close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ АССОЦИИРОВАННЫХ С НАГРУЗКОЙ ЛИЗОСОМАЛЬНОГО АППАРАТА МАКРОФАГОВ ЛИНЕЙНЫМИ ДЕКСТРАНАМИ

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЧЕЧУШКОВ
Антон Владимирович
ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ,
АССОЦИИРОВАННЫХ С НАГРУЗКОЙ ЛИЗОСОМАЛЬНОГО АППАРАТА
МАКРОФАГОВ ЛИНЕЙНЫМИ ДЕКСТРАНАМИ
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
14.03.03 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Новосибирск, 2016
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном
учреждении
«Научно-исследовательский
институт
экспериментальной
и
клинической медицины» (Новосибирск)
Научные руководители:
заслуженный деятель науки РФ,
академик РАН, доктор медицинских наук,
профессор
Доктор медицинских наук
Официальные оппоненты
доктор биологических наук, профессор,
зав. лаб. ультраструктурных исследований
ФГБНУ
«Научно-исследовательский
институт
клинической
и
экспериментальной лимфологии»
доктор биологических наук,
профессор, зав. лаб. фармакологических
исследований ФГБУН «Новосибирский
институторганической химии им. Н.Н.
Ворожцова» СО РАН
Шкурупий Вячеслав Алексеевич
Меньшикова Елена Брониславовна
Бгатова Наталия Петровна
Толстикова Татьяна Генриховна
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и
биохимии» (г. Новосибирск).
Защита состоится «27» сентября 2016 года в 1200 часов на заседании
диссертационного совета
Д.001.048.01 при Федеральном государственном
бюджетном
научном
учреждении
«Научно-исследовательский
институт
экспериментальной и клинической медицины» по адресу: г. Новосибирск, ул.
Тимакова, д. 2., 630117.Тел/факс 8 (383) 333-64-56
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭКМ и на сайте
http://www.centercem.ru
Автореферат разослан «___» __________ 2016 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
д.б.н.
Пальчикова Наталья Александровна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Многие лекарственные препараты лизосомотропны (т.е.
способны избирательно накапливаться в лизосомальном аппарате клеток), и в
лизосомах начинается первый этап их метаболизма (Giraldo, 2014). Наиболее часто
он сводится к выбросу соединений из клеток с помощью системы белков ABC и
MDR, что приводит к необходимости повышения терапевтических дозировок и
приближения их к токсическим (Maniganda, 2014). Еще одна проблема
лизосомотропных химиотерапевтических препаратов – вызываемое ими
повреждение лизосомальных мембран, неизбежно ведущее к лизосомальной
дисфункции и гибели клеток (Boya, 2008). Одним из привлекательных способов
сохранения внутриклеточной концентрации лекарственных соединений является их
конъюгирование с полимерными носителями, способными накапливаться в
лизосомах (в частности, полисахаридами) и постепенно высвобождать активное
соединение
(Kunjachan,
2012).
Декстраны
являются
семейством
высокомолекулярных
полисахаридов,
относительно
медленно
метаболизирующихся в лизосомах (Шкурупий В.А., 2007). Благодаря этому они
могут быть использованы в качестве носителей лекарственных препаратов,
обеспечивающих их концентрирование в вакуолярном аппарате клеток (Varshosaz,
2012). Исследования на лабораторных животных показали, что, конъюгат декстрана
с изониазидом облегчает элиминацию микобактерии БЦЖ в макрофагах вследствие
повышенной локальной концентрации изониазида (Шкурупи, Козяев, 2008). Его
терапевтическая эффективность сопровождается также низкой токсичностью (в
частности, гепатотоксичностью) по сравнению с аналогичными дозами чистого
препарата, что позволяет создавать локальные бактериостатические и
бактериотоксические концентрации изониазида в эндосомально-лиозосомальном
компартменте клеток системы мононуклеарных фагоцитов (Шкурупий В.А., 2007).
Степень разработанности темы исследования. Механизмы этих эффектов
неизвестны. Принимая во внимание сходство химической структуры и физикохимических свойств декстранов и гликогена, в основу исследования было положено
предположение о том, что молекулярные события, происходящие при эндоцитозе
декстранов, могут быть аналогичны таковым, происходящим при связанной с
дефектом альфа-1,4-глюкозидазы болезни Помпе и приводящим к накоплению в
лизосомах клеток гликогена (Lim, 2014). Спектр внутриклеточных событий вызван
лизосомальной дисфункцией и последующим окислительным стрессом, и
характеризуется общим набором признаков независимо от химической природы
соединений и сопровождается развитием окислительного стресса и
ассоциированным с ним повреждением клеток (Cohignac, 2014; Fröhlich, 2013;
Sabella, 2014; Sohaebuddin, 2010).
Цель исследования: установить характер внутриклеточных событий,
сопровождающих эндоцитоз декстранов макрофагами млекопитающих.
Задачи:
1. Исследовать кинетические особенности эндоцитоза декстранов с
молекулярной массой 40 и 70 кДа клетками млекопитающих эпителиального
(кератиноциты HaCat), мезенхимального (фибробласты FRSN) и моноцитарно3
макрофагального гистогенеза (макрофаги J774).
2. Исследовать влияние декстранов с различной молекулярной массой на
функциональное состояние лизосомального аппарата клеток J774 (pH и количество
лизосом) при инкубировании в течение 4 и 24 часов.
3. Исследовать индукцию аутофагии в клетках J774 в условиях
блокирования лизосомального слияния и без него при инкубировании с
декстранами с различной молекулярной массой в течение 4 и 24 часов.
4. Исследовать влияние декстранов с массой 40 и 70 кДа на спонтанную и
индуцированную гидропероксидом кумола и хлоридом аммония интенсивность
свободнорадикальных окислительных процессов в культуре клеток J774.
5. Исследовать влияние декстрана с молекулярной массой 70 кДа на
активность
сигнальной
системы
антиоксидант-респонсивного
элемента
Keap1/Nrf2/ARE, изучив их действие на внутриклеточное распределение
транскрипционного фактора Nrf2, внутриклеточное содержание и характер
распределения его ингибитора Keap1, а также экспрессию ARE-зависимых генов в
клетках J774.
6. Установить характер влияния декстранов на неспецифическую
активацию макрофагов, исследовав влияние декстрана с молекулярной массой 70
кДа на стимулированную бактериальным липополисахаридом продукцию
цитокинов IL6, IL10, IL12, IL17, TNFα, IFNγ, MCP-1 макрофагами J774 in vitro и in
vivo.
7. Исследовать регуляторную взаимосвязь сигнальной системы
Keap1/Nrf2/ARE и мастер-регуляторов лизосомального биогенеза TFEB и TFE3 с
помощью компьютерного анализа перекрестного наличия сайтов связывания в
промоторах соответствующих генов и экспериментального изучения влияния
оригинальных и прототипичеких индукторов системы Keap1/Nrf2/ARE на
экспрессию генов Tfeb и Tfe3, количество лизосом и аутофагию в клетках J774.
Научная новизна. В настоящей работе впервые было установлено, что нагрузка
эндосомально-лизосомального аппарата декстранами защищает клетки от
индуцированного перекисного окисления липидов, а также стабилизирует
лизосомальный pH при алкилирующем воздействии хлоридом аммония. Впервые
показано, что декстраны массой 40 и 70 кДа являются индукторами аутофагии:
увеличивают количество клеток с индуцированной аутофагией.
В результате проведения сравнения внутриклеточных событий,
сопровождающих нагрузку везикулярного аппарата клеток декстранами, с
аналогичной последовательностью событий, описанной для гликогенозов типа II,
впервые показано, что характерные для гликогенозов накопление аутофагосом и
генерация активных форм кислорода также происходят и при эндоцитозе
декстранов, однако в последнем случае в клетках развиваются компенсаторные
процессы, корректирующие состояние лизосомального аппарата, а также динамику
аутофагии.
Установлено, что лизосомальная нагрузка декстранами ассоциирована с
индукцией сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE при участии неканонического
механизма её активации, и сопровождается повышением экспрессии ARE4
зависимых генов глутатион-S-трансферазы P1, гемоксигеназы-1 и NAD(P)Hхиноноксидоредуктазы-1, участвующих в контроле внутриклеточной концентрации
активных форм кислорода, а также защите от перекисного окисления липидов.
Впервые показано, что гены мастер-регуляторов лизосомального биогенеза
TFEB и TFE3 содержат эволюционно консервативный регуляторный элемент ARE,
и индукторы Nrf2 увеличивают экспрессию генов, кодирующих TFEB и TFE3, в
перитонеальных макрофагах мышей C57Bl6.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования
уточняют современные представления об ассоциированной с нагрузкой
лизосомального аппарата внутриклеточной сигнальной трансдукции. Полученные
данные раскрывают представление о ранних этапах патологических изменений в
клетках, происходящих при накоплении недеградируемого материала в
лизосомальном аппарате клеток, и могут быть использованы для разработки
подходов к заместительной ферментативной терапии при сопряженных с ним
заболеваниях, в частности гликогенозов. Результаты исследования, полученные для
декстрана с молекулярной массой 70 кДа также могут быть использованы при
проектировании и создании средств модуляции иммунного ответа. Установленная
регуляторная взаимосвязь между системой антиоксидант-респонсивного элемента и
генами мастер-регуляторов лизосомального биогенеза TFE3 и TFEB может служить
основанием для разработки новых фармакологических подходов терапии
лизосомальных болезней накопления, направленных на поддержание экспрессии
этих генов и активности соответствующих белков, что потенциально будет
способствовать элиминации патологического субстрата из клеток. Разработано
несколько программных подходов для исследования характеристик процесса
аутофагии в клетках с помощью флуоресцентной микроскопии, позволяющих
оптимизировать процедуру анализа везикулярных структур в различных типах
клеток в режиме высокопроизводительного скрининга.
Основные положения, выносимые на защиту. 1) Нагрузка эндосомальнолизосомального аппарата макрофагов декстранами с молекулярной массой 40 и 70
кДа сопровождается увеличением продукции активных форм кислорода, но не
окислительным стрессом. Декстраны оказывают протективный эффект при
воздействии на клетки инициаторов перекисного окисления липидов, что может
быть ассоциировано с активацией ими сигнальной системы антоксидантреспонсивного элемента Keap1/Nrf2/ARE неканоническим путем и приводит к
индукции экспрессии генов антиоксидантной защиты, участвующих также в
регуляции внутриклеточного содержания свободного железа. Это, в свою очередь,
определяет повышенную резистентность нагруженных декстраном клеток к
индукции перекисного окисления липидов. 2) Аккумулирование декстранов в
клетках повышает резистентность лизосомальных мембран к алкилирующим
воздействиям, а также положительно влияет на аутофагосомально-лизосомальное
слияние. Эти эффекты связаны с потенцированием активности мастер-регуляторов
лизосомального биогенеза TFEB и TFE3, которая ассоциирована с индукцией
сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE.
Апробация работы. Результаты работы представлены и обсуждены на Шестой
5
Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты
компенсаторно-приспособительных процессов» 16-17 апреля 2013 г. (г.
Новосибирск), на Седьмой Всероссийской научно-практической конференции
«Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» 21-22
апреля 2015 г. (г. Новосибирск), Biochemical Society Focused Meeting "The
Keap1/Nrf2 Pathway in Health and Disease" 6–8 января 2015 г. (Кэмбридж,
Великобритания), на IX международной конференции «Биоантиоксидант», 29
сентября – 2 октября 2015 г. (г. Москва).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 6
статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для публикации
материалов диссертационных исследований.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав,
включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования,
изложения собственных результатов и их обсуждения, а также заключения,
выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 324 источника (из них 11
отечественных и 313 зарубежных). Материал диссертации изложен на 124 странице
машинописного текста и иллюстрирован 1 таблицей и 31 рисунком.
Благодарности. Исследование проводилось с использованием оборудования
центра коллективного пользования «Современные оптические системы». Автор
выражает специальную благодарность научному сотруднику НИИМББ к.м.н.
Воронцовой Е.В., а также заведующему сектором клеточных технологий ИЦИГ,
к.б.н. Орищенко К.Е. за помощь в реализации высокопроизводительных методов
микроскопического исследования клеточных культур.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Модели исследования. В работе использовали моноцито/макрофагоподобные
клетки гистиоцитарной саркомы мыши J774, кератиноциты человека HaCaT и
фибробластоподобные клетки человека FRSN. Все клеточные линии были
получены из Банка клеточных культур Института цитологии РАН (г. СанктПетербург, Россия). Также в работе были использованы мыши линии C57Bl6/J.
Дизайн экспериментов. Непосредственно перед началом эксперимента декстраны
массой 40 и 70 кДа, а также сахарозу растворяли в полной культуральной среде в
термостате при 37оС. Дизайн экспериментов строили таким образом, чтобы
конечная точка эксперимента содержала все временные периоды инкубирования:
для этого в соответствующих группах культуральную среду заменяли средой с
декстранами за 24, 4 и 1 час до окончания эксперимента. В контрольных группах
культуральную среду заменяли на аналогичную, не содержащую декстраны или
сахарозу. Дизайн экспериментов для клеток линии HaCaT и FRSN строили
аналогично J774.
Исследование эндоцитоза флуоресцентно-меченных декстранов. Исследование
проводилось
с
помощью
FITC-меченного
декстрана
на
проточном
цитофлуориметре FACSCalibur (BD, США). Настоящее исследование проводилось
для периода времени 24 часа.
6
Исследование интенсивности процессов перекисного окисления липидов. Для
исследования уровня ПОЛ в клетках J774 был использован липофильный
флуоресцентный индикатор BODIPY-C11 (10мкМ, 20 минут при +37оС и
атмосфере, содержащей 5% СО2), пик флуоресценции которого смещается с 595 нм
к 520 нм при активации процессов ПОЛ. Инкубацию с ГК (100 мкМ, 30 минут) в
соответствующих группах проводили после инкубации с индикатором. Анализ
проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (BD, США),
флуоресцентный сигнал детектировали в каналах FL1 (510 nm) и FL3 (590 nm).
Исследование внутриклеточной продукции АФК. Продукцию АФК в клетках
J774 исследовали с помощью липофильного индикатора H2-DCF DA (10 мкМ, 30
минут в р-ре Хэнкса + 1,8 г/л глюкозы, +37oС, 5% СО2). NH4Cl (25мМ, 30 минут) в
соответствующие группы добавляли после инкубации с индикатором.
Исследование флуоресценции производили на проточном цитофлуориметре,
детекцию флуоресценции осуществляли в канале FL1.
Исследование лизосомального pH. Для целей данного исследования был
использован флуоресцентный индикатор LysoSensor DND-189 (1мкМ, 30 минут,
+37оС и атмосфере, содержащей 5% СО2). Исследование флуоресценции с
помощью проточного цитофлуориметра в канале FL1.
ПЦР в реальном времени. Для исследования экспрессии генов Nqo1, Gstp1, Hmox1,Tfeb, Tfe3 были подобраны пары праймеров и зонды Taq-Man с помощью
программы Primer Blast. Для обеспечения контроля качества процедуры реакция
для каждого экспериментального образца осуществлялась в трех повторах. ПЦР
проводили с помощью амплификатора CFX96 System (BioRad, США). Пороговый
цикл устанавливали после проведения 40 циклов реакции. Полуколичественное
сравнение уровня экспрессии мРНК осуществляли методом ΔΔСt (расчетная
эффективность реакции составляла 1,9). В качестве референсного гена был
использован ген Gapdh.
Иммунофлуоресцентное исследование. По истечении экспериментальных
периодов клетки фиксировали либо 10% раствором формалина, либо ледяным
метанолом (-20оС) в течение 15 минут. После фиксации клетки отмывали
раствором PBS, блокировали с помощью 1% мышиной сыворотки и 5% бычьего
альбумина. Затем клетки гибридизовали с неконъюгированными антителами к
целевым белкам, и, после отмывки, с конъюгированным с флуорохромами
антителами. После отмывки клетки быстро ополаскивали в деионизированной воде
и заключали в монтирующую среду FluoroShield. Изображения получали на
лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM710/NLO (Carl Zeiss,
Германия) или на анализаторе IN Cell Analyser 2200 (GE Healthcare Life Sciences,
США).
Исследование продукции цитокинов. Для исследования продукции цитокинов in
vivo мышей C57Bl6/J по окончании экспериментального периода декапитировали,
собирали кровь и выделяли плазму. Исследование концентрации цитокинов in vitro
производили в культуральной среде после культивирования перитонеальных
макрофагов в экспериментальных условиях.
Исследование цитокинов
производилось с помощью коммерческих наборов Cytometric Bead Array (CBA)
7
Human Inflammatory Cytokine Kit (BD, США) и Cytometric Bead Array (CBA) Mouse
Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit (BD, США) на проточном цитофлуориметре BD
FACSClibur. Анализ данных проводили в программной среде Cytobank.
Анализ данных. Данные, полученные на проточном цитофлуориметре,
анализировали с помощью открытого программного пакета Cytobank Community.
Анализ изображений, полученных методом флуоресцентной микроскопии,
проводили с помощью программного пакета ImageJ. Статистический анализ
выполняли в программной среде R Studio. Для сравнения данных
экспериментальных групп использовали тест Крускала – Уоллиса и
непараметрический критерий Данна для множественных сравнений, различия
считали значимыми при p < 0,05. На рисунках представлены медианы
(горизонтальные линии), межквартильный размах (прямоугольники), размах между
минимальным и максимальным значением («усы»), если не указано другое.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
А
Б
В
Рисунок 1. Результаты исследования изменения флуоресценции клеток при
их инкубировании с немеченными и FITC-меченными декстранами в течение 24
часов. А) клетки линии HaCaT (кератиноциты человека); Б) клетки линии FRSN
(фибробласты кожи человека); В) клетки линии J774 (макрофаги). Каждая точка
кривой соответствует средней интенсивности флуоресценции, усы – стандартному
отклонению.
В первую очередь были исследованы параметры эндоцитоза FITCмеченных декстранов тремя типами клеток: моноцитарно-макрофагальными,
эпидермальными и фибробластами кожи. Кроме сравнительной характеристики,
эти данные были необходимы для установления характера накопления декстрана в
8
клетках. В течение всего экспериментального периода при всех использованных
концентрациях декстрана отмечался постепенный рост флуоресценции в клетках
J774, HaСaT и FRSN, темп которого к концу наблюдения постепенно снижался
(Рис. 1). Результаты исследования эндоцитоза декстранов демонстрируют
следующие особенности. Площадь под кривой эндоцитоза, характеризующая
количество захваченного соединения, закономерно наиболее высока у макрофагов
и минимальна у кератиноцитов. Более того, характер кривой изменения
флуоресценции макрофагов указывает на время-зависимое изменение скорости
эндоцитоза декстрана с ее увеличением в период с 6 до 12 часов. Такая кривая
типична для любого классического фармакологического время- и дозозависимого
процесса, и указывает на то, что в определенный период времени в клетках
индуцируется петля положительной обратной связи, повышающая интенсивность
эндоцитоза клетками (Golan et al. 2012). Поскольку общее количество захваченного
декстрана существенно больше у макрофагов, можно заключить, что эти клетки
будут наиболее восприимчивы к эффектам накопления декстрана. В связи с этим
дальнейшее исследование проводилось на макрофагальной клеточной линии J774.
Влияние декстранов на состояние лизосомального аппарата в ранние сроки
после нагрузки декстраном
Для декстрана массой 40 кДа и используемой в качестве препарата
сравнения сахарозы характерно небольшое снижение флуоресценции лизосенсора
при четырехчасовой экспозиции декстрана и возвращение к контрольным
значениям при 24-часовой экспозиции (Рис. 2). В то же время декстран массой 70
кДа демонстрирует время- и дозозависимое увеличение флуоресценции
индикатора. Также отмечается дозозависимое увеличение этого эффекта для
декстрана массой 70 кДа (Рис 2).
Далее было исследовано влияние декстранов на изменение лизосомального
pH, вызванное добавлением в культуральную среду клеток NH 4Cl (25 мМ, 30
минут), которое само по себе вызывает снижение pH благодаря лизосомотропности
и аклилирующим свойствам реагента. Результаты исследования демонстрируют
(Рис. 3), что алкилирующий эффект NH4Cl проявляет себя в меньшей степени, если
клетки предварительно (в течение 24 часов) были инкубированы с 2 мг/мл
декстранов, причем D70 оказывает более выраженное воздействие. Интересно, что
при использовании более высоких концентраций декстранов (20 мг/мл) их
способность нивелировать индуцированное хлоридом аммония защелачивание
лизосомального компартмента уменьшается (Рис. 3).
Полученные
результаты
свидетельствуют
о
возможном
мембранопротекторном эффекте декстранов, что определенным образом
согласуется с многочисленными исследованиями, в которых линейные декстраны
используются в качестве криопротекторов при заморозке культур клеток (Jim et al.
2016; Shaw et al. 1997). Из литературных данных известно, что нагрузка лизосом
декстранами сопровождается феноменом макромолекулярной перегрузки (macromolecular crowding) (Sasahara et al. 2003; Winzor & Wills 2006; Ghahghaei et al. 2007),
которая может приводить к изменению активности сигнальных систем,
ассоциированных с лизосомальной мембраной, в частности, mTORC1, что в свою
9
очередь изменяет активность аутофагии.
Рисунок 2. Результаты исследования изменения лизосомального pH при
инкубировании клеток в присутствии декстранов с молекулярной массой 40 и 70
кДа. Статистически значимые (p < 0,05) отличия от величин соответствующих
показателей: * – контроля, # – клеток, инкубированных в аналогичных условиях в
присутствии 2 мг/мл декстрана, ^ – клеток, инкубированных в аналогичных
условиях в течение 4 ч.
Рисунок 3. Результаты исследования влияния предварительной 24-часовой
загрузки декстранами клеток J774 на изменение лизосомального pH, вызванное
10
хлоридом аммония. Cтатистически значимые (p < 0,05) отличия от величин
соответствующих показателей: * – контроля, # – положительного контроля (клеток,
обработанных только NH4Cl).
Влияние декстранов с молекулярной массой 40 и 70 кДа на аутофагию в
клетках J774
Продолжая проверку гипотезы о сопоставимости загрузки клеток
декстранами и состоянием лизосомального накопления, мы исследовали влияние
декстрана на аутофагию.
Б
А
Рисунок 4. Результаты исследования влияния декстрана с массой 40 кДа (А) и 70
кДа (Б) в концентрациях 2 и 20 мг/мл на количество клеток с индуцированной
аутофагией в течение 4 и 24 часов экспозиции. Cтатистически значимые (p < 0,05)
отличия от величин соответствующих показателей: * – контроля, # – клеток,
инкубированных в аналогичных условиях без хлорохина. F – эффективность
аутофагии.
Декстран с молекулярной массой 40 кДа в концентрации 2 мг/мл при
четырехчасовой экспозиции не вызывает достоверно значимого увеличение
количества LC3-позитивных клеток (Рис.4 А). При этом соотношение количества
клеток в экспериментах с блоком и без блока лизосомального слияния,
характеризующее активность аутофагии (далее – F), не изменяется по сравнению с
контролем. 24 часовое увеличение экспозиции декстрана происходит к
уменьшению доли позитивных клеток в группе без обработки хлорохином, что
свидетельствует об активации лизосомальной компоненты аутофагии.
Увеличение концентрации декстрана с молекулярной массой 40 кДа до 20
мг/мл в первые 4 часа приводит к увеличению значения F (в 1,45 раза по
отношению к контролю), что указывает на усиление аутофагосомальнолизосомального слияния. Более продолжительная экспозиция с декстранами
сопровождается торможением лизосомального слияния, вероятно, связанным с
11
лизосомальной перегрузкой. Декстран массой 70 кДа в целом демонстрирует
похожий эффект (Рис 4 Б). В то же время, в концентрации 20 мг/мл он вызывает
более устойчивый во времени эффект (в течение 24 часов).
Сохранение интенсивности аутофагосомально-лизосомального слияния
указывает на то, что, несмотря на перегрузку декстраном, лизосомальный аппарат
клеток сохраняет стабильный функциональный статус. Это подтверждается и
исследованием среднего значения лизосомального pH в клетках, которое снижается
при 24-часовой экспозиции клеток с декстраном, что свидетельствует о стимуляции
активности V-АФТазы. Такой эффект, вероятно, является результатом снижения
поступления в клетку низкомолекулярных нутриентов, которое происходит
вследствие макромолекулярной перегрузки лизосом декстраном и способствует
увеличению количества субъединиц V-АФТазы в эндосомальных и лизосомальных
мембранах (Stransky & Forgac 2015). Этот эффект также может быть связан со
стимуляцией
генов
лизосомального
биогенеза,
контролируемых
транскрипционными факторами TFEB и TFE3.
Исследование генерации АФК при нагрузке лизосомального аппарата клеток
декстранами
Рисунок 5. Результаты исследования продукции АФК клетками J774 в присутствии
декстранов в концентрации 20 мг/мл. Cтатистически значимые (p < 0,05) отличия от
величин соответствующих показателей: * – контроля, скобы – клеток,
инкубированных в аналогичных условиях в течение 1 ч.
Накопление клетками крупномолекулярных соединений сопровождается
резким увеличением генерации АФК и повреждением клеточных мембран (Fröhlich
2013). Очевидно, что такую активность проявляют и декстраны, и для проверки
справедливости данного предположения была исследована способность декстранов
вызывать генерацию АФК и влиять на ПОЛ мембран клеток с учетом того, что
повышение интенсивности свободнорадикальных окислительных процессов
12
является одним из патогенетических факторов болезни Помпе.
Обнаружено, что экспозиция клеток J774 c декстраном массой 40 кДа в
концентрации 20 мг/мл в течение 1, 4 и 24 часов сопровождается незначительным,
но статистически значимым увеличением продукции АФК (Рис. 5). Нагрузка клеток
декстраном массой 70 кДа в аналогичных условиях вызывает менее выраженное, но
также значимое увеличение генерации АФК.
Влияние декстранов на индуцированное гидроперекисью кумола перекисное
окисление липидов
Установлено, что декстраны самостоятельно не вызывают значимого
изменения окислительной модификации флуоресцентного маркера (Рис. 6), что на
первый взгляд не согласуется с результатами исследования продукции АФК. В то
же время, учитывая низкий уровень генерации АФК и короткое время воздействия
(по сравнению с персистирующей продукцией при болезнях накопления), такой
эффект ожидаем.
Рисунок 6. Результаты исследования влияния предварительной загрузки клеток
J774 декстранами на уровень ПОЛ без добавления ГК.
Экспозиция декстранов с молекулярными массами 40 и 70 кДа в
концентрации 20 мг/мл продемонстрировала существенный времязависимый
эффект, вызывая снижение конверсии BODIPY-C11 в клетках J774 (Рис. 7).
Интересно, что при инкубировании в течение 24 часов декстраны оказывали
воздействие, сравнимое с таковым -токоферола в дозе 400 мкМ. Поскольку ПОЛ,
индуцированное ГК, зависит от концентрации Fe2+, было исследовано влияние
декстрана на его интенсивность в присутствии хелатора железа деферипрона.
Введение деферипрона в среду инкубирования в диапазоне концентраций 5-500
мкМ само по себе дозозависимо снижает выраженность ПОЛ, вызванного ГК, что
ранее было описано в литературе (Glickstein, 2005). Ожидалось, что декстран может
потенцировать эффект деферипрона, в случае если его добавление клеткам влияет
13
на доступность свободного Fe2+.
Рисунок 7. Результаты исследования влияния предварительной загрузки клеток
J774 декстранами в концентрации 20 мг/мл на интенсивность ПОЛ,
индуцированного ГК (100 мкМ, 30 мин. Cтатистически значимые (p < 0,05) отличия
от величин соответствующих показателей: * - контроля, # - положительного
контроля (клетки, инкубированные в аналогичных условиях в присутствии только
ГК), ^ – клеток, инкубированных в аналогичных условиях в течение 1 ч.
Экспериментальная проверка продемонстрировала, что при использовании
сочетания деферипрона (50 мкМ, 30 мин) и ГК (100 мкМ, 30 мин) наблюдается
небольшое, но статистически достоверное снижение конверсии BODIPY-C11 в
клетках, инкубированных с декстранами в течение 1 и 4 часов, но не 24 часов (Рис.
8). Результаты эксперимента с деферипроном указывает на то, что декстраны, с
одной стороны, не потенцируют эффект хелатирования железа, но, с другой
стороны, по мере их накопления в лизосомальном аппарате происходит снижение
эффективности деферипрона, что указывает на увеличение лизосомального пула
редокс-активного железа, например вследствие увеличения аутофагии ферритина.
Наблюдаемый эффект снижения ПОЛ на фоне добавления декстрана, в то же время,
может
объясняться
индукцией
антиоксидантной
сигнальной
системы
Keap1/Nrf2/ARE, проверка которой явилась следующим шагом исследования.
Поскольку наиболее выраженный эффект в отношении лизосомального
компартмента и аутофагии был получен для декстрана с молекулярной массой 70
кДа, а влияние на внутриклеточные редокс процессы было одинаковым для
декстранов с молекулярной массой 40 и 70 кДа, то, вероятно, наибольшим
терапевтическим потенциалом обладает декстран с молекулярной массой 70 кДа.
Это также подкрепляется данными ранее проведенных исследований, в которых
14
противофибротический эффект был показан именно для этой молекулярной массы
(Шкурупий В.А., 2014; Шкурупий В.А., 2011; Шкурупий В.А., 2007).
Рисунок 8. Результаты исследования влияния предварительной экспозиции клеток
J774 с декстранами (20 мг/мл) на эффект деферипрона на интенсивность процессов
ПОЛ, вызванного ГК. Cтатистически значимые (p < 0,05) отличие от величин
соответствующих показателей: * – контроля, ^ – клеток, инкубированных в
аналогичных условиях в присутствии деферипрона и ГК (без добавления
декстранов).
Исследование влияния декстрана на индукцию сигнальной системы
Keap1/Nrf2/ARE
Индукция сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE была оценена по степени
транслокации белка Nrf2 в ядро, по содержанию в клетке белка Keap1 и по уровню
экспрессии генов, контролируемых Nrf2. Декстран с молекулярной массой 70 кДа
при экспозиции с клетками J774 в течение 4 часов демонстрирует дозозависимое
увеличение транслокации Nrf2 в ядро (Рис. 9). Поскольку максимальный эффект
ядерной транслокации Nrf2 отмечен для концентрации 20 мг/мл, этак же
концентрация была использована для исследования поведения белка Keap1.
Обнаружено, что в интактных клетках J774 отмечается локализация Keap1 в
области центра образования микротрубочек (ЦОМТ), что, вероятно,
свидетельствует о конститутивном процессе агрегации Keap1. Четырехчасовая
экспозиция с декстраном с молекулярной массой 70 кДа в концентрации 20 мг/мл
сопровождается снижением количества белка Keap1 в клетках (Рис. 10 А), но не
изменением размеров агрегатов белка в области ЦОМТ, площадь которых,
напротив, несколько увеличивается (Рис 10 Б). Полученные результаты
свидетельствуют о том, что активация Nrf2 в течение 4 часов происходит при
поддержке генерируемых АФК, что сопровождается протеасомной деградацией
15
белка Keap1.
Рисунок 9. Результаты исследования влияния декстрана с молекулярной массой 70
кДа на ядерную транслокацию Nrf2. Красный контур - автоматическое выделение
ядерной области; желтый контур – область повышенной ядерной локализации Nrf2.
* – отличие от величины показателя в контроле статистически значимо при p < 0,05.
# – отличие от величины показателя при концентрации декстрана 2 мг/мл
статистически значимо при p < 0,05. Лазерная сканирующая конфокальная
микроскопия. Увеличение 630х.
Более продолжительная экспозиция приводит к выраженному увеличению
количества белка Keap1 (Рис. 10 А), но одновременно увеличивается и площадь его
агрегатов в области ЦОМТ (Рис. 10 Б). Поскольку в тот же период происходит
увеличение ядерной транслокации Nrf2, можно заключить, что повышение
содержания белка Keap1 связано с его агрегированием, которое способствует
дальнейшему увеличению активности Nrf2. Возможно, накопление таких агрегатов
является одной из причин активации аутофагии в клетках, которая, однако, в
данном случае оказывается несостоятельной для быстрой элиминации агрегатов.
Полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют, что
нагрузка клеток декстранами приводит к неканонической активации системы
Keap1/Nrf2/ARE, заключающейся в агрегации белка Keap1 с последующей
аутофагосомной деградацией. При этом агрегаты белка Keap1 накапливаются в
области ЦОМТ. Для определения транскрипционной активности Nrf2 был
исследован уровень транскрипции генов, кодирующих NQO1, GSTP1 и HO-1,
экспрессия которых положительно контролируется Nrf2. Установлено, что
экспозиция клеток J774 с декстраном массой 70 кДа в течение 24 часов приводит к
увеличению экспрессии гена NQO1, а также генов GSTP1 и HO-1 (Рис. 11).
16
А
Б
Рисунок 10. Результаты исследования изменения внутриклеточного содержания
белка Keap1(А) и площади агрегатов белка Keap1 (Б) в клетках J774 при
экспозиции с декстраном с молекулярной массой 70 кДа. На графике Г отображено
количество белка Keap1, нормированное на контроль (0 ч). * – отличие от величины
показателя в контроле статистически значимо при p < 0,05; # – отличие от
величины показателя при 4 часах экспозиции статистически значимо при p < 0,05.
Рисунок 11. Результаты исследования экспрессии ARE-зависимых генов NAD(P)Hхиноноксидоредуктазы-1 (NQO1), глутатионтрансферазы P1 (GSTP1) и
гемоксигеназы-1 (HMOX1) в клетках J774 при инкубировании с декстраном с
молекулярной массой 70 кДа в течение 24 часов. * – отличие от величины
показателя в контроле (0 ч) статистически значимо при p < 0,05.
Основываясь на полученных результатах, можно утверждать, что
накопление декстранов в клетках J774 сопровождается время- и дозозависимой
индукцией сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE. Экспрессия ARE-зависимых
генов позволяет объяснить установленные протекторные эффекты декстрана 70
кДа: фермент NQO1, играет важную роль в детоксификации липофильных
ксенобиотиков, в частности, ГК, что объясняет защитный эффект декстрана в
отношении вызванного ею ПОЛ (Siegel et al. 1997); GSTP1 защищает клетки от
ксенобиотиков
и
продуктов
ПОЛ
посредством
их
восстановления,
17
глутатионилирования или нуклеофильного замещения гидрофобных групп;
гемоксигеназа (кодируемая геном Hmox1) вносит существенный вклад в защиту от
ПОЛ благодаря катаболизму гемсодержащих белков и самого гема, который
является сильным прооксидантом (Gozzelino et al. 2010).
Влияние декстранов на стимулированную бактериальным
липополисахаридом продукцию цитокинов макрофагами in vitro и in vivo
В ходе данной работы было исследовано содержание про- и
противовоспалительных цитокинов в плазме мышей C57Bl6/J через 24 часа после
интраперитонеального введения бактериального липополисахарида и LPS в
сочетании с декстраном в концентрации 2 мг/мл (Рис. 12). Кроме того, поскольку
основным модельным объектом данного исследования являлись макрофаги,
аналогичный эксперимент проводили in vitro на культуре перитонеальных
макрофагов мышей той же линии (Рис. 13).
Введение LPS приводило к увеличению сывороточной концентрации IL6,
MCP-1 и TNFα, однако снижался уровень IL10, что характерно для мышей линии
C57Bl (Рис. 12). В то же время, сочетание LPS с декстраном с молекулярной массой
70 кДа увеличивал продукцию IL12, уровень которого в присутствии одного лишь
LPS не менялся. В то же время падала стимулированная липополисахаридом
продукция IL6, MCP-1, а также в еще большей степени снижалась продукция IL10.
Рисунок 12. Результаты исследования концентрации цитокинов в плазме крови
мышей C57Bl6/J после внутрибрюшинного введения 2 мг/мл декстрана с
молекулярной массой 70 кДа в сочетании с бактериальным липополисахаридом.
Для того чтобы проверить, какая часть модуляции цитокинового профиля
может быть делегирована макрофагам (Рис. 13), нагруженным декстранами, была
исследована продукция цитокинов in vitro в культуре изолированных
18
перитонеальных макрофагов. В данном случае, характер ответа цитокинов IL10 и
IL12, а также цитокинов, IL6, MCP-1 на LPS был аналогичен таковому в
эксперименте in vivo, однако добавление декстрана с молекулярной массой 70 кДа
изменяло уровень этих цитокинов в гораздо меньшей степени, чем при
исследовании in vivo. Влияние декстранов на уровень продукции TNFα
макрофагами отсутствовало. Характер влияния декстранов на уровень цитокинов
IL-6, MCP-1 и TNFα указывает на то, что мишенью декстрана являются не только
моноцитарное клеточное звено, но и другие типы клеток, в частности,
эпителиальные или тканевые фибробласты.
Влияние декстранов на IL-10 и IL-12 может быть отнесено к эффектам
воздействия именно на макрофаги, являющиеся главными продуцентами этих
цитокинов, и характерезует декстран как иммуномодулятор, смещающий
иммунный ответ в сторону первого типа.
Рисунок 13. Результаты исследования концентрации цитокинов культуральной
среде перитонеальных макрофагов мышей C57Bl6/J после их инкубирования с
липополисахаридом в сочетании с декстраном или без него.
Исследование регуляторной связи сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE и
транскрипционных регуляторов лизосомального биогенеза.
Механизм влияния декстрана на продукцию цитокинов плохо понятны, но
могут быть объяснены влиянием на толл-подобные рецепторы. С другой стороны,
тот факт, что развитие эффектов требует достаточно длительного времени (24 часа)
указывает на влияние декстрана на внутриклеточную сигнальную трансдукцию,
определяющую в дальнейшем способ реагирования клеток на стресс. Объяснением
19
может служить активация сигнальных систем, ассоциированных с лизосомальной
мембраной, и контролируемых транскрипционными факторами TFEB и TFE3.
Известно, что оба этих фактора участвуют в контроле стимулированной LPS
продукции цитокинов IL-6 и TNFα (Napolitano & Ballabio, 2016). Каким образом
декстран может влиять на активность этих транскрипционных факторов
неизвестно, однако, фармакологическая активация данных транскрипционных
факторов в целом проблемная задача, являющаяся в настоящий момент мировым
трендом в области экспериментальной терапии болезней накопления. Поскольку
нагрузка декстраном приводит к активации сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE, а
последняя играет активную роль не только в антиоксидантной защите клеток, но и
в регуляции метаболических процессов, мы предположили наличие регуляторной
связи между этой системой и генами TFEB и TFE3.
Предполагая наличие регуляторной взаимосвязи между сигнальной
системой
Keap1/Nrf2/ARE
и
генами
лизосомального
биогенеза
мы
проанализировали последовательности генов TFE3 и TFEB на предмет наличия
регуляторной последовательности ARE. Для поиска последовательности ARE в
интересующих генах на основании 52 различных последовательностей ARE (Wang,
2007) была сформирована позиционная матрица (Position Frequency Matrix).
Обнаружение последовательности проводилось с помощью программного пакета
RSAT (Defrance et al. 2008; Sand et al. 2008).
В гене TFEB человека и мыши обнаружено по 15 ARE-подобных мотивов
(Рис. 14 А). Из них последовательность (условно обозначенная нами как ARE_tfeb),
расположенная в первом интроне, является консервативной среди позвоночных
животных. В литературе до настоящего момента наличие подобной регуляторной
последовательности не описано. Гены TFE3 человека и мыши содержат меньше
ARE-подобных последовательностей (Рис. 14 Б). Среди них обращает на себя
внимание консервативная среди позвоночных последовательность, расположенная
во втором интроне, и обозначенная нами как ARE_tfe3. На основании данных ChIPseq базы ENCODE (Wang, 2013) был проанализирован гистоновый ландшафт в
соответствующих областях генома. Участок локализации последовательности
ARE_tfeb характеризуется высокой частотой гистоновой модификации H3K3me3, и,
следовательно, может быть отнесен к промоторной области гена..
А
20
Б
Рисунок 14. Локализация последовательностей ARE в области гена Tfeb мыши (А)
и Tfe3 мыши (Б). Гистограмма характеризует уровень консервативности
соответствующих последовательностей среди позвоночных животных (получены с
помощью инструмента PhastCons).
Аналогичный анализ для области локализации мотива ARE_tfe3
демонстрирует следующее. Анализ гистоновых модификаций для этой области
обнаруживает высокую частоту модификация H3K27Ac и метилирования лизина 4
гистона H3 (H3K4m1), фланкирующих указанную регуляторную область, что
характерно для энхансерных областей генов (Pennacchio, 2013) (Рис. 15). В то же
время для данного мотива характерно связывание транскрипционных факторов
Bach1, MAF и NFE, а также белков, взаимодействующих с Nrf2: JunD, FOSL2, FOS.
Кроме того, рядом с мотивом ARE_Tfe3 располагаются мотивы связывания
транскрипционных факторов CEBPB, CTCF и MAZ, локализация которых также
является консервативной. Поэтому можно предположить, что в регуляции
активности гена TFE3 играет роль весь тандем указанных регуляторных мотивов.
Рисунок 15. Гистоновые модификации (H3K4Me1 и H3K27Ac) и мотивов
связывания различных транскрипционных факторов в области ARE_tfe3.
Экспериментальная проверка возможности регуляции лизосомального
биогенеза со стороны сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE
С целью исследовать регуляторное влияние сигнальной системы
Keap1/Nrf2/ARE на экспрессию генов TFEB и TFE3 был проведен ПЦР-анализ
продуктов их транскрипции в клетках J774. Для гена TFE3 отмечено увеличение
экспрессии при добавлении в культуральную среду оригинального синтетического
индуктора системы Keap1/Nrf2/ARE ТС13, с максимальной выраженностью в
концентрации 10 мкМ и падением эффекта при увеличении концентрации до 100
мкМ. Для гена TFEB характерен менее выраженный, но устойчивый дозозависимый
ответ (Рис. 16). ТС13 оказывал аналогичное воздействие на количество лизосом в
цитоплазме, дозозависимо увеличивая его в аналогичном диапазоне концентраций,
что показано с помощью лизосомального индикатора LysoTracker DND-99.
21
Прототипический индуктор Keap1/Nrf2/ARE трет-бутилгидрохинон (tBHQ),
схожий по структуре с ТС13, но жирорастворимый, вызывал аналогичный, но более
выраженный эффект (Рис. 17). Следует заметить, что в отличие от TC13, tBHQ
токсичен для клеток J774 в концентрациях более 10 мкМ, что и ограничило
диапазон использованных концентраций.
Б
А
Рисунок 16. Результаты исследование экспрессии генов, кодирующих TFE3
и TFEB, при инкубировании клеток J774 в течение 12 часов с индуктором Nrf2
TC13 в различных концентрациях (А) и при инкубации с декстраном 70 кДа 24 часа
(Б). Cтатистически значимое (p < 0,05) отличие от величин в контроле для: * экспрессии гена TFEB, # - экспрессии гена TFE3.
Рисунок 17. Результаты исследования влияния индукторов Keap1/Nrf2/ARE на
лизосомальный аппарат клеток J774 при инкубировании с ТС13 и tBHQв течение 24
часов, оцененное по накоплению флуоресцентного лизосомотропного индикатора
LysoTracker DND-99. Cтатистически значимое (p < 0,05) отличие от контроля для:
* - tBHQ, # - ТС13
Таким образом, в результате проведения настоящего исследования
установлено, что воздействие на клетки активаторами системы Keap1/Nrf2/ARE
действительно может сопровождаться дозозависимой индукцией гена TFE3 и
22
TFEB, сопровождающейся постепенным увеличением количества лизосом.
Интересно, что 24-часовая нагрузка декстраном массой 70 кДа не вызывает
индукции экспрессии генов TFE3 и TFEB (Рис. 17 Б), однако не сопровождается и
ее снижением, которое, согласно данным литературы, отмечается через 24 часа
после сильных лизосомотропных воздействий. Таким образом, выраженная
индукция сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE при нагрузке клеток декстранами
может способствовать поддержанию активности генов TFE3 и TFEB, которая в
противном случае была бы понижена через 24 часа после воздействия. Для
проверки данного предположения требуются дальнейшие исследования с
применением ингибирования внутриклеточной экспрессии белка Nrf2.
ВЫВОДЫ
1.
Эндоцитоз декстранов с массой 40 и 70 кДа наиболее эффективно
происходит в клетках моноцитарно-макрофагального ряда по сравнению с
эпителиальными и мезенхимальными клетками. Следовательно, наиболее
вероятной мишенью в организме млекопитающих являются моноцитарномакрофагальное клеточное звено. В то же время, клетки иного гистогенеза, также в
состоянии аккумулировать декстран.
2.
Декстраны стабилизируют лизосомальный pH при алкилирующем
воздействии, а также положительно влияют на активность лизосомальных
протонных помп.
3.
Декстран с массой 40 кДа вызывает выраженное увеличение
лизосомального слияния аутофагосом, тогда как декстран с массой 70 кДа в
дополнение к этому стимулирует формирование аутофагосом.
4.
Декстраны с массой 40 и 70 кДа в одинаковых массовых концентрациях
вызывают генерацию активных форм кислорода в клетках, но не окислительный
стресс. Более того, предварительная нагрузка клеток J774 декстранами снижает
выраженность индуцированного гидроперекисью кумола перекисного окаисления
липидов, способствуя уменьшению пула свободного железа в клетках.
5.
Декстран с молекулярной массой 70 кДа индуцирует сигнальную систему
Keap1/Nrf2/AREпо механизму, ассоциированному с формированием агрегатов
белков Keap1, что сопровождается увеличением свободной фракции белка Nrf2 и
его ядерной транслокацией. Показано, что среди ключевых генов антиоксидантной
защиты, контролируемых мотивом ARE, в присутствии декстранов наиболее
выражена экспрессия гемоксигеназы-1 и NAD(P)H-хиноноксидоредуктазы-1,
ассоциированных также с контролем метаболизма железа.
6.
Установлено, что декстран с молекулярной массой 70 кДа
модулируетлипополисахарид-зависимую продукцию цитокинов, снижая продукцию
IL10 и потенцируя продукцию IL12, при этом уменьшая базальный уровень
продукции цитокинов, ассоциированных с повреждением тканей. Введение
декстрана 70 кДасопровождается снижением продукции провоспалительных
цитокинов IL6 и MCP-1.
7.
Обнаружена взаимосвязь между сигнальной системой Keap1/Nrf2/ARE и
генами мастер-регуляторов лизосомального биогенеза TFE3 и TFEB. Показано, что
индукторы Nrf2 увеличивают экспрессию этих генов в макрофагах мышей. Таким
23
образом, индукция Keap1/Nrf2/ARE декстранами может способствовать
поддержанию активности TFE3 и TFEB, что является объяснением увеличения
лизосомального pH и стимуляции аутофагии на поздних сроках инкубации с
декстраном 70 кДа. Кроме того, обнаруженная взаимосвязь открывает
потенциальные возможности для поиска новых фармакологических стимуляторов
генов лизосомального биогенеза, что является одной из актуальных задач
современных фармакологических исследований в области болезней накопления и
нейродегенеративных заболеваний.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Участие редокс-чувствительной сигнальной системы Keap1/Nrf2/ARE в
дифференцировке и активации Т-лимфоцитов/А.В. Чечушков, В.О. Ткачев, Н.К.
Зенков, Е.Б. Меньщикова // Бюл. СО РАМН.– 2012.– № 5.– С. 21–27. (Список ВАК)
2. Исследование влияния липосомальных композиций с окисленными
декстранами на функциональную активность макрофагоподобных клеток линии
U937 in vitro /П.М. Кожин, А.В. Чечушков, Н.С. Зайцева, А.Е. Лемза, Е.Б.
Меньщикова, А.В. Троицкий, В.А. Шкурупий // Бюл. эксперим. биол. мед.– 2015.–
Т. 160, № 7.– С. 67–71. (Список ВАК)
3. Влияние индукции редокс-чувствительной системы Keap1/Nrf2/ARE на
классическую активацию макрофагов/ П.М. Кожин, Н.К. Зенков Н.К., А.Е. Лемза,
А.В. Чечушков, Н.С. Зайцева, Н.В. Кандалинцева, Е.Б. Меньщикова // Сибирский
научный медицинский журнал. – 2015. – № 6. – С. 37–44. (Список ВАК)
4. Окисленный декстран усиливает альтернативную активацию макрофагов
мышей оппозитных линий/ А.В. Чечушков, П.М. Кожин, Н.С. Зайцева, А.Е. Лемза,
Е.Б. Меньщикова, А.В. Троицкий, В.А. Шкурупий // Бюл. эксперим. биол. мед. –
2015. – Т. 160, № 12. – С. 749–753. (Список ВАК)
5. Plant phenols and autophagy/ N.K. Zenkov, A.V. Chechushkov, P.M. Kozhin,
Kandalintseva N.V., Martinovich G.G., Menshchikova E.B. // Biochemistry. – 2016. –
Vol. 81, No. 4. – С. 297–314. (Список ВАК)
6. Аутофагия в патогенезе туберкулеза/ А.В. Чечушков, Н.К. Зенков, П.М.
Кожин, Т.А. Колпакова, Е.Б. Меньщикова // Туберкулез и болезни легких. – 2016. –
№ 3. – С. 8–19.
7. Влияние окисленного декстрана на уровень Т-хелпер зависимых цитокинов в
крови мышей оппозитных линий/ А.В. Чечушков А.В., П.М. Кожин, В.А.
Старостенко, А.Е. Лемза
// Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов: тез.докл. VI Всерос. научно-практич. конф. с
международным участием. – Новосибирск, 2013. – С. 184-185.
8. Влияние
молекулярно-наносомальных
фармацевтических
композиций
окисленных декстранов на продукцию активных форм кислорода клетками линии
U937/П.М. Кожин, А.Е. Лемза, А.В. Чечушков, Н.С. Зайцева, Н.К. Зенков, Е.Б.
Меньщикова, А.В. Троицкий, В.А. Шкурупий // Фундаментальные аспекты
компенсаторно-приспособительных процессов: тез.докл. Седьмой Всерос. научнопрактич. конф. – Новосибирск, 2015. – С. 120–122.
9. Индукция аутофагии модифицированными декстранами/ А.В. Чечушков, Н.К.
Зенков, Е.Б. Меньщикова, А.В. Троицкий, В.А. Шкурупий// Фундаментальные
аспекты компенсаторно-приспособительных процессов: тез.докл. Седьмой Всерос.
научно-практич. конф. – Новосибирск, 2015. – С. 313–315.
10. Nuclear translocation of Nrf2 in J774 macrophages is induced by lactoferrin/ E.
Zakharova, A. Chechushkov A., E. Menshchikova, P. Kozhin, N. Zenkov, V. Kostevich,
A. Sokolov,V. Vasilyev // The Keap1/Nrf2 Pathway in Health and Disease: Abstr. Biochemical Society Focused Meeting, 6–8 January 2015, Cambridge.– Cambridge: Portland
Press Ltd., 2015.– P. 34.
24
11. Влияние оригинального индуктора редокс-чувствительной системы
Keap1/Nrf2/ARE на аутофагию / А.В. Чечушков, Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зенков //
IX Международная конференция "Биоантиоксидант", 29 сентября – 2 октября 2015
г.: Тез. докл. – М., 2015. – С. 199.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК – активные формы кислорода
БЦЖ – бацилла Кальметта-Герена
ГК – гидропероксид кумола
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ТС-13 – 3-(3'-трет-бутил-4'-гидроксифенил)пропилтиосульфонат натрия
ХА – хлорид аммония
ЦОМТ – центр образования микротрубочек
ARE – антиоксидант-респонсивный элемент
CLEAR – регуляторный геномный элемент, координирующий лизосомальный
биогенез
D40 – декстран с молекулярной массой 40 кДа
D70 – декстран с молекулярной массой 70 кДа
DFP – деферипрон
FITC – флуоресцеин-5-изотиоцианат
GSTP – глутатион-S-трансфераза P
HMOX1 – гемоксигеназа-1
IFN – интерферон
IL – интерлейкин
LPS – липополисахарид
mTOR – мишень млекопитающих для рапамицина
NADH – никотинамиддинуклеотид восстановленный
NADPH – никотинамиддинуклеотид фосфат восстановленный
NQO1 – NAD(P)H-хиноноксидоредуктаза-1
TFE3 – транскрипционный фактор E3
TFEB – транскрипционный фактор EB
V-АТФаза –вакуолярная АТФаза
Соискатель
Чечушков А.В.
25
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа