close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Дофамин-продуцирующие нейроны тубероинфундибулярной системы гипоталамуса пластичность и роль в регуляции лактотрофов

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Курина Анна Юрьевна
ДОФАМИН-ПРОДУЦИРУЮЩИЕ НЕЙРОНЫ
ТУБЕРОИНФУНДИБУЛЯРНОЙ СИСТЕМЫ ГИПОТАЛАМУСА:
ПЛАСТИЧНОСТЬ И РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ЛАКТОТРОФОВ
03.03.01 – физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2016
Работа выполнена в лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций
Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института
биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Научный руководитель
доктор биологических наук,
профессор, академик РАН
Угрюмов Михаил Вениаминович
Официальные оппоненты
доктор медицинских наук, профессор
Ковалев Георгий Иванович,
зав. лабораторией радиоизотопных методов
исследований Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Научноисследовательский институт фармакологии
имени В.В. Закусова»
доктор биологических наук
Базян Ара Саакович,
зав. лабораторией нейрохимических
механизмов обучения и памяти
Федерального государственного бюджетного
учреждения науки «Институт высшей нервной
деятельности и нейрофизиологии РАН»
Ведущая организация
Федеральное государственное
учреждение науки Институт
им. И.П. Павлова РАН
бюджетное
физиологии
Защита состоится «___» ноября 2016 г. в ____ часов на заседании
диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте
Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.ru/.
Автореферат разослан «___»_____________ 2016 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Бойко О.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность и современное состояние проблемы
Ключевую роль в нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции
организма
играют
дофаминергические
(ДА-ергические)
нейроны
тубероинфундибулярной системы мозга, включающей аркуатное ядро
медиобазального гипоталамуса и срединное возвышение. Дофамин (ДА),
синтезирующийся в ДА-ергических нейронах аркуатного ядра, выделяется из
аксонов в срединном возвышении в портальный кровоток, ингибируя секрецию
пролактина через рецепторы ДА, расположенные на лактотрофах гипофиза
[Ben-Jonathan and Hnasko, 2001]. В предыдущих исследованиях в нашей
лаборатории было показано, что ДА в аркуатном ядре синтезируется не только
в ДА-ергических нейронах, содержащих оба фермента синтеза ДА –
тирозингидроксилазу и декарбоксилазу ароматических L-аминокислот, но и
тандемами недофаминергических моноферментных нейронов, содержащих по
одному из комплементарных ферментов синтеза ДА. Число таких нейронов у
плодов крыс превышает 99% от общего числа нейронов, экспрессирующих
ферменты синтеза ДА [Balan et al., 2000]. При этом было показано, что в
моноферментных нейронах, содержащих тирозингидроксилазу, из L-тирозина
синтезируется L-диоксифенилаланин (L-ДОФА), который выделяется из этих
нейронов в межклеточное пространство и с помощью транспортера больших
нейтральных аминокислот переносится в моноферментные нейроны,
содержащие только декарбоксилазу ароматических L-аминокислот, где и
происходит синтез ДА [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov et al., 2013]. Однако у
взрослых животных, у которых количество моноферментных нейронов
составляет около 50% от общего числа нейронов, экспрессирующих ферменты
синтеза ДА [Ershov et al., 2002а], не было получено доказательство переноса LДОФА между моноферментными нейронами в процессе кооперативного
синтеза ДА. Интерес к проблеме кооперативного синтеза в значительной
степени обусловлен его вовлеченностью в компенсаторные процессы,
развивающиеся при патологии – функциональной недостаточности ДАергических нейронов. Однако, для более отчетливого понимания роли
кооперативного синтеза в патологии, необходимо изучение его механизмов в
норме.
Дегенерация ДА-ергических нейронов тубероинфундибулярной системы у
человека приводит к нарушению репродуктивной функции, в частности к
развитию синдрома гиперпролактинемии. Гиперпролактинемия является
социально значимым заболеванием, при котором, в отличие от традиционных
нейродегенеративных заболеваний – болезни Паркинсона и болезни
Альцгеймера, страдают люди в репродуктивном периоде жизни [Serri et al.,
2003]. Поскольку изучение клеточных и молекулярных механизмов синдрома
гиперпролактинемии
у
людей
крайне
ограничено,
используют
экспериментальные модели, основанные на введении в боковые желудочки
мозга 6-гидроксидофамина (6-ГДА) – нейротоксина, вызывающего гибель ДА3
ергических и норадренергических (НА-ергических) нейронов [Glinka, 1997;
Jonsson, 1983]. На данной экспериментальной модели было показано, что на 14й день после введения токсина происходит снижение уровня ДА в
тубероинфундибулярной системе и увеличение уровня пролактина в крови.
Однако уже на 45-й день оба показателя приходят в норму, т.е. наблюдается
компенсация [Fenske and Wuttke, 1976; Зиязетдинова и др., 2008]. Интересно,
что при гибели примерно половины ДА-ергических нейронов аркуатного ядра
под действием 6-ГДА было обнаружено увеличение числа моноферментных
нейронов в этой области мозга [Ershov et al., 2005]. Это позволило выдвинуть
гипотезу о том, что компенсация происходит за счет усиления кооперативного
синтеза ДА моноферментными нейронами в тубероинфундибулярной системе
[Зиязетдинова и др., 2008].
В настоящее время важной является проблема определения клеточномолекулярных механизмов регуляции синтеза ДА в моноферментных нейронах,
что может служить основой для разработки фармакотерапии нового поколения
при гиперпролактинемии. Так, в предыдущем исследовании нашей лаборатории
было показано, что экспрессия тирозингидроксилазы в вазопрессинергических
нейронах супраоптического ядра находится под ингибиторным контролем НАергических афферентов [Abramova et al., 2011]. Более того, раннее были
получены косвенные подтверждения, что так же регулируется экспрессия
ферментов синтеза ДА в моноферментных нейронах тубероинфундибулярной
системы [Daikoku et al., 1986; Дильмухаметова и др., 2009]. Поскольку 6-ГДА
вызывает гибель и НА-ергических нейронов, модель гиперпролактинемии с
введением 6-ГДА была дополнена одновременным введением с 6-ГДА и
десметилимипрамина (ДМИ) – ингибитора обратного захвата норадреналина
(НА) [Sheward, 1985]. В этом случае, в отличие от модели с введением только 6ГДА,
отсутствовала
компенсация
синтеза
ДА
и
сохранялась
гиперпролактинемия [Дильмухаметова и др., 2009]. В связи с этим важно было
получить прямое доказательство ингибирующего влияния НА на синтез ДА в
моноферментных нейронах тубероинфундибулярной системы.
Дофамин-продуцирующие нейроны тубероинфундибулярной системы
оказывают ингибирующее влияние не только на секрецию пролактина, но и на
пролиферацию лактотрофов гипофиза, что также может приводить к
гиперпролактинемии [Ishida et al., 2007; Kelly et al., 1997]. Однако в
подавляющем
большинстве
работ,
выполненных
на
моделях
гиперпролактинемии,
пролиферативная
активность
лактотрофов
не
рассматривается.
Изучение
влияния
дефицита
катехоламинов
на
пролиферативную
активность
лактотрофов
при
функциональной
недостаточности тубероинфундибулярной системы является важной задачей,
поскольку хроническая гиперпролактинемия и усиленная пролиферация
лактотрофов у человека со временем приводит к развитию пролактиномы –
опухоли гипофиза и бесплодию [Fagila, 1988].
4
Цель и задачи исследования
Целью данной работы явилось изучение механизмов пластичности дофаминпродуцирующих нейронов тубероинфундибулярной системы гипоталамуса
в норме, при нейродегенерации и их роли в регуляции лактотрофов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1) Получить доказательство переноса L-ДОФА между моноферментными
нейронами
в
процессе
кооперативного
синтеза
дофамина
в тубероинфундибулярной системе у крыс в норме.
2) Оценить вклад моноферментных и дофаминергических нейронов в синтез
дофамина в тубероинфундибулярной системе у крыс при функциональной
недостаточности катехоламинергических систем:
а) на модели дефицита норадреналина и дофамина;
б) на модели дефицита дофамина.
3) Оценить роль дофамина и норадреналина в регуляции пролиферации
лактотрофов:
а) на модели дефицита норадреналина и дофамина;
б) на модели дефицита дофамина.
Научная новизна работы
Впервые получено окончательное доказательство транспорта L-ДОФА из
нейронов, содержащих тирозингидроксилазу, в нейроны, содержащие
декарбоксилазу ароматических L-аминокислот в процессе кооперативного
синтеза ДА моноферментными нейронами в тубероинфундибулярной системе
гипоталамуса у взрослых крыс в норме.
Впервые получены прямые доказательства того, что кооперативный синтез
ДА моноферментными нейронами является одним из механизмов пластичности
мозга, направленных на компенсацию функциональной недостаточности
тубероинфундибулярной системы при дегенерации части ДА-ергических
нейронов.
Впервые получены доказательства ингибирующего влияния НА-ергических
афферентов
на
синтез
ДА
в
моноферментных
нейронах
тубероинфундибулярной системы.
Впервые показано, что в условиях хронического дефицита ДА in vivo сроком
1,5 месяца ДА и НА не оказывают существенного влияния на пролиферацию
лактотрофов.
Практическая значимость работы
В работе получены доказательства транспорта L-ДОФА между
моноферментными нейронами в процессе осуществления кооперативного
5
синтеза ДА в тубероинфундибулярной системе. Показана роль кооперативного
синтеза ДА как одного из важнейших механизмов пластичности мозга при
функциональной недостаточности тубероинфундибулярной ДА-ергической
системы, а также механизмы регуляции кооперативного синтеза ингибирующее влияние НА на синтез ДА моноферментными нейронами.
Полученные результаты могут внести важный вклад в разработку
фармакотерапии при гиперпролактинемии.
Положения, выносимые на защиту
1. В тубероинфундибулярной системе гипоталамуса у взрослых крыс синтез ДА
осуществляется
не
только
ДА-ергическими,
но
и
совместно
недофаминергическими моноферментными нейронами. При этом в процессе
кооперативного синтеза промежуточный продукт синтеза ДА - L-ДОФА
переносится из нейронов, содержащих тирозингидроксилазу, в нейроны,
содержащие декарбоксилазу ароматических L-аминокислот.
2. Кооперативный синтез ДА моноферментными нейронами является одним из
механизмов
пластичности
мозга,
направленных
на
компенсацию
функциональной недостаточности тубероинфундибулярной ДА-ергической
системы.
3. НА, поступающий в тубероинфундибулярную систему из ствола мозга,
оказывает ингибирующее влияние на синтез ДА в моноферментных нейронах,
предотвращая усиление кооперативного синтеза ДА этими нейронами.
4. При хроническом дефиците ДА и НА (1.5 месяца) не происходит ожидаемого
усиления пролиферации лактотрофов, что не исключает этого при более
длительном дефиците ДА.
Апробация результатов
Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на
российских и международных симпозиумах: конференциях молодых ученых
ИБР РАН (Москва, 2013, 2014); всероссийской конференции с международным
участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и
патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2014); IV Международной
междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной
регуляции физиологических функций» (Москва, 2015.).
6
Личный вклад автора
Все этапы работы: планирование, выполнение экспериментов и дальнейший
анализ полученных данных выполнены автором лично в Институте биологии
развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них статей в
журналах, соответствующих перечню ВАК – 2, статей в иностранных
рецензируемых журналах – 1, тезисов и материалов конференций – 4.
Работа поддержана следующими грантами:
Российский гуманитарный научный фонд 09-06-00543А (2012-2014 гг.);
Программа Президиума РАН «Механизмы интеграции молекулярных систем
при реализации физиологических функций» (2013-2015 гг.); Федеральная
целевая программа “Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–
2020 годы” (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0073).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 114 страницах, содержит 43 рисунка, 3
таблицы и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы,
материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список
сокращений и список литературы. Библиография включает 253 источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные
Работа проводилась на самцах крыс линии Вистар весом 220-250 г. Все
манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом,
утвержденным комиссией по биоэтике Института биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН и находящимся в соответствии с национальными и
международными требованиями.
7
Эксперименты и подготовка материала
Инъекции 6-гидроксидофамина и десметилимипрамина
Для моделирования дефицита катехоламинов животным вводили: в 1-й
группе (модель дефицита ДА и НА) – внутрибрюшинно 0.9% NaCl, через 40
мин стереотаксически в боковой желудочек мозга 250 мкг 6-ГДА (Sigma,
США), растворенного в 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой
(стабилизатор-антиоксидант); во 2-й группе (модель дефицита ДА) –
внутрибрюшинно ДМИ (25 мг/кг веса) (Sigma, США) в 0.9% NaCl, через 40 мин
в боковой желудочек мозга 250 мкг 6-ГДА в 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1%
аскорбиновой кислотой. В соответствующих контрольных группах вместо 6ГДА вводили 15 мкл 0.9% NaCl с 0.1% аскорбиновой кислотой.
Инъекции бромдезоксиуридина
Для выявления пролиферирующих лактотрофов гипофиза на 14-й и 45-й дни
после инъекций 6-ГДА или ДМИ и 6-ГДА с соответствующими контролями
животным внутрибрюшинно вводили бромдезоксиуридин (Sigma, США, 100
мг/кг веса; в концентрации 20 мкг/мл на 0,9% NaCl с 0,007н NaOH). Инъекции
бромдезоксиуридина проводили один раз в день в течение 4 дней с интервалом
24 часа.
Проточная инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса и черной
субстанции
Для проточной инкубации использовали слайсы (срезы) медиобазального
гипоталамуса и черной субстанции. Животных декапитировали, вскрывали
черепную коробку, аккуратно перерезали оптические нервы, стебель гипофиза
и черепно-мозговые нервы и быстро выделяли мозг. При помощи вибратома
(Vibratome 1000 Plus, Sectioning system, Германия) делали фронтальные слайсы
мозга толщиной 300 мкм в растворе Кребса-Рингера следующего состава (мМ):
NaCl 120, KCl 4.8, CaCl2 2.0, MgSO4 1.2, NaHCO3 25, D-глюкоза 10.1, HEPES
20) (pH=7.4) при +4ºС. Было использовано 16 интактных животных для
приготовления слайсов медиобазального гипоталамуса - под контролем
бинокулярной лупы вырезали 4 слайса, с координатами от 2.3 мм до 3,5 мм
каудальнее брегмы [Paxinos et al., 2009]. Материал от 16 других интактных
животных использовали для приготовления слайсов черной субстанции вырезали 3 слайса области компактной части черной субстанции, с
координатами от 4,8 мм до 5,7 мм каудальнее брегмы. Полученные слайсы от
медиобазального гипоталамуса и черной субстанции делили на 2
симметричные половины – правую и левую. Слайсы помещали в
термостатируемые (+37ºС) камеры объемом 400 мкл и инкубировали в
проточном растворе Кребса-Рингера. Постоянную скорость (100 мкл/мин)
протока раствора через камеры обеспечивали с помощью перистальтического
насоса Ismatec IPC (Micropump Ltd, США).
8
Инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса и черной субстанции
с L-лейцином
В первой серии эксперимента левые половины слайсов медиобазального
гипоталамуса инкубировали в растворе Кребса-Рингера в течение 40 мин –
период стабилизации, в течение которого фракции оттекающей инкубационной
среды не собирали. Затем левые половины слайсов медиобазального
гипоталамуса продолжали инкубировать в растворе Кребса-Рингера в течение
60 минут, собирая три последовательные 20-ти минутные фракции
инкубационной среды, оттекавшей из камер. В это же время камеры с правыми
половинами слайсов медиобазального гипоталамуса инкубировали в растворе
Кребса-Рингера с добавлением 0.5 мМ L-лейцина (Sigma, США) –
аминокислоты, конкурирующей с L-ДОФА за связывание с транспортером
больших нейтральных аминокислот, собирая три последовательные 20-ти
минутные фракции инкубационной среды. Левые и правые половины слайсов
черной субстанции инкубировали по такой же схеме.
Инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса и черной субстанции
с L-лейцином и толкапоном
Во второй серии эксперимента левые половины слайсов медиобазального
гипоталамуса инкубировали сначала в растворе Кребса-Рингера в течение 40
мин, как это было описано выше, а затем в течение еще 40 мин в растворе
Кребса-Рингера с добавлением 0.1 мМ толкапона (Sigma, США) – ингибитора
катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ). В этот период инкубационную среду
также не собирали. Затем левые половины слайсов медиобазального
гипоталамуса продолжали инкубировать в растворе Кребса-Рингера с
добавлением 0.1 мМ толкапона в течение 60 минут, собирая три
последовательные 20-ти минутные фракции инкубационной среды, оттекавшей
из камер. А камеры с правыми половинами слайсов медиобазального
гипоталамуса за это же время инкубировали в растворе Кребса-Рингера с
добавлением 0.1 мМ толкапона и 0.5 мМ L-лейцина. Левые и правые половины
слайсов черной субстанции инкубировали аналогичным способом.
Инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса с L-лейцином на 14-й
и 45-й день после стереотаксических инъекций
Данный эксперимент проводили на четырех исследуемых группах животных
на 14-й и 45-й день после инъекций 6-ГДА или ДМИ и 6-ГДА с
соответствующими контролями – всего 80 животных. Выделение мозга и
приготовление вибратомных слайсов медиобазального гипоталамуса проводили
по схеме, описанной выше, но с некоторыми модификациями: из мозга этих
животных выделяли не 4, а 5 слайсов толщиной 250 мкм, с координатами от 2.3
мм до 3,5 мм каудальнее брегмы. Для определения исходного уровня ДА, НА и
L-ДОФА 2 и 4 слайсы взвешивали и замораживали без инкубации
(неинкубированные слайсы), после чего левые половины слайсов
9
медиобазального гипоталамуса инкубировали в растворе Кребса-Рингера, а
правые - в растворе Кребса-Рингера с добавлением 0.5 мМ L-лейцина.
В собранные фракции среды от всех инкубаций добавляли по 100 мкл 1 М
HClO4 и по 250 пмоль/мл 3,4-дигидроксибензиламина в качестве внутреннего
стандарта, необходимого для дальнейшей высокоэффективной жидкостной
хроматографии. После окончания инкубаций слайсы взвешивали, после чего
замораживали в жидком азоте. Фракции инкубационной среды замораживали и
вместе со слайсами хранили при -70°C.
Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимической
детекцией
Измерение ДА, НА и L-ДОФА проводили при помощи обратно-фазной
высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической
детекцией (Amperometric detector LC 4B, Bioanalytical Systems, США) при
потенциале 850 мВ. Разделение производили на 10-ти сантиметровой колонке с
внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3.3 мкм (Dr. Maisch GmbH,
Германия). Содержание веществ рассчитывали методом внутреннего стандарта,
используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце с
помощью программного обеспечения «Мультихром» (Ampersand LTD, Россия).
Иммуногистохимия
Для выявления пролиферирующих лактотрофов проводили двойное
иммуномечение по пролактину и бромдезоксиуридину в гипофизе крыс на 14-й
и 45-й день после введений 6-ГДА или ДМИ и 6-ГДА с соответствующими
контролями.
Пролактин и бромдезоксиуридин выявляли на срезах гипофиза толщиной 10
мкм, приготовленных на криостате (Leica, Германия) и монтированных на
стекла. Ядра клеток выявляли с помощью DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол
дигидрохлорида). Срезы последовательно инкубировали с: (а) 0,1% Triton Х100 (Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течении 10 мин при +20°С; (б) ДНКазным
буффером (10мМ CaCl2, 40мМ TRIS-HCl, 6мМ MgCl2, 10мМ NaCl, pH 7,9) в
течении 5 мин при +20°С; (в) ДНКазы I (100 ЕА/мл) (Sigma, США) в течении 10
мин при +37°С; (г) 5% нормальной козьей сывороткой (Abcam, США), 5%
нормальной сывороткой осла (Abcam, США) и 0.3% Triton Х-100 (Sigma, США)
на 0.02 М ФСБ в течение 30 минут при +20°С; (д) поликлональными
антителами кролика к пролактину (1:1000) (AbD Serotec, США) и
моноклональными антителами мыши к БрдУ (1:250) (Santa Cruz, США) в 2,5%
нормальной козьей сыворотки (Abcam, США), 2,5% нормальной сывороткой
осла (Abcam, США) и 0.1% Triton Х-100 в течение 20 часов при +20°С; (е) Alexa
Fluor 546-конъюгированными антителами осла против иммуноглобулинов
10
кролика (Alexa Fluor antirabbit, 1:1500) (Life Technologies, США) в течение 2
часов при +20°С; (ж) Alexa Fluor 488-конъюгированными антителами козы
против иммуноглобулинов мыши (Alexa Fluor antimouse, 1:1500) (Life
Technologies, США) в течение 2 часов при +20°С; (з) DAPI (1:10000) (Sigma,
США) в течение 5 минут при +20°С. После каждой инкубации, за исключением
второй и четвертой, срезы промывали в фосфатно-солевом буфере 3 раза по 15
минут, после последней инкубации - в течение часа. Срезы заключали в
гидрофильную среду Mowiol (Calbiochem, Германия).
Микроскопия и анализ изображений
Срезы
гипофиза
после
двойного
мечения
по
пролактину
и бромдезоксиуридину были исследованы с помощью флуоресцентного
микроскопа Zeiss Observer Z1, который был оснащен фильтрами для DAPI (для
визуализации клеточных ядер), Alexa 488 (для бромдезоксиуридина) и Alexa
546 (для пролактина) с использованием программного обеспечения AxioVision
4.8. Анализировали по 3 среза гипофиза. На каждом срезе было случайно
выбрано 10 областей при увеличении объектива ×40, на которых в дальнейшем
проводили подсчет клеток, иммуно-позитивных по пролактинау, и клеток,
иммуно-позитивных по бромдезоксиуридину с помощью программы Image J.
Считали клетки только с видимыми ядрами. Митотический индекс лактотрофов
(процент делящихся лактотрофов от общего числа лактотрофов) высчитывали
по отношению количества клеток, меченных одновременно по пролактину и
БрдУ к количеству клеток, меченных только по пролактину:
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных
программ GraphPad Prism Version 6.0 для Windows (GraphPad Software, США).
Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± средняя ошибка
среднего арифметического (M±m). Для определения статистической
значимости полученных результатов были использованы параметрический tкритерий Стьюдента (Т-тест) и непараметрический U-критерий Манна-Уитни
(U- тест).
11
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Кооперативный синтез дофамина моноферментными нейронами
у крыс в норме
Функциональное значение моноферментных нейронов долгое время
оставалось не ясным, пока не было доказано, что такие нейроны способны
совместно синтезировать ДА [Ugrumov et al., 2004].
Доказательства осуществления совместного синтеза ДА моноферментными
нейронами впервые были получены в нашей лаборатории на клеточной
суспензии медиобазального гипоталамуса у плодов крыс, используя
оригинальную методологию. Так, было показано, что L-ДОФА,
синтезирующийся из L-тирозина в моноферментных нейронах, содержащих
тирозингидроксилазу, выделяется во внеклеточную среду и захватывается с
помощью транспортера больших нейтральных аминокислот в моноферментные
нейроны, содержащие декарбоксилазу ароматических L-аминокислот, где
осуществляется синтез ДА (рисунок 1) [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov, 2013].
Захват L-ДОФА из межклеточного пространства в нейроны, содержащие
декарбоксилазу ароматических L-аминокислот, может быть предотвращен при
введении в инкубационную среду в высокой концентрации больших
нейтральных аминокислот, которые в этом случае будут конкурентно
ингибировать транспортер, а следовательно захват L-ДОФА [Misu, 1996, 2003;
Uchino et al., 2002]. В исследовании на плодах крыс, у которых число
моноферментных нейронов составляет более 99% от всех нейронов,
экспрессирующих ферменты синтеза ДА, в качестве конкурентного ингибитора
поступления
L-ДОФА
в
моноферментные
нейроны,
содержащие
декарбоксилазу ароматических L-аминокислот, был использован L-тирозин
[Ugrumov et al., 2004]. При этом наблюдалось снижение уровня ДА в суспензии
клеток медиобазального гипоталамуса и в среде и повышение уровня L-ДОФА
в межклеточной среде. Эти данные являются прямым доказательством
совместного синтеза ДА моноферментными нейронами [Ugrumov et al., 2004].
Рисунок 1 – Схема синтеза дофамина в медиобазальном гипоталамусе.
ДАА – декарбоксилаза ароматических L-аминокислот;
ТГ – тирозингидроксилаза.
12
Позднее оценка кооперативного синтеза ДА была проведена в
медиобазальном гипоталамусе у взрослых крыс с использованием той же
методологии [Ugrumov et al., 2004], но с некоторыми модификациями. Вопервых, вместо клеточной суспензии были использованы виборатомные слайсы
(срезы) медиобазального гипоталамуса. Инкубация слайсов живой ткани
позволяет оценить выделение ДА и L-ДОФА в среду и их накопление в ткани в
течение нескольких часов in vitro и при этом отчасти сохранить нормальные
межнейрональные взаимоотношения, которые полностью сформированы в
мозге у взрослых животных в отличие от эмбрионального периода. Во-вторых,
поскольку L-тирозин является субстратом синтеза ДА в биферментных ДАергических нейронах, а у взрослых животных количество моно- и
биферментных нейронов примерно одинаково, в исследовании на взрослых
животных вместо L-тирозина был использован L-лейцин – аминокислота, не
влияющая на метаболизм ДА. В-третьих, в работе была использована
проточная инкубация, которая, в отличие от статичной инкубации, позволяет
исключить влияние накопленных в инкубационной среде продуктов синтеза и
деградации катехоламинов [Мельникова и др., 2012]. В результате было
продемонстрировано снижение уровня ДА в слайсах медиобазального
гипоталамуса и в среде [Мельникова и др., 2012], однако не была дана оценка
второго важного показателя синтеза ДА моноферментными нейронами –
содержания L-ДОФА в межклеточной среде. Поэтому первой задачей данной
работы явилось получение этого недостающего звена доказательства
кооперативного синтеза ДА в виде переноса L-ДОФА между
моноферментными нейронами в процессе кооперативного синтеза в
тубероинфундибулярной системе у взрослых крыс в норме. В качестве
контроля в данной работе, как и в предыдущих, была использована черная
субстанция – область мозга, в которой локализованы только биферментные ДАергические нейроны и отсутствуют моноферментные нейроны [Kitahama et al.,
1998].
В первой серии экспериментов была проведена инкубация слайсов
медиобазального гипоталамуса и черной субстанции в чистом растворе КребсаРингера и в растворе Кребса-Рингера с добавлением L-лейцина. В
медиобазальном гипоталамусе добавление в инкубационную среду L-лейцина
привело к 37% снижению содержания ДА в слайсах и 43% снижению в трех 20ти минутных фракциях среды (рисунок 2А, Б).
В отличие от медиобазального гипоталамуса, при инкубации слайсов черной
субстанции в присутствии L-лейцина содержание ДА в слайсах и в среде не
изменилось (рисунок 3А, Б). Однако при инкубации слайсов медиобазального
гипоталамуса в присутствии L-лейцина уровень L-ДОФА в оттекающей
инкубационной среде не изменился (рисунок 2Б). Это ставит под сомнение
ингибирующий эффект L-лейцина на захват L-ДОФА в моноферментные
нейроны, содержащие ДАА, а, следовательно, и саму гипотезу о кооперативном
синтезе ДА моноферментными нейронами.
13
*– достоверные различия между группами с L-лейцином и без него (р < 0,05)
Рисунок 2 - Содержание дофамина и L-ДОФА в слайсах медиобазального
гипоталамуса (А) и в среде (Б) после инкубации с L-лейцином (Leu+)
и без него (Leu-).
Рисунок 3 - Содержание дофамина и L-ДОФА в слайсах черной
субстанции (А) и в среде (Б) после инкубации с L-лейцином (Leu+)
и без него (Leu-).
Мы предположили, что увеличение L-ДОФА в среде не происходит, потому
что в эксперименте при инкубации с L-лейцином усиливается метаболизм LДОФА. L-ДОФА имеет 2 пути метаболизма: с помощью КОМТ до образования
3-О-метилдофа и с помощью декарбоксилазы ароматических L-аминокислот до
образования ДА. При инкубации слайсов медиобазального гипоталамуса с Lлейцином снижалось содержание ДА, который также как и L-ДОФА
метилируется с помощью КОМТ, однако имеет большую аффинность к этому
ферменту, чем L-ДОФА [Reenilä and Männistö, 2001], т.е. при снижении
содержания ДА L-ДОФА в большей степени начинает метаболизироваться с
помощью КОМТ. Для проверки этого предположения была проведена вторая
серия инкубаций слайсов медиобазального гипоталамуса и черной субстанции в
растворе Кребса-Рингера с добавлением в инкубационную среду толкапона 14
ингибитора КОМТ и в растворе Кребса-Рингера с добавлением толкапона и Lлейцина.
Результаты исследования показали, что при инкубации слайсов
медиобазального гипоталамуса с L-лейцином на фоне действия толкапона
наблюдалось не только 53% снижение содержания ДА в среде и 41% снижение
содержания ДА в слайсах после инкубации (рисунок 4А, Б), но и значительное
увеличение содержания L-ДОФА в инкубационной среде – на 46% (рисунок
4Б). В то время как в черной субстанции при таком же воздействии изменений в
содержании L-ДОФА, так же как и ДА, не происходило (рисунок 5А, Б), что
подтверждает наше предположение.
*– достоверные различия между группами с L-лейцином и без него (р < 0,05)
Рисунок 4 - Содержание дофамина и L-ДОФА в слайсах медиобазального
гипоталамуса (А) и в среде (Б) после инкубации с толкапоном и L-лейцином
(толкапон + Leu +) и с толкапоном без L-лейцина (толкапон + Leu -).
Рисунок 5 - Содержание дофамина и L-ДОФА в слайсах черной субстанции (А)
и в среде (Б) после инкубации с толкапоном и L-лейцином (толкапон + Leu +)
и с толкапоном без L-лейцина (толкапон + Leu -).
Таким образом, получено окончательное доказательство переноса L-ДОФА
между моноферментными нейронами в процессе кооперативного синтеза ДА в
тубероинфундибулярной системе у взрослых крыс в норме.
15
Кооперативный синтез дофамина моноферментными нейронами у крыс
при нейродегенерации
Использованные модели дефицита катехоламинов
Гипоталамо-гипофизарная система является важнейшим центром регуляции
репродуктивной функции организма, и в первую очередь, регуляции секреции
пролактина лактотрофами гипофиза. Эта регуляторная система состоит из трех
функционально взаимосвязанных элементов: ДА-продуцирующих нейронов
гипоталамуса, НА-ергических нейронов ствола мозга и пролактинсекретирующих клеток гипофиза (лактотрофов) (рисунок 6).
Рисунок 6 - Катехоламинергическая регуляция секреции пролактина.
В следующих разделах работы эксперименты были проведены на двух
раннее разработанных в нашей лаборатории моделях дефицита катехоламинов
в тубероинфундибулярной системе [Зиязетдинова и др., 2008; Дильмухаметова
и др., 2009]. На обеих моделях крысам за 14 и 45 дней до взятия материала в
боковые желудочки мозга вводили 6-ГДА - нейротоксин, который обладает
структурным сходством с ДА и НА, благодаря чему захватывается в ДАергические и НА-ергические нейроны, где способствует разобщению
окислительного фосфорилирования в митохондриях, что приводит к
оксидативному стрессу и гибели нейронов [Glinka, 1997; Jonsson, 1983]. При
этом было показано, что на 14-й день после введения 6-ГДА происходит
снижение уровня ДА в медиобазальном гипоталамусе и увеличение уровня
пролактина в крови, однако к 45-му дню оба показателя приходят в норму, то
есть происходит компенсация [Fenske and Wuttke, 1976; Зиязетдинова и др.,
2008]. На второй модели крысам перед внутрижелудочковом введении 6-ГДА
внутрибрюшинно вводили ДМИ, который связывается с мембранным
переносчиком на НА-ергических нейронах и таким образом ингибирует
обратный захват НА, предотвращая захват 6-ГДА и дегенерацию НАергических нейронов [Fulceri, 2006; Sheward, 1985]. При этом было показано,
что на 14-й день происходит снижение уровня ДА в медиобазальном
гипоталамусе и увеличение уровня пролактина в крови, но на 45-й день
16
восстановления не происходит, уровень ДА остается пониженным, а уровень
пролактина – увеличенным [Дильмухаметова и др., 2009].
В качестве доказательства воспроизводимости моделей определяли
содержание ДА и НА в неинкубированных слайсах медиобазального
гипоталамуса. На 14-й день после введения 6-ГДА наблюдалось снижение
содержания ДА на 75% и снижение содержания НА на 86% по сравнению с
соответствующим контролем (рисунок 7А, Б). На 45-й день после введения
6-ГДА содержание ДА восстановилось до уровня контроля, а содержание НА
было снижено на 92% по сравнению с контролем (рисунок 7А, Б).
На 14-й день после введения 6-ГДА при предварительном введении ДМИ
содержание ДА снизилось на 67% по сравнению с контролем, а содержание НА
было снижено на 57% по сравнению с контролем (рисунок 7А, Б). На 45-й день
после введения 6-ГДА на фоне действия ДМИ содержание ДА было ниже на
65%, чем в контроле, в то время как содержание НА было снижено в меньшей
степени, чем на первой модели – всего на 43% от контрольного уровня
(рисунок 7А, Б). Несмотря на то, что на 45-й день уровень НА не
восстанавливается до контрольного, на данной модели не происходит
компенсации ДА, в отличие от модели с введением только 6-ГДА.
* – достоверные различия между опытом и контролем; (р < 0,05)
Рисунок 7 - Содержание дофамина (А) и норадреналина (Б)
в неинкубированных слайсах медиобазального гипоталамуса на 14-й и 45-й
день после введений в боковые желудочки мозга 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl
в контроле или 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl в контроле на фоне системного
введения ДМИ.
Кооперативный синтез дофамина в тубероинфундибулярной системе
у крыс как компенсаторный механизм при нейродегенерации
Изучение механизмов пластичности мозга, направленных на компенсацию
функциональной недостаточности тубероинфундибулярной ДА-ергической
системы, может оказаться ключом к разработке фармакотерапии при
17
гиперпролактинемии. Для этого необходимо оценить вклад кооперативного
синтеза ДА моноферментными нейронами в секрецию ДА при
нейродегенерации. Как было показано в наших предыдущих исследованиях,
после дегенерации примерно половины ДА-ергических нейронов аркуатного
ядра у крыс под воздействием 6-ГДА в первые две недели развивается дефицит
ДА, а через полтора месяца синтез ДА возвращаются к норме. В этой связи
было высказано предположение, что при дегенерации ДА-ергических нейронов
усиливается кооперативный синтез ДА моноферментными нейронами
[Зиязетдинова и др., 2008]. Для проверки выдвинутой гипотезы, данное
исследование проводили на модели дефицита ДА и НА сначала на 14-й день
после введения 6-ГДА - на стадии декомпенсации, когда должна была
закончиться дегенерация нейронов в ответ на введение токсина, а затем на 45-й
день - на стадии компенсации, когда реализуются компенсаторные процессы –
механизмы пластичности мозга [Jonsson, 1983]. При дегенерации ДАергических нейронов и возникающем при этом дефиците ДА может включаться
ряд компенсаторных процессов, таких как: (а) увеличение синтеза ДА
сохранившимися ДА-ергическими нейронами; (б) прорастание аксонов ДАергических нейронов из неповрежденных токсином экстрагипоталамических
структур мозга; (в) включение экспрессии генов ферментов синтеза ДА в
недофаминергических нейронах; (г) усиление кооперативного синтеза ДА
моноферментными нейронами [Ugrumov, 2004; Ugrumov, 2014; Ugrumov, 2008;
Vos et al., 1999].
В эксперименте была использована методология, описанная выше –
инкубация слайсов медиобазального гипоталамуса в чистом растворе КребсаРингера и в растворе Кребса-Рингера с добавлением L-лейцина. На 14-й день
после внутрижелудочкового введения 0,9% NaCl (контроль) содержание ДА в
слайсах медиобазального гипоталамуса снизилось на 47% после инкубации с Lлейцином по сравнению с инкубацией без L-лейцина (рисунок 8А). На 14-й
день после внутрижелудочкового введения 6-ГДА (опыт) содержание ДА в
слайсах медиобазального гипоталамуса после инкубации с L-лейцином было на
49% ниже, чем после инкубации без L-лейцина (рисунок 8А). Аналогичная
ситуация наблюдалась в инкубационной среде: на 14-й день после введения
0,9% NaCl содержание ДА после инкубации с L-лейцином снизилось на 43% по
сравнению с инкубацией без L-лейцина, а после введения 6-ГДА - на 41%
(рисунок 8Б). Другими словами, добавление в инкубационную среду L-лейцина
вызвало одинаковое снижение содержания ДА в контрольной и опытной
группах, что говорит об одинаковом вкладе кооперативного синтеза ДА
моноферментными нейронами в секрецию ДА в период декомпенсации.
На 45-й день после внутрижелудочкового введения 0,9% NaCl содержание
ДА в слайсах медиобазального гипоталамуса после инкубации с L-лейцином
было на 40% ниже, чем после инкубации без L-лейцина (рисунок 8А), а
содержание ДА в среде - на 42% ниже, чем после инкубации без L-лейцина
(рисунок 8Б). В то время как на 45-й день после введения 6-ГДА наблюдалось
максимальное 68% снижение содержания ДА в слайсах медиобазального
18
гипоталамуса (рисунок 8А) и 52% снижение содержания ДА в среде (рисунок
8Б) после инкубации с L-лейцином по сравнению с инкубацией без L-лейцина.
Значительное снижение содержания ДА после инкубации с L-лейцином
свидетельствуют об усилении кооперативного синтеза ДА моноферментными
нейронами на 45-й день после введения токсина – в период компенсации.
Усиление кооперативного синтеза ДА на 45-й день после введения 6-ГДА
согласуется с нашими предыдущими результатами о восстановлении уровня
ДА [Зиязетдинова и др., 2008].
*– достоверные различия между группами с L-лейцином и без него (р < 0,05)
Рисунок 8 - Содержание дофамина в слайсах медиобазального гипоталамуса
(А) и в среде (Б) после инкубации с L-лейцином (Leu +) и без него (Leu -)
на 14-й и 45-й день после введений в боковые желудочки мозга 6-ГДА в опыте
и 0,9% NaCl в контроле.
Содержание L-ДОФА в среде после инкубации с L-лейцином увеличилось на
70% по сравнению с инкубацией без L-лейцина только на 45-й день после
введения 6-ГДА – в период компенсации, в то время как в других исследуемых
группах добавление в среду L-лейцина не привело к изменениям в содержании
L-ДОФА (рисунок 9). Ранее было показано, что в норме при ингибировании
кооперативного синтеза с помощью добавления в инкубационную среду Lлейцина, накопление L-ДОФА в среде происходит только при дополнительном
добавлении в среду толкапона – ингибитора КОМТ. Однако в данном
эксперименте содержание L-ДОФА увеличилось при добавлении в
инкубационную среду только L-лейцина, а это означает, что на стадии
компенсации скорость синтеза L-ДОФА в нейронах, содержащих только
тирозингидроксилазу, сильно возрастает, по сравнению с нормой и стадией
декомпенсации. Усиление кооперативного синтеза может быть связано с
увеличением
числа
моноферментных
нейронов,
содержащих
тирозингидроксилазу, происходящим при дегенерации примерно половины
ДА-ергических нейронов, что было показано ранее в морфологических
исследованиях в нашей лаборатории [Ershov et al., 2005].
19
*– достоверные различия между группами с L-лейцином и без него (р < 0,05)
Рисунок 9 - Содержание L-ДОФА в среде после инкубации с L-лейцином (Leu
+) и без него (Leu -) на 14-й и 45-й день после введений в боковые желудочки
мозга 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl в контроле.
Таким образом, компенсаторное увеличение содержания ДА в
тубероинфундибулярной системе, наблюдаемое у крыс на 45-й день после
введения 6-ГДА, обусловлено усилением кооперативного синтеза ДА
недофаминергическими моноферментными нейронами.
Влияние норадреналина на кооперативный синтез дофамина
По косвенным данным, полученным в нашей лаборатории, НА ингибирует
синтез тирозингидроксилазы в нейронах аркуатного ядра, особенно, в
вентролатеральной области, где преобладают моноферментные нейроны,
экспрессирующие только тирозингидроксилазу [Дильмухометова и др., 2009].
Так, плотность НА-ергической иннервации в вентролатеральной области
аркуатного ядра, как в контроле, так и через 45 дней после введения 6-ГДА на
фоне действия ДМИ в пять раз превышает плотность НА-ергической
иннервации дорсолатеральной области аркуатного ядра, в которой
локализованы в основном биферментные ДА-ергические нейроны. Содержание
тирозингидроксилазы через 45 дней после введения 6-ГДА на фоне действия
ДМИ увеличивается в нейронах дорсомедиальной области аркуатного ядра и не
изменяется в нейронах в вентролатеральной области. В совокупности эти
данные позволяют предположить, что НА стимулирует экспрессию гена и / или
синтеза тирозингидроксилазы в ДА-ергических биферментных нейронах и
тормозит эти процессы в моноферментных нейронах [Дильмухометова и др.,
2009]. Эти результаты согласуются с данными литературы, согласно которым в
вентролатеральной области аркуатного ядра происходит увеличение числа
тирозингидроксилаза-иммунопозитивных нейронов после деафферентации
медиобазального гипоталамуса [Daikoku et al., 1986]. Прямое доказательство
того, что НА ингибирует экспрессию тирозингидроксилазы в моноферментных
20
нейронах было получено в нашей лаборатории в отношении
вазопрессинергических нейронов супраоптического ядра гипоталамуса
[Abramova et al., 2011].
В неинкубированных слайсах медиобазального гипоталамуса на модели
дефицита ДА, в отличие от модели дефицита ДА и НА, на 45-й день после
введения токсина отсутствовала компенсация синтеза ДА и сохранялся его
дефицит, т.е. косвенно подтвердилось наше предположение о НА-ергическом
ингибиторном контроле на синтез ДА в моноферментных нейронах
медиобазального гипоталамуса. Предполагается, что устранение НАергических афферентов со временем и приводит к компенсаторному
восстановлению до нормы синтеза ДА в медиобазальном гипоталамусе, что
было показано на модели дефицита ДА и НА [Зиязетдинова и др., 2008].
Для проверки предположения об ингибирующем влиянии НА на синтез ДА в
моноферментных нейронах через 14-й и 45-й дней после внутрижелудочкового
введения 6-ГДА при предварительном системном введении ДМИ проводили
инкубацию слайсов медиобазального гипоталамуса в чистом растворе КребсаРингера и в растворе Кребса-Рингера с добавлением L-лейцина.
Результаты исследования показали, что на 14-й день после введения 0,9%
NaCl на фоне системного введения ДМИ добавление в инкубационную среду Lлейцина вызвало 51% снижение содержания ДА в слайсах после инкубации
(рисунок 10А). На 14-й день после введения 6-ГДА на фоне системного
введения ДМИ снижение содержания ДА в слайсах после инкубации составило
50% (рисунок 10А). В среде после инкубации с L-лейцином содержание ДА
снизилось на 41% в контрольной группе и на 52% в опытной. На 45-й день
после введения 0,9% NaCl на фоне системного введения ДМИ содержание ДА
после инкубации с L-лейцином по сравнению с инкубацией без L-лейцина
снизилось на 51% в ткани и на 40% в среде (рисунок 10А, Б). На 45-й день
после введения 6-ГДА на фоне системного введения ДМИ содержание ДА в
среде после инкубации с L-лейцином снизилось на 44% в слайсах и на 52% в
среде (рисунок 10А, Б). Практически одинаковое снижение содержания ДА во
всех исследуемых группах после инкубации с L-лейцином свидетельствует об
одинаковой интенсивности кооперативного синтеза моноферментными
нейронами на данной модели и согласуется с предыдущими данными об
отсутствии компенсации уровня ДА при сохранении части НА-ергических
афферентов [Дильмухометова и др., 2009].
Содержание L-ДОФА в среде после инкубации с L-лейцином не изменилось
по сравнению с пробами, инкубированными без L-лейцина на 14-й и на 45-й
день в контроле и в опыте (рисунок 11). Это свидетельствует о том, что
скорость синтеза L-ДОФА в нейронах, содержащих тирозингидроксилазу,
одинакова в обеих группах.
Таким образом, НА оказывает ингибирующее влияние на синтез ДА в
моноферментных нейронах тубероинфундибулярной системы и препятствует
усилению кооперативного синтеза ДА этими нейронами и восстановлению
уровня ДА до нормы.
21
*– достоверные различия между группами с L-лейцином и без него (р < 0,05)
Рисунок 10 - Содержание дофамина в слайсах медиобазального
гипоталамуса (А) и в среде (Б) после инкубации с L-лейцином (Leu +)
и без него (Leu -) на 14-й и 45-й день после введений в боковые желудочки
мозга 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl в контроле на фоне системного
введения ДМИ.
Рисунок 11 - Содержание L-ДОФА в среде после инкубации с L-лейцином
(Leu +) и без него (Leu -) на 14-й и 45-й день после введений в боковые
желудочки мозга 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl в контроле на фоне системного
введения ДМИ.
Влияние катехоламинов на пролиферацию лактотрофов гипофиза
при нейродегенерации
Влияние катехоламинов и их дефицита на секрецию пролактина было
продемонстрировано в наших предыдущих исследованиях: на модели дефицита
ДА и НА уровень пролактина восстанавливается к 45-му дню, а на модели
дефицита только ДА наблюдается хроническая гиперпролактинемия
[Зиязетдинова и др., 2008; Дильмухаметова и др., 2009], однако не было
22
проведено оценки пролиферативной активности лактотрофов при
функциональной недостаточности тубероинфундибулярной ДА-ергической
системы. Поэтому последней задачей данной работы явилась оценка влияния
НА и ДА на пролиферацию лактотрофов на модели дефицита ДА и НА,
вызванного введением 6-ГДА, и дефицита ДА, вызванного сочетанным
введением 6-ГДА и ДМИ.
Действительно, хотя ДА ингибирует пролиферацию лактотрофов in vitro
[Arita et al. 1998; Ishida et al. 2007], практически не существует моделей in vivo,
на которых бы оценивалось влияние ДА и НА на пролиферацию лактотрофов и
образование пролактином. Единственной моделью служат трансгенные мыши с
нокаутом гена Д2-рецепторов [Kelly et al. 1997, Saiardi et al. 1997]. С этой точки
зрения, используемые в данном исследовании токсические модели, имеют
особое значение для оценки влияния катехоламинов и их дефицита на
пролиферацию лактотрофов.
Для оценки пролиферативной активности рассчитывали митотический
индекс лактотрофов - подход, широко применяемый для оценки пролиферации
[Spady et al., 1998; Schuff et al., 2002; Oomizu et al., 2004; Sosa et al., 2013]. Для
определения пролиферирующих лактотрофов был использован метод двойного
флуоресцентного
мечения
на
пролактин
и
бромдезоксиуридин.
Бромдезоксиуридин является аналогом тимидина, который встраивается в ДНК
клетки в S-фазе митотического цикла конкурентно с тимидином [Miller and
Nowakowski, 1988]. Поскольку гипофиз относится к органам с низкой
пролиферативной активностью [Carbajo-Perez and Watanabe, 1990], было
проведено 4 инъекции бромдезоксиуридина с интервалом 24 часа для захвата
большего числа пролиферирующих клеток.
#– тенденция между опытом и контролем (р < 0,1)
Рисунок 12 - Митотический индекс лактотрофов на 14-й и 45-й день
после введений в желудочки мозга 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl в контроле (А)
или 6-ГДА в опыте и 0,9% NaCl в контроле на фоне системного введения
ДМИ (Б).
23
Рисунок 13 – Флуоресцентная микроскопия.
Двойное иммуномечение пролактина (красный) и бромдезоксиуридина
(зеленый) в гипофизе у крыс на 45-й день после введения в боковые желудочки
мозга NaCl (А) или 6-ГДА (Б) на фоне системного введения ДМИ.
Ядра окрашены с помощью DAPI (синий). Бар - 10 мкм.
непролиферирующие лактотрофы
пролиферирующие лактотрофы.
Результаты данного исследования показали, что через 14 дней после
внутрижелудочкового введения 6-ГДА пролиферативная активность
лактотрофов не отличалась от контрольного уровня на обеих моделях (рисунок
12А, Б). На модели дефицита ДА и НА, т.е. при восстановлении уровня ДА к
45-му дню после введения токсина изменения пролиферативной активности
лактотрофов также не происходило (рисунок 12А). В то же время на модели
дефицита только ДА на 45-й день после введения 6-ГДА на фоне действия
ДМИ наблюдалась тенденция к увеличению пролиферативной активности
лактотрофов (рисунок 12Б, 13). Это может свидетельствовать о том, что
пролиферативная активность лактотрофов будет усиливаться при длительном
дефиците ДА (более 1,5 месяцев).
Полученный нами результат хорошо согласуется с результатами предыдущих
исследований, в которых показано отсутствие увеличения веса гипофиза к 45му дню на модели дефицита ДА [Дильмухометова и др., 2010]. Вероятно, при
24
дальнейшем дефиците ДА пролиферативная активность гипофиза увеличится,
учитывая, что у мышей, с нокаутом гена Д2-рецепторов гиперплазия
лактотрофов развивается значительно позднее - с восьмого месяца жизни
животного [Saiardi et al., 1997]. В этой связи наше исследование необходимо
продолжить – пролонгировать модель дефицита ДА и оценить пролиферацию
лактотрофов на более позднем сроке после сочетанного введения 6-ГДА и
ДМИ, когда, возможно, будет наблюдаться значительное усиление
пролиферативной активности лактотрофов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в данной работе нам удалось доказать перенос L-ДОФА из
нейронов, содержащих тирозингидроксилазу, в нейроны, содержащие
декарбоксилазу ароматических L-аминокислот в процессе кооперативного
синтеза ДА недофаминергическими моноферментными нейронами в
тубероинфундибулярной системе гипоталамуса у взрослых крыс. Согласно
полученным данным, кооперативный синтез ДА моноферментными нейронами
является одним из важнейших механизмов пластичности мозга при
функциональной недостаточности тубероинфундибулярной ДА-ергической
системы. Кроме того, в рамках данной работы определены механизмы
регуляции кооперативного синтеза, а именно, ингибирующее влияние НА на
синтез ДА моноферментными нейронами. При этом дефицит ДА в течение 1,5
месяцев не сопровождается нарушением пролиферативной активности
лактотрофов – явление, которое, возможно, проявляется при более длительном
дефиците ДА. Однако последнее предположение требуют дальнейшего
изучения.
ВЫВОДЫ
1. Получено окончательное доказательство переноса L-ДОФА между
моноферментными нейронами в процессе кооперативного синтеза
дофамина в тубероинфундибулярной системе у крыс в норме.
2. При функциональной недостаточности катехоламинергических нейронов
происходит компенсаторное усиление кооперативного синтеза дофамина
моноферментными нейронами в тубероинфундибулярной системе.
3. Норадреналин
ингибирует
кооперативный
синтез
дофамина
моноферментными нейронами в тубероинфундибулярной системе.
4. Дофамин и норадреналин не оказывают существенного влияния на
пролиферацию лактотрофов, по крайней мере, на использованных
моделях функциональной недостаточности катехоламинергических
систем.
25
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРАТАЦИИ
Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК
1. M.Ugrumov, J.Taxi, T.Pronina, A.Kurina, A.Sorokin, A.Sapronova, A.Calas.
Neurons expressing individual enzymes of dopamine synthesis in the mediobasal
hypothalamus of adult rats: functional significance and topographic interrelations.
Neuroscience. 2014. V. 277. P. 45-54.
2. А. Ю. Курина, Т. С. Пронина, В. С. Кудрин,М. В. Угрюмов. Недостающее
доказательство кооперативного синтеза дофамина недофаминергическими
нейронами. Доклады Академии наук. 2016. Т. 468. № 3. с. 336–338.
Тезисы конференций
1. Курина А.Ю. Синтез дофамина недофаминергическими нейронами при
гиперпролактинемии у крыс // Тезисы докладов IX школы-конференции
молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцовы РАН, 5-6
декабря 2013 г. Москва. С. 35-36.
2. Курина А.Ю. Синтез дофамина недофаминергическими нейронами
тубероинфундибулярной системы гипоталамуса крыс в норме и при
гиперпролактинемии // Тезисы докладов X школы-конференции молодых
ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцовы РАН, 8 – 9 декабря
2014 г. Москва. С. 28-30.
3. Курина А.Ю., Пронина Т.С., Угрюмов М.В. Синтез дофамина
недофаминергическими нейронами при дегенерации дофаминергических
нейронов в аркуатном ядре // Тезисы докладов Всероссийской конференции с
международным участием «Нейрохимические механизмы формирования
адаптивных и патологических состояний мозга», Санкт-Петербург, 24 – 26
июня 2014 г. С. 85.
4. А.Ю. Курина, Т.С. Пронина, М.В. Угрюмов. Роль моноферментных
нейронов в синтезе дофамина в медиобазальном гипоталамусе крыс // Тезисы
докладов
IV
Международной
междисциплинарной
конференции
«Современные проблемы системной регуляции физиологических функций»,
Москва, 17-18 сентября, 2015, С. 399.
Список сокращений
L-ДОФА – L-диоксифенилаланин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин; ДА – дофамин;
ДА-ергический – дофаминергический; ДМИ – десметилимипрамин;
КОМТ
–
катехол-О-метилтрансфераза;
НА
–
норадреналин;
НА-ергический – норадренергический.
26
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа