенческой научной конференции памяти чл-корр. Академии
наук РТ, проф. И.Г. Салихова (Казань, 23-24 апреля 2012 г.); 87-ой Всероссийской
научно-практической конференции студентов и молодых учёных, посвящённой
155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013); 88-ой
6
Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных,
посвящённой 200-летию КГМУ (Казань, 26-27 марта 2014); Российской научнопрактической конференции «Актуальные вопросы повышения качества
подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 25 марта 2013 г.); Российской
научно-практической конференции «Эффективная аптека – новые технологии и
возможности для провизоров и фармацевтов, руководителей и менеджеров аптек
и розничных сетей» (Казань, 19 марта 2014 г.).
Научно-исследовательский
проект
«Разработка
антибактериального
препарата из листьев эвкалипта прутовидного» стал победителем конкурса
«50 инновационных идей для РТ» (Казань, 2014), финалистом «Молодёжного
научно-инновационного конкурса» Фонда содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере (Казань, 2014).
Связь задач исследования с проблемным планом НИР. Диссертационная
работа выполнена в соответствии с тематическим планом научноисследовательских работ ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский
университет» Минздрава России: «Исследования в области совершенствования
контроля качества ЛРС, содержащего БАВ различной природы, с учетом
перехода их в используемые лекарственные формы» (№ Государственной
регистрации 01201174259) и программы «Совершенствование методов
стандартизации и разработка антимикробных препаратов эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного»
(№ Государственной регистрации 114120240054).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 16 печатных
работ, в том числе 4 работы в рецензируемых журналах по перечню ВАК
Минобрнауки РФ, 1 работа в журнале, входящем в базу данных Scopus.
Личный вклад автора. Результаты, изложенные в диссертации, получены
на базе экспериментов, проводимых лично автором. В рамках диссертации
проведены исследования по разработке подходов к стандартизации листьев
эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя
продырявленного. Разработаны проекты изменения к фармакопейным статьям
(ФС) на описанные виды сырья. Комплекс исследований по оценке содержания
фенолальдегидов в извлечениях из листьев эвкалипта прутовидного и
микробиологические испытания, проведённые автором, позволили предложить
способ получения и методы стандартизации антибактериального препарата из
листьев эвкалипта прутовидного, проявляющего высокую антибактериальную
активность в отношении грамположительных микроорганизмов (на примере
S. aureus), в том числе и антибиотикоустойчивых штаммов по сравнению с
имеющимися аналогами. Автором предложена схема комплексной переработки
травы зверобоя продырявленного, включающая в себя получение препарата
антибактериального действия и настойки.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158
страницах машинописного текста, результаты исследований иллюстрированы 43
таблицами и 34 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты
собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, общих выводов,
7
списка литературы, включающего в себя 129 источников, из которых 67 на
иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель
и задачи, отмечена научная новизна и практическая значимость работы, изложены
положения, выносимые на защиту.
Глава 1 содержит систематизированный обзор отечественной и зарубежной
литературы по современным исследованиям ЛРС (эвкалипта прутовидного,
шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного), обладающего
антибактериальной активностью. Систематизированы данные литературы о
химическом составе, биологической активности и вопросам стандартизации
сырья.
В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования.
Описаны методики обнаружения и идентификации, количественного анализа БАВ
листьев эвкалипта прутовидного, шалфея лекарственного и травы зверобоя
продырявленного.
В главе 3-5 приводятся результаты собственных исследований по
разработке подходов к стандартизации ЛРС с позиций определения основной
группы БАВ, отвечающей за антибактериальную активность; разработке
препаратов на основе изучаемых видов ЛРС и методов их анализа; оценке уровня
антибактериальной активности извлечений из ЛРС; изучению возможности
комплексной переработки сырья.
В приложение вынесены материалы¸ подтверждающие практическую
значимость
диссертационного
исследования:
проекты
изменений
к
фармакопейным статьям на сырьё, акты внедрения.
Результаты, полученные при проведении экспериментальных исследований,
обработаны статистически и представлены по тексту диссертации в таблицах,
формулах, рисунках.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Объекты и методы исследования
Объектами диссертационного исследования являлось следующее ЛРС:
- листья эвкалипта прутовидного: цельные, заготовленные в разные годы в Сирии,
Марокко (2007-2008 гг.), Абхазии (2007-2011 гг.); приобретённые на рынках г.
Казани, г. Чебоксары (2012 – 2013 гг.); измельчённые, фасованные различных
отечественных производителей (ОАО «Красногорсклексредства», ООО
«Фитофарм», ЗАО «Здоровье», образец ОАО «Татхимфармпрепараты»);
- листья шалфея лекарственного цельные, заготовленные в ботаническом саду
КГМУ (2012-2013 гг.), и измельчённые, фасованные различных производителей:
(ЗАО «Ст-Медифарм», ОАО «Красногорсклексредства», ООО «Фитофарм», ЗАО
«Здоровье», ООО «Фитобот»);
- трава зверобоя продырявленного и зверобоя пятнистого, заготовленные в июне –
июле 2010 – 2011 гг. в Республике Татарстан.
Для проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ) применяли
силикагелевые пластины «Sorbfil ПТСХ-АФ-В" 15x15см и «Sorbfil ПТСХ-АФ-ВУФ" 15x15см. Детектирование проводили в видимом и УФ-свете (при длинах
волн 254 и 365 нм).
8
УФ–спектры
записывались
на
спектрофотометрах
LAMBDA–25
(PerkinElmer, США) и Evolution 220 (ТhermoScientific, США). Измерения
оптических плотностей исследуемых растворов проводили на отечественных
спектрофотометрах ПЭ–5300В (НПО «Экрос») и СФ-46.
Для исследования антибактериальной активности извлечений из ЛРС был
использован метод двукратных серийных разведений в мясо-пептоном бульоне
(МПБ) (pH 7,0) с музейными микробами: S. aureus АТСС 6538-Р, MRSA 205-Р и
штаммами, полученными из носоглотки от здоровых носителей. Исследование
антибактериальной активности препарата на основе листьев эвкалипта
прутовидного проводили в сравнении с отечественными аналогами –
«Хлорофиллиптом» и «Галенофиллиптом».
2. Совершенствование методов стандартизации и разработка
антибактериального препарата эвкалипта прутовидного
2.1. Совершенствование методов стандартизации листьев
эвкалипта прутовидного
Вышедшие в последние годы НД различных производителей (ОАО
«Красногорсклексредства»,
ОАО
«Фармацевтическая
фабрика
СанктПетербурга», ООО ПКФ «Фитофарм») помимо определения эфирного масла
стандартизуют листья эвкалипта прутовидного и по содержанию терпеноидных
фенолальдегидов. При небольших различиях метод определения фенолальдегидов
в этих НД принципиально один и тот же – фенолальдегиды экстрагируются 70
или 95% спиртом и полученный раствор фотометрируется при 278 нм.
Получаемые данными методиками результаты многократно выше
минимального нормируемого уровня (до трех раз), что объясняется влиянием на
измеряемую оптическую плотность присутствующих в извлечениях других
фенольных соединений (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных
веществ).
Чтобы избежать влияния на измеряемую оптическую плотность фенольных
соединений, для целевой экстракции фенолальдегидов мы использовали
липофильный растворитель – гексан.
УФ-спектр гексанового извлечения (рис. 1) имел отчётливый максимум при
длине волны 278 ± 3 нм без «плеч» в диапазоне длин волн 320 – 360 нм, что
свидетельствовало о наличии фенольных соединений (фенолальдегидов) и об
отсутствии в извлечении таких веществ как фенолкарбоновые кислоты и
флавоноиды.
Дополнительно присутствие в гексановом извлечении фенолальдегидов и
отсутствие других групп фенолов подтверждали методом ТСХ. На пластинках
«Sorbfil» в системе хлороформ – спирт (1:1) были обнаружены после обработки
проявляющими реактивами (1% водный раствор железоаммонийных квасцов и
0,5% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М растворе хлористоводородной
кислоты) 3 зоны адсорбции с величиной Rf около 0,4; 0,6 и 0,7 (рис. 2).
Использование в качестве проявителя железоаммонийных квасцов показало
присутствие трёх соединений фенольной природы. Эти же соединения окрасились
2,4-динитрофенилгидразином (специфическим реактивом на альдегидную
9
группу), что подтвердило их принадлежность к фенолальдегидам. Других
окрашенных пятен на хроматограмме не наблюдалось.
Оптическая плотность
1,4
Rf ~0.7
Rf ~0.6
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
347,5
341
334,5
328
321,5
315
308,5
302
295,5
289
282,5
276
269,5
Rf ~0.4
263
256,5
250
0
Длина волны, нм
1
2
Рис. 1. УФ-спектр гексанового извлечения из
листьев эвкалипта прутовидного
Рис. 2.ТСХ гексанового извлечения из
листьев эвкалипта прутовидного.
1 – проявлено 2,4-динитрофенилгидразином;
2- проявлено железоаммонийными квасцами
При разработке метода количественного определения фенолальдегидов в
сырье было установлено, что максимальное извлечение достигается при
использовании сырья с размером частиц 1 мм, экстракции при нагревании на
кипящей водяной бане в течение 60 мин. и соотношении сырья и
экстрагента 1:200. Фотометрирование аликвоты раствора проводят при 278 нм.
Для расчета содержания фенолальдегидов использовали удельный показатель
поглощения ГСО эвкалимина равный 720. Ошибка метода составила 2,33%.
В табл. 1 представлены основные показатели и нормы качества листьев
эвкалипта прутовидного, которыми могут быть дополнены НД на этот вид
растительного сырья.
Таблица 1. Показатели и нормы качества листьев эвкалипта прутовидного
Разделы ФС
Метод
Нормы
анализа
Фенолальдегиды ТСХ
На хроматограмме испытуемого раствора должны
наблюдаться пятна оранжевого (2,4-динитрофенилгидразин в 2 М растворе хлористоводородной
кислоты) и тёмно-фиолетового цвета (1% раствор
железоаммонийных квасцов), принадлежащие фенолальдегидам с Rf около 0,4, 0,6 и 0,7.
Спектрофо- УФ-спектр раствора гексанового извлечения, притометрия
готовленного
по
разделу
«Количественное
определение», должен иметь отчётливый максимум
поглощения при 278 ± 3 нм
Сумма фенолСпектрофо- Не менее 1,5
альдегидов,%
тометрия
10
2.2. Разработка способа получения антибактериального препарата из
листьев эвкалипта прутовидного
Учитывая хорошую растворимость фенолальдегидов в неполярных
растворителях типа гексана, мы изучили динамику высвобождения этих
соединений из сырья эвкалипта прутовидного, заменив из экономических
соображений гексан на более доступный петролейный эфир 40/70 (рис. 3).
x, %
3
1.5
Рис. 3. Гистограмма высвобождения фенолальдегидов из листьев эвкалипта прутовидного при экстракции петролейным эфиром 40/70. Черные столбцы – результаты
последовательных
экстракций
при
t = 1 час; серые столбцы – результаты последовательных экстракций при t = 30 мин.
На основании полученных результатов
был разработан способ получения
0
1
2
3
4
антибактериального
препарата
из
листьев эвкалипта прутовидного, основанный на двукратной экстракции сырья в
соотношении 1:50 в экстракционной колбе общей продолжительностью 1 час.
Подобный подход позволяет извлечь около 90% всех фенолальдегидов,
значительно минимизирует число стадий получения, как следствие повышает
сохранность действующих веществ на выходе, исключает использование
растворителей с высокой степенью токсичности, обеспечивает устойчивость в
процессе хранения в связи с отсутствием чувствительных к действию света
хлорофиллов.
2.3. Оценка антибактериальной активности препарата из листьев
эвкалипта прутовидного
Количественную оценку антибактериального действия препарата из листьев
эвкалипта прутовидного (условно названного нами «Флорофелиптом») проводили
в сравнении с препаратами «Хлорофиллипт (1% раствор спиртовый) и
«Галенофиллипт». Сравнивали показатели минимальной подавляющей
концентрации (МПК) препаратов, оказывающей бактерицидное действие на
клетку S. aureus АТСС 6538-Р, MRSA 205-Р (табл. 2).
Таблица 2.Антибактериальная активность препаратов из листьев эвкалипта
прутовидного на музейных штаммах S. aureus АТСС 6538-Р и MRSA 205-Р
Препарат
Максимальное разбавление
МПК препарата,
извлечения, оказывающее
мкг/мл
бактерицидное действие на
клеткуS. aureus
АТСС 6538-Р
MRSA 205-Р
АТСС 6538-Р MRSA 205-Р
«Флорофелипт»
1:1280
1:640
7,8
15,63
«Хлорофиллипт
1:512
1:64
19,5
156,25
«Галенофиллипт»
1:256
1:64
39,06
156,25
11
Полученные результаты показали, что антибактериальная активность
«Флорофелипта» на музейном штамме S. аureus в 2,5 раза выше, чем у
«Хлорофиллипта» и в 5 раз выше, чем у «Галенофиллипта». Для музейного
штамма, устойчивого к метициллину, разница в активности отличалась в 10 раз.
2.4. Подходы к стандартизации «Флорофелипта» – антибактериального
препарата из листьев эвкалипта прутовидного
Для включения в раздел «Подлинность» НД на препарат предложены
методики обнаружения фенолальдегидов методом ТСХ и УФ-спектрофотометрии.
Для количественной оценки фенолальдегидов в препарате предложен метод
прямой спектрофотометрии в пересчете на ГСО эвкалимина при 278 нм, ошибка
метода не превышает 1,09%. Показатели и нормы качества «Флорофелипта»
представлены в табл. 3.
Таблица 3. Основные показатели и нормы качества антибактериального препарата из
листьев эвкалипта прутовидного
Показатель
Метод
Нормы
качества
анализа
Описание
Визуальный Прозрачная жидкость бледно-желтого цвета, без
запаха.
Подлинность
ТСХ
На хроматограмме испытуемого раствора должны
Фенолальденаблюдаться пятна оранжевого (2,4-динитрогиды
фенилгидразин в 2 М растворе хлористоводородной
кислоты и тёмно-фиолетового цвета (1% раствор
железоаммонийных квасцов), принадлежащие фенолальдегидам с Rf около 0,4, 0,6 и 0,7
УФУФ-спектр поглощения раствора препарата, приспектроготовленного по разделу «Количественное опредефотометрия ление», в области от 230 до 280 нм должен иметь
отчётливый максимум поглощения при 278 ± 3нм
АнтибактеМикробио- Препарат должен подавлять рост тест культуры
риальная
логический S.aureus АТСС 6538-Р в концентрации не менее 7,8
активность
метод
мкг/мл
Количественное УФНе менее 0,9
определение
спектроСумма фенолфотометрия
альдегидов, %
3. Совершенствование методов стандартизации и технологии извлечений
листьев шалфея лекарственного
3.1. Разработка метода количественного определения дитерпеновых
кислот в листьях шалфея лекарственного
В настоящее время стандартизация листьев шалфея НД проводится только по
содержанию эфирного масла. Вместе с тем, есть публикации, в которых
предлагается стандартизовать это сырье спектрофотометрическим методом по
содержанию суммы дитерпеновых кислот (Зилфикаров и др.). Наши исследования
показали, что данная методика даёт завышенные результаты, обусловленные
вкладом в оптическую плотность раствора других соединений фенольной
12
природы. На УФ-спектре ацетонового извлечения, полученного в соответствии с
методикой, имеются максимумы поглощения при 285 ± 3нм и 330 ± 3 нм (рис. 4).
Рис. 4. УФ-спектр ацетонового
(неочищенного) извлечения из листьев
шалфея лекарственного
Рис. 5. УФ-спектр ацетонового очи(щенного) извлечения из листьев
шалфея лекарственного
Второй максимум поглощения характерен для гидроксикоричных кислот,
которые вносят свой вклад в оптическую плотность раствора, измеряемого при
аналитической длине волны (285 ± 3нм). После очистки ацетонового экстракта
высота этого пика уменьшилась, однако он выражен, следовательно, часть этих
соединений осталась в растворе после очистки (рис. 5).
Чтобы избежать влияния на измеряемую оптическую плотность других
фенольных соединений, для целевой экстракции дитерпеновых кислот мы
использовали липофильный растворитель – петролейный эфир 40/70. УФ-спектр
извлечения (рис. 6), не имеет максимумов поглощения в районе 330 нм, а только
отчетливый максимум при 285 ± 3 нм.
Оптическая плотность
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
250
300
350
400
450
Длина
волны
500
Рис. 6. УФ-спектр извлечения из листьев S. officinalis, полученного при экстракции
петролейным эфиром 40/70
После установления факта избирательной экстракции дитерпеновых кислот
петролейным эфиром 40/70 с целью выбора оптимального режима экстракции
изучали кинетику извлечения целевых веществ. Более 85% дитерпеновых кислот
оказывается в растворе уже к начальному моменту времени (рис. 7). Далее, кривая
выхода экстракта растёт в течение 10-20 мин, достигает своего максимального
13
значения и сохраняет его до конца экстракции, t ≤ 120 мин. Подобное поведение
кривой характерно для различных соотношений сырья и экстрагента (рис. 9).
x, %
Рис. 7. Динамика экстракции дитерпеновых кислот при значении L =1:100.
Круги – экспериментальные данные,
квадраты – сплошная линия – среднее
значение (x = 2,4%) по всем экспериментам (при t≥ 20 мин).
2
1
0
0
40
t, мин
80
Учитывая полученные данные, целевые вещества в сырье (дитерпеновые
кислоты) можно условно разделить на две части: “свободная” фракция»,
(характеризуется слабым взаимодействием с сырьём и выделяется в растворитель
к начальному моменту времени) и “связанная” фракция (для извлечения
необходимы пониженные концентрации действующих веществ в растворе).
Выдвигаемая гипотеза свидетельствует о принципиальной необходимости
использования методик, основанных на многократной экстракции. (рис. 9).
x, %
x, %
2.2
2.7
1.8
1.1
0.9
0
0
1:50
1:100
1:150
1:200
L, г/мл
Рис. 8. Динамика экстракции дитерпеновых кислот при различных значениях
L. Серые столбцы – t = 20 мин, черные
столбцы – t = 60 мин.
1:50
1:100
1:150
1:200
1:400
L, г/мл
Рис. 9. Трехкратная экстракция при
различных
значениях
L.
Черные
столбцы – результаты последовательных
повторностей экстракции при одном и
том же L; серые столбцы – суммарное
извлечение
для
соответствующего
соотношения; белые столбцы (заливка) –
извлечение
для
соответствующего
соотношения L за третью экстракцию.
Время каждой экстракции 20 мин.
14
Установлено, что максимальное извлечение достигается при использовании
мелко измельченного сырья (размер частиц менее 200 мкм), двухкратной
экстракции при нагревании на кипящей водяной бане продолжительностью
20 мин. каждая и соотношении сырья и экстрагента 1:200. Фотометрирование
раствора проводят при длине волны 285 нм. Для расчета содержания суммы
дитерпеновых кислот использовали удельный показатель поглощения
карнозоловой кислоты равный 40,92. Ошибка метода составила 2,38%.
3.2. Совершенствование технологии извлечений из листьев шалфея
лекарственного
Листья шалфея используются в форме спиртовых («Сальвин–ВИФ») и
водных (настой) извлечений. Учитывая кислотный характер действующих
веществ сырья и их способность образовывать соли, мы предположили
возможность совершенствования технологии экстракционных препаратов шалфея
исходя из этой особенности. Для спиртовых извлечений использовали
предварительное подкисление сырья для перевода солевых форм в свободные
(лучше растворяются в органических растворителях), а для водных, напротив,
получение солевых форм добавлением гидрокарбоната натрия (табл.4,5).
Таблица 4. Антибактериальная активность спиртовых извлечений из листьев шалфея
лекарственного на музейном штамме S. aureus АТСС 6538-Р
Экстрагент Степень
Количество
Концентрация
Maксимальное
МПК
экстракизвлечённых дитерпеновых
разбавление
препации,%
дитерпеновых
кислот в
извлечения, инрата,
кислот в % от извлечениях, % нактивирующее мкг/мл
массы сырья
размножение
микроба
Спирт
53,96±3,6
3,4±0,22
0,23±0,02
1:256
39,06
этиловый
95%
Спирт
86,09±5,84
5,50±0,23
0,37±0,02
1:512
19,53
этиловый
95%*
* − сырьё смочено 1% раствором хлористоводородной кислоты
Таблица 5. Содержание дитерпеновых кислот в водных извлечениях из листьев шалфея
Экстрагент
Гидромодуль
Степень
Количество
Концентрация
экстракции,
извлечённых
дитерпеновых
%
дитерпеновых
кислот в
кислот в % от массы извлечениях, %
сырья
Вода
1:10
9,72 ± 1,15
0,62 ± 0,09
0,06 ± 0,009
очищенная
1% раствор
1:10
33,49 ± 2,29
2,15 ± 0,15
0,21 ± 0,02
NaHCO3
Вода
1:20
19,77 ± 1,43
1,25 ± 0,1
0,06 ± 0,004
очищенная
1% раствор
1:20
69,23 ± 5,47
4,34 ± 0,32
0,22 ± 0,01
NaHCO3
15
Продолжение таблицы 5
Экстрагент
Гидромодуль
Вода
очищенная
1% раствор
NaHCO3
Степень
экстракции,
%
1:33
24,24 ± 2,22
Количество
извлечённых
дитерпеновых
кислот в % от массы
сырья
1,55 ± 0,1
1:33
75,39 ± 8,80
4,82 ± 0,59
Концентрация
дитерпеновых
кислот в
извлечениях, %
0,14 ± 0,02
0,05 ± 0,004
Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены параметры оптимальной технологии
настоя из листьев шалфея.
Экспериментальные данные показали, что предложенные способы получения
извлечений из листьев шалфея в разы повышают их активность в отношении
золотистого стафилококка.
Были определены технологические параметры получения настоя из листьев
шалфея. Установлено, что максимальное извлечение дитерпеновых кислот
достигается при экстракции 1% раствором натрия гидрокарбоната на кипящей
водяной бане в течение 15 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:20
(табл. 5). Антибактериальная активность настоя, полученного описанным
способом, составила 39,06 мкг/мл.
Для оценки содержания дитерпеновых кислот в спиртовых и водных
извлечениях использовали методику, предложенную И.Н. Зилфикаровым с
соавторами. Однако, как отмечалось выше, данная методика определяет, скорее
всего, суммарное содержание дитерпеновых и гидроксикоричных кислот.
Поскольку нами было показано, что дитерпеновые кислоты можно избирательно
извлечь из сырья петролейным эфиром, мы провели изучение антибактериальной
активности спиртовых извлечений, полученных из сырья, до и после экстракции
его этим растворителем (табл. 6).
Таблица 6. Антибактериальная активность
лекарственного на культурах S. aureus
извлечений
из
листьев
Максимальное разбавление
извлечения, инактивирующее
размножение S. aureus
ATTC 6538-P
MRSA 205-Р
Спиртовый раствор
(1:10), полученный
БАВ, отвечающие за
антибактериальную
активность
из листьев шалфея
необработанных
петролейным эфиром
Сумма дитерпеновых
и гидроксикоричных
кислот
1:256
1: 64
Гидроксикоричные
кислоты
1:64
1: 64
Дитерпеновые
кислоты
1:32
1:16
из листьев шалфея
обработанных петролейным эфиром
растворением сухого
отстатка после отгонки
петролейного эфира
шалфея
Результаты показали, что антибактериальной активность спиртового
раствора, полученного из петролейного экстракта шалфея (содержавшего только
16
дитерпеновые кислоты без примеси других фенольных соединений) в сравнении с
суммарным спиртовым экстрактом была в 8 раза ниже. Эти результаты
свидетельствуют о наличии антибактериальной активности не только у
дитерпеновых кислот, но и у других фенольных соединений (прежде всего
гидроксикоричных кислот), которые остаются в сырье после экстракции его
петролейным эфиром. Таким образом, стандартизацию сырья необходимо
проводить по двум группам указанных соединений.
3.3. Оценка содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
лекарственного
Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
рационально
использовать
унифицированный
метод
определения
гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи. Показано, что более 90%
действующих веществ выходит в раствор уже по истечению 20 – 30 мин, что
позволяет говорить об исчерпывающей экстракции гидроксикоричных кислот за
заданное в методике время (рис. 10)
Рис. 10. Динамика экстракции гидроксикоричных кислот при значении L= 1:400.
Круги – экспериментальные данные,
сплошная линия – среднее значение
(x = 4,38%)
Метод был апробирован как на нативном сырье, так и на сырье,
обработанным петролейным эфиром, что послужило дополнительным
доказательством того, что в необработанном сырье при использовании данной
методики оцениваются только гидроксикоричные кислоты (табл. 7).
Таблица 7. Содержание гидроксикоричных кислот в листьях шалфея лекарственного, %
Листья шалфея
Содержание гидроксикоричных кислот, %
необработанные петролейным эфиром
4,25±0,29
обработанные петролейным эфиром
4,29±0,19
листья
В табл. 8 представлены основные показатели и нормы качества листьев
шалфея лекарственного, которыми могут быть дополнены НД на этот вид
растительного сырья.
Таблица 8. Основные показатели и нормы качества листьев шалфея лекарственного
Разделы ФС
Метод анализа
Нормы
Внешние признаки
Оставлен без изменений (ст. 22 ГФ XI)
Числовые показатели Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы
дитерпеновых кислот и суммой гидроксикоричных кислот
17
Продолжение таблицы 8
Разделы ФС
Метод анализа
Количественное
Метод 1 ГФ XI
определение
Эфирное масло, %
Сумма дитерпеноСпектрофотометрия
вых кислот, %
Сумма
Спектрофотометрия
гидроксикоричных
кислот, %
Нормы
Не менее 0,8
Не менее 2,0
Не менее 2,0
Оптическая плотность
4. Совершенствование методов стандартизации и разработка
антибактериального препарата травы зверобоя продырявленного
4.1. Совершенствование методов стандартизации травы зверобоя
продырявленного
Возможность использования травы зверобоя для получения извлечений с
антибактериальной активностью изучали с позиции идентификации гиперфорина
в сырье двух видов зверобоя – H. perforatum и H. maculatum. Для качественного
обнаружения гиперфорина использовали ТСХ-анализ на пластинках марки
Сорбфил ПТСХ-АФ-А в системе гексан – этилацетат 9:1. Гиперфорин
обнаруживали в виде пятен с Rf около 0,45 по интенсивной сине-фиолетовой
флюоресценции в УФ-свете при 360 нм. Гиперфорин был обнаружен только в
извлечении из травы H. рerforatum (рис. 11).
Для дополнительного подтверждения наличия гиперфорина в извлечении из
H. perforatum и отсутствия его в H. maculatum, нами были записаны УФ-спектры
гексановых извлечений для двух видов зверобоя. УФ-спектр извлечения из
H. perforatum имел четко выраженный максимум при 278 нм, тогда как у
H. maculatum он практически отсутствовал (рис. 12).
0,5
H. maculatum
0,45
H. perforatum
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
450
436
423
409
396
382
369
355
342
328
315
301
288
274
261
247
234
220
0
Длина волны, нм
Рисунок 13. УФ-спектры гексановых извлечений из травы H. perforatum и H. maculatum.
Рис. 12. ТСХ гексановых извлечений
из травы H. рerforatum (1) и H. maculatum (2)
18
Присутствие гиперфорина в химическом составе только травы зверобоя
продырявленного дополнительно показано при оценке антибактериальной
активности извлечений из обоих видов зверобоя. Антибактериальная активность
зверобоя продырявленного была в 4 раза выше зверобоя пятнистого (табл. 9).
Таблица 9. Антибактериальная
активность
извлечений
из
травы
зверобоя
продырявленного и травы зверобоя пятнистого (на культуре S. aureusATTC 6538-P)
Спиртовой экстракт (1:20), полученный
Максимальное разбавление извлечения,
после удаления гексана
иннактивирующее размножение S. aureus
Трава зверобоя продырявленного
1:512
Трава зверобоя пятнистого
1:128
При разработке метода количественного определения гиперфорина и его
производных в сырье было установлено, что максимальное извлечение
достигается при использовании сырья с размером частиц 1 мм, экстракции при
нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин. и соотношении сырья и
экстрагента 1:100. Фотометрирование аликвоты раствора проводят при 278 нм.
Для расчета содержания производных гиперфорина использовали молярный
показатель поглощения 6∙10-4 М раствора гиперфорина равный 8200. Ошибка
метода составила 1,53%.
В табл. 10 представлены основные показатели и нормы качества травы
зверобоя продырявленного, используемой для получения антимикробных
препаратов, которыми могут быть дополнены НД на этот вид сырья.
Таблица 10. Основные показатели и нормы качества травы зверобоя продырявленного
Разделы ФС
Метод анализа
Нормы
Гиперфорин
ТСХ
На хроматограмме испытуемого раствора
должно наблюдаться пятна пятно с интенсивно-синей флуоресценцией (УФ-свет) с Rf
около 0,45 (гиперфорин). Возможно присутствие других зон
СпектрофотоУФ-спектр раствора гексанового извлечения,
метрия
приготовленного по разделу «Количественное
определение», должен иметь максимум
поглощения при 278 ± 3нм
Числовые
Раздел должен быть дополнен нормой содержания суммы
показатели
производных гиперфорина
Количественное
СпектрофотоНе менее 1,0
определение
метрия
Сумма
производных
гиперфорина,%
4.2. Разработка способа получения антибактериального препарата из
травы зверобоя продырявленного
Учитывая возможность эксрагироваания производных гиперфорина из травы
зверобоя продырявленного гексаном, изучили динамику высвобождения этих
соединений из сырья в аппарате Сокслета, заменив из экономических
соображений гексан на более доступный петролейный эфир 40/70 (табл. 11).
19
Таблица 11.Содержание производных гиперфорина в извлечении из травы зверобоя
продырявленного при экстракции петролейным эфиром 40/70, %
Вариант
Степень извлечения
Количество
Концентрация
экстракции производных гиперфорина
извлечённых
производных
(% от суммы в сырье)
производных
гиперфорина в
гиперфорина
извлечении, %
(% от массы сырья)
Экстракция
96,35 ± 2,98
1,23 ± 0,03
0,01 ± 0,003
в аппарате
Сокслета
На основании полученных результатов был разработан способ получения
антибактериального препарата из травы зверобоя продырявленного, на основе
экстракции сырья в аппарате Сокслета в соотношении 1:100 в экстракционной
колбе общей продолжительностью около 3 часов (10 сливов экстрагента).
Предлагаемая технологическая схема антибактериального препарата из
травы зверобоя продырявленного в условиях отсутствия готовой лекарственной
формы с доказанным антибактериальным эффектом позволяет получить препарат,
оказывающий бактериостатическое действие в отношении S. aureus АТСС 6538- Р
в разведении 1:512 (19,5 мкг/мл).
4.3. Подходы к стандартизации антибактериального препарата из травы
зверобоя продырявленного
Для включения в раздел «Подлинность» НД на препарат предложены
методики обнаружения производных гиперфорина методом ТСХ и УФспектрофотометрии. Для количественной оценки производных гиперфорина в
препарате предложен метод прямой спектрофотометриив пересчете на
гиперфорин при 278 нм, ошибка метода не превышает 1,16%.
Предлагаемые показатели и нормы качества антибактериального препарата
на основе травы зверобоя продырявленного представлены в табл. 12.
Таблица 12. Основные показатели и нормы качества препарата из травы зверобоя
продырявленного
Показатель
Метод анализа
Нормы
качества
Описание
Визуальный
Прозрачная жидкость бледно-желтого цвета, без
запаха.
Подлинность
ТСХ
На хроматограмме испытуемого раствора долГиперфорин
жно наблюдаться пятно с интенсивно-синей
флуоресценцией (УФ-свет при 360 нм) с Rf около
0,45. Возможно присутствие других зон.
УФ-спектроУФ-спектр поглощения раствора препарата,
фотометрия
приготовленного по разделу «Количественное
определение», в области от 230 до 280 нм должен иметь максимум поглощения при 278 ± 3нм
Антибактериальн МикробиоПрепарат должен подавлять рост тест культуры
ая активность
логический
S. aureus АТСС 6538-Рв концентрации не менее
метод
19,5 мкг/мл
Количественное
УФНе менее 0,2
определение
спектрофото20
Продолжение таблицы 12
Показатель
Метод анализа
качества
Сумма
метрия
Не менее 0,2
производных
гиперфорина,%
в пересчёте на гиперфорин
Нормы
4.4.Исследование возможности комплексного использования травы зверобоя
продырявленного
Исходя из того, что экстракция петролейным эфиром 40/70 производных
гиперфорина из травы зверобоя продырявленного довольно избирательна и
другие группы БАВ зверобоя, такие как флавоноиды и дубильные вещества, не
растворяются в нем, мы предположили, что шрот можно использовать для
получения настойки зверобоя, в которой эти соединения являются активным
началом. Из шрота таким образом была получена настойка в соотношении сырья
и экстрагента 1:5 методами дробной мацерации и перколяции (табл. 13, 14).
Таблица 13. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом перколяции
70% этанолом при настаивании в течение 7 суток
Настойка (1:5, 40% спирт) из
Содержание флавоноидов, %
Сухой остаток, %
травы зверобоя продыряв(не менее 0,2 %)
(не менее 2,8 %)
ленного
необработанной петролейной
0,33± 0,01
3,59 ± 0,02
эфиром
обработанной петролейным
0,40± 0,01
4,05± 0,04
эфиром
Таблица 14. Показатели качества настойки зверобоя, полученной методом дробной
мацерации 70 % этанолом
Настойка (1:5, 40% спирт) из
Содержание флавоноидов, %
Сухой остаток, %
травы зверобоя продыряв(не менее 0,2 %)
(не менее 2,8 %)
ленного
необработанной петролейным
0,31± 0,01
3,90 ± 0,02
эфиром
обработанной петролейным
0,45± 0,01
3,96± 0,04
эфиром
Можно констатировать, что при получении антибактериального препарата
из травы зверобоя предложенным экстракцией петролейным эфиром, возможно
дальнейшее использование отработанного шрота для получения настойки
зверобоя. Использование шрота травы зверобоя, оставшегося после обработки
петролейным эфиром, для получения настойки, позволяет получать препарат с
более высоким содержанием действующих веществ в сравнении с настойкой,
приготовленной по той же технологии из травы зверобоя, необработанной
петролейным эфиром.
Выводы
1. Предложены подходы к стандартизации сырья и препаратов эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного,
21
заключающиеся в их анализе по основным группам БАВ, отвечающим за
антибактериальную активность.
2. Разработаны методики качественного анализа листьев эвкалипта прутовидного
и травы зверобоя продырявленного, основанные на обнаружении терпеноидных
фенолальдегидов и производных гиперфорина соответственно, с использованием
ТСХ-анализа и УФ-спектрофотометрического метода.
3. С помощью предложенной математической модели экстрагирования
дитерпеновых кислот из листьев шалфея лекарственного объяснены
закономерности экстракции липофильных соединений из растительного
материала присутствием «свободных» и «связанных» со внутренними
структурами фракций сырья.
3. Разработаны
методики
количественного
определения
терпеноидных
феноальдегидов (листья эвкалипта прутовидного), дитерпеновых кислот (листья
шалфея лекарственного), производных гиперфорина (трава зверобоя
продырявленного) с использованием метода УФ-спектрофотометрии. Ошибка
единичного определения содержания действующих веществ в сырье не
превышает ± 2,33%; ±2,47% и ± 1,53% соответственно.
4. Обоснована необходимость стандартизации листьев шалфея лекарственного по
двум группам природных соединений – дитерпеновым и гидроксикоричным
кислотам, ответственным за антибактериальную активность сырья.
5. Для оценки содержания гидроксикоричных кислот в листьях шалфея
предложено
использовать
унифицированный
метод
определения
гидроксикоричных кислот Европейской Фармакопеи.
6. Предложены способы получения антибактериальных препаратов на основе
листьев эвкалипта прутовидного («Флорофелипт») и травы зверобоя
продырявленного, заключающиеся в использовании оптимального экстрагента –
петролейного эфира 40/70, позволяющего исчерпывающе извлекать основные
БАВ, отвечающие за антибактериальную активность
7. Разработаны
методики
качественного
и
количественного
анализа
«Флорофелипта» и антибактериального препарата на основе травы зверобоя
продырявленного с использованием ТСХ и УФ-спектрофотометрического метода.
8. Микробиологические исследования показали высокую антибактериальную
активность «Флорофелипта» в отношении S. аureus, в том числе и
антибиотикоустойчивых штаммов, в сравнении с существующими аналогами.
9. Предложены технологические подходы к получению препаратов с высоким
уровнем антибактериальной активности из листьев шалфея лекарственного,
заключающиеся в извлечении БАВ кислого характера в свободной форме (для
спиртовых извлечений), в форме солей (для водных извлечений).
10. Предложена
схема
комплексной
переработки
травы
зверобоя
продырявленного, включающая в себя две основные стадии: первая – получение
антибактериального препарата на основе целевой экстракции производных
гиперфорина; вторая – получение из оставшегося шрота настойки, содержащей
соединения фенольного ряда (флавоноиды, дубильные вещества).
22
11. На основании экспериментальных данных оформлены проекты изменения к
ФС «Листья эвкалипта прутовидного», «Листья шалфея лекарственного», «Трава
зверобоя продырявленного».
Практические рекомендации. Результаты диссертационной работы
позволяют
усовершенствовать
методики
анализа
листьев
эвкалипта
прутовидного, шалфея лекарственного и зверобоя продырявленного и могут быть
использованы в учебных процессах по курсам «Фармакогнозия» и
«Фармацевтическая химия», а также в центрах сертификации и контроля качества
ЛС и на фармацевтических предприятиях. Предложенные технологические схемы
получения препаратов из ЛРС могут быть использованы на фармацевтических
предприятиях в рамках получения лекарственных препаратов антибактериального
действия.
Перспективы дальнейшей разработки темы диссертационного
исследования имеют важное научно-практическое значение для фармакогнозии и
фармацевтической химии с целью дальнейшего изучения растений, обладающих
антибактериальной активностью, разработке препаратов на их основе и
современных подходов к стандартизации, заключающихся в анализе препаратов
по основным группам соединений, отвечающим за фармакологический
(антибактериальный) эффект.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Хазиев, Р.Ш. Количественное определение терпеноидных фенолальдегидов в
листьях эвкалипта прутовидного / Р.Ш. Хазиев, М.В. Васильева, А.С. Макарова,
Л.Т. Мусина //Химия растительного сырья. – 2013. – № 3. – С. 155 – 159.
2. Хазиев, Р.Ш. Количественное определение производных гиперфорина в траве
зверобоя продырявленного / Р.Ш. Хазиев, Л.И. Насыбуллина, А.С. Макарова,
Л.Т. Мусина // Химия растительного сырья. – 2013. – № 4. – С. 121 – 125.
3. Хазиев, Р.Ш. Получение извлечений из листьев шалфея, оптимизированных по
содержанию дитерпеновых кислот, и изучение их антимикробной активности /
Р.Ш. Хазиев, А.С. Макарова, Л.Т. Мусина // Вопросы биологической,
медицинской и фармацевтической химии. – 2013. – № 2. – С. 35 –38.
4. Саламатин, А.А. Кинетика экстракции биологически активных веществ из
растительного сырья кипящим растворителем/А.А. Саламатин, Р.Ш. Хазиев,
А.С. Макарова, С.А. Иванова // Теорет. основы хим. технологии. – 2015. – Т. 49,
№ 2. – С. 200 – 206.
5. Хазиев, Р.Ш. Получение извлечений из листьев шалфея, оптимизированных по
содержанию дитерпеновых кислот/Р.Ш. Хазиев, А.С. Макарова // Разработка,
исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр. –
Пятигорск, 2012. – С. 177 – 178.
6. Макарова, А.С. Получение извлечений из листьев шалфея, оптимизированных
по содержанию дитерпеновых кислот, и изучение их антимикробной
активности/86-я Всероссийская студенческая научная конференция памяти члкорр. Академии наук РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 23-24 апр. 2012 г.):
Сборник тезисов.− Казань, 2012. – С. 355.
7. Макарова, А.С. Изучение антимикробной активности извлечений из листьев
шалфея/86-я Всероссийская студенческая научная конференция памяти чл-корр.
23
Академии наук РТ, проф. И. Г. Салихова (Казань, 23-24 апр. 2012 г.): Сборник
тезисов. − Казань, 2012. – С. 355−356.
8. Макарова, А.С. Совершенствование
анализа
листьев
эвкалипта
прутовидного/87-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов и
молодых учёных, посвящённая 155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича
(Казань, 21-22 марта 2013 г.): Сборник тезисов. − Казань, 2013. – С. 342 – 343.
9. Макарова, А.С. Изучение антибактериальной активности водных извлечений из
листьев шалфея/87-я Всероссийская научно-практическая конференция студентов
и молодых учёных, посвящённая 155-летию со дня рождения Л.О. Даршкевича
(Казань, 21-22 марта 2013 г.): Сборник тезисов. − Казань, 2013. – С. 409.
10. Макарова, А.С. Изучение антибактериальной активности препарата из листьев
эвкалипта прутовидного/87-я Всероссийская научно-практическая конференция
студентов и молодых учёных, посвящённая 155-летию со дня рождения
Л.О. Даршкевича (Казань, 21-22 марта 2013 г.): Сборник тезисов. − Казань, 2013.
– С. 409 -410
11. Макарова, А.С. Совершенствование анализа листьев и препаратов эвкалипта
прутовидного/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. Мусина//Материалы науч.-практ.
конф. «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки
фармацевтических кадров» (Казань, 25 марта 2013 г.). − Казань, 2013. – С. 80 – 81.
12. Макарова, А.С. Получение препарата из листьев эвкалипта прутовидного и
оценка его антибактериальной активности/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев,
Л.Т. Мусина//Материалы
Всероссийской
заочной
научно-практической
конференции с международным участием «Микробиология в современной
медицине» (Казань, 16 марта 2013). − Казань, 2013. – С. 149 – 150.
13. Макарова, А.С. Изучение корреляции между содержанием гиперфорина в
извлечениях из травы H. perforatum и H. maculatum/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев,
Л.Т. Мусина, Л.И.Насыбуллина//Материалы Всероссийской заочной научнопрактической конференции с международным участием «Микробиология в
современной медицине» (Казань, 16 марта 2013). − Казань, 2013. – С. 150 – 152.
14. Макарова, А.С. Оценка антибактериальной активности извлечений из листьев
Salvia officinalis/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. Мусина, А.Н.Николаева//
Материалы Всероссийской заочной научно-практической конференции с
международным участием «Микробиология в современной медицине» (Казань,
26 апреля 2014). − Казань, 2014. – С. 28 – 29.
15. Макарова, А.С. Совершенствование количественного анализа листьев шалфея
лекарственного/А.С. Макарова, Р.Ш. Хазиев, Л.Т. Мусина, А.Н. Николаева//
Материалы Российской науч.-практ. конф. «Эффективная аптека – новые
технологии и возможности для провизоров и фармацевтов, руководителей и
менеджеров аптек и розничных сетей» (Казань, 19 марта 2014 г.). − Казань, 2014.
– С. 49 – 51.
16. Макарова, А.С. Изучение антибактериальной активности извлечений из
листьев шалфея лекарственного и эвкалипта прутовидного/88-я Всероссийская
научно-практическая конференция студентов и молодых учёных, посвящённая
200-летию КГМУ. − Казань, 26-27 марта 2014 г.): Сборник тезисов. − Казань,
2013. – С. 262 – 263.
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа