close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Структура острова патогенности XII стрептококков группы В

код для вставкиСкачать
Санкт-Петербургский государственный университет
На правах рукописи
КУЛЕШЕВИЧ
Евгения Владимировна
СТРУКТУРА ОСТРОВА ПАТОГЕННОСТИ XII
СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2015
2
Работа выполнена в отделе молекулярной микробиологии Федерального
государственного бюджетного научного учреждения «Институт
экспериментальной медицины»
Научный руководитель:
Суворов Александр Николаевич,
доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Нарвская Ольга Викторовна, доктор медицинских наук,
профессор, зав. лабораторией молекулярной
микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера
Сбойчаков Виктор Борисович, доктор медицинских
наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии ФГБВОУ
ВПО Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова
Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие
Государственный научно-исследовательский институт
особо чистых биопрепаратов Федерального медикобиологического агентства
Защита состоится «______»________________2015 г. в___________ на заседании
диссертационного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских
диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:
199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биологический факультет,
аудитория_______
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького
Санкт-Петербургского государственного университета и на сайте spbu.ru
Автореферат разослан «_________»_________________ 2015 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Е. И. Шарова
3
Общая характеристика работы
Актуальность темы
Стрептококки группы В (СГВ) или Streptococcus agalactiae, впервые
выделенные у коров, больных маститом, длительное время рассматривались
исключительно как возбудители заболеваний животных. И лишь начиная с 90-х
годов XX века для научного сообщества стало очевидным, что СГВ способны
вызывать тяжелые инфекции у человека (Тотолян и др., 2009). Большинство
исследователей относят эти бактерии к условно-патогенным микроорганизмам
(Покровский и др., 2006), которые вызывают в определенных условиях целый ряд
заболеваний (Тотолян и др., 2009). Инфекция СГВ у беременных может приводить
к тяжелым патологиям новорожденных в форме сепсиса, менингита и пневмонии.
Смертность новорожденных при развитии заболеваний достигает 4-6% (Verani et
al., 2010). СГВ также являются причиной многих заболеваний взрослых людей, а
именно пневмонии, перитонита, артрита, менингита, эндокардита, абдоминального
абсцесса, кистозного фиброза, некротизирующего фасциита, инфекций
урогенитального тракта, кожи, мягких тканей и костей (Bishop et al., 2007; Martins
et al., 2007; van der Mee-Marquet et al., 2008; Eickel et al., 2009; Imam et al., 2012;
Sambola et al., 2012; Ulett et al., 2012; Cheng et al., 2013).
Установлено, что СГВ вызывают заболевания у самых различных видов
млекопитающих: крупного рогатого скота, собак, кошек, слонов, кур, верблюдов,
лошадей, обезьян, нутрий, хомяков, мышей, морских млекопитающих,
крокодилов, лягушек и различных рыб (Bishop et al., 2007; Evans et al., 2008;
Richards et al., 2011; Pereira et al., 2013). Таким образом, СГВ обладают
способностью колонизировать различные экологические ниши и являются
причиной развития инфекционного процесса как у людей, так и животных, что во
многом обусловлено особенностями генетической организации стрептококков
группы В, содержащих в геноме множественные мобильные генетические
элементы.
Мобильные генетические элементы (плазмиды, транспозоны, бактериофаги
и острова патогенности) вносят существенный вклад в формирование
вирулентного фенотипа патогенных микроорганизмов. Острова патогенности
характеризуются целым рядом структурных и генетических особенностей, в
частности, наличием генов патогенности и генов, кодирующих системы секреции
(Hacker, Carniel, 2001; Chen et al., 2007). Они могут мигрировать как в пределах
одного генома, так и участвовать в генетическом обмене. Острова патогенности
участвуют в эволюции бактерий, способствуя выживанию микроорганизма в
организме
хозяина.
Миграция
островов
приводит
к
образованию
высоковирулентных эпидемических штаммов бактерий за счет получения генов
патогенности от других бактерий. На острове патогенности XII СГВ локализован
4
ген sspB1, кодирующий поверхностный адгезин, относящийся к системе секреции
V типа, а также кластер генов, кодирующих систему секреции IV типа. Высказано
предположение, что продукты генов sspB семейства влияют на развитие
внутриутробной инфекции в организме плода или новорожденных детей и могут
способствовать адгезии СГВ к эпителию мочеполового тракта (Зациорская и др.,
2006; Suvorov et al., 2006). Присутствие гена sspB1, а также генов других факторов
патогенности на данном острове может усиливать вирулентность СГВ,
способствуя формированию эпидемически актуальных штаммов. Однако
информации об организации данного острова патогенности и его
распространенности среди штаммов СГВ в научной литературе недостаточно.
Учитывая тот факт, что остров патогенности XII по всем имеющимся признакам
относится к мобильным генетическим элементам, способным влиять на степень
патогенности бактерии, в настоящей работе была поставлена задача изучения
распространенности и организации острова патогенности XII в геноме
стрептококков группы В.
Степень разработанности темы
Стрептококки группы В обладают широким набором различных факторов
патогенности, что определяет различия в вирулентности отдельных штаммов, при
этом многие гены, кодирующие факторы патогенности, локализованы на
мобильных
генетических
элементах.
Полногеномное
секвенирование
стрептококков группы В позволило установить, что в состав генома этих бактерий
помимо «коровой» части входят разнообразные мобильные генетические
элементы. В геноме СГВ по данным различных авторов обнаружено от 14 до 15
островов патогенности, несущих разнообразные детерминанты вирулентности, что
составляет около 17% всего генома СГВ (Ferretti, Suvorov, 2002; Glaser et al., 2002;
Tettelin et al., 2002).
В связи с этим понимание характера организации мобильных элементов
СГВ и роль генов, кодирующих отдельные факторы патогенности, важно для
выяснения вклада данных факторов в формирование вирулентного фенотипа и
патогенеза стрептококковых заболеваний.
Первоначально в штамме O9OR СГВ методом вычитающей гибридизации
был обнаружен ген поверхностного адгезина sspB1 (Suvorov, Ferretti, 2004).
Позднее в результате поиска гомологов sspB1 в других штаммах СГВ был
обнаружен ген sspB1a (Suvorov et al., 2006). Наличие генов sspB семейства
коррелировало с возникновением инфекций в урогенитальном тракте (Суворов и
др., 2005). Анализ литературы, а также нуклеотидных последовательностей
геномов СГВ показал, что гены sspB1, sspB1а, а также scpB и lmb, кодирующие
С5а пептидазу и ламинин-связывающий белок соответственно, локализованы на
острове патогенности XII СГВ (Glaser et al., 2002; Herbert et al., 2005; Suvorov et al.,
5
2006). Другие авторы полагают, что эта область острова патогенности XII, за
исключением генов, фланкирующих scpB и lmb, является конъюгативным
элементом (Tettelin et al., 2002; Brochet et al., 2008). Гены scpB и lmb, по мнению
Franken и Al Safadi, локализованы на сложном транспозоне (Franken et al., 2001;
Al Safadi et al., 2010).
Белок SspB1, как фактор патогенности, включен в состав разрабатываемой в
Отделе молекулярной микробиологии вакцины против СГВ.
Таким образом, в литературе отсутствует единое мнение об организации
мобильного генетического элемента (острова патогенности XII), а также его
распространенности среди штаммов СГВ.
Все вышеперечисленное определило цели и задачи данного исследования.
Цель исследования
Целью исследования является определение распространенности и изучение
генетической организации острова патогенности XII в штаммах стрептококков
группы В.
Задачи исследования
1) Определить распространенность острова патогенности XII, ассоциированного с
геном sspB1, среди штаммов стрептококков группы В, выделенных в России и
зарубежных странах.
2) Установить генетическую организацию острова патогенности
XII
стрептококков группы В.
3) Выявить
распространенность
мобильного
генетического
элемента,
ассоциированного с геном sspB1а, среди штаммов стрептококков группы В.
4) Сравнить организацию мобильных генетических элементов, ассоциированных с
генами sspB1 и sspB1а, среди штаммов стрептококков группы В.
5) Сконструировать новые векторы для экспрессии и инактивации гена sspB1.
Научная новизна
В результате проведенной работы получены новые данные об организации
участка генома, кодирующего несколько факторов патогенности. Впервые
установлено, что остров патогенности XII, на котором локализован ген sspB1,
состоит из трех мобильных генетических элементов, а именно: сложного
транспозона (PAI-C), геномного островка (PAI-B) и острова патогенности (PAI-A).
Впервые определена распространенность острова патогенности PAI-A,
ассоциированного с геном sspB1, среди штаммов СГВ из России (СанктПетербурга) (14%). Данный мобильный генетический элемент не был обнаружен в
штаммах из США, Германии, Великобритании, Португалии, Анголы, Чешской
республики. Каждый элемент характеризуется гетерогенностью по составу
6
включенных в него генов. Выдвинуто предположение о том, что интеграция
геномного островка и острова патогенности происходит за счет прямых повторов,
локализованных на концах мобильных генетических элементов. Показана
способность острова патогенности и геномного островка образовывать
циклическую структуру. Частота встречаемости гена sspB1а и острова
патогенности PAI-A1 превышает частоту встречаемости гена sspB1 и острова
патогенности PAI-A.
Теоретическая и практическая значимость
Стрептококки группы В впервые были обнаружены как возбудители мастита
у коров. В настоящее время установлено, что СГВ вызывают широкий спектр
заболеваний человека и животных. Они способны быстро адаптироваться к
изменяющимся условиям окружающей среды за счет содержания в геноме
мобильных элементов. Адаптации бактерий к разным экологическим нишам
способствуют острова патогенности, ассоциированные с факторами патогенности.
Установлено, что характер течения инфекционного заболевания связывают с
наличием определенного острова патогенности. На острове патогенности,
ассоциированном с геном sspB1, локализованы гены различных факторов
патогенности. В связи с тем, что наличие острова с генами sspB семейства в
штаммах СГВ коррелирует с инфекциями в урогенитальном тракте, вызванными
данными штаммами, понимание организации и распространенности острова
патогенности имеет большое практическое и теоретическое значение. Выявление
роли отдельных генов на данном генетическом элементе в формировании
вирулентного фенотипа позволяет глубже понимать патогенез стрептококковой
инфекции, а также использовать их в качестве маркеров для детекции
высоковирулентных штаммов стрептококков группы В, обнаруженных у
беременных. В свою очередь выявление носительства вирулентных штаммов у
беременных
позволит
снизить
риск
инфицирования
новорожденных
стрептококками группы В.
Методология и методы исследования
Методологией исследования является экспериментальная работа по анализу
геномов
штаммов
стрептококков
группы
В
с
использованием
микробиологических, молекулярно-биологических, молекулярно-генетических
методов. Данные обрабатывали с помощью компьютерного и статистического
анализов.
Положения, выносимые на защиту
1) Остров патогенности XII состоит из трех мобильных генетических элементов,
каждый из которых включает элементы, необходимые для транспозиции.
7
2) Остров патогенности PAI-A обнаруживается в штаммах стрептококков группы
В из России (Санкт-Петербурга) и не определяется в штаммах СГВ из
зарубежных стран.
3) Остров патогенности PAI-A1 циркулирует в штаммах СГВ из различных стран и
более широко распространен, чем остров патогенности PAI-A.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности полученных результатов определяется достаточным
объемом выборки (235 штаммов СГВ), использованием молекулярно-генетических
методов, компьютерного анализа и точного критерия Фишера.
Результаты исследования были доложены на V конференции молодых
ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс
клинической медицины», на III Международном молодежном медицинском
конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009», на 20-м Европейском
конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, на
Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки
третьего тысячелетия», на XVIII Международном Симпозиуме Лэнсфильд, на II
всероссийской
научной
конференции
молодых
ученых
«Проблемы
биомедицинской науки третьего тысячелетия».
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 112 страницах, состоит из введения, обзора
литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка
сокращений, списка литературы. Список литературы включает в себя 130
источников, в том числе 15 – отечественных и 115 – иностранных. Диссертация
иллюстрирована 14 таблицами и 27 рисунками.
Основное содержание работы
Материалы и методы исследования
В данном исследовании использовались 235 штаммов стрептококков группы
В, полученных из различных коллекций России (113 штаммов), США (12
штаммов), Чешской республики (9 штаммов), Германии (16 штаммов), Португалии
(56 штаммов) и Анголы (19 штаммов).
Штаммы из Германии, Португалии, Анголы относились к двум группам:
инвазивные (45 штаммов) и выделенные от носителей (46 штаммов).
Штаммы Escherichia coli (E. coli) DH5α, JM109, M15 были использованы при
создании конструкций для экспрессии и инактивации гена sspB1.
В исследовании использовались следующие плазмидные векторы: p7ErmB,
pQE-32, pGEMTEasy.
Компьютерный анализ проводился с помощью базы данных National Centre
of Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и компьютерных
8
программ
BLAST,
ClustalW2
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov,
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2). Праймеры создавались с помощью
компьютерной программы Primer 3.0. G+C состав генов определяли с помощью
программы FastPCR. Статистический анализ осуществлялся с помощью
программы Statistica ver.10. При представлении нуклеотидной последовательности
в виде вторичной структуры использовалась компьютерная программа The mfold
Web Server (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form). Построение
филогенетического дерева осуществлялось программой MEGA 6, использовался
метод Maximum Parsimony.
ДНК из штаммов СГВ была выделена с использованием фенолхлороформного метода или набора «ДНК-экспресс» («Литех», Россия).
ДНК из 10 выделенных от носителей штаммов из Великобритании была
выделена с помощью MagNA Pure Compact сотрудниками центра по защите
здоровья (Health Protection Agency) в Лондоне.
Масс-спектрометрия была проведена в сотрудничестве с лабораторией
биомедицинской и фармацевтической масс-спектрометрии отдела молекулярной
микробиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН под руководством Мильмана Б.Л.
В процессе исследования были использованы следующие методы:
полимеразная цепная реакция, электрофорез в агарозном геле, клонирование,
ДНК-секвенирование.
Результаты исследования и их обсуждение
Молекулярно-генетическая организация и распространенность острова
патогенности XII
Для оценки распространенности острова патогенности среди штаммов
стрептококков группы В были определены предполагаемые функции 81 гена
штамма
NEM316
с
помощью
геномной
базы
данных
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
и
компьютерной
программы
blastx
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (поиск белков по транслируемой нуклеотидной
последовательности) (рисунок 1). Гены gbs1374, gbs1375, gbs1376 локализованы за
пределами острова патогенности XII.
Для дальнейшего исследования были выбраны гены gbs1343, gbs1348,
gbs1352, gbs1356 (sspB1), gbs1360, gbs1364, gbs1376, кодирующие zeta токсин,
белок Zn-finger, метилтрансферазу, SspB1, компонент системы секреции IVC
VirB4, компонент системы секреции IVC VirD4, АТФ-зависимую протеазу
соответственно. Ген gbs1376 локализован за пределами острова патогенности,
поэтому был выбран в качестве положительного контроля ПЦР.
Гены острова патогенности XII (PAI XII) были обнаружены в геномах 16 из
113 штаммов из России и отсутствовали в зарубежных штаммах (таблица 1). При
этом организация острова характеризовалась гетерогенностью по составу генов.
9
Серотипы СГВ штаммов из России, США, Германии оценивали с помощью
мультиплексной ПЦР на гены капсульного оперона (Poyart et al., 2007).
Серотипы штаммов из Чешской республики, Великобритании, Португалии и
Анголы были известны.
Распределение 235 штаммов из названных регионов по серотипам
представлено на рисунке 2. 37 штаммов были отнесены к серотипу Ia, 25 – к Ib, 31
– ко II, 56 – к III, 34 – к IV, 18 – к V, 1 – к VI, 1 – к VII, 1 – к VIII.
Сопоставление данных мультиплексного типирования с результатами
анализа на локализацию генов острова показало, что не существует корреляции
между наличием острова патогенности XII и серотипом СГВ.
Масс-спектрометрический анализ штаммов стрептококков группы В
Штаммы СГВ с островом патогенности XII и без него были
проанализированы с использованием масс-спектрометрии в диапазоне
молекулярных весов от 2000 до 18000 Да, однако различия по этому признаку
между штаммами не были выявлены.
Создание рекомбинантных конструкций для экспрессии и инактивации гена
sspB1
В процессе анализа свойств гена sspB1 создана конструкция для экспрессии
гена sspB1 с применением экспрессионного вектора pQE-32, которая может быть
использована при создании вакцины против стрептококков группы В.
Конструкции для инактивации гена sspB1 по односайтовой рекомбинации и по
дойному кроссинговеру были получены на основе векторов p7ErmB и pGEMTEasy
для определения вклада гена sspB1 в формирование вирулентных свойств СГВ.
Сравнительный анализ белков SspB1 и SspB1a с гомологичными белками других
микроорганизмов
В связи с тем, что существует два гомологичных гена sspB1 и sspB1a в
штаммах СГВ, был проведен сравнительный компьютерный анализ белка SspB1 и
его гомолога SspB1a. В результате анализа обнаружили, что белок SspB1a имеет
более высокую степень гомологии со сходными по строению белками других
микроорганизмов, что свидетельствует о большей распространенности белка
SspB1a по сравнению с белком SspB1. По результатам филогенетического анализа
можно сделать предположение о том, что ген, кодирующий белок SspB1,
принадлежал к геному общего предка с бактериями, содержащими гомологи
SspB1a, после чего в процессе эволюции произошла дивергенция данных генов,
которые в настоящее время обнаруживаются в различных штаммах СГВ (рисунок
3). Не исключено, что гены sspB1 и sspB1a попали в СГВ из различных хозяев в
процессе горизонтального переноса.
10
Гены gbs1307, gbs1308, gbs1311, gbs1314, gbs1316, gbs1324, gbs1325, gbs1327, gbs1335, gbs1338, gbs1343, gbs1344, gbs1348,
gbs1352, gbs1356, gbs1360, gbs1364, gbs1374, gbs1376 кодируют LmB; ScpB; транспозазу; сайт-специфическую рекомбиназу
из семейства фаговых интеграз; белок, участвующий в репликации плазмиды; рестриктазу типа IIG и метилтрансферазу;
сайт-специфическую рекомбиназу из семейства фаговых интеграз; LacX; LacB; релаксазу; zeta токсин; epsilon антитоксин;
белок Zn-finger; метилтрансферазу; SspB1; компонент системы секреции IVC VirB4; компонент системы секреции IVC
VirD4; рибосомный белок 50S; АТФ-зависимую Clp протеазу соответственно. Стрелками обозначены относительные
размеры и направление трансляции генов, локализованных на «острове патогенности».
Рисунок 1 – Генетическая организация острова патогенности XII СГВ
11
gbs1343
gbs1348
gbs1352
sspB1
gbs1360
gbs1364
gbs1376
Россия
A
-
-
-
-
-
-
+
2
Россия
B
-
+
+
-
-
-
+
1
Россия
C
+
-
-
-
-
-
+
10
Россия
D
+
+
+
+
+
+
+
5
Россия
E
-
+
+
+
+
-
+
1
Россия
F
+
+
-
+
+
-
+
12
США
A
-
-
-
-
-
-
+
9
Чешская
A
-
-
-
-
-
-
+
штаммов
Страна
95
Число
Тип
организации
генома*
Таблица 1 – Анализ штаммов стрептококков группы В методом ПЦР
республика
16
Германия
A
-
-
-
-
-
-
+
10
Великобритания
A
-
-
-
-
-
-
+
12
Португалия
A
-
-
-
-
-
-
+
44
Португалия
G
nt
nt
nt
-
nt
nt
nt
19
Ангола
G
nt
nt
nt
-
nt
nt
nt
* Типы организации генома представлены в виде буквенных обозначений
nt – не тестированы
12
35
30
Великобритания
25
Германия
20
Португалия
Россия
15
США
10
Чешская республика
Ангола
5
0
Ia
Ib
II
III
IV
V
VI
VII VIII NT
Рисунок 2 – Серотипы штаммов СГВ
Рисунок 3 – Дендрограмма белков SspB1, SspB1a и их гомологов
Определение распространенности гена sspB1a
Российские и зарубежные штаммы СГВ, у которых отсутствовал ген sspB1,
проанализировали на наличие гена sspB1a. В результате было обнаружено, что
распространенность гена sspB1a среди штаммов СГВ различного географического
происхождения оказалась значительно выше по сравнению с таковой гена sspB1
(рисунок 4).
13
Определение области интеграции острова патогенности, ассоциированного с
геном sspB1
Исследование распространенности острова патогенности XII среди штаммов
СГВ выявило определенное противоречие в данных научной литературы,
посвященной организации геномов СГВ. Известно, что ген scpB, первоначально
локализованный на PAI XII, встречается у 100% штаммов, выделенных от
человека (Chmouryguina et al., 1996; Dmitriev et al., 1999; Glaser et al., 2002).
Однако по результатам ПЦР анализа остров патогенности XII был обнаружен
только у 14% штаммов СГВ из России. В связи с этим было сделано
предположение о том, что ген scpB не обязательно принадлежит к PAI XII, а
может быть локализован на другом генетическом элементе. Так, показано, что
гены scpB и lmb входят в состав сложного транспозона (Franken et al., 2001; Al
Safadi et al., 2010). Анализ результатов ПЦР и компьютерных данных выявил
присутствие в составе PAI XII трех мобильных генетических элементов: сложного
транспозона (PAI-С), геномного островка (PAI-В) и острова патогенности,
ассоциированного с геном sspB1 (PAI-A).
Рисунок 4 – Распространенность генов sspB1a и sspB1 среди штаммов СГВ
В межгенном пространстве генов gbs1324-gbs1325 и gbs1373-gbs1374 были
обнаружены нуклеотидные последовательности, образующие вторичные
структуры в виде «шпилек». Наличие двух «шпилек» в областях gbs1324-gbs1325
и gbs1373-gbs1374 допускает возможность ошибки репликации хромосомной ДНК
с «выщеплением» мобильного элемента в виде автономного ДНК фрагмента.
В геноме штамма 2603V/R в области острова патогенности XII
присутствуют гомологи генов, локализованных на PAI 89К Streptococcus suis
14
(Chen et al., 2007, Li et al., 2011). Такие же прямые повторы были обнаружены на
интегративных конъюгативных элементах, прилегающих к гену рибосомного
белка, у штаммов СГВ NEM316, 2603V/R, A909 (Brochet et al., 2008). В результате
компьютерного поиска повторы были обнаружены на 3’ конце гена gbs1374,
кодирующего рибосомный белок 50S, и в межгенном пространстве генов gbs1313gbs1314, gbs1324-gbs1325. Повторы в межгенном пространстве gbs1313-gbs1314,
gbs1324-gbs1325 и на 3’ конце гена gbs1374 подтверждают выдвинутую, на
основании данных ПЦР, гипотезу о комплексной организации острова
патогенности XII, включающего три мобильных генетических элементов (рисунок
5). Способность острова патогенности PAI-А и геномного островка PAI-B
выходить из генома как совместно, так и по отдельности была показана с
использованием ПЦР анализа.
Рисунок 5 – Структура острова патогенности XII
Так как было установлено, что остров патогенности XII включает все три
упомянутые структуры, однако приведенные выше данные о распространенности
этого острова среди штаммов СГВ относятся не ко всему генетическому элементу,
а только к той его части, которая ассоциирована с геном sspB1 и обозначенному
как PAI-A. Таким образом, распространенность острова патогенности PAI-A
составляет 14%, тогда как в геноме изученных зарубежных штаммов данный
элемент не был обнаружен.
15
Сравнительный анализ острова патогенности, ассоциированного с геном
sspB1, с островом патогенности, ассоциированным с геном sspB1a
Остров патогенности PAI-A содержит ген sspB1. Гомолог гена sspB1 – ген
sspB1а также локализован на мобильном генетическом элементе, который в
данном исследовании был обозначен, как PAI-A1.
Сравнительный анализ структуры островов патогенности, ассоциированных
с генами sspB1 и sspB1а, позволил сформулировать предположение о том, что
острова патогенности PAI-A и PAI-A1 являются независимыми мобильными
генетическими элементами, а существенные отличия в их генетической
организации указывает на то, что дивергенция данных мобильных генетических
элементов от общего предка произошла достаточно давно. Локализация
идентичных прямых повторов на концах данных мобильных генетических
элементов, имеющих гомологичные области, может привести к формированию
нового генетического элемента.
Молекулярно-генетический анализ штаммов СГВ, использованных в работе
показал, что распространенность гена sspB1a оказалась значительно выше, чем
распространенность гена sspB1. Следовательно, распространенность острова
патогенности PAI-A1, ассоциированного с геном sspB1a, превышает
распространенность острова патогенности PAI-A, ассоциированного с геном
sspB1. Штаммы СГВ, несущие PAI-A1, в отличие от штаммов с PAI-A
циркулируют не только в России, но и в зарубежных странах.
Не обнаружено корреляции между наличием гена sspB1a, острова PAI-A1 и
серотипом СГВ.
В Санкт-Петербурге (Россия) циркулируют штаммы СГВ, содержащие
несколько вариантов островов патогенности, гомологичных PAI-A и PAI-A1.
Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов, ассоциированных
с геном sspB1a
В связи с отсутствием PAI-A в штаммах из стран зарубежья, коллекция
штаммов СГВ из Португалии и Анголы была проанализирована на наличие генов
мобильных генетических элементов PAI-A1 и PAI-В, распространенность которых
составила 13% и 87% соответственно. Объединив с ранее полученными
результатами, выявили, что геномный островок PAI-В встречается у 66% штаммов
СГВ, а остров патогенности PAI-A1 – у 33% штаммов, что указывает на большую
распространенность по сравнению с островом патогенности PAI-A.
Заключение
Стрептококки группы В являются актуальными возбудителями тяжелых и
часто смертельных заболеваний человека и животных. Относительно высокая
16
скорость эволюции генома СГВ обусловлена присутствием мобильных
генетических элементов, в частности островов патогенности, несущих гены,
способствующие быстрой адаптации микроорганизма к новым экологическим
нишам.
Проведенное исследование было посвящено одному из таких мобильных
генетических элементов – острову патогенности XII, присутствие которого в
геноме СГВ ассоциировано с вирулентным фенотипом. Установлено, что в геноме
штаммов СГВ, изолированных в различных географических регионах,
гетерогенный по структуре остров патогенности XII встречается с разной
частотой. Анализ генетический организации выявил три мобильных элемента в
составе острова патогенности XII: сложный транспозон PAI-C, геномный островок
PAI-B и один из двух вариантов острова патогенности: PAI-A или PAI-A1а,
ассоциированных с генами sspB1 или sspB1a (гомолог sspB1) соответственно.
Рекомбинантный фрагмент белка SspB1 (продукт гена sspB1) используется в
качестве одного из компонентов разрабатываемой в отделе молекулярной
микробиологии вакцины против СГВ.
В работе осуществлено клонирование фрагмента гена sspB1 в
экспрессионном векторе и созданы новые конструкции для инактивации гена
sspB1.
Установлено, что доля штаммов (зарубежных), несущих PAI-A1,
значительно превышала таковую для PAI-A. Данные последовательности
кодируют глюкан-связывающие белки и адгезины – факторы вирулентности
многих грамположительных патогенных стрептококков и энтерококков. Наличие
нескольких мобильных элементов в составе изученного острова патогенности XII
СГВ свидетельствует о возможности формирования новых мобильных
генетических элементов посредством горизонтального переноса генов.
Выявленное методом ПЦР многообразие генотипов российских штаммов
СГВ по острову патогенности XII отражает гетерогенность структуры данного
генетического элемента и имеет значение для эпидемиологической диагностики и
мониторинга СГВ инфекции в России.
Выводы
1)
Остров патогенности XII стрептококков группы B состоит из трех
мобильных генетических элементов: сложного транспозона PAI-C, геномного
островка PAI-B и острова патогенности PAI-A, ассоциированного с геном sspB1.
Геномный островок и остров патогенности фланкированы прямыми повторами.
2)
Остров патогенности PAI-A был обнаружен только в штаммах
стрептококков группы В из России и отсутствовал в геномах штаммов из ряда
зарубежных стран.
17
3)
Острова патогенности PAI-A и PAI-A1, ассоциированные с генами sspB1 и
sspB1a соответственно, являются независимыми генетическими элементами,
способными самостоятельно «выщепляться» из хромосомы.
4)
Распространенность острова патогенности PAI-A1 составила 33% среди
российских
и
зарубежных
штаммов,
что
значительно
превышает
распространенность острова патогенности PAI-A (14%).
5)
Сконструированы векторы для экспрессии и инактивации гена sspB1.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1)
Афиногенова, А. Г. Влияние
бигуанидов
на
формирование
стрептококковой биопленки на модели культуры клеток фибробластов кожи
эмбриона человека [Текст] / А. Г. Афиногенова, К. Б. Грабовская, Е. В.
Кулешевич, А. Н. Суворов, Г. Е. Афиногенов // Инфекции в хирургии. – 2011.
– Т. 9, № 1. – С. 3-11.
2)
Кулешевич, Е. В. Анализ «острова патогенности» № XII в клинических
штаммах стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич // Медицинский
академический журнал. – 2010. – Т. 10, № 5. – С. 87.
3)
Кулешевич, Е. В. Генетическая организация «острова патогенности» № XII
стрептококков группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич // Сборник тезисов III
Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские
научные чтения – 2009». – 2009. – С. 113.
4)
Кулешевич, Е. В. Изучение «острова патогенности» стрептококков группы В
[Текст] / Е. В. Кулешевич // Приложение к журналу «Вестник Российской
Академии медицинских наук» №6. – 2008. – С. 228.
5)
Кулешевич, Е. В. Распространенность и генетическая организация
«острова патогенности» №XII у клинических штаммов стрептококков
группы В [Текст] / Е. В. Кулешевич, А. М. Савичева, О. Н. Аржанова, А. Н.
Суворов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2013. –
№1. – С. 26-30.
6)
Кулешевич, Е. В. Сравнительная характеристика организации «острова
патогенности» №XII в различных штаммах стрептококков группы В [Текст] /
Е. В. Кулешевич // Медицинский академический журнал. – 2012. – Т.12, № 4. –
С. 49-51
7)
Пат. 2542483 Российская Федерация, МПК С07К14/315, С12N15/09,
C12N15/31,C12N1/21, A61K38/16. Рекомбинантный полипептид StV,
обладающий протективными свойствами в отношении Streptococcus
agalactiae, рекомбинантная ДНК StV, его кодирующая и рекомбинантный
штамм Escherichia coli M15-StV, содержащий рекомбинантную плазмиду
PQE-StV [Текст] / А.Н. Суворов, Т.В. Гупалова, Е.В. Кулешевич, К.Б.
18
Грабовская, Г.Ф. Леонтьева; заявитель и патентообладатель ФГБУ
«НИИЭМ» СЗО РАМН. – №2012120508/10; заявл. 17.05.2012; опубл. 20.02.2015,
Бюл. №5. – 13 с.
8)
Grabovskaya, K. SspB1 – streptococcal surface protein as possible component of
recombinant streptococcal vaccine [Text] / K. Grabovskaya, T. Gupalova, G. Leontieva,
A. Korjueva, L. Meringova, E. Kuleshevitch, A. Totolian, A. Suvorov // Clinical
Microbiology and Infection. – 2009. – Vol.15, N 4. – P. O176.
9)
Kuleshevich, E. Distribution of pathogenicity island XII of group B streptococci
[Text] / E. Kuleshevich, A. Savicheva, A. Suvorov // Clinical Microbiology and
Infection. – 2011. – Vol. 17, N s4. – P. S249.
10) Kuleshevich, E. Genetic organization of pathogenicity island XII of group B
streptococci [Text] / E. Kuleshevich, A. Suvorov // Clinical Microbiology and Infection.
– 2010. – Vol. 16, N 2. – P. S587.
11) Kuleshevich, E. The analysis of group B streptococcal gene sspB1 localized on
pathogenisity island [Text] / E. Kuleshevich, К. Grabovskaya, G. Leontieva, A. Suvorov
// Abstract book of XVIII Lancefield International Symposium. – 2011. – P. 170.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
14
Размер файла
874 Кб
Теги
xii, структура, стрептококков, группы, патогенность, остров
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа