close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Новые ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 на основе производных пиримидинов....pdf

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ВАЛУЕВ-ЭЛЛИСТОН Владимир Треворович
НОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ ВИЧ-1 НА ОСНОВЕ
ПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИНОВ
Специальность 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Москва 2016
1
Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных
соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института
молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Кочетков Сергей Николаевич
доктор химических наук, профессор, членкорреспондент РАН, заведующий Лабораторией
молекулярных основ действия физиологически
активных соединений Федерального
государственного бюджетного учреждения науки
Института молекулярной биологии им.
В.А.Энгельгардта Российской академии наук.
Тарантул Вячеслав Залманович
доктор биологических наук, профессор, заведующий
Лабораторией репликации и репарации генома
Федерального государственного бюджетного
учреждение науки Института молекулярной генетики
Российской академии наук
Бобкова Марина Ридовна
доктор биологических наук, заведующая лаборатории
Вирусов лейкозов, заведующая отделом общей
вирусологии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского
ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России
Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение высшего образования
«Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет». 630090,
Новосибирская область, г. Новосибирск, ул.
Пирогова, д. 2, (383) 363-43-33
Защита диссертации состоится « » ______________ 2016 г. в ____ часов на заседании
диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном
учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по
адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН (119991, Москва, ул.
Вавилова, д. 32) и на сайте ИМБ РАН http://eimb.ru.
Автореферат разослан «___»______________2016 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета
кандидат химических наук
А.М. Крицын
2
Общая характеристика работы.
Актуальность проблемы.
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает одно их наиболее распространенных и
пожизненных заболеваний. В настоящий момент в мире насчитывается более 34
миллионов носителей ВИЧ-инфекции. Только по официальной статистике на Российскую
Федерацию приходится более 700 тыс. носителей, и эта цифра продолжает расти со
скоростью приблизительно 50 тыс. человек в год. К текущему моменту в терапии ВИЧ
применяются 27 препаратов, 9 из которых являются нуклеозидными ингибиторами
(НИОТ) обратной транскриптазы ВИЧ (ОТ ВИЧ), 5 – ненуклеозидными ингибиторами
(ННИОТ) ОТ ВИЧ, 9 – ингибиторами протеазы ВИЧ, и по одному веществу ингибиторами интегразы ВИЧ, слияния вируса с клеткой и его проникновения в клетку,
соответственно. ВИЧ-инфекция неизлечима, поэтому терапия носит, как правило,
пожизненный характер. Появление высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ)
– комплексного применения как минимум 3-х препаратов, направленных на подавление
функционирования различных белков вируса, позволило подобрать наиболее подходящую
терапию для каждого пациента. Во многих случаях она позволяет увеличить
продолжительность жизни ВИЧ-инфицированных пациентов на многие годы. Одним из
наиболее часто используемых режимов ВААРТ является комбинация из двух НИОТ и
одного ННИОТ. В основе принципа действия ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ
лежит их связывание c гидрофобным карманом фермента, что проявляется в
неконкурентном ингибировании реакции обратной транскрипции. Принято считать, что
фиксация ННИОТ в гидрофобном кармане препятствует конформационным изменениям
фермента, резко снижая его активность.
Среди ННИОТ выделяют два поколения препаратов: к первому относят невирапин
(NVP), эфавиренц (EFV) и делавердин (DLV), ко второму – этравирин (ETV) и
рилпивирин (RPV). Как и в случае любых других анти-ВИЧ препаратов, для ННИОТ
крайне острой является проблема возникновения резистентности к последним, которая
возникает у пациентов, проходящих терапию. Несмотря на широкий профиль
резистентности ННИОТ второго поколения, в клинической практике уже встречаются
пациенты с мутациями в ОТ ВИЧ, позволяющими вирусу противостоять действию этих
препаратов. Следовательно, задача поиска новых соединений, являющихся
ненуклеозидными ингибиторами ОТ ВИЧ и обладающими профилем резистентности,
сравнимым с ННИОТ второго поколения, представляется весьма актуальной.
Наиболее совершенные ННИОТ - (этравирин (ETV) и рилпивирин (RPV))относятся
к классу диарилзамещенных пиримидинов (DAPY). В отличие от ненуклеозидных
ингибиторов первого поколения, соединения этого класса обладают структурной
гибкостью, позволяющей соединению лучше «приспособиться» к изменениям
гидрофобного кармана в случае мутаций внутри последнего. Именно этим, по-видимому,
и объясняется широкий профиль резистентности, характерный для ННИОТ второго
поколения, поэтому новые ННИОТ наиболее эффективно создавать на основе
замещенных пиримидинов, придерживаясь принципа структурной гибкости соединений.
Одним из наиболее удобных способов оценки ненуклеозидных ингибиторов ОТ
ВИЧ является проверка веществ на рекомбинантном белке. Поэтому для создания
наиболее эффективной системы тестирования ингибиторов необходима панель мутантных
3
форм ОТ ВИЧ, содержащих наиболее часто встречающиеся мутации, дающие
устойчивость к применяющимся в клинической практике препаратам.
Цели и задачи исследования.
Целью работы было получение новых высокоактивных ненуклеозидных
ингибиторов ОТ ВИЧ (ННИОТ), обладающих широким профилем резистентности,
сравнимым с применяющимся в клинической практике препаратам. Для достижения
данной цели в работе сформулированы следующие задачи:
1.
Создание панели мутантных форм ОТ ВИЧ, содержащих мутации, встречающиеся
у пациентов с устойчивостью к ННИОТ для проведения скрининга ингибиторов.
2.
Исследование потенциальных ННИОТ на основе замещенных пиримидинов и
отбор наиболее перспективных соединений-лидеров для дальнейшего
исследования.
3.
Проверка соединений-лидеров на панели мутантных форм ОТ ВИЧ, обладающих
устойчивостью к применяющимся в клинической практике ненуклеозидным
ингибиторам ОТ ВИЧ.
Научная новизна и практическое значение работы.
В рамках работы получена панель мутантных форм ОТ ВИЧ, устойчивых к
действию применяющихся в клинической практике ННИОТ, и позволяющая в короткие
сроки тестировать перспективные соединения, Для всех полученных мутантных форм
отработана методика очистки, позволяющая добиться более чем 95% чистоты и высоких
выходов.
В рамках работы в качетсве ННИОТ исследовано около 200 соединений,
полученных на основе замещенных пиримидинов. Для наиболее перспективных
соединений исследовано изменение ингибирующей активности на наиболее часто
встречающихся мутантных формах ОТ ВИЧ. Широкий охват соединений, относящихся к
нескольким классам, позволяет не только сделать выводы о закономерностях структураактивность внутри каждого класса веществ, но и способствует формированию модели, в
рамках которой возможно создание высокоактивных ненуклеозидных ингибиторов ОТ
ВИЧ, необходимой для более эффективного и рационального драг-дизайна.
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались на 38’th FEBS Congress (Конгрессе
Федерации европейских биохимических обществ 2013. Биологические механизмы, СанктПетербург, 2013), Первой Российской конференции по медицинской химии, (Москва,
2013), IV-ом Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с
международным участием («Современные проблемы медицинской химии. Направленный
поиск новых лекарственных средств»).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 7 статей
в научных журналах и 7 тезисов докладов в материалах конференций.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на _153_ страницах,
состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка
литературы, включающего _255_ источников. Материал иллюстрирован _29__ рисунками
и _77__таблицами.
4
Работа выполнена при
финансовой поддержке Российского Фонда
Фундаментальных Исследований (гранты 13-0401837_а, Государственным контрактом
№16.512.12.2006 от 15.06.2011, Соглашением с МинОбрНауки РФ №8069 от 20.07.2012 в
рамках Федеральной Целевой Программы «Научные и научно-педагогические кадры
инновационной России» на 2009 – 2013 годы», и программы Президиума РАН
«Молекулярная и клеточная биология». Часть экспериментов проводилась при
использовании оборудования ЦКП «Геном» (ИМБ РАН).
5
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
С момента одобрения невирапина в 1996 FDA (U.S. Food and Drug Administration)
ННИОТ являются неотъемлемой частью антиретровирусной терапии. К настоящему
времени известно более 50 классов соединений, ингибирующих ОТ ВИЧ, но FDA в
качестве лекарственных ННИОТ одобрено лишь 5 соединений. Препараты первого
поколения невирапин (NVP) и эфавиренц (EFV) являются стандартом для первой линии
ВААРТ.
В связи с тем, что в клинической практике случаи устойчивости ВИЧ к ННИОТ
первого поколения стали встречаться все чаще и чаще, важнейшим критерием при
создании новых ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ стал широкий профиль
резистентности. Препараты второго поколения этравирин (ETV) и рилпивирин (RPV)
обладают устойчивостью к широкому спектру мутаций в ОТ ВИЧ, вызывающих
резистентность к невирапину и эфавиренцу. Как было указано во введении,
предполагается, что причиной широкого профиля резистентности ненуклеозидных
ингибиторов ОТ ВИЧ второго поколения является «гибкость» структуры, позволяющая
соединению приспособиться к изменившейся форме гидрофобного кармана в случае
возникновения мутаций в ОТ ВИЧ. Следственно, концептуально перспективный
ненуклеозидный ингибитор ОТ ВИЧ представляется как система из нескольких
ароматических циклов, соединенных гибкими линкерами. Также стоит отметить, что и
этравирин и рилпивирин относятся к классу диарилпиримидинов (DAPY), поэтому имеет
смысл использовать замещенный пиримидин в качестве приоритетного структурного
мотива.
1. Создание панели мутантных форм ОТ ВИЧ.
Одной из основных причин неудач антиретровирусной терапии ВИЧинфицированных пациентов является выработка ферментом резистентности к
применяющимся препаратам. Из 26 таких препаратов 13 направлены на подавление
актвности ОТ ВИЧ, поэтому нет ничего удивительного в том, что в мировой популяции
ВИЧ образовалось множество мутантных форм этого белка, устойчивых к
применяющимся в клинической практике препаратам. Именно это обстоятельство
выдвигает требование при разработке новых соединений иметь набор наиболее часто
встречающихся форм ОТ ВИЧ с мутациями, нивелирующими действие уже
использующихся лекарств. Так как целью работы являлось исследование новых
ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ, было запланировано получение набора из
нескольких форм фермента, содержащих мутации, наиболее часто встречающиеся у
пациентов с резистентностью к ННИОТ.
Согласно
литературным
данным,
большинство
описанных
«мутаций
резистентности» к ННИОТ локализовано непосредственно в гидрофобном кармане,
сформированном вблизи каталитического центра ОТ ВИЧ. Среди пациентов с выявленной
резистентностью к ненуклеозидным ингибиторам наиболее частыми являются мутации
K103N (56,98%) и Y181C (24,95%). Нами было запланировано получение форм ОТ ВИЧ1, содержащих эти замены, а также широко представленные у пациентов L100I, V106A,
G190A и двойная мутация K103N+Y181C.
Для получения экспрессионной системы для выделения целевых белков была
выбрана двухцистронная система на основе вектора pET-21-2C, созданная ранее в нашей
лаборатории для экспрессии белков вируса гепатита С и доказавшая свою эффективность.
6
Рисунок. 1 Сравнение гомо- и гетеродимера ОТ ВИЧ: полимеразная активность и
ингибирование фермента.
Рисунок 2. Выделение гомодимера ОТ ВИЧ. Анализ фракций при выделении ОТ ВИЧ
дикого типа (А). Целевые продукты выделения мутантных форм ОТ ВИЧ (Б).
Мутантные
формы ОТ
ВИЧ-1
/мутация/
Дикий тип
/L100I/
/ K103N/
/ V106A/
/ Y181C/
/ G190A/
Выход
белка, мг/л
культуры
Препарат,
мг/мл
KМ
(dATP),
мкМ
Vmax,
мкМ/c×мг
5
26
7
23
12
7
3,3
11,7
3
9,2
18,7
20,2
0,76
1,2
0,78
0,77
0,84
0,83
1,5
1,05
0,92
1,6
1,3
1,36
Таблица 1. Характеризация ОТ ВИЧ в форме гомодимера.
ОТ ВИЧ-1 существует в физиологических условиях как в виде гетеродимера
p51/p66, так и в виде гомодимера p66/p66, при этом гетеродимер превалирует, как более
стабильный. Ряд экспериментов по сравнению ингибирующей активности двух форм ОТ
ВИЧ-1 дикого типа показал, что хотя гетеродимер является более активной формой
7
фермента (рисунок 1), значения КI для ННИОТ у двух форм ОТ ВИЧ-1 различаются
незначительно, поэтому для дальнейших исследований использовались гомодимеры
мутантных форм ОТ ВИЧ-1, благодаря более простой процедуре их получения и очистки.
Методом сайт-специфического мутагенеза были получены все запланированные
мутантные формы ОТ ВИЧ-1 в виде гомодимеров. Белки были выделены и очищены
методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой. Чистота всех
рекомбинантных белков составляла не менее 95% (рисунок 2). Выделенные белки были
охарактеризованы (таблица 1).
Полученная панель мутантных форм ОТ ВИЧ-1 была применена для выявления
новых высокоэффективных ненуклеозидных ингибиторов фермента.
1.
Ингибиторы ОТ ВИЧ-1 на основе бензофеноновых производных
пиримидинов.
Характерной чертой ННИОТ второго поколения является широкий профиль
резистентности, позволяющий проводить терапию пациентов с выработанной
устойчивостью к действию ННИОТ первого поколения. Причиной широкого профиля
резистентности является «гибкость» структуры ННИОТ второго поколения, позволяющая
соединению приспособиться к изменившейся форме гидрофобного кармана в случае
возникновения мутаций в ОТ ВИЧ.
Одной из широко используемых парадигм при создании новых препаратов,
действие котрых направлено против известной мишени, является комбинаторный метод,
когда при дизайне нового перспективного соединения используются структурные мотивы
соединений, проявивших активность в отношении выбранной мишени. Подобный подход
активно используется при создании ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ [Li D et al., J
Med Chem. 2012]. В настоящей работе создание новых ингибиторов следовало именно
этой парадигме - используя мотивы изученных соединений, проявивших высокую
активность в отношении ОТ ВИЧ (рисунок 3).
Рисунок 3. Концепция создания высокоактивных новых ненуклеозидных ингибиторов
ОТ ВИЧ на основе бензофеноновых производных пиримидинов
Первое соединение – MKC-442, представитель класса соединений, полученный на
основе HEPT (1-[(2-гидроксиэтокси)метил]-6-(фенилсульванил)тимина), проявившее
очень высокую анти-ВИЧ активность [Baba M, Antimicrob Agents Chemother. 1994]. В
экспериментах на инфекционной культуре in vitro в присутствии MKC-442 была выявлена
быстрая выработка резистентности, причиной которой являлась единичная мутация
Y181C в ОТ ВИЧ, приводящая к падению ингибиторной активности MKC-442 в 3500 раз.
8
Было также обнаружено, что in vivo MKC-442 способно активировать цитохром Р450,
метаболизирующий ингибиторы протеазы ВИЧ. Вследствие этих обстоятельств,
доклинические исследования MKC-442 были приостановлены.
Второе соединение класса бензофенонов – GW678248, проявившее не только
высокую активность в отношении ОТ ВИЧ дикого типа, но и в отношении большинства
мутантных форм ОТ, устойчивых к действию ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ
первого поколения [Ferris R, Antimicrob Agents Chemother. 2005]. Соединение успешно
прошло доклинические испытания, но было снято компанией GlaxoSmithKline с третьей
стадии клинических испытаний без объяснения причин.
По данным кристаллографических исследований вблизи «выхода» из гидрофобного
«кармана» фермента у бензофеноновых производных расположен бензольный цикл С, в
то время как наиболее сильно вдающимся в «карман» является цикл А (см. рисунок 3).
Все работы по синтезу соединений были выполнены нашими коллегами из
ВолГМУ в лаборатории медицинской химии Волгоградского медицинского научного
центра группой доцента доктора фарм. наук. М.С. Новикова (в том числе Д.А. Бабковым и
М.П. Парамоновой).
Полученные бензофеноновые производные пиримидинов содержат в своем
составе наиболее важные фармакофоры – бензофеновый фрагмент и остаток урацила,
которые определяют анти-ВИЧ-1 для соединений MKC-442 и GW678248. Для удобства
обсуждения свойств структуры в дальнейшем будут использованы буквенные
обозначения трех ароматических циклов, аналогично рисунку 3.
O
H
N
O
O
O
N
R2
HN
O
O
R2
N
R1
R1
O
1
2-4
№ соединения
1
2
3
4
5
6
NH2
N
O
R1
N
O
O
O
R2
5-6
R1
Н
H
2,4-CH3
2,4-CH3
Н
Н
R2
Н
H
H
CH3
H
CH3
KI (мкМ)
1,26
>100
>100
41
>100
>100
Таблица 2. Ингибирующая активность бензофеноновых производных урацила 1-6
В первую очередь предложенную концепцию было решено проверить, создав
несколько аналогов бензофенонов, отличающиеся положением гибкого линкера,
связывающего бензофеноновый фрагмент с молекулой урацила (соединения 1 – 6, таблица
2). Как видно, наилучшую ингибирующую активность проявил 1-[2-(2-бензоилфенокси)этил]урацил (1), в связи с чем данное соединение было принято за основу.
Дальнейшее развитие концепции бензофеноновых производных пиримидинов было
решено сосредоточить на варьировании заместителей при трех ароматических циклах
(таблица 3).
9
O
O
N
O
R5
N
C
O
R4
R3
R1
A
B
R2
№ соединения
R1
R2
R3
R4
R5
1
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
H
H
H
H
H
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-F
3,5-Cl
3,5-Cl
3,5-Br
H
H
H
H
H
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
H
CH3
F
Cl
Br
CH3
Cl
Br
Cl
Cl
Br
Cl
H
H
H
H
H
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CH3
CH3
H
CH3
CH3
CH3
n-C3H7
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CH3
F
Br
H
CH3
CH3
H
CH3
n-C4H9
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
KI
(мкМ)
1.26
5.6
2.9
0.98
2.0
2.4
2.4
1.04
0.77
0.68
0.35
2.3
0.47
0.71
0.7
0.98
0.24
1.2
0.73
0.083
>100
95
28
3,5-CH3
Cl
N
H
H
>100
29
30
31
32
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
Cl
Cl
Cl
Cl
H
H
H
H
-CH2CH2CH2-N=CH-NH-
-С3H6N(C3H7)2
-СH2СH2СH2Br
H
H
22
20
0.31
4.52
7,2
0,01
O
NVP
EFV
Таблица 3. Ингибирующая активность бензофеноновых производных урацила 7-32. NVP –
невирапин, EFV- эфавиренц
Заместители в бензофеноновом фрагменте оказывали влияние на ингибиторную
активность соединений. Так, в случае соединений с Cl- и Br- заместителями в
центральном ароматическом фрагменте (7-10) их активность была несколько выше, чем у
соответствующих аналогов с Me и F. Тем не менее, в сравнении с незамещенным
бензофеноном 1, в отсутствие заместителей в положении R1, хлор- и бром- производные 9
и 10 это влияние не слишком значительно (9, 10 про сравнению с 1). В случае соединений
с заместителями в ароматическом фрагменте А наблюдается та же тенденция, при которой
10
соединения, замещенные по положению R2 на хлор или бром, выигрывают в активности у
соответствующих метильных производных (12, 13 по сравнению с 11).
Поскольку наилучшие уровни активности проявили соединения, в которых
заместителем в положении R2 был атом Сl или Br, основное внимание при варьировании
заместителя в положении R1 было уделено именно им. Из литературных данных,
касающихся
близких аналогов, следует, что наибольшую активность проявляют
соединения с двумя заместителями в мета-положении бензольного кольца в положении
R1 [Romines KR et al., J Med Chem. 2006]. Среди замещенных по положению R1
соединений однозначной закономерности выявить не удалось. На примере соединений 9,
12, 14, 15, 17 видно, что наибольшую активность проявили фтор- и хлор-замещенные
соединения, в то время как их бром- и метил- замещенные аналоги оказались менее
активны.
Значительное влияние на активность соединений оказывают заместители в
урацильном цикле С. Было отмечено, что оптимальным заместителем в 5-ом положении
урацила является метильная группа (из сравнения активности соединений 18-20). Наличие
двух метильных грпп, как в пятом, так и в шестом положении урацильного фрагмента
существенно увеличивает ингибирующую активность соединений в отношении ОТ ВИЧ-1
(сравнивая соединения 22 с 1, а также 25 с 12). Тем не менее, более объемные заместители
привели лишь к падению активности (соединения 26-28). Попытки замкнуть 5 и 6
положения урацила в неароматический цикл имели переменный успех. Активность
соединения 31 с гидрофобным циклом выше, чем у незамещенного аналога 12, а вот
соединение 32 соединению 12 в активности проигрывает. Наличие заместителей в
положении R5 урацильного фравгмента также весьма существенно влияет на активность
соединений. Замена протона на объемные гидрофобные заместители приводила к
уменьшению ингибирующей активности на порядок (соединения 29, 30).
R1
N
O
O
O
R2
N
H3C
CH3
Cl
33 – 39
№ соединения
33
34
35
36
37
38
39
R1
R2
-CH2COOH
=O
-CH2COOEt
=O
-CH2CONH2
=O
H
-NH2
H
-NHCH2CH2OH
H
-NHCH2CH2Ph
H
-NHCH2CH3
NVP
EFV
KI (мкМ)
>100
>100
>100
11
19,9
32,7
38,5
7,2
0,01
Таблица 4. Ингибирующая активность бензофеноновых производных урацила 33-39
11
Одной из наиболее значимых проблем соединений бензофенонового семейства
является их чрезвычайно низкая растворимость, что резко снижает их практическое
значение в качестве потенциальных анти-ВИЧ препаратов. В нашем случае для решения
этой проблемы была выполнена попытка введения заместителей в пиримидиновый цикл,
способных улучшить растворимость.
Помимо введения заместителей в N3 положение пиримидинового цикла
(соединения 33-35) была исследована возможность замены урацильного фрагмента
цитозиновым (36-39) (таблица 4). Данная попытка успехом не увенчалась - соединения,
содержащие заряженные группы в N3-положении пиримидина оказались полностью
неактивны (33-35), а соединения на основе цитозина проигрывали в активности
урацильным производным (сравнивая 36 с 12).
H
N
O
R1
O
n
O
N
R2
R3
№ соединения
40
41
42
43
44
45
46
47
R1
H
H
H
H
H
-OH
=O
H
40 – 47
R2
H
3-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
3,5-CH3
NVP
EFV
R3
CH3
CH3
CH3
Cl
Br
Cl
Cl
CH3
n
1
1
1
1
1
1
2
4
KI (мкМ)
76
36
5.9
5.0
11
>100
>100
>100
7,2
0,01
Таблица 5. Ингибирующая активность бензофеноновых производных урацила 40-47
Кроме заместителей в ароматических кольцах, была исследована и структура
линкера, соединяющего ароматические фрагменты молекулы (таблица 5). Так, была
доказана важность наличия кето-группы между двумя бензольными кольцами. Замена
кето-группы на алкильный линкер приводила к падению активности (сравнивая соединия
40, 42-44 с их аналогами 7, 11-13), а замена кето-группы на гидроксил (соединение 45) - к
полной ее потере. Варьирование длины линкера между урацильным и бензольным
фрагментами улучшения активности также не принесло (соединения 46,47).
Для дальнейших испытаний на панели мутантных форм ОТ были отобраны 3
соединения – 15, и 25, как наиболее активные, и соединение 12, показавшее самую низкую
цитотоксичность в экспериментах на клетках (CC50>313 мкM), и имевшее, вследствие
этого, высокий индекс селективности (SI>19588). Растворимость соединения 16,
продемонстрировавшего наибольшую ингибирующую активность в отношении ОТ дикого
типа, была чрезвычайно низкой, что делало малоперспективными исследования при
концентрациях в несколько раз выше его KI. Как видно из полученных данных (таблица
6), все вещества были активны в отношении большинства мутантных форм ОТ ВИЧ-1,
12
устойчивых к действию невирапина – наиболее часто применяющегося в ВААРТ в
качестве ННИОТ. Сравнивая вещества с другим одобренным в клиническую практику
ННИОТ 1-го поколения - эфавиренцом, следует отметить, что, хотя столь высокой
активности, как у последнего добиться не удалось ни для одного из исследованных
соединений, соединение 15 значительно меньше теряет в активности на всех мутантных
формах, за исключением V106A. Для 12 меньшие потери в активности проявлялись в
случае мутаций L100I, K103N и G190A. Наиболее активное из исследованных
бензофенонов вещество 25 проявило парадоксально высокие потери в активности по
H
N
O
O
N
O
O
O
12
15
25
NVP
EFV
KI
мкM
2,4
0,7
0,083
7,2
0,01
O
O
Cl
L100I
Cl
KI
мкM
3,3
0,86
0,31
273
0,08
ПА
разы
1,38
1,23
3,73
37,9
8
KI
мкM
33
5,68
4,68
>720
0,58
ПА
разы
13,8
8,11
56,4
>100
58
CH3
CH3
O
CH3
Cl
Cl
15
K103N
O
H3C
12
№
N
Cl
CH3
H
N
O
O
N
H3C
WT
H
N
O
V106A
KI
мкM
>240
>70
>10
>720
0,05
ПА
разы
>100
>100
>100
>100
5
25
Y181C
KI
мкM
8
0,36
0,21
>720
0,03
ПА
разы
3,33
0,51
2,53
>100
3
G190A
KI
мкM
1
0,9
0,37
>720
0,06
ПА
разы
0,42
1,29
4,46
>100
6
K103N
+ Y181C
KI
ПА
мкM разы
57
23,8
1,1
1,57
8,56 >100
>720 >100
0,14
14
Таблица 6. Ингибирующая активность бензофеноновых производных урацила 12, 15, 25
на мутантных формах ОТ ВИЧ. ПА- падение активности соединений
сравнению с другими соединеними в случае мутации K103N и двойной мутации
K103N+Y181C. Помимо этого, вещество 25, в отличие от других бензофенонов,
достоверно выигрывало по потере активности у эфавиренца лишь в случае мутации L100I.
Тем не менее, несмотря на высокие потери в активности, KI для вещества 25 оказалась
наименьшей среди исследованных бензофенонов, в случае всех мутаций, за исключением
V106A и двойной мутации K103N+Y181C.
Для изучения парадоксально высокого падения активности соединения 25 в случае
мутантных форм K103N и K103N+Y181C было решено исследовать взаимосвязь между
типом заместителя в урацильном фрагменте и ингибирующей активностью соединений на
мутантных формах ОТ ВИЧ. В качестве модельных были выбраны соединения 22 (схожее
с 25 заместителями в урацильном фрагменте) и 20 (кардинально отличается от 25)
(таблица 7).
Галоген-замещенное соединение 20 теряет в активности сильнее, чем 22 и 25.
Зависимость потерь активности соединений 20 и 22 от типа мутации практически
полностью коррелирует с соединением 25, с поправкой на отсутствие заместителей в
бензольных кольцах (что закономерно вызывает потери в активности вследствие более
свободного расположения в гидрофобном кармане фермента). Соединение 20 больше
13
остальных соединений теряет в активности в случае всех мутаций, кроме K103N.
Согласно литературным данным предполагается, что данная мутация затрудняет
проникновение ингибитора в гидрофобный карман за счет перераспределения водородных
связей внутри кармана, однако гидрофобный характер соединения остается неизменным,
что позволяет ингибитору связываться с последним. [Hsiou Y et al., J Mol Biol. 2001]. По
всей видимости энергетические затраты, приходящиеся на то, чтобы разорвать
водородные связи и поместить в карман более объемную (за счет метильных заместителей
в обоих дистальных циклах)
молекулу, не компенсируются выигрышем от
дисперсионных и гидрофобных взаимодействий метильных групп с остатками
гидрофобного кармана. Именно поэтому незамещенные по дистальному бензольному
циклу молекулы 20 и 22 теряют в активности в случае мутации K103N меньше, чем 25. В
случае мутанта K103N+Y181C потеря в активности более чем на два порядка объясняется
суммарным эффектом потерь в ингибирующей активности от обеих мутаций.
H
N
O
H
N
O
N
O
O
H
N
O
O
N
Br
O
O
CH3
CH3
O
N
O
WT
№
20
22
25
NVP
EFV
KI
мкM
0,64
0,2
0,083
7,2
0,01
KI
мкM
37,8
1,9
0,31
273
0,08
ПА
разы
59,1
9,5
3,73
37,9
8
K103N
KI
мкM
17,6
5,9
4,68
>720
0,58
ПА
разы
27,5
29,5
56,4
>100
58
V106A
KI
мкM
>64
>20
>10
>720
0,05
ПА
разы
>100
>100
>100
>100
5
CH3
O
Cl
22
L100I
CH3
H3C
CH3
20
O
25
Y181C
KI
мкM
10,4
2,5
0,21
>720
0,03
ПА
разы
16,3
12,5
2,53
>100
3
G190A
KI
мкM
27
4,2
0,37
>720
0,06
ПА
разы
42,2
21
4,46
>100
6
K103N
+ Y181C
KI
ПА
мкM разы
69
>100
25
>100
8,56 >100
>720 >100
0,14
14
Таблица 7. Игибирующая активность бензофеноновых производных урацила 20, 22, 25 на
мутантных формах ОТ ВИЧ. ПА- падение активности соединений
В целом, бензофеноновые производные урацила показали высокую ингибирующую
активность в отношении ОТ ВИЧ (вплоть до наномолярных значений), но крайне низкую
растворимость и нулевую биодоступность на животных моделях (данные не указаны).
Попытки улучшить растворимость успехом не увенчались, поэтому было решено
изменить структуру тестируемых соединений, оставляя неизменным прицип нескольких
ароматических циклов, соединенных гибкими линкерами.
2. Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 на основе N1,N3-замещенных
урацилов.
Детальное изучение соединений, содержащих урацильный фрагмент в качестве
дистального цикла А (данные приведены в диссертации), не привело к заметному
улучшению ингибирующих свойств, поэтому было решено предложить в качестве
ННИОТ диарилпиримидины, поместив пиримидиновый цикл в центральное положение
молекулы в качестве цикла В (рисунок 4). Отталкиваясь от структуры ранее изученного
14
класса бензофеноновых производных, длины линкеров было решено оставить без
изменений.
Рисунок 4. Концепция создания высокоактивных ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ
методом перемещения структурных мотивов
Для проверки концепции было получено значительное число соединений с
различными заместителями по всем трем циклам А, В, С.
R1
A
O
O
N
B
N
O
O
C
R2
N
O
R3
N
O
O
N
O
CH3
O
48-56, 58-67
№ соединения
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
N
57
R1
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Н
H
H
2-CH3
3-CH3
4-CH3
2,5-CH3
3,5-CH3
2,4,6-CH3
3,5-CH3
H
H
R2
H
2-CH3
3-CH3
4-CH3
4-t-Bu
4-Ph
4-Cl
4-F
4-CN
См. рисунок
3,4-CH3
3,5-CH3
4-CH3
4-CH3
4-CH3
4-CH3
4-CH3
4-CH3
H
4-CH3
4-CH3
NVP
EFV
68
R3
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Н
H
H
H
H
H
H
H
H
H
CH3
См. рисунок
KI (мкМ)
68
>100
>100
52
15
8.1
22
70.6
51.5
12
>100
>100
>100
6.62
46.6
10.3
0.26
>100
0.37
>100
>100
7,2
0,01
Таблица 8. Ингибирующая активность N1,N3-замещенных урацилов 48-68
15
Введение заместителей R3 в урацильный фрагмент B (соединения 67, 68), а
также метильных групп в положения 2 и 3 фрагмента С, приводило к полной потере
ингибиторной активности соединений (соединения 49, 50, 58 и 59) (таблица 8).
Положение 4 этого фрагмента оказалось более благоприятным для введения заместителей.
Из сравнения соединений 48 и 52-57 видно, что объемные заместители в этом положении
ведут к существенному увеличению активности. Введение хлора (54), трет-бутильной (52)
или фенольной (53) групп в положение R2, а также замещение бензольного фрагмента С
на нафтильный (57) вызывало, с одной стороны, уменьшение растворимости, и с другой
стороны, резкий рост цитотоксичности соединений (данные не преведены).
Поскольку введение циано-группы (56) приводило к увеличению цитотоксичности
(данные не приведены), в дальнейшем, при создании соединений, замещенных по
положению R1 было решено остановиться на метильном заместителе в 4-ом положении
фрагмента С (51), как наиболее удачном. Из сравнения активностей соединений такого
типа (60-66) с заместителями в бензольном цикле А наиболее значимыми оказались
положения 3 и 5 (соед. 61, 63, 64, 65), в то время как модификации в положениях 2, 4 и 6
(соединения 60, 62-65) приводили к частичной или полной потере активности.
При сравнении вклада заместителей в положениях R1 и R2 (соединения 51 и 66 по
сравнению с соединением 48), очевидно, что заместители в положениях 3 и 5 цикла А
значительно важнее для противовирусной активности молекул, чем метильная группа в 4ом положении цикла С. Любые введения гидрофобных группировок в цикл С приводили
к понижению растворимости (соединения 52-54, 57), поэтому, учитывая незначительное
влияние метильной группы в 4-ом положении фрагмента С на улучшение активности,
было решено в дальнейшем оставить этот цикл незамещенным.
A
A
A
O
N
B
O
N
O
CH3
O
N
H3C
C
B
O
O
N
CH3
O
69
O
O
B
N
N
C
O
B
C
A
O
C
CH3
N
N
B
N
C
O
O
72
O
71
CH3
A
A
N
B
O
70
CH3
H3C
N
N
C
73
74
№ соединения
69
70
71
72
73
74
KI (мкМ)
>100
6,54
>100
>100
32.5
29,4
NVP
EFV
7,2
0,01
Таблица 9. Ингибирующая активность N1,N3-замещенных урацилов 69-74
16
Помимо оценки влияния заместителей, открытым оставался вопрос длины
линкеров и их структуры. В связи с этим проведено тестирование ряда соединений,
позволивщее пролить свет на эту проблему (таблица 9).
Из полученных данных видно, что увеличение длины линкера между фрагментами
А и В в соединении 69 приводило к полной потере активности. Разветвление линкера
между фрагментами А и В (70), наоборот, приводило к увеличению активности, вероятно
за счет более плотной фиксации 70 в гидрофобном кармане.
При сравнении активности 71 и 72 с 48, а также 73 с 66, отличающихся линкером
между фрагментами В и С, можно сделать вывод, что ни увеличение длины, ни замена
эфирного линкера на алкильный не ведут к увеличению ингибирующей активности
соединений. Соединение 74, напротив, почти в 3 раза превзошло в активности
аналогичное соединение 48, с эфирным линкером. По-видимому, двойная связь в трансконфигурации изменяет свойства линкера, выступая в роли жесткого ориентирующего
мотива и придавая молекуле 74 оптимальное положение в гидрофобном кармане ОТ.
Выявление типа линкера, существенно повышающего ингибирующую активность
соединения, потребовало более детального изучения данного подкласса N1,N3замещенных урацилов. Так как фрагмент C, а также длина линкера между ним и
фрагментом B остались теми же, что и у ранее изученных представителей этого класса
(48-68), было предположено, что заместители во фрагменте С также не будут значительно
влиять на активность соединений.
R2
R3
A
O
N
B
O
O
N
N
C
R1
N
O
74-81
82
№ соединения
R1
R2
74
75
76
77
78
79
80
81
82
H
H
H
H
H
H
H
CH3
H
H
H
F
F
Cl
Cl
Br
Br
CH3
Br
CH3
CH3
CH3
t-Bu
CH3
CH3
См. рисунок
NVP
EFV
R3
KI
(мкМ)
29,4
12
0,67
0,23
0,27
0,54
2,93
0,31
6,6
7,2
0,01
Таблица 10. Ингибирующая активность N1,N3-замещенных урацилов 74-82
Замена бензольного фрагмента A на нафтильный при некотором выигрыше в
активности приводила к резкому падению растворимости соединения 82 (таблица 10),
поэтому, учитывая схожесть соединений 74 и 48, при оптимизации структуры было
решено сосредоточиться на заместителях в 3 и 5 положениях бензольного цикла A. При
сравнении активности соединений 79 и 66, содержащих одинаковые заместители во
17
фрагменте A, наблюдалось ее незначительное падение. По всей видимости, это вызвано
тем, что более жесткий линкер между циклами B и C искажает положение молекулы в
гидрофобном кармане относительно положения аналогов с эфирным линкером. Эту
версию подтверждает факт сохранения активности соединения 81, относительно
соединения 79, в то время как для похожего соединения с эфирным линкером (67) при
введении заместитителей во фрагмент B наблюдалась полная потеря активности.
В случае заместителей в положениях 3 и 5 цикла А (75-77, 79), активность растет
в ряду Br>Me>Cl>F. Важен и стерический фактор, за счет которого соединение 80,
содержащее трет-бутильную группу, проигрывает в активности диметильному аналогу 79.
Наиболее активным соединением является 77, однако оно имеет крайне низкую
растворимость.
CH3
H3C
A
O
N
B
O
N
C
CH3
O
64
Cl
Cl
Br
A
Br
Br
A
O
N
B
N
C
O
B
N
№
64
76
77
78
79
NVP
EFV
L100I
KI
ПА
мкM разы
0,13
0,5
0,92
1,4
0,36
1,6
0,24
0,89
0,76
1,4
270
38
0,08
8
№
64
76
77
78
79
NVP
EFV
N
C
B
N
N
C
B
N
C
O
O
77
WT
KI
мкM
0,26
0,67
0,23
0,27
0,54
7,2
0,01
O
O
O
76
CH3
A
O
N
H3C
CH3
A
78
K103N
V106A
KI
ПА
KI
ПА
мкM разы мкM разы
>26
>100
7,4
29
16
23
11
17
9,4
41
4,2
18
6,9
26
2,3
8,3
12
22
2,9
5,4
>720
>100
>720
>100
0,58
58
0,05
5
K103N
G190A
+ Y181C
KI
ПА
KI
ПА
мкM разы мкM разы
0,36
1,4
>26
>100
0,55
0,82
>67
>100
0,3
1,3
>23
>100
0,18
0,67
>27
>100
0,4
0,74
>54
>100
>720 >100
>720
>100
0,06
6
0,14
14
79
Y181C
KI
ПА
мкM разы
16
61
43
64
>23
>100
20
76
>54
>100
>720
>100
0,03
3
Таблица 11. Ингибирующая активность N1,N3-замещенных урацилов на мутантных
формах ОТ ВИЧ. ПА- падение активности соединений
18
Оба подкласса N1,N3-производных урацила представляли повышенный интерес для
исследования на панели мутантных форм ОТ ВИЧ-1. Во-первых, в качестве представителя
N1,N3-замещенных урацилов с эфирным линкером было выбрано наиболее активное
соединение 64. Во-вторых, поскольку многие соединения этого класса, содержащие
двойную связь в линкере, проявили высокую игибирующую активность, было решено
выбрать несколько соединений этого подкласса, чтобы изучить влияние заместителей на
активность в случае мутантных форм ОТ ВИЧ. Были отобраны 4 соединения, проявившие
субмикромолярную активность и отличающиеся лишь заместителями в положениях 3 и 5
цикла А (соединения 76-79).
При исследовании профиля резистентности у двух подклассов N1,N3-замещенных
урацилов (таблица 11) выявилось много общего. Так, оба подкласса были устойчивы к
мутациям L100I и G190A. В случае мутаций K103N и V106A существенным было влияние
структуры линкера. Литературные данные предполагают, что мутация K103N затрудняет
образование
гидрофобного
кармана,
необходимого
ингибитору
вследствие
перераспределения системы водородных связей [Hsiou Y et all J Mol Biol. 2001]. По всей
видимости, в такой перераспределенной системе вклад эфирного линкера соединения 64
во взаимодействие ингибитора с гидрофобным карманом фермента оказывается
незначительным. Двойная связь в новой системе водородных связей не участвует, а
взаимодействует с молекулой фермента за счет стекинг-взаимодействий с
ароматическими аминокислотами гидрофобного кармана, поэтому мутация K103N хоть и
приводит к потере активности соединений 76-79, однако к полной резистентности не
ведет. В случае мутации V106A сказываеся ориентирующий эффект двойной связи
между фрагментами В и С, в результате которого изменяется положение молекулы
ингибитора (76-79) относительно положения соединения 64 в гидрофобном кармане.
Двойная мутация K103N+Y181C за счет суммарного эффекта обеих замен приводит к
потере активности более чем на 2 порядка в случае всех исследованных N1,N3замещенных урацилов.
Учитывая достаточно высокую ингибиторную активность N1,N3-замещенных
урацилов, содержащих двойную связь в линкере между фрагментами молекулы В и С,
было решено продолжить поиск в этом направлении, создав еще один подкласс N1,N3замещенных урацилов с более «жестким» малоподвижным линкером, также содержащим
двойную связь. В качестве элемента, добавляющего структуре «жесткости» и
ориентирующего молекулу ингибитора в гидрофобном кармане подобно подклассу N1,N3замещенных урацилов, с двойной связью в линкере, был выбран карбоциклический
пятичленный фрагмент (рисунок 5).
Было создано 2 типа структур (таблица 12):
1)
содержащие алкильный радикал между фрагментами А и В (по аналогии с
другими ранее исследованными N1,N3-замещенными урацилами) (83-93);
2)
содержащие кето-группу в линкере между фрагментами B и C (по аналогии
с ранее исследованными бензофенонами) (94-97)
Из данных таблицы 12 видно, что наличие кето-группы между фрагментами B и C
(ср. 83 и 94), а также наличие заместителй в цикле B (88-90, 95) приводит к полной потере
активности. Введение заместителей R1 в любое положение бензольного фрагмента А
приводит к полной потере активности (сравнивая соединения 84-87 с 83), в то время как
19
для заместителей в положении R2 оптимальными оказались 3 и 5 положения бензольного
кольца С (соединения 92 и 93 по сравнению с 83).
R
R1
A
A
O
O
N
B
R4
N
O
C
N
O
R
B
O
N
O
C
R2
R3
83-97
Рисунок 5. Концепция создания нового подксласса ННИОТ на основе N1,N3-замещенных
урацилов за счет измененияструктуры линкера
№ соединения
R1
R2
R3
R4
83
84
85-87
H
4-CH3
2,4-CH3; 3,5-CH3;
3,5-F
H; 4-CH3; 3,5-CH3
H
H
H
H
H
3,5-CH3
3,5-Cl
NVP
EFV
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
2-CN
3,5-CH3
3,5-Cl
H
H
3,5-CH3
3,5-Cl
CH3
H
H
H
H
CH3
H
H
H
H
H
H
=O
=O
=O
=O
88-90
91
92
93
94
95
96
97
KI
(мкМ)
13.4
18.7
>100
>100
>100
8.2
5.2
>100
>100
>100
>100
7,2
0,01
Таблица 12. Ингибирующая активность карбоциклических аналогов N1,N3-замещенных
урацилов 83-97
Чтобы наиболее полно изучить влияние структуры соединений данного подкласса
N ,N -замещенных урацилов на их активность на мутантных формах ОТ ВИЧ, было
отобрано 4 структуры – 83, 84, 92, 93, содержащие заместители или во фрагменте А, или
во фрагменте С (таблица 13).
Вопреки ожиданиям, вызванным жесткостью структуры ингибитора, вещества
показали парадоксально высокую активность в случае мутации L100I. Все исследованные
соединения данного типа (83, 84, 92, 93) проявили в 5-10 раз более высокую активность,
чем на ОТ ВИЧ дикого типа. Для соединений, содержащих заместители в бензольном
цикле С (соединения 92, 93), было также зафиксировано лишь незначительное падение
активности в случае мутации K103N. В случае всех остальных мутаций из-за низкой
растворимости соединений не удалось достичь концентраций, при которых активность ОТ
ВИЧ-1 падала бы в 2 раза.
1
3
20
CH3
A
A
O
N
B
O
N
O
O
N
C
O
O
N
B
O
83
84
A
A
O
N
B
O
N
O
CH3
O
N
C
O
B
O
N
O
C
Cl
92
WT
83
84
92
93
Cl
O
CH3
№
C
O
KI
мкM
13,4
18,7
8,2
5,2
93
L100I
KI
мкM
1,22
2,37
2,1
1,29
K103N
ПА
разы
0,09
0,13
0,26
0,25
KI
мкM
>20
>20
17,3
8,8
ПА
разы
2,11
1,69
V106A
Y181C
G190A
Y181C+K103N
KI
мкM
>20
>20
>20
>10
Таблица 13. Ингибирующая активность карбоциклических аналогов N1,N3-замещенных
урацилов на мутантных формах ОТ ВИЧ. ПА- падение активности соединений
3.
Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 на основе 6бензилизоцитозинов.
Еще один подход к созданию высокоактивных ненуклеозидных ингибторов ОТ
ВИЧ-1 на основе замещенных пиримидинов заключался в создании соединений на основе
изоцитозинов (рис. 6). К ним относятся хорошо изученные классы соединений NH- и Sдигидро-алкоксилбензилоксопиримидины (NH-DABO и S-DABO) [Yang S.,Curr Med
Chem. 2012]. Ранее, для соединений этих классов – MC-1047 и его аналогов, в которых
атом серы был замещен на NH группу, была отмечена субмикромолярная ингибиторная
активность в отношении ОТ ВИЧ-1. Замещение пентильного фрагмента на третий
ароматический цикл в принципе должно способствовать усилению стекинг
взаимодействий, что в свою очередь должно положительно сказываться на ингибирующей
активности соединений как в отношении ОТ ВИЧ-1 дикого типа, так и в отношении ее
«резистентных» мутантных форм.
В ряду полученных соединений (таблица 14) четко прослеживаются
закономерности зависимости активности соединений от их структуры. В первую очередь
стоит отметить важность галогеновых заместителей в положениях R1 и R2 фрагмента А:
сравнивая активности 99 и 100 с 98, мы видим увеличение активности более чем на
порядок.
21
98-104
105-109
Рисунок 6. Концепция создания новых ННИОТ на основе производных 6бензилизоцитозинов
№ соединения
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
R1
H
F
F
F
H
H
H
F
F
F
F
F
R2
H
F
Cl
Cl
H
H
H
Cl
Cl
Cl
Cl
Cl
R3
H
H
H
OCH3
OCH3
F
H
F
F
F
F
OCH3
NVP
EFV
R4
CH3
CH3
CH3
CH(CH3)2
CH3
CH3
CH3
H
CH3
C2H5
CH(CH3)2
CH(CH3)C2H5
n
1
1
1
1
1
1
2
-
KI (мкМ)
32,1
0,46
0,93
4,2
29,6
24,9
41,7
12,8
4,49
0,66
0,55
0,51
7,2
0,01
Таблица 14. Ингибирующая активность производных 6-бензилизоцитозинов 98-109
Большое значение имеет заместитель в положении R4 пиримидинового цикла B.
Для соединений 105-109 прослеживается прямая зависимость увеличения активности с
увеличением объема гидрофобного заместителя в этом положении. Однако для
соединений, содержащих аминогруппу в линкере, зависимость диаметрально
противоположна. Так, соединение 101 с изопропильной группой значительно проигрывает
в активности своему близкому аналогу 100 с метильной группой. По всей видимости, это
вызвано изменением положения ингибитора в гидрофобном кармане при замене линкера,
как это наблюдалось у обсужденных выше N1,N3-замещенных урацилов.
Незначительное падение активности наблюдалось в случае увелинения длины
линкера между фрагментами В и С (ср. 104 и 98). На примере соединений 102, 103 и 98
видно, что заместители в бензольном кольце С оказывают незначительное влияние на
22
активность соединений. Вследствие этого была опробована возможность «отказа» от
третьего ароматического цикла, что привело к субмикромолярной активности соединения
A
Cl
N
B
F
H3C
H3C
CH3
N
CH3
№ соединения
110
KI (мкМ)
0,038
NVP
EFV
7,2
0,01
NH
O
110
110 в отношении ОТ. Высокая активность, сравнимая с таковой у эфавиренца, сделала
целесообразным изучение профиля резистентности данного вещества на панели
мутантных форм ОТ ВИЧ (таблица 15).
№
110
NVP
EFV
WT
KI
мкM
0,038
7,2
0,01
L100I
KI
ПА
мкM разы
0,103 2,71
273
37,9
0,08
8
K103N
KI
ПА
мкM разы
0,664 17,47
>720
>100
0,58
58
№
110
NVP
EFV
V106A
Y181C
KI
ПА
KI
ПА
мкM разы мкM разы
0,08
2,11
0,22
5,79
>720
>100
>720
>100
0,05
5
0,03
3
K103N
G190A
+ Y181C
KI
ПА
KI
ПА
мкM разы мкM разы
0,061
1,61
>3,8
>100
>720
>100
>720
>100
0,06
6
0,14
14
Таблица 15. Ингибирующая активность производного 6-бензилизоцитозина 110 на
мутантных формах ОТ ВИЧ. ПА- падение активности соединений
Вещество 110 незначительно теряло в активности в отношении мутантных форм
L100I, V106A и G190A, еще раз показывая активность, сравнимую с эфавиренцем.
Падение в активности более чем на порядок в отношении мутации K103N объясняется
превалированием вклада гидрофобных взаимодейтвий над водородными связями, поэтому
в условиях более стабильной стуркутры гидрофобного кармана, обеспеченной новой
системой водородных связей, введение вещества 110 в «карман» недостаточно
эффективно способствует его перестройке. Падение активности в 5 раз в случае мутации
Y181C вероятнее всего объясняется важностью стекинг-взаимодействий фрагмента А
соединения 110 с Y181, как это предполагалось, для аналогичных DABO. Уменьшение
активности более чем на 2 порядка в случае двойного мутанта объясняется суммарным
действием обеих мутаций.
110 является наиболее активным из всех исследованных в работе соединений. Его
профиль резистентности сравним с использующимся в клинической практике препаратом
эфавиренц, что позволяет назвать его чрезвычайно перспективным для дальнейших
биологических испытаний.
23
1)
2)
3)
4)
Выводы
Получена панель мутантных форм ОТ ВИЧ-1, устойчивых к действию
применяющихся в клинической практике ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ-1
(ННИОТ) первого поколения, и отработана методика быстрого тестирования новых
ННИОТ.
Проведен структурно-функциональный анализ бензофеноновых производных
урацила и их аналогов в качестве ННИОТ на рекомбинантной ОТ ВИЧ-1 и ее
мутантных формах. Выявлены соединения-лидеры с субмикромолярной
активностью.
В качестве ННИОТ предложены N1,N3-замещенные урацилы 3 подклассов:
фенилоксиэтил-, цинамил- и
5’-норкарбоциклические производные.
Для
фенилоксиэтил- и цинамил-производных урацила обнаружены соединения с
субмикромолярной активностью. Для соединений-лидеров была изучена
активность в отношении панели мутантных форм ОТ ВИЧ-1.
Исследована ингибиторная активность в отношениии ОТ ВИЧ-1 у новых
дигидроалкоксилбензилоксопиримидин(DABO)-подобных
производных
6бензилизоцитозинов, среди которых обнаружено перспективное соединение с
мощной ингибиторной активностью в отношении ОТ ВИЧ-1 дикого типа (KI = 38
nM) и ее мутантных форм
24
Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:
Статьи в журналах
1.
Парамонова М.П., Бабков Д.А., Валуев-Эллистон В.Т., Иванов А.В., Кочетков С.Н.,
Паннекук К., Озеров А.А., Бальзарини Я., Новиков М.С. Синтез и антивирусная
активность 1-[ω-(фенокси)алкил и -аленил]производных урацила. Химикофармацевтический журнал, 2013; 47(9): 7-11.
2.
Matyugina E.S., Valuev-Elliston V.T., Geisman A.N., Novikov M.S., Chizhov A.O.,
Kochetkov S. N., Seley-Radtke K.L. and Khandazhinskaya A.L.. Structure-Activity Evaluation
of New Uracil-Based Non-Nucleoside Inhibitors of HIV Reverse Transcriptase. Medicinal
Chemistry Communications, 2013; 4(4): 1443–1451.
3.
Matyugina E.S, Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Novikov M.S., Ivanov A.V.,
Kochetkov S.N., Balzarini J., Seley-Radtke K.L., Khandazhinskaya A.L.. 5'-Nor carbocyclic nucleosides: unusual nonnucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Medicinal Chemistry
Communications, 2013; 4(4):741–748.
4.
Novikov M.S., Valuev-Elliston V.T., Babkov D.A., Paramonova M.P., Ivanov A.V.,
Gavryushov S.A., Khandazhinskaya A.L., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Andrei G., Snoeck
R., Balzarini J., Seley-Radtke K.L.. N1,N3-disubstituted uracils as nonnucleoside inhibitors of
HIV-1 reverse transcriptase. Bioorg Med Chem, 2013 Mar 1; 21(5): 1150-1158.
5.
Прокофьева М.М., Валуев-Эллистон В.Т., Иванов А.В., Кочетков С.Н., Новиков
М.С., Прасолов В.С. Бензофеноновые производные пиримидинов – эффективные
ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 дикого типа и лекарственноустойчивых форм. Доклады Академии Наук, 2012; 447(3): 338–339.
6.
Валуев-Эллистон В.Т., Иванов А.В., Орлинсон Б.С., Герасимов Е.Н., Брунилина
Л.Л., Кочетков С.Н., Новаков И.А., Навроцкий М.Б. Синтез и биологическая активность
новых производных 6-бензилизоцитозина: ненуклеозидных ингибиторов обратной
транскриптазы ВИЧ-1. Химико-фармацевтический журнал, 2012; 46(7): 397-401.
7.
Novikov M.S., Ivanova O.N., Ivanov A.V., Ozerov A.A., Valuev-Elliston V.T.,
Temburnikar K., Gurskaya G.V., Kochetkov S.N., Pannecouque C., Balzarini J., Seley-Radtke
K.L. 1-[2-(2-Benzoyl- and 2-benzylphenoxy)ethyl]uracils as potent anti-HIV-1 agents. Bioorg.
Med. Chem. 2011; 19(19): 5794-5802.
Тезисы конференций
1.
Gottikh M., Korolev S., Agapkina Y., Kondrashina O., Knyazhanskaya E. and ValuevElliston V.. Modified oligonucleotides as inhibitors of HIV-1 enzymes.// 38th Federation Of European Biochemical Societies Congress 2013, “Mechanisms in Biology”. Санкт-Петербург, 611 июля 2013 г., FEBS Journal, Volume 280 (Suppl. 1), 85.
2.
Valuev-Elliston V., Babkov D., Paramonova M., Ivanov A. and Kochetkov S..
Disubstituted uracils as novel nonnucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase inhibitors.// 38th Federation Of European Biochemical Societies Congress 2013, “Mechanisms in Biology”. Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г., FEBS Journal, Volume 280 (Suppl. 1), 370.
3.
Matyugina E.S., Valyev-Elliston V.T., Novikov M.S., Alexandrova L.A., Chernoysova
L.N., Kochetkov S.N. and Khandazhinskaya A.L.. New carbocyclic uracil derivatives as poten25
tial antiviral and antibacterial agents.// 38th Federation Of European Biochemical Societies Congress 2013, “Mechanisms in Biology”. Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г., FEBS Journal,
Volume 280 (Suppl. 1), 358.
4.
Валуев-Эллистон В.Т., Гейсман А.Н., Новиков М.С., Кочетков С.Н.. 6бензилоксиметил-урацилы, как ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы
ВИЧ.// Первая Российская конференция по медицинской химии (MedChem Russia) с
международным участием, Москва, 8-12 сентября 2013 г., Тезисы, с.33.
5.
Матюгина Е.С., Валуев-Эллистон В.Т., Новиков М.С., Хандажинская А.Л.. Дизайн
и синтез новых ненуклеозидных ингибиторов ОТ ВИЧ-1.// Первая Российская
конференция по медицинской химии (MedChem Russia) с международным участием,
Москва, 8-12 сентября 2013 г., Тезисы, с.92.
6.
Валуев-Эллистон В.Т., Иванов А.В., Новиков М.С., Кочетков С.Н., Зависимость
Структура-Активность для ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ на
основе бензофеноновых производных пиримидинов, Вестник ВолГМУ, Приложение
(Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с
международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный
поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012)), с. 12-14
7.
Матюгина Е.С., Валуев-Эллистон В.Т., Новиков М.С., Хандажинская А.Л., Дизайн
и синтез биологически активных производных карбоциклического 5’-норуридина,
Вестник ВолГМУ, Приложение (Материалы IV Всероссийского научно-практического
семинара молодых ученых с международным участием «Современные проблемы
медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград,
2012)), с. 51-53
26
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
987 Кб
Теги
транскриптазы, обратное, пиримидинов, вич, pdf, основы, производной, ингибиторов, новый
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа