close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА И ВЫЯВЛЕНИЮ ЛЕГИОНЕЛЛ В ВОДНЫХ СИСТЕМАХ

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
КАРПОВА ТАТЬЯНА ИГОРЕВНА
НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА И ВЫЯВЛЕНИЮ ЛЕГИОНЕЛЛ
В ВОДНЫХ СИСТЕМАХ
03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва – 2016
2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении
«Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии
имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Тартаковский Игорь Семенович
Официальные оппоненты:
Дятлов Иван Алексеевич, член-корреспондент РАН, доктор медицинских
наук, профессор, директор Федерального государственного учреждения науки –
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии
(ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
Припутневич Татьяна Валерьевна, доктор медицинских наук, руководитель
отдела эпидемиологии, микробиологии и клинической фармакологии ФГБУ
Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова
Минздрава России
Багирова Наталия Сергеевна, доктор медицинских наук, ведущий научный
сотрудник ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени
Н.Н.Блохина» Минздрава России
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное
учреждение
высшего
профессионального
образования
«Смоленская
государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Защита состоится « 11 » ноября 2016 года в 11.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.130.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении «Федеральный научно-исследовательский центр
эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи»
Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу г. Москва, ул.
Гамалеи д. 18.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.
Гамалеи» Минздрава России по адресу г. Москва, ул. Гамалеи д. 18 и на сайте
центра www.gamaleya.org.
Автореферат разослан «______» __________2016 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук,
профессор
Русакова Екатерина Владимировна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Легионеллез - сапронозная бактериальная острая инфекционная болезнь с
аспирационным механизмом передачи возбудителя. Различают две клинические
формы заболевания: болезнь легионеров и лихорадку Понтиак. Болезнь
легионеров - тяжелая острая пневмония, для которой описаны спорадические
случаи и вспышки, в том числе и внутрибольничные. Несмотря на проводимое
этиотропное лечение смертность может достигать 10 -12%, а при
внутрибольничных вспышках - 30-40%. Легионеллез характеризуется весьма
специфическими
эпидемиологическими
особенностями,
существенно
отличающимися от таковых для всех остальных респираторных инфекций,
которые до настоящего времени находятся в состоянии изучения, что во многом
определяется качеством лабораторной диагностики этой инфекции (Luck P.C.,
Helbig J.H., Schuppler M. 2002; Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. 2002).
Статистические данные о числе случаев легионеллеза в России не отражают
истинного распространения ни болезни легионеров, ни тем более лихорадки
Понтиак. Наличие возбудителя легионеллеза в водных объектах окружающей
среды, где он часто находится в симбиозе с амебами, водорослями и другими
представителям водного планктона,
объясняет
зависимость вероятности
возникновения случаев заболевания
от
таких факторов, как уровень
контаминации воды легионеллами; эффективность образования аэрозолей,
содержащих легионеллы, и скорость его распространения по воздуху; а также
индивидуальная восприимчивость человека и вирулентность штаммов (Jakubovski
W. et al. 1983; Breiman R.E. 1993).
Легионеллез представляет существенную угрозу общественному здоровью,
описаны крупные эпидемические вспышки и спорадические случаи в различных
странах мира с высоким процентом летальных исходов (5-20%). Характер
вспышек также значительно отличается от вспышек других респираторных
инфекций, что демонстрируют следующие примеры: вспышка в Германии,
Ульм(2010), источник возбудителя – градирня в центре города; Варштейн (2013),
источник – пруды очистки воды на пивоваренном заводе; в Коста-Бланка (2012),
вспышка в отеле продолжалась в течение полугода, источник - СПА-бассейн; в
Шотландии, Эдинбург (2012), предполагаемый источник – градирни; в НьюЙорке (2015) источник – система охлаждения воздуха в гостинице и др. Для
попадания возбудителя в организм человека необходим инфицированный
мелкодисперсный аэрозоль.
Поэтому случаи заболевания связаны с
контаминацией легионеллами потенциально опасных водных систем, прежде
всего
систем горячего водоснабжения и водных систем охлаждения
общественных зданий и промышленных предприятий, с водой которых
возбудитель попадает в организм человека (И.С.Тартаковский 2001; Cooper A. et
al 2004).
На территории Российской Федерации первые случаи легионеллеза (болезни
легионеров) были выявлены и описаны ещё в 1979 г. (С.В.Прозоровский,
И.С.Тартаковский с соавт. 1980) на основе использования главным образом
4
серологических методов диагностики (НИФ, РПГА), при этом многие методы
носили ретроспективный характер, что не позволяло в кратчайшие сроки
назначать этиотропную терапию.
До начала настоящих исследований лабораторная диагностика легионеллезной
инфекции и выявление возбудителя в объектах окружающей среды в Российской
Федерации соответствовали в целом уровню 80-х годов прошлого века и не
учитывали тех изменений, которые произошли в понимании проблемы
легионеллеза за последние десятилетия. Основным методом считался метод
непрямой иммунофлюоресценции при исследовании одиночной сыворотки
(В.И.Покровский, С.В.Прозоровский с соавт. 1995), что позволяло установить
предполагаемый диагноз. Диагностическое нарастание титров антител носило
запоздалый ретроспективный характер, что не позволяло скорректировать схему
антибиотикотерапии тяжелой пневмонии легионеллезной этиологии. В XXI веке к
бактериологическому выделению легионелл («золотой стандарт») был добавлен
метод определения антигена легионелл в моче и метод ПЦР (Н.Д.Темежникова,
И.С.Тартаковский 2007). За рубежом ПЦР, несмотря на широкое распространение
данного метода для диагностики инфекционных заболеваний, до настоящего
времени не включена в стандарты лабораторной диагностики легионеллеза, и
используется в качестве базового метода в ограниченном числе лабораторий (Hu
J. et al.2002; Uldum S.A., Molbak K. 2002).
В последние годы принципиально важным для предупреждения случаев
легионеллеза стало понимание того, что для его профилактики не применимы
подходы,
традиционно
используемые
для
предупреждения
других
респираторных инфекций, а основное направление профилактики легионеллёза
было
направлено на
снижение концентрации легионелл (с помощью
термических или химических способов) в водных объектах, из которых водный
аэрозоль
мог
поступить
в
организм
человека
(Н.Д.Темежникова,
И.С.Тартаковский 2007). Для этого необходимо проводить
регулярно
микробиологический мониторинг потенциально опасных для человека водных
объектов, генерирующих аэрозоль (градирни, централизованные системы
кондиционирования с водным охлаждением, джакузи и др.); систем горячего
водоснабжения, если температура воды не превышает 55О С; оборудования и
инструментария, представляющего опасность возникновения нозокомиального
легионеллёза (Г.Г.Онищенко, Ю.В.Демина, И.С.Тартаковский 2009).
В Российской Федерации в 21 веке до начала настоящих исследований
лабораторная диагностика легионеллеза и выявление легионелл в потенциально
опасных водных системах не соответствовали современному уровню в связи с
отсутствием
соответствующей
методической
базы,
а
сведения
о
распространении легионелл на территории Российской Федерации и их роли в
этиологии внебольничных и внутрибольничных пневмоний
были
недостаточными.
Цель работы: Обосновать и разработать новые подходы к лабораторной
диагностике легионеллеза,
обеспечивающие
эффективную диагностику
5
внебольничных и внутрибольничных пневмоний и количественный мониторинг
легионелл в потенциально опасных водных системах.
Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:
1. Разработать
эффективные алгоритмы лабораторной диагностики
легионеллеза на основе дифференцированного методического подхода к
диагностике внебольничных и внутрибольничных пневмоний легионеллезной
этиологии.
2. Разработать
алгоритм количественного мониторинга легионелл в
потенциально опасных водных системах с помощью полимеразной цепной
реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с последующим бактериологическим
подтверждением.
3. Оценить эффективность разработанных алгоритмов при расследовании
эпидемической вспышки внебольничного легионеллеза и выявлении случаев
легионеллеза, связанных с пребыванием в лечебно-профилактических
организациях (ЛПО).
4. Изучить особенности формирования природных биопленок легионелл в
открытых и закрытых потенциально опасных водных системах.
5. Провести анализ
уровня и частоты колонизации легионеллами
потенциально опасных водных систем различного типа на территории Российской
Федерации.
6. Охарактеризовать серологическое разнообразие штаммов Legionella
pneumophila,
циркулирующих в градирнях и системах водоснабжения в
Российской Федерации, для выявления локализации штаммов наиболее значимых
в эпидемиологическом отношении серогрупп легионелл.
7. Создать национальную отечественную коллекцию штаммов легионелл,
выделенных из окружающей среды и клинического материала и охарактеризовать
их с помощью панели моноклональных антител и секвенирования.
Научная новизна работы:
 Впервые был предложен и использован дифференцированный подход для
диагностики внебольничных пневмоний (сочетание иммунохроматографического
метода выявления антигена легионелл в моче и бактериологических методов) и
легочных
осложнений
у
иммунокомпрометированных
пациентов
(внутрибольничных пневмоний) легионеллезной этиологии (ПЦР-РВ с
последующим применением бактериологических методов).
 При разработке алгоритма выявления легионелл в окружающей среде,
основанном на предварительном скрининге образцов воды в потенциально
опасных водных системах на наличие ДНК легионелл с помощью ПЦР-РВ с
последующим бактериологическим подтверждением, предложено рассматривать
ПЦР-РВ и бактериологическое исследование воды не как альтернативные
подходы, а как единый комплекс методов.
 Разработанные алгоритмы диагностики легионелеза и выявления легионелл
в объектах окружающей среды были впервые применены нами в полном объеме
при расследовании крупной эпидемической вспышки легионеллеза в Верхней
6
Пышме и изучении роли легионелл в этиологии легочных осложнений у
иммунокомпрометированных больных в ФГБУ «Гематологический научный
центр» Минздрава России (ГНЦ).
 Впервые была получена коллекция прижизненно выделенных клинических
штаммов L.pneumophila от пациентов ГНЦ.
 Применение иммунохроматографического метода для определения
легионеллезного антигена в моче было
эффективно
при диагностике
внебольничных пневмоний, тогда как для расшифровки внутрибольничных
пневмоний исключительно важное значение имело применение ПЦР-РВ для
исследования жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ).
 Впервые в России был
успешно применен современный алгоритм
молекулярно-генетического типирования при выявлении нескольких (более двух)
случаев легионеллеза. От четырех пациентов была выделена культура
L.pneumophila серогруппы 1. Мультилокусное секвенирование и типирование с
помощью панели моноклональных антител показало, что речь идет о трех разных
штаммах легионелл. Показано отсутствие связи между случаями легионеллеза,
вызванными штаммами L.pneumophila серогруппы 1 и контаминированной
легионеллами воды, циркулирующей в системе водоснабжения ЛПО. Для шести
случаев легионеллезной инфекции, вызванных штаммом L.pneumophila
серогруппы
3,
результаты
были
диаметрально
противоположными.
Мультилокусное секвенирование показало, что все эти случаи вызваны одним
штаммом Hem2 (St87), циркулирующим в системе водоснабжения ЛПО. Таким
образом, доказано, что система горячего водоснабжения центра является
источником распространения L.pneumophila серогруппы 3, а выявленные случаи
легионеллезной инфекции с полным основанием относятся к случаям инфекции,
связанной с оказанием медицинской помощи.
 Доказано, что в настоящее время визуальное выявление и взятие образцов
биопленок для количественного определения в них легионелл является
обязательным элементом любого профилактического обследования потенциально
опасных водных объектов и расследования возможной эпидемической ситуации
на объекте.
 Создана
национальная
отечественная
коллекция
легионелл,
насчитывающая
354 штамма, выделенных из окружающей среды (339) и
клинического материала (15) и охарактеризованных с помощью панели
моноклональных антител и секвенирования. Коллекция насчитывает 354 штамма,
принадлежащих к 13 серогруппам L.pneumophila и 15 штаммов 11 видов
Legionella spp.
Теоретическая значимость работы для микробиологии состоит в изучении
колонизации легионеллами потенциально опасных водных систем различного
типа, особенностей формирования природных биопленок в различных системах,
серологическом разнообразии штаммов легионелл, циркулирующих в этих
системах, анализе роли мультилокусного секвенирования для характеристики
опасности для пациентов штамма легионелл, циркулирующего в водной системе.
7
Практическая значимость работы: проведенные исследования позволили
разработать и внедрить современные методы лабораторной диагностики
легионеллеза и профилактического мониторинга легионелл в потенциально
опасных водных системах в практику отечественного здравоохранения. Методы
диагностики легионеллеза хорошо стандартизованы и доступны в настоящее
время широкому кругу микробиологических лабораторий России. Широкое
использование стандартов лабораторной диагностики легионеллеза практическим
здравоохранением является необходимым условием своевременного выявления и
эффективной антибиотикотерапии случаев легионеллезной инфекции в нашей
стране. Это нашло отражение в следующих документах национального уровня:
1. Санитарные правила:
Профилактика легионеллеза (Санитарные правила 3.1.2.2626-10), 2010, с.24
2. Методические указания:
 Определение бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей
среды. (Методические указания 4.22.17.07 Роспотребнадзора), 2007
 Эпидемиологический надзор за легионеллезной инфекцией (Методические
указания МУ 3.1.2.2412-08), 2008, с.35
3. Методические рекомендации:
- Выявление и количественное определение легионелл в водных образцах
методом полимеразной цепной реакции с использованием тест-систем
производства «Синтол» (Методические рекомендации МР 02.039-09), 2009, с.31
- Выявление антигена бактерий Legionella pneumophila серогруппы 1 в
клиническом материале иммунохроматографическим методом (Методические
рекомендации N01/14633-8-34), 2010
- Практические рекомендации по диагностике и лечению легионеллезной
инфекции, вызываемой Legionella pneumophila серогруппы 1. Пособие для врачей,
2009, с.24 (МАКМАХ и Российское респираторное общество)
Методология и методы исследования.
Разработан комплекс методов лабораторной диагностики легионеллеза и
выявления легионелл в потенциально опасных водных системах на основе
следующих алгоритмов: разработан и внедрен в практику алгоритм диагностики
легионеллеза при внебольничных пневмониях и при легочных осложнениях у
иммунокомпрометированных больных на основе бактериологического и ПЦРисследования БАЛ пациента и иммунохроматографического анализа мочи;
разработан и внедрен в практику алгоритм количественного выявления легионелл
в природных образцах воды и биопленках с помощью бактериологического
метода и ПЦР-РВ.
Выделенные штаммы легионелл изучались с помощью серологических,
биохимических и молекулярно-генетических методов. При выполнении работы
были
использованы
современные
микробиологические,
молекулярнобиологические методы.
8
Степень достоверности результатов исследования.
Для решения поставленных задач в работе использовали современные
микробиологические
методы
(культуральные,
микроскопические,
биохимические), серологические, молекулярно-генетические (ПЦР-РВ)
и
статистические методы исследования.
Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных
биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации,
обоснованы и подтверждены фактическим материалом.
Указанное выше позволяет считать полученные результаты достоверными,
сделанные выводы обоснованными и вытекающими из результатов проведенных
исследований.
Апробация работы.
Основные результаты работы доложены на научных конгрессах, съездах,
конференциях: 21ая Европейская рабочая группа по легионеллёзу, Лиссабон,
2006; 22ая Европейская рабочая группа по легионеллёзу, Стокгольм, 2007; IХ
съезд ВНПОЭМП, 2007; V Международная конференция по генодиагностике,
ноябрь 2007г; 18ый международный конгресс Европейского респираторного
общества, Берлин, 2008; IХ межгосударственная конференция стран участников
СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с
инфекционными заболеваниями на территории государств участников
содружества независимых государств, 2008; 23я Европейская рабочая группа по
легионеллезу, Мадрид, 2008; конференция «Теоретические и практические
аспекты современной эпидемиологии» посвященной 75-летию Б.Л.Черкасского,
2009; Х съезде ВНПОЭМП, Москва 2012. VII международная конференция по
легионеллёзу, Париж, 2009; 25ая Европейская рабочая группа по легионеллезу,
Копенгаген, 2010; 26ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Вена, 2011,
27ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Дрезден, 2012; VI ежегодный
конгресс всероссийского общества инфекционистов, Москва, 24-26марта 2014;
29ая Европейская рабочая группа по легионеллезу, Барселона; 2014 VII научнопрактическая междисциплинарная конференция «Основные направления
диагностики и лечения заболеваний микробной этиологии», Ставрополь, 2016.
Апробация диссертационной работы состоялось на научной конференции
отдела медицинской микробиологии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи»
Минздрава России 22 декабря 2015 года.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 монография, 52
научные публикации, в том числе 25 в рецензируемых журналах, входящих в
перечень ВАК РФ, а также 26 тезисов конференций, из них 11 международных.
Основные положения, выносимые на защиту:
 Современные подходы к лабораторной диагностике легионеллеза
нуждаются в усовершенствовании и должны строиться на дифференцированном
подходе:
9
- к диагностике внебольничных тяжелых пневмоний;
-легочных осложнений у пациентов со сниженным иммунитетом (как правило,
внутрибольничных пневмоний) легионеллезной этиологии; и разработке
специальных алгоритмов микробиологических исследований для каждой группы.
 Впервые был предложен и использован дифференцированный подход для
диагностики внебольничных пневмоний, заключающийся в сочетанном
использовании иммунохроматографического метода определения антигена
легионелл в моче и бактериологических методов, тогда как для этиологической
диагностики легочных осложнений у иммунокомпрометированных пациентов
(внутрибольничных пневмоний)
необходимо применять
ПЦР-РВ
с
последующим бактериологическим подтверждением.
 С учетом достаточно высокой частоты колонизации
легионеллами
основных типов потенциально опасных водных систем в России (градирни,
горячее водоснабжение, джакузи массового пользования) оперативное
применение представленного в данной работе методического подхода должно
стать обязательным элементом эпидемиологического расследования при
выявлении нескольких (более 2-х) случаев легионеллеза, связанных с
пребыванием на одном объекте.
 Впервые создана национальная коллекция легионелл, насчитывающая 354
штамма, выделенных из окружающей среды (339) и клинического материала (15)
и охарактеризованных с помощью панели моноклональных антител и
секвенирования. Коллекция насчитывает 354 штамма, принадлежащих к 13
серогруппам L.pneumophila и 15 штаммов 11 видов Legionella spp.
Личный вклад автора в получении научных результатов. Автором
разработан комплекс методов лабораторной диагностики легионеллеза и
выявления легионелл в водных системах на основе следующих алгоритмов:
разработан и внедрен в практику алгоритм диагностики легионеллеза при
внебольничных пневмониях и при легочных осложнениях у больных с
иммунодефицитами на основе бактериологического и ПЦР-исследования БАЛ
пациента и иммунохроматографического анализа мочи; разработан и внедрен в
практику алгоритм количественного выявления легионелл в природных образцах
воды и биопленках с помощью предварительного скрининга с использованием
ПЦР-РВ с дальнейшим подтверждением количества жизнеспособных клеток
легионелл бактериологическим методом.
Выбор и отработка методик исследования, обработка и оценка полученных
результатов исследования, оформление диссертации и автореферата выполнены
автором самостоятельно.
Исследования по изучению биопленок легионелл с помощью электронной
микроскопии проводились совместно с лабораторией анатомии микроорганизмов
«ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» под руководством заведующей лабораторией,
д.м.н. Диденко Л.В.
10
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные
положения диссертации и результаты проведённого исследования соответствуют
паспорту научной специальности 03.02.03 – микробиология.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, 3 глав, включающих обзор литературы, собственные исследования и их
результаты, обсуждения, выводов,
списка литературы, содержащего 35
отечественных и 123 зарубежных источников. Работа изложена на 200 страницах
компьютерного текста, иллюстрирована 25 таблицами и 36 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Штаммы микроорганизмов. В данной работе использовали 36 штаммов
легионелл из коллекции лаборатории легионеллеза; 339 штаммов, выделенных из
окружающей среды; и 15 штаммов, выделенных из клинического материала.
Определение антигена в моче. В работе исследовали 125 образцов мочи на
наличие растворимого антигена легионелл. Тесты для быстрого выявления
антигена легионелл в моче - NOW Legionella Urinary Antigen Test «BINAX»
(США) использовали согласно инструкции по применению (МР №01/14633-8-34,
2010).
Исследование клинического материала. Было исследовано 114 образцов
БАЛ, материал биопсии легкого, аспираты, мокроты. Для получения БАЛ
использовали методику, разработанную Галстян Г.М. с соавт.(2007).
Транспортировка материала в лабораторию осуществлялась непосредственно
после взятия материала. Допускается хранение материала до начала исследования
в течение не более 48 ч. в условии холодильника. Для деконтаминации
клинических образцов от возможного присутствия грибов, дрожжей и условно
патогенных бактерий, таких как Pseudomonas spp. и Proteus spp. использовали
прогревание части образца (0,2 – 0,3 мл) при 50оС в течение 30 мин. или
обработку части образца (0,2 – 0,3 мл) кислотным буфером (HCl-KCl рН 2,2).
Мутные образцы и образцы с примесью крови обязательно использовали для
бактериологического исследования. У больных, у которых не было олигоанурии,
одновременно с лаважной жидкостью на исследование направляли образцы мочи
для определения легионеллезного антигена с использованием тестов для быстрого
выявления антигена легионелл в моче - NOW Legionella Urinary Antigen Test
«BINAX» (США). Для выделения легионелл использовали селективный
буферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ) (Legionella BMPAα selective
medium, «OXOID», Великобритания). Для серологической идентификации
выделенных колоний легионелл использовали латексный тест (Legionella latex
test, «OXOID», Великобритания) и международную Дрезденскую панель
моноклональных антител, предоставленную С. Luck и J. Helbig (2002).
11
Применение ПЦР в реальном времени для диагностики легионеллезной
инфекции у гематологических больных.
Образцы жидкости БАЛ получали от гематологических больных с
пневмониями и острой дыхательной недостаточностью, которые находились на
лечении в 2011-2014 гг. в отделении реанимации и интенсивной терапии ГНЦ.
Бронхоскопию для получения БАЛ проводили в соответствии с методикой
(Соколов А.Н., Галстян Г.М., 2007). Объем полученной жидкости БАЛ
варьировал от 100 мл до 80 мл. Все образцы БАЛ были исследованы методом
ПЦР-РВ. ПЦР проводили с использованием набора реагентов (Яцышина С.Б.,
Портенко С.А., 2008) производства ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора на приборе
RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). ДНК L.pneumophila
обнаруживали методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме реального времени.
Мишенью для обнаружения ДНК L.pneumophila в данном тесте является ген
mip, кодирующий протеин, который является фактором вирулентности и
необходимый для внутриклеточной инвазии в макрофаги и присутствующий в
геноме L.pneumophila всех серогрупп. Метод выявления ДНК L.pneumophila в
клиническом материале основан на одновременной амплификации участка ДНК
гена mip L.pneumophila и участка генома человека (эндогенный внутренний
контроль). Результат амплификации ДНК L.pneumophila регистрировался при
измерении флуоресценции красителя JOE, результат амплификации ДНК
внутреннего контроля регистрировался при измерении флуоресценции красителя
FAM. Эндогенный внутренний контроль позволял не только контролировать
этапы ПЦР-анализа (экстракцию ДНК и проведение ПЦР), но и оценивать
адекватность забора материала, что необходимо, так как искомый возбудитель
является внутриклеточным патогеном (Яцышина С.Б., Портенко С.А., 2008).
Образцы жидкости БАЛ в количестве 1 мл центрифугировали на настольной
центрифуге в пробирках объемом 1,5 мл при 10 тыс. об/мин в течение 10 мин.
Надосадочную жидкость отбирали, и осадок ресуспендировали в 100 мкл
оставшейся жидкости. Полученную суспензию (50 мкл) использовалась для
экстракции ДНК без добавления экзогенного внутреннего контрольного образца.
Бактериологические методы. Все штаммы легионелл выращивали на плотной
агаризованной среде буферном угольно-дрожжевом агаре (БУДРАГ, BCYEα) с
ростовой и селективной добавкой («Oxoid») при 36-370С в течение 72ч, в качестве
ростовых добавок применяли L-цистеин 400мг/л (Япония) и пирофосфат железа
растворимый 250мг/л («Sigma»), стерилизованные через фильтр с диаметром пор
0,4 мкм.
В качестве контрольной среды, не поддерживающей рост легионелл,
использовали среду БУДРАГ без добавления селективной и ростовой добавки.
Для пересева колоний легионелл и дальнейшего культивирования, использовали
среду БУДРАГ с ростовой, но без селективной добавки.
Выполняли микроскопию мазков культур легионелл, окрашенных по Граму.
12
Посевы биологического материала (жидкость БАЛ, материал биопсии легкого,
аспираты, мокроту) проводили на буферный угольно-дрожжевой агар BCYEα с
селективными добавками GVPC, BMPA («BioMerieux», Франция; «Oxoid»,
Великобритания). Культивировали в условиях термостата при температуре 3637°С в течение 4-10 суток.
Бактериологическое исследование воды и биопленок. Образцы воды,
биопленок, смывов из градирен промышленных предприятий и систем горячего
водоснабжения зданий общественного пользования исследовали в соответствии с
разработанным алгоритмом (Садретдинова О.В., Груздева О.А., Карпова Т.И.,
2011)
Отобранные образцы воды пропускали под вакуумом через мембранный
поликарбонатный фильтр с диаметром пор 0,4 мкм. После окончания фильтрации
мембранные фильтры переносили в стерильные центрифужные пробирки.
Добавляли стерильную дистиллированную воду 2-3 мл. Для десорбции
микрофлоры с фильтров, пробирку помещали на встряхиватель на 1-2 мин.
Для снижения уровня загрязненности сконцентрированной пробы посторонней
микрофлорой одну ее часть подвергали прогреванию, другую обрабатывали
кислотным буфером, также высевали 0,1 мл концентрированной пробы без
обработки.
Образцы биопленок, смывы с поверхностей подвергали концентрированию с
помощью центрифугирования, затем кислотной и термической обработке.
По 0,1 мл исходного сконцентрированного, или обработанного кислотным
буфером, или прогретого при 500С образца высевали на чашки со средой БУДРАГ
с ростовой и селективной добавкой. Образец распределяли по поверхности
питательной среды шпателем. Чашки инкубировали при 36-37оС до 10 дней во
влажной атмосфере и в присутствии 2,5% СО 2 .
Просматривать чашки начинали на следующие сутки с целью обнаружения
посторонней микрофлоры, так как колонии легионелл при выделении из
окружающей среды или клинического материала могут появляться на 4-6 сутки и
в более поздние сроки.
Для идентификации бактерий рода Legionella, подозрительные колонии,
выросшие на 4-5 сутки, высевали на среду БУДРАГ без селективной добавки и на
контрольную среду (без селективной и ростовой добавок). Легионеллы растут на
среде БУДРАГ и не растут на контрольной среде. Идентифицированные
подобным образом колонии относили к роду Legionella. После подтверждения
латексной тест-системой культуры L.pneumophila, выросшие колонии
подсчитывали количественно для последующего определения легионелл в 1 литре
воды.
Идентификация легионелл. Для определения принадлежности выросших
колоний к виду L.pneumophila, использовали тест-систему для латексагглютинации (Legionella Latex Test
«Oxoid», Великобритания; SLIDEX
«Biomerieux», Франция).
13
Типирование легионелл с помощью панели моноклональных антител.
Серотипирование выделенных штаммов L.pneumophila осуществляли с помощью
Дрезденской панели моноклональных антител иммуноферментным методом
(Helbig J., Luck С., Bernander S., 2002; Helbig J., Kurtz J.,1997). Панель
моноклональных антител предоставлена Ю. Хельбиг и К.Люк (Германский
референс центр по легионеллезу, Институт медицинской микробиологии и
гигиены, Технический университет, Дрезден, Германия).
MAb Lp1
+
Mab 3 (ATCC)
+
Nonserogroup 1
-
Mab 3/1
-
+
Mab 3
+
Mab 8/4
Mab 8/4
+
-
+
Mab 26/1
-
+
Mab 10/6
-
-
+
Mab 3
Mab 20/1
+
Knoxville
Philadelphia
Benidorm
France/
Allent.
+
OLDA
Oxford
Bellingham
Heysham
Camperdown
Рисунок 1. Подгруппы L.pneumophila серогруппы 1, выявляемые с помощью
Дрезденской панели моноклональных антител.
Секвенирование ДНК легионелл. В работе типировали культуры Legionella
spp. и L.pneumophila, а также культуры легионелл, выделенные в разных регионах
Российской Федерации
в 2005-2008 годах. ДНК легионелл выделяли с
использованием набора «DNA-Extra-Sorb» (лаб. молекулярной диагностики и
генно-инженерных конструкций ВНИИ СБ РАСХН).
Амплификацию и секвенирование фрагментов генов flaA, pilE, asd, mip, mompS,
proA, neu A проводили согласно протоколу SBT (Sequence-Based Typing) EWGLI
(EWGLI Sequence-Based Typing (SBT) protocol for epidemiological typing of
Legionella pneumophila Version 3.0, 2007), используя следующие реактивы: Hot
rescue DNA pol, ПЦР буфер 10х (лаб. молекулярной диагностики и генноинженерных конструкций ВНИИ СБ РАСХН), dNTP 5 mM (Medigen), праймеры
(ЗАО «Синтол»), набор реактивов для секвенирования к прибору 3130 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems/Hitachi).
Амплификацию и секвенирование протяженного фрагмента гена mip с целью
идентификации вида легионелл выполняли по протоколу EWGLI (External Quality
Assurance (EQA) scheme) (Fry N.K., Afshur B., 2013).
После проведения ПЦР-РВ при наличии в пробе только основного продукта
очистку и концентрирование проводили с помощью набора «DNA-Extra-Sorb».
Для проб, содержащих минорные дополнительные продукты, применяли
процедуру препаративного электрофореза в агарозном геле с последующим
14
вырезанием фрагментов геля, элюцией ДНК и концентрированием. Пробы
концентрировали до 10-20 нг/мкл.
Секвенирование фрагментов ДНК проводили на приборе 3130 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems / Hitachi). Анализ последовательностей и выравнивание
выполняли с помощью программы CLUSTAL W (1.83). Видовую идентификацию
легионелл на основе последовательностей гена mip осуществляли с применением
геномной и программной базы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
(Воронина О.Л., Кунда М.С., 2008).
Идентификацию и характеристику клинических штаммов L.pneumophila и
изолятов легионелл, выделенных из системы водоснабжения, осуществляли в
соответствии с ранее описанным протоколом, включавшим латексный
агглютинационный тест и способности к формированию биопленок (Романова
Ю.М., Алексеева Н.В., 2008). Типирование выделенных культур L. pneumophila c
целью определения идентичности клинических штаммов и изолятов из
окружающей
среды
проводили
с
использованием
мультилокусного
секвенирования в соответствии с протоколом SBT и Дрезденской панели
моноклональных антител (Адгамов Р.Р., Ермолаева С.А., 2013; С. Luck, J. Helbig,
2002).
Получение моновидовых биоплёнок. Для изучения способности легионелл
формировать биопленки использовали 26 штаммов 10 видов Legionella spp. из
коллекции лаборатории легионеллеза ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, в том числе
свежевыделенные штаммы из объектов окружающей среды в Российской
Федерации.
Бактериальные культуры выращивали в протеозопептонном бульоне (Difco)
или на агаре BCYE α (Oxoid) c добавлением L-цистеина и водорастворимой формы
пирофосфата железа при 37ОС в течение 72 ч.
В качестве вирулентной культуры использовали штамм L.pneumophila,
Philadelphia 1 (LD 50 для морских свинок не более 105 КОЕ).
Тестирование всех штаммов легионелл на способность формировать биопленки
проводили в 96-луночных плоскодонных пластиковых планшетах для
иммуноферментного анализа («Costar») (Романова Ю.М., Алексеева Н.В., 2008).
Отработку оптимальных условий образования монобиопленок легионеллами
осуществляли, используя типовой штамм L.pneumophila Philadelphia 1.
Сравнительную оценку способности штаммов Legionella spp. к формированию
биопленок производили при культивировании в питательной среде (96 часов) и
воде (до 2 недель).
15
Получение биоплёнок других микроорганизмов. Для работы использовали
типовые штаммы Salmonella typhimurium и Pseudomonas aeruginosa.
Бактериальные культуры выращивали в жидкой Luria-Bertani (LB) или
агаризованной среде MacCONCEY AGAR (DIFCO), SS–агар при 370С.
Тестирование штаммов сальмонелл и псевдомонад на способность формировать
биоплёнки проводили в плоскодонных пластиковых планшетах для
иммуноферментного анализа по методике (Романова Ю.М., Алексеева Н.В.,
2008).
Изучение природных биопленок. Высев из биопленок на легионеллы и другие
микроорганизмы. Образцы биопленок из окружающей среды исследовали в
соответствии с разработанным алгоритмом. Образцы биопленок, смывы с
поверхностей подвергали концентрированию с помощью центрифугирования,
кислотной или термической обработке.
При высеве биопленок на легионеллы для снижения уровня загрязненности
сконцентрированной пробы посторонней микрофлорой одну ее часть подвергали
прогреванию, а другую обрабатывали кислотным буфером.
При высеве биопленок на другие сопутствующие микроорганизмы, после
концентрирования пробы, высевали по 0,1 мл на питательный агар для общего
подсчета колоний, кровяной агар, агар Эндо, SS-агар, энтерококковый агар.
Инкубировали при 30ОС и 37ОС в течение 2-5 суток.
Электронно-микроскопическая характеристика биопленок. Для изучения
биопленок методом сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии,
были взяты соскобы из градирен промышленных предприятий. Предварительно
проведенные бактериологические исследования соскобов показали присутствие в
них легионелл.
В работе исследовали образцы биопленок из систем горячего водоснабжения
общественных зданий г. Москвы. Для исследования формирования биопленок
L.pneumophila в системах горячего водоснабжения, на водопроводные краны
монтировали антибактериальные фильтры Pall («Аквасейф»). После экспозиции в
течение 1, 2 и 3 недель соответственно фильтры демонтировали и исследовали
биопленку, сформировавшуюся на внешней поверхности фильтра.
Для изучения биопленок методами сканирующей и трансмиссионной
электронной микроскопии полученные образцы были фиксированы по методу Ito
– Karnovsky (Ito S., Karnovsky M.J., 1968).
Для анализа ультратонких срезов биопленки препараты были подготовлены по
общепринятой методике заливки в заливочную среду (метакрилатную смолу) LR
White (Newman G.R., Jasani B., Williams E.D.,1982). Ультратонкие срезы получали
с помощью ультрамикротома LKB – 3, окрашивали по методу Reynolds (Reynolds
E.S., 1963), и изучали в электронном микроскопе JEOL 100 B (Japan).
В работе был проведен рентгеновский микроструктурный анализ образцов с
помощью приставки EDAX (EDAX Inc. USA) к сканирующему электронному
микроскопу Quanta 200 3 D. Пробоподготовка образцов для этого метода
исследования заключалась в упомянутой выше фиксации и напыления нанослоем
16
золота, толщиной 5 nm, что позволяло сохранить нативную структуру образца. С
помощью этого метода исследования возможно проводить анализ
микроэлементного состава объекта.
Статистические методы обработки результатов. Для проведения
исследований была создана база данных в программе Excel Office2010. Все
анализируемые параметры вносили в эту базу с последующей статистической
обработкой с помощью программ Statistica 10. Для анализа данных использовали
методы описательной статистики и частотный анализ.
Для сравнения
2
качественных признаков применяли критерий χ . Статистически значимыми
считали различия при степени вероятности безошибочного прогноза 95%
(p<0,05).
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2.1 Диагностика легионеллеза при внебольничных и внутрибольничных
пневмониях легионеллезной этиологии
Нами предложен дифференцированный подход к лабораторной диагностике
тяжелых внебольничных и внутрибольничных пневмоний легионеллезной
этиологии при легочных осложнениях.
Разработка алгоритма диагностики легионеллёза при внебольничных
пневмониях. Для диагностики легионеллеза нами было предложено сочетание
бактериологического метода (БАЛ, биопсия) (рисунок 2) и экспрессного
иммунохроматографического теста (моча), позволяющего за 30 минут установить
и подтвердить окончательный диагноз легионеллезной инфекции, вызванной
L.pneumophila серогруппы 1.
Растворимый антиген выявляется в моче больных, начиная с третьего дня
болезни, и может быть обнаружен в течение нескольких последующих месяцев
(до 1 года).
Вместе с определением растворимого антигена легионелл в моче применяли
бактериологический метод. В качестве клинического материала для посева
использовали в основном БАЛ, материал биопсии легкого и аспираты, а также
мокроту. Для снижения уровня загрязненности пробы посторонней микрофлорой
часть пробы обрабатывали кислотным буфером либо прогревали непосредственно
перед высевом.
17
БАЛ, содержащий альвеолярные
макрофаги
Обработка кислотным буфером
(0,4М HCl 0,4M KCl рН 2,2) 1:1
(0,2 мл+0,2 мл) в течение 4 мин
Посев на буферный угольнодрожжевой агар (BMPAα) с селект.
добавками (0,2мл)
Рост культуры Legionella spp.на 4 5 сутки
Моча
Иммунохроматографический
тест на антиген L.pn. sg1
Получение результата
в течение 30 мин.
Идентификация с помощью
латексного теста и
моноклональных антител
Рисунок 2. Схема исследования клинического материала от больных с подозрением на
легионеллезную пневмонию
Недостатком культурального метода является длительность инкубации, так как
рост колоний легионелл наблюдали не ранее чем на 4-5 сутки, а отрицательный
результат окончательно регистрировали на 10-е сутки. Тем не менее,
бактериологический метод остается основным методом
диагностики
легионеллеза, в особенности при диагностике случаев легионеллеза, вызванных
видами легионелл, отличными от L.pneumophila.
Разработка алгоритма диагностики легионеллёза при лёгочных
осложнениях у иммунокомпрометированных пациентов
При попытке применить разработанный алгоритм выявления легионелл при
тяжелых пневмониях у пациентов ГНЦ, столкнулись с определенными
сложностями. Экспресс-диагностика легионеллеза, основанная на определении
антигена в моче, была невозможна у пациентов с острой или хронической
почечной недостаточностью, которым проводился гемодиализ и, как следствие,
наблюдалась олигоанурия. Кроме того, у больных со сниженным иммунитетом
серьёзную опасность могут представлять также L.pneumophila других серогрупп и
других видов Legionella spp. В связи с этим алгоритм был дополнен
исследованием жидкости БАЛ методом ПЦР-РВ. Параллельно с этим применяли
бактериологический метод - высевали БАЛ на среду для легионелл с
селективными добавками.
18
Алгоритм исследования клинического материала на наличие легионелл у таких
больных представлен на рисунок 3.
БАЛ, содержащий альвеолярные макрофаги
Обработка кислотным буфером
(0,4М HCl 0,4M KCl рН 2,2) 1:1
(0,2 мл+0,2 мл) в течение 4 мин
Обработка БАЛ (1 мл центрифугировать на центрифуге в объеме
1,5 мл при 10 тыс. об/мин, 10 мин.
Посев на буферный угольнодрожжевой агар (BMPAα) с
селективн. добавками (0,2мл)
Отобрать надосадочную жидкость,
ресуспендировать осадок в 100 мкл
Рост культуры Legionella spp.
на 3 - 5 сутки
суспензию (50 мкл) использовать
для экстракции ДНК
Идентификация с помощью
латексного теста и моноклональных
антител
Постановка ПЦР-РВ. Получение
результата в течение 3 час.
Рисунок 3. Схема исследования клинического материала от больных с подозрением на
легионеллезную пневмонию, находящихся на гемодиализе (с олигоанурией).
2.2 Разработка алгоритма выделения легионелл из окружающей среды.
Нами был разработан алгоритм выявления легионелл в окружающей среде,
основанный на предварительном скрининге образцов воды в водных системах на
наличие
ДНК
легионелл
с
помощью
ПЦР-РВ
с
последующим
бактериологическим подтверждением, позволяющий на основании полученных
данных дифференцированно оценивать уровень эпидемической опасности
контаминации легионеллами потенциально опасных водных систем.
Для исследования потенциально опасных водных систем на наличие легионелл
брали образцы воды объемом 0,5-1,0 литр и соскобы биопленок с внутренних
поверхностей участков системы горячего водоснабжения зданий общественного
пользования и градирен промышленных предприятий (рисунок 4).
19
Выбор точек
Отбор проб
Пробоподготовка
Образец воды
Образец биопленки
Концентрирование образцов –
вакумная фильтрация
Суспендирование в
дистиллированной воде
Сконцентрированный образец (вода или биопленка)
Бактериологический
метод (получение
результата в течение
5-7 дней)
Деконтаминация образцов
ПЦР-РВ
(получение
предварительного
результата в течение 3
часов)
Суспензию (1 мл) использовать для
экстракции ДНК
Посев на питательные среды
Просмотр колоний
Постановка добавочных тестов
Подсчет колоний
Постановка ПЦР. Получение
результата в течение 3 час.
Выдача ответа с определением
числа КОЕ на литр
Выдача ответа с определением
числа геномных копий на литр
Рисунок 4. Алгоритм количественного выявления легионелл в потенциально опасных
объектах окружающей среды.
Концентрированные образцы воды исследовали в соответствии с
разработанным алгоритмом бактериологическим методом (рисунок 5, 6).
Легионеллы относятся к числу трудно культивируемых организмов, требующих
высокого качества питательных сред, строго соблюдения pH среды и наличия
ростовых добавок. Обильная контаминация технической воды посторонней
микрофлорой,
многокомпонентность
естественных
биопленок
требует
соблюдения достаточно сложных подготовительных процедур и использования
селективных добавок для выделения легионелл.
20
Исследуемый образец (вода объемом 0,5-1л, смывы)
Мембранная фильтрация
Смыв с фильтра
Ресуспендирование осадка в 1 мл
ф
О,1 мл
О,1 мл
Обработка
кислотным буфером
О,1 мл
Тепловая обработка
БУДРАГ с ростовой и селективной добавкой
36 0С,
до 10
дней,
2,5% СО2
Отбор подозрительных колоний
Рисунок 5 Схема выделения Legionella spp. из объектов внешней среды:
выделение культуры.
Бактериологическое исследование образцов воды и биопленок на наличие
легионелл занимает от 7 до 10 дней.
Применение для мониторинга легионелл в водных системах технологии ПЦРРВ позволяет сократить время исследования до 1 дня.
Наши исследования были направлены на разработку и внедрение в практику
экспресс-методов выявления и контроля легионелл в потенциально опасных
водных системах.
21
Подозрительные колонии
Окраска по Граму
Грам «-»
палочки длиной
2-3 мкм
БУДРАГ без
селективных добавок
37 0С, 48ч
БУДРАГ без селективных
и ростовых добавок 37 0С,
48ч
Есть рост
НЕТ роста
Legionella spp.
Идентификация вида
Legionella pneumophila
Латекс-агглютинация
ПЦР
Рисунок 6. Схема выделения Legionella spp. из объектов внешней среды:
идентификация подозрительных колоний
Для этой цели нами с ЗАО «Синтол» были сконструированы две тест-системы
(Аляпкина Ю.С., Садретдинова О.В., 2009).
АМПЛИ-ЛЕГ-РВ
для
одновременного
количественного
выявления
L.pneumophila и Legionella spp. По результатам экспериментов чувствительность
системы составила для L.pneumophila: 103 /500мл и 102 /100мл в реакции
определения ДНК гена mip, 102 /500мл в реакции определения ДНК гена 16S
pРНК.
Также была разработана тест система АМПЛИ-ЛЕГ+РВ для количественного
определения L.pneumophila и одновременного выявления Legionella spp. и
P.aeruginosa, что является актуальным для мониторинга систем водоснабжения в
отделениях групп риска ЛПО.
22
Разработанные тест-системы были предложены в качестве скринингового
метода для последующего подтверждения бактериологическим методом, что
позволило выявлять как ДНК легионелл, так и жизнеспособные клетки данного
микроорганизма для предварительного результата в течение 3-4 часов (с
последующим бактериологическим подтверждением) (рисунок 4. Применение
ПЦР-РВ для исследования широкого спектра образцов воды и биопленок,
полученных из градирен промышленных предприятий, системы водоснабжения,
блоков увлажнения централизованной системы кондиционирования при
профилактическом мониторинге, выявило удовлетворительную корреляцию
результатов бактериологического метода и ПЦР. Концентрация легионелл,
определяемая с помощью ПЦР-РВ (геномных копий/л) в некоторых образцах
превышала концентрацию легионелл, выявляемую бактериологически (КОЕ/л) на
1-2 порядка, что может быть объяснено, как присутствием в соответствующих
экосистемах планктонных форм легионелл, выявляемых с помощью ПЦР и
бактериологически, так и некультивируемых форм легионелл, выявляемых только
с помощью ПЦР.
2.3 Применение разработанного алгоритма при расследовании вспышки
внебольничного легионеллеза в Верхней Пышме
В середине июля 2007 года в городе Верхняя Пышма Свердловской области
была выявлена эпидемическая вспышка легионеллезной инфекции, которая
продолжалась около 3-х недель.
Применяя стандарты лабораторной диагностики легионеллеза, в качестве
первого шага было выбрано применение иммунохроматографического метода для
определения легионеллезного антигена в моче больных. Образцы мочи были
взяты у группы наиболее тяжелых больных, находящихся в реанимационном
отделении (8 человек). В течение 30 минут положительные результаты были
получены для 7 больных, у одного больного результат анализа был
отрицательный.
Параллельно секционный материал от 3 умерших больных был исследован с
помощью количественной модификации ПЦР с видоспецифическими праймерами
на mip ген L.pneumophila. ДНК возбудителя в высокой концентрации была
выявлена в образцах легочной ткани пациентов, умерших от легионеллезной
пневмонии.
Следующим
шагом
применения
стандартов
стало
использование
бактериологического метода для исследования секционного материала (легочная
ткань) от 3-х пациентов, умерших от пневмонии, и исследование 67 образцов
мочи больных на наличие антигена легионелл иммунохроматографическим
методом.
Культура L.pneumophila серогруппы 1 была выделена из легочной ткани 1 из 3
умерших пациентов после 5 дней культивирования на среде буферный угольнодрожжевой агар (BCYE) c селективной добавкой, содержащей цефамандол,
полимиксин и анизомицин (модификация данной среды называется также BMPA).
23
Последующая идентификация культуры с помощью бактериологических тестов,
латекс-агглютинации и ПЦР-РВ заняла 2 суток.
Затем были проведены исследования образцов воды из потенциально опасных
водных систем города. В качестве таковых рассматривались 3 возможных
объекта: градирни предприятия УГМК (3 градирни), комплекс из двух фонтанов
в центре города, горячая вода из центральной системы водоснабжения города
(таблица 1).
Предварительный скрининг с помощью ПЦР-РВ позволил исключить комплекс
фонтанов, в котором присутствовала только ДНК Legionella spp., но
отсутствовала ДНК L.pneumophila.
Таблица 1. Результаты исследования образцов окружающей среды в г. Верхняя Пышма с
помощью ПЦР-РВ и бактериологического исследования на наличие Legionella spp. и
L.pneumophila.
№
Описание образца
Результаты оценки
Выделение
методом ПЦР-РВ
культуры
П№
Legionella
Legionella
п/п
spp.
pneumophila
Пробы воды от 30.07.07
1.
Дренажная вода теплопункта 1
L.pneumophila
+
серогруппа1 **
2.
Обводной трубопровод в
+
теплопункте 2
3.
Дренажный колодец, промывная
+
вода после фильтра, СУГРЭС
4.
Сбросный канал теплой воды
+
5.
Вода из трубы подающего
трубопровода теплопункта 1
6.
Вода из колодца 1
Legionella spp.* **
+
7.
Вода из колодца 2
+
8.
Вода из фонтана № 1
+
9.
Вода из фонтана № 2
+
10.
Вода техническая
L.pneumophila
+
+
промышленного предприятия
серогруппа 3 **
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Смывы биопленок от 30.07.07
Смыв с поверхности дренажного
канала теплопункта 1
Смыв из дренажной трубы из
теплопункта 2
Смыв из дренажного колодца,
СУГРЭС
Смыв из дренажного колодца над
кромкой воды, СУГРЭС
Внутренняя поверхность трубы
подающего трубопровода
теплопункта1
Смыв с сетки дренажного канала
теплопункта 1
+
+
-
-
+
-
-
-
-
-
+
-
L.pneumophila
серогруппа1
24
17.
18.
Смыв с душевой сетки в
квартире больного 1
Смыв с душевой сетки в
квартире больного 2
-
-
+
+
L.pneumophila
серогруппа 3 **
*- изоляты выделены в сентябре-октябре 2007 при повторном исследовании
концентратов образцов, хранившихся при 4оС с использованием обработки кислотным
буфером.
** - изоляты Legionella spp.
Последняя была в заметных количествах обнаружена в воде градирен, смывах и
соскобах биопленок системы городского водоснабжения, несмотря на отсутствие
в ней воды и одновременное проведение дезинфекционных мероприятий (смывы
с труб теплопунктов, душевых рожков в квартирах больных, дренажных
колодцев). Результаты бактериологического обследования продемонстрировали
высокую степень гетерогенности штаммов легионелл, выделенных из системы
городского водоснабжения и градирен (таблица 2).
Таблица 2. Штаммы L.pneumophila и Legionella spp., выделенные в г. Верхняя Пышма.
№ Legionella
Клинические
Штаммы из системы Штаммы из градирен
п/п
штаммы
водоснабжения
промышленного
(количество)
города (количество) предприятия
(количество)
L.pneumophila
(cерогруппа)
1.
1 (Philadelphia)
1
2.
1 (Bellingham)
1
3.
1 (Oxford)
11
4.
1 (26/1)
2
5.
1 (Benidorm)
2
6.
1 (Heysham)
6
7.
1
9
2
8.
1
1
3
9.
1
5
5
10. 6
1
17
11. 10
5
12. 12
1
13. 14
2
Legionella spp.
14. L.anisa
1
15. L.gratiana
3
16. L.gormanii
1
17. L.dumoffii
2
18. L.londiniensis
1
Применение разработанного нами алгоритма диагностики легионеллеза и
мониторинга объектов окружающей среды на наличие легионелл позволило
25
впервые в России выявить крупную эпидемическую вспышку внебольничных
пневмоний легионеллезной этиологии, быстро и эффективно ее ликвидировать и
осуществить комплекс профилактических мероприятий.
2.4 Применение разработанного алгоритма при анализе случаев
пневмоний в ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
В
совместной работе с ГНЦ была отработана методика прижизненного
выделения культуры легионелл у больных пневмонией. Для диагностики
использовали бактериологическое исследование БАЛ и определение антигена
легионелл в моче пациентов иммунохроматографическим методом.
С января 2011 по февраль 2015 гг. обследовали больных на возможность
легионеллеза. Всего обследовали 114 пациентов с заболеваниями системы крови,
поступивших в отделение реаниматологии и интенсивной терапии (ОРИТ) ГНЦ
вследствие тяжелой пневмонии.
Все больные обследовались в соответствии со схемой, описанной ранее
(рисунок 2), предусматривающей выполнение фибробронхоскопии с получением
БАЛ с последующим высевом жидкости БАЛ на селективные среды для
легионелл, а также определение антигена легионелл в моче больных
иммунохроматографическим методом.
Таблица 3. Результаты выделения L.pneumophila из бронхоальвеолярного лаважа больных
пневмониями из ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ.
№ п/п Возраст, Пол
НазваLegionella
ГематологичеСиквенспаци- лет
ние
pneumophila,
ский диагноз
тип
ента
штамма серогруппа
1
58
м
лекарственный
Hem 1
SТ42
1France/Allent
агранулоцитоз
2
34
м
иммунная
Hem 2
ST87
3
тромбоцитопения
3
32
м
острый
Hem 3
ST87
лимфобластный
3
лейкоз
4
83
м
неходжкинская
Hem 4
ST36
1Philadelphia
лимфома
5
55
м
множественная
Hem 5
ST1489
1Benidorm
миелома
6
64
м
множественная
Hem 6
ST87
3
миелома
7
81
м
неходжкинская
Hem 7
ST87
3
лимфома
8
62
м
множественная
Hem 8
ST87
3
миелома
9
45
ж
острый
Hem 9
ST87
миелобластный
3
лейкоз
10
38
ж
Т-клеточная
Hem 10
ST87
3
лимфома
26
11
35
ж
12
61
м
лимфогранулематоз
острый
миелоидный
лейкоз
Hem 11
3
ST87
ST51
Hem 12
1
Применение разработанного алгоритма позволило установить диагноз
легионеллезной этиологии у 12 из 114 обследованных гематологических больных
(10,5%). Медиана возраста пациентов с легионеллезной пневмонией была 57 лет
(разброс от 32 до 83 лет). Среди заболевших преобладали мужчины (9 мужчин, 3
женщины). Легионеллезная пневмония развивалась у пациентов с различными
заболеваниями системы крови (лекарственный агранулоцитоз, неходжкинская
лимфома, множественная миелома, острый лимфобластный лейкоз, иммунная
тромбоцитопения). Диагноз был установлен бактериологически в результате
выделения культуры L.pneumophila из жидкости БАЛ. Из 12 выделенных культур
L.pneumophila – 4 принадлежали к серогруппе 1 (Hem1, Hem4, Hem5, Hem12), 8 –
к серогруппе 3.
Однако у больных с иммунодефицитами серьёзную опасность могут
представлять также L.pneumophila других серогрупп. Выделение культуры в
жидкости БАЛ бактериологическим методом занимало не менее 4-5 суток,
вследствие этого нередко диагноз легионеллеза устанавливался слишком поздно и
этиотропную терапию не успевали назначить. Экспресс-диагностика
легионеллеза, основанная на определении легионеллезного антигена в моче
иммуноферментным или иммунохроматографическим методом, была невозможна
у пациентов с острой или хронической почечной недостаточностью, которым
проводился гемодиализ и, как следствие, наблюдалась олигоанурия. В подобных
случаях наиболее приемлемым решением может служить использование ПЦР-РВ.
По результатам исследования образцов БАЛ в ПЦР-РВ, ДНК L.pneumophila
была обнаружена в 7 (8,9%) из 79 исследованных образцов жидкости БАЛ. Из
этих же образцов ранее была выделена культура легионелл: в 3 случаях была
выделена культура L. pneumophila серогруппы 1 (ST 42, 36, 1489) и в 4 случаях –
L. pneumophila серогруппы 3 (все изоляты принадлежали к ST 87).
Полученные результаты подтверждают важное значение ПЦР диагностики
легионеллеза у иммунокомпрометированных пациентов с острой дыхательной
недостаточностью. Выигрыш во времени 3-4 суток по сравнению с
бактериологическим анализом БАЛ может быть определяющим для успешной
антибиотикотерапии и исхода болезни.
Следующим этапом нами был проведен бактериологический анализ образцов
воды из системы горячего водоснабжения ГНЦ, как возможного источника
распространения легионелл. Температура в бойлерной ГНЦ была ниже 55оС, что
крайне благоприятно для размножения возбудителя.
Количественный анализ воды на наличие L.pneumophila в системе горячего
водоснабжения ГНЦ осуществляли в 6 гематологических отделениях центра, в
отделении реаниматологии и интенсивной терапии, в двух подсобных
27
технических помещениях (пищеблок, бойлерная) в соответствии с разработанным
алгоритмом.
Анализ воды, циркулирующей в системе горячего водоснабжения ГНЦ, выявил
заметный уровень контаминации легионеллами. Культура L.pneumophila выявлена
более чем в 60% образцов воды, взятых в основных отделениях центра и двух
подсобных технических помещениях. Концентрация легионелл в воде составляла
от 3х102 до 5,5х104 КОЕ/л. Несмотря на обильный рост легионелл, изоляты не
отличались серологическим разнообразием. Все изоляты принадлежали к
серогруппе 3 (Hemenvir 1) и 2 (Hemenvir 2) L.pneumophila.
Поскольку случаи легионеллеза среди больных, ассоциированные с
L.pneumophila серогруппы 1 и серогруппы 3, относятся к категории «2 и более
случаев легионеллеза, связанных с пребыванием на одном объекте», для
выявления возможного источника распространения легионеллезной инфекции
использовали мультилокусное секвенирование в соответствии с протоколом SBT
и Дрезденскую панель моноклональных антител (EWGLI SBT protocol for
epidemiological typing of Legionella pneumophila Version 3.0, 2007; С. Luck, .J.
Helbig, 2002).
Результаты типирования представлены в таблице 3. Очевидно, что случаи
легионеллеза, ассоциированные с L.pneumophila серогруппы 1, вызваны
различными штаммами возбудителя и не связаны с пребыванием в стационаре
или с каким-либо другим общим источником. Штаммы принадлежат к трем
различным подгруппам серогруппы 1 (mab France/Allentown, Benidorm и
Philadelphia) и, соответственно, относятся к трем различным серотипам или
сиквенс типам (ST). Причем ST 1489 (штамм Hem5) ранее не описан и впервые
внесен в базу данных ELDSNet. Какие-либо изоляты L.pneumophila серогруппы 1
в воде системы водоснабжения объекта не обнаружены.
Все случаи легионеллеза, ассоциированные с L.pneumophila серогруппы 3,
вызваны изолятами одного ST 87. В воде системы водоснабжения объекта в
высокой концентрации также присутствовал изолят L.pneumophila серогруппы 3,
принадлежащий к ST 87. Штамм L.pneumophila серогруппы 3 Hem2 (St87) был
выделен из жидкости БАЛ больного, умершего от легионеллезной инфекции в
марте 2011 года. Все последующие изоляты L.pneumophila серогруппы 3,
выделенные от больных и из воды системы водоснабжения в 2011-2015 годах
идентичны клиническому штамму Hem 2.
Применение мультилокусного секвенирования позволило определить
аллельный профиль выделенных штаммов легионелл и подтвердить идентичность
штамма L.pneumophila 3 серогруппы, выделенного от онкогематологических
больных и циркулирующего в системе горячего водоснабжения ЛПО. Штаммы
относятся к SТ87. В тоже время клинические штаммы 1 серогруппы имели
различный аллельный профиль. Таким образом, можно считать доказанным
внутрибольничную природу заражения пациентов ГНЦ штаммом серогруппы 3,
ST 87.
28
2.5 Изучение особенностей формирования модельных и природных
биопленок легионелл
2.5.1
Особенности
формирования
модельных
биопленок
в
экспериментальных условиях
Нами была проведена сравнительная оценка способности различных штаммов и
видов легионелл к формированию моновидовых биопленок и в ассоциации с
P.aeruginosa в условиях эксперимента. В работе использовали штаммы
L.pneumophila и Legionella spp. из коллекции лаборатории легионеллеза
«ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи», в том числе свежевыделенные в Российской
Федерации штаммы, а также штамм P.aeruginosa АТСС 9027.
Для отработки модели образования биопленок легионеллами необходимо было
выбрать оптимальные условия роста бактерий, позволяющие количественно
тестировать формируемые ими биопленки. В качестве основных параметров,
влияющих на формирование биопленок, определяли начальную концентрацию
клеток при засеве, температуру и время инкубации поверхности планшет.
При подборе начальной концентрации клеток при засеве показано, что
оптимальным является разведение 72 часовой культуры в 10 раз, позволяющее
получить видимый рост планктонных форм легионелл после инкубации,
определяемый с помощью спектрофотометра по оптической плотности при длине
волны 540 нм. При больших разведениях независимо от сроков инкубации
значения оптической плотности не превышали фоновых.
Формирование моновидовых биопленок у таких широко распространенных во
внешней среде микроорганизмов как P.aeruginosa или Burkholderia cepacia не
превышает 1-2 сут. Наши исследования показали, что для легионелл данные
сроки инкубирования явно недостаточны и образование биопленок занимает
более длительный период. В качестве минимального срока формирования
биопленок легионелл при культивировании в питательной среде использовали
инкубацию в течение 96 ч.
В условиях эксперимента было выявлено, что оптимальной температурой для
образования биопленок является 28оС.
После отработки условий культивирования мы изучали сравнительную
способность к формированию биопленок 28 штаммов 12 видов Legionella spp.
Наряду с типовыми штаммами различных видов легионелл и музейными
клиническими изолятами, в работе использовали свежевыделенные штаммы
L.pneumophila BLR-05 и Total 1.
Сравнительный анализ выявил различия в способности к формированию
биопленок у штаммов различных видов легионелл и у штаммов, принадлежащих
29
к виду L.pneumophila (рисунок 7).
O
D
54
0
Клетки
Биопленки
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
1 – Legionella pneumophila, Philadelphia 1; 2 – Legionella pneumophila BLR-05; 3 – L. pneumophila Total1; 4 – L. parisiensis; 5 – L. micdadei; 6 – L. bozemanii; 7 – L. hackeliae; 8 – L. anisa; 9 – L. feeleii; 10 –
L. erythra; 11 – L.oakridgensis; 12 – L.dumoffii; 13 – L. pneumophila Los-Angeles-1, sg. 4; 14 – L.
pneumophila Pyshma-1; 15 – L. pneumophila Pyshma-9; 16 – фон.
Рисунок 7. Эффективность планктонного роста и биопленок легионелл в воде на 7-е сутки.
Результаты, полученные с штаммами, принадлежащими к видам L.pneumophila
и L.longbeachae, отличались наибольшей стабильностью и воспроизводимостью
при образовании биопленок в условиях эксперимента. Среди штаммов,
принадлежащих к виду L.pneumophila, способность к формированию биопленок
наиболее выражена у свежевыделенных штаммов BLR-05 и Total 1. Не выявлено
различий в формировании биопленок между штаммами L.pneumophia Philadelphia
1 с различным уровнем вирулентности для морских свинок.
Поскольку легионеллы являются широко распространенным водным
микроорганизмом, мы сравнили способность к формированию биопленок при
инкубации клеток в питательном бульоне и воде. При культивировании в воде
формирование биоплёнок происходило более медленно. У большинства
исследованных штаммов визуальные и фотометрические данные отличались от
фоновых незначительно.
Тем не менее, для штаммов L.longbeachae и L.pneumophila BLR-05 показана
способность стабильно формировать биопленки в воде после 2 недель инкубации,
причем морфологически и по степени прикрепления к поверхности лунки,
биопленки этих штаммов практически не отличались от биопленок, образуемых в
питательной среде.
Таким образом, на 28 различных штаммах Legionella spp. показана способность
легионелл формировать моновидовые биопленки в статических условиях,
количественно тестируемые окрашиванием кристалл виолетом в пластиковых
30
планшетах. Подобраны условия, позволяющие стабильно воспроизводить
формирование биопленок в питательной среде и воде. Принципиально важным
представляется различный уровень способности к формированию биопленок
легионеллами, выявленный у различных видов легионелл и штаммов
L.pneumophila.
На следующем этапе исследований анализировалась способность легионелл
сохранять жизнеспособность и персистировать в биопленках, формируемых
P.aeruginosa. Выявленные различия в способности штаммов легионелл к
формированию моновидовых биопленок были
использованы для отбора
штаммов, способных к персистенции в биопленках псевдомонад. Показано, что
штаммы L.pneumophila различаются по способности к персистенции в биопленке,
образованной P.aeruginosa. Штамм BLR-05 не только выявляли в ассоциативной
биопленке в течение 2 недель, но было отмечено
и увеличение числа
жизнеспособных клеток.
Для других использованных в работе штаммов легионелл выявлено снижение
числа жизнеспособных клеток в процессе эксперимента. Для штамма BLR-05 по
сравнению с 27 другими исследованными в работе штаммами L.pneumophila и
Legionella spp. наиболее выражена способность к образованию моновидовых и
ассоциативных биопленок.
Выявленные различия в способности штаммов L.pneumophila к формированию
моновидовых биопленок в легко воспроизводимых статических условиях
эксперимента, позволяют рассматривать отработанную методику как возможный
подход для характеристики выделяемых штаммов легионелл. Наряду с
молекулярным типированием и определением вирулентности для морских
свинок, способность к формированию моновидовых биопленок может быть
важной характеристикой штамма, свидетельствующей о его способности к
адгезии на различных пластиковых поверхностях, широко используемых в
искусственных
водных
системах.
Относительно
простые
и
легко
воспроизводимые статические условия эксперимента позволяют рассматривать
способность к формированию моновидовых и ассоциативных биопленок как один
из возможных эпидемиологических маркеров штаммов легионелл, выделяемых
из клинического материала и окружающей среды.
2.5.2. Изучение особенностей формирования биопленок в открытых
(градирни промышленных предприятий) и закрытых (системы горячего
водоснабжения общественных зданий) водных системах.
Визуальное обнаружение биопленок на границе поверхность-вода в любой
потенциально опасной водной системе (градирня, джакузи, система
водоснабжения и др.) свидетельствует о неудовлетворительной эксплуатации
данной системы и наличии в ней условий благоприятных для размножения
легионелл. При обследовании открытых систем (градирни, джакузи) биопленки
легко можно выявить на поверхности камер орошения, чаши градирен; под
пластиковым покрытием вокруг СПА-бассейна, где скапливается и застаивается
вода; на дне и поверхности накопительного бака или другой емкости для
31
длительного хранения воды. В закрытых водных системах биопленки образуются
на внутренней поверхности труб, в головках душа, прокладках водопроводных
кранов, различных фильтрах. В этом случае образцы биопленок можно взять с
помощью соскобов, нарушив при этом их нативную структуру, за исключением
внутренней поверхности труб, практически недоступной для рутинных
исследований. Биопленки на внутренней поверхности труб удается исследовать
лишь при проведении специальных научных исследований или обнаружении
«мертвых» зон водопроводной системы “dead leg” при эпидемиологическом
расследовании.
В 2010-12гг. нами совместно с лабораторией анатомии микроорганизмов
«ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи», возглавляемой д.м.н. Л.В.Диденко, было
проведено исследование особенностей структурной организации биопленок,
образуемых с участием легионелл, в системах водоснабжения лечебнопрофилактических учреждений и градирнях промышленных предприятий.
В работе исследовали образцы биопленок из градирен промышленных
предприятий c высоким уровнем контаминации L.pneumophila (более 105 КОЕ/л
воды) и систем горячего водоснабжения (более 104 КОЕ/л воды).
При исследовании в сканирующем электронном микроскопе в препаратах
выявлялись длинные переплетающиеся волокнистые структуры, по всей
видимости, гифы грибов, которые образовывали своеобразный сетчатый каркас.
На них были видны аморфные массы и геометрически правильные объемные
структуры (рисунок 8, 9).
Рисунок 8. Волокнистые структуры ↑,
аморфные массы
Геометрически правильные фигуры
(Ув. 600х).
Рисунок 9. Биопленка в градирне в виде
аморфных масс, на поверхности биопленки
видны контуры единичных бактериальных
клеток, диатомовые водоросли (Ув. 5000х)
При большем увеличении оказалось, что аморфные массы являются
биопленками, на поверхности которых можно было видеть контуры
бактериальных клеток. Геометрически правильные образования представляли
собой диатомовые водоросли.
Внутренняя поверхность труб системы водоснабжения была недоступна для
исследования, а взятие соскобов с внутренней поверхности головок душа и
водопроводных кранов приводило к нарушению структуры биопленки. Поэтому
32
для изучения динамики формирования природных биопленок в системе горячего
водоснабжения ЛПО на водопроводные краны в отделении монтировали
антибактериальные фильтры Pall (Аквасейф), предназначенные для защиты
пациентов в отделениях групп риска. После экспозиции в течение 1 и 3 дней, 1, 2
и 3 недель, соответственно, фильтры демонтировали и исследовали биопленку,
сформировавшуюся на поверхности фильтра.
Полученные результаты дают представление о формировании и структуре
биопленок, содержащих легионеллы, в потенциально опасных водных системах.
Биопленки на поверхности градирен промышленных предприятий формируются в
условиях непрерывного производственного процесса, являясь своеобразными
«накопителями» легионелл, других микроорганизмов и химических соединений.
В данной работе впервые биопленки градирен изучены комплексно с помощью
электронно-микроскопических
методов
исследования
(сканирующей
и
трансмиссионной электронной микроскопии). Результаты подтверждают
представления о природных биопленках как устойчивых сообществах легионелл,
грибов и водорослей. Впервые показано с помощью микроэлементного анализа
наличие в биопленках включений различных металлов, в том числе, титана и
железа, что указывает на тесную взаимосвязь формирования биопленок с
процессами коррозии.
Образование биопленок, ассоциированных с легионеллами, на поверхности
защитных антибактериальных фильтров, монтированных на водопроводном кране
нельзя экстраполировать на обычное водопроводное оборудование. В условиях
общей сильной колонизации легионеллами системы водоснабжения высока
скорость образования биопленки. Было проведено исследование особенностей
структурной организации биопленок, образуемых с участием легионелл, в
системах водоснабжения зданий общественного пользования, в том числе ЛПО.
Полученные результаты дают представление о формировании и структуре
биопленок, содержащих легионеллы, в потенциально опасных водных системах.
Высокая скорость формирования биопленок на поверхности защитных фильтров
Pall в системе водоснабжения ЛПО свидетельствует о высоком уровне
контаминации горячей воды микроорганизмами. В диапазоне температуры воды
45-52оС на поверхности фильтра, установленного на водопроводном кране, в
течение 3 недель наблюдали активное формирование биопленок (рисунок 10).
Формирование биопленок в системах городского горячего водоснабжения
общественных зданий, в том числе ЛПО, скорее гигиеническая, чем
эпидемиологическая проблема. В целом, этот процесс не представляет опасности
для здорового населения, поскольку в данном случае нет условий для
возникновения мелкодисперсного аэрозоля, а возможна лишь аспирация воды,
содержащей легионеллы и другие бактерии, входящие в состав биопленки. В
отделениях групп риска ЛПО ситуация принципиально меняется.
33
Рисунок 10. Исходная микропористая поверхность фильтрующего элемента и последующее
образование биопленки на фильтре Pall (21 cутки) в системе водоснабжения
Ассоциации
микроорганизмов в
биопленке могут быть причиной
нозокомиальной инфекции в результате аспирации воды пациентами групп риска
на фоне иммуносупрессии или сопутствующих заболеваний.
Наиболее распространенные микроорганизмы в биопленках систем
водоснабжения ЛПО г. Москвы в ассоциации с легионеллами: Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas spp., Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter spp.,
Brevibacterium vesicularis, Micrococcus luteus.
2.6. Сравнительное изучение особенностей колонизации легионеллами 2-х
типов потенциально опасных водных систем
Исследования, проводившиеся на Урале во время и после эпидемической
вспышки легионеллеза, выявили высокую степень контаминации легионеллами
градирен промпредприятий и системы водоснабжения г. Верхняя Пышма.
Однако, оставалось неясным носит ли столь высокий уровень контаминации
легионеллами локальный характер в районе эпидемической вспышки или
аналогичная ситуация наблюдается и в других регионах России.
Нами проведено обследование водных систем охлаждения промышленных
предприятий и систем горячего водоснабжения зданий общественного
пользования, в том числе ЛПО, в различных регионах России с целью
определения частоты и количественного уровня их контаминации L.pneumophila.
В процессе исследования разработан порядок обследования, позволяющий
выявлять контаминированные легионеллами участки и зоны потенциально
опасных водных объектов. Изучено разнообразие штаммов легионелл,
циркулирующих в потенциально опасных водных системах с помощью
серологических и молекулярно-генетических методов.
Для первичного скрининга легионелл нами были выбраны потенциально
опасные системы двух типов: градирни промышленных предприятий и системы
горячего водоснабжения общественных зданий.
2.6.1. Особенности колонизации градирен промышленных предприятий.
34
В работе исследовали образцы воды, смывов и биопленок из градирен
промышленных предприятий Московского и Уральского региона, Твери и
Самары, а также систем горячего водоснабжения зданий общественного
пользования Москвы и Московской области, Уральского региона, ХантыМансийского автономного округа, Самары, Омска, Белгорода и Нижнего
Новгорода обследованных в 2008-2014 гг. на предмет контаминации
L.pneumophila.
Всего обследовано 62 градирни на 26 предприятиях пищевого, химического,
строительного и научно-технологического профиля
и системы горячего
водоснабжения 30 комплекса зданий общественного пользования: торговые и
офисные центры, гостиницы и ЛПО.
Образцы воды, биопленок и смывов из градирен и систем горячего
водоснабжения исследовали в соответствии с разработанным алгоритмом с
помощью бактериологического метода на среде BCYE с селективными добавками
(Legionella BMPAα selective medium, «OXOID», Великобритания) и набора для
латекс-агглютинации Legionella latex test, «OXOID», Великобритания.
Таблица 4. Уровень контаминации L.pneumophila градирен промышленных предприятий.
Объект Кол-во
Кол-во
Концентрация
присутстКол-во
обследоконтами- L.pneumophila (КОЕ/л)
вие
градирен,
ванных
нирован- минималь- максималь- биопленок, в которых
градирен ных
содержащих была
ная
ная
градирен
превышеL.pneumophila
на норма
1
4
4
1,2 х102
2,4 х103
+
5
2
1
1
40
2 х10
+
1
3
4
1
1,2 х102
4
2
0
5
8
6
6 х102
3,6 х103
+
4
4
6
2
2
1,2 х10
9,6 х10
+
2
3
3
7
2
2
3 х10
4,5 х10
+
8
1
1
50
1 х102
+
9
1
0
10
1
0
6 х103
1 х106
+
1
11
1
1
1,8 х103
1,9 х103
12
1
0
3
13
1
1
5 х10
+
14
1
0
15
5
5
1,6 х103
2 х105
+
3
16
3
3
1,6 х102
3,6 х105
+
2
17
1
1
1 х102
5,2 х103
+
2
2
18
2
1
1,2 х10
1,5 х10
19
2
1
8,4 х102
9,6 х104
+
1
20
2
2
1,2 х103
5,4 х103
+
3
4
21
3
3
2,4 х10
7,8 х10
+
2
22
3
2
5 х102
4 х104
+
1
3
3
23
5
3
1,5х10
8,5х10
24
2
0
-
35
25
1
1
26
3
2
2
1,6х10
2,4х102
3
7,2х10
4,5х102
+
-
Контаминация
L.pneumophila выявлена в 21 из 26 промышленных
предприятий, в 43 из 62 обследованных градирен (69,4%), причем в 30% случаев
были превышены допустимые значения концентраций легионелл (таблица 4).
Концентрация возбудителя в контаминированных системах колебалась в
диапазоне от 40 до 1х106 КОЕ на литр воды. Среди выделенных изолятов 46%
принадлежали L.pneumophila 1 серогруппы, 54% возбудителя других серогрупп.
Из 14% положительных образцов были выделены изоляты L.pneumophila
нескольких серогрупп, в том числе первой. В биопленках помимо легионелл, как
правило, присутствовали диатомовые водоросли, бактерии Pseudomonas spp. При
превышении концентрации легионелл в воде градирен уровня 104 КОЕ/л в
биопленках и воде выявлено присутствие Staphylococcus spp.
Практически во всех случаях превышению концентрации легионелл в пробах
сопутствовало визуальное выявление биопленок, содержащих легионеллы на
поверхности чаши градирни.
2.6.2. Особенности колонизации легионеллами систем водоснабжения
общественных зданий.
Далее нами были изучены особенности колонизации легионеллами систем
водоснабжения зданий общественного пользования Москвы и Московской
области, Уральского региона, Ханты-Мансийского автономного округа, Самары,
Омска, Белгорода и Нижнего Новгорода обследованных в 2008-2014 гг. на
предмет контаминации L.pneumophila.
Для исследования уровня контаминации L.pneumophila систем водоснабжения
были выбраны здания или комплексы зданий с централизованной системой
холодного водоснабжения. Горячее водоснабжение объектов обеспечивалось
нагреванием холодной воды в калориферах бойлерной до температуры – 49о-63оС.
Всего обследовано 30 зданий общественного пользования с централизованной
системой холодного водоснабжения. Отбор проб воды и смывов осуществляли в
«застойных», концевых и редко используемых участках системы горячего
водоснабжения объекта. Исследовали образцы воды объемом 500-1000мл и
смывы с внутренней поверхности сеток душа и водопроводных кранов.
При обследовании систем водоснабжения зданий общественного пользования,
контаминация L.pneumophila выявлена в системе горячего водоснабжения в 28 из
30 обследованных объектов, что составляет 93,3% (таблица 5). Концентрация
L.pneumophila в положительных пробах составляла от 6х101 до 6,4х105 КОЕ /литр
воды. Концентрация возбудителя, превышающая 103 КОЕ/л, выявлена на 25
объектах, что составляет 78%. Среди выделенных изолятов 13% относились к
L.pneumophila серогруппы 1; 87% к L.pneumophila других серогрупп. Из 19%
положительных проб были выделены изоляты L.pneumophila нескольких
серогрупп, в том числе первой.
36
Таблица 5. Уровень контаминации L.pneumophila систем горячего водоснабжения зданий
общественного пользования.
Объект Кол-во
Кол-во
Концентрация
Кол-во точек
обследованучастков
L.pneumophila
отбора,
в
ных
системы
(КОЕ/л)
которых
участков
водоснабжения минималь- максималь- была
объекта,
превышена
ная
ная
контаминиронорма
ванных
L.pneumophila
1
6
1
2,8 х104
1
2
14
11
8,9 х102
6,4 х105
9
5
3
10
1
3,6 х10
1
4
8
1
8,4 х104
1
2
5
5
7
4
6 х10
1,2 х10
2
2
6
7
1
2 х10
0
7
11
1
1,2 х103
1
3
8
13
1
6 х10
1
9
12
1
5,6 х103
1
2
5
10
14
9
1,2 х10
1,2 х10
6
11
14
8
1,2 х102
4,9 х104
7
3
12
12
4
6 х10
3,6 х10
2
3
13
6
1
1,8 х10
1
14
7
2
2 х102
3 х103
1
3
4
15
7
3
4,6 х10
5,4 х10
2
16
7
0
не обнаружено
0
4
17
5
1
1,6 х10
1
18
12
10
3 х102
4,2 х105
7
2
3
19
9
3
6 х10
7,8 х10
2
4
5
20
6
4
1,6 х10
3 х10
4
21
25
7
3,1 х102
3,4 х104
2
2
3
22
3
3
1,2 х10
5 х10
2
23
5
5
60
6 х104
3
2
24
2
1
6,6 х 10
0
25
2
0
не обнаружено
0
3
26
16
12
8х10
9,2 х10
6
2
4
27
6
5
3,1х10
4,2 х10
2
28
4
1
9,6 х102
1
2
2
29
3
3
1,8х10
1,2 х10
0
30
16
5
2,4х102
6х104
3
Из 296 образцов воды и смывов культура L.pneumophila была выделена из 120
(40,5%) образцов. В 12 % образцов в ассоциации с L.pneumophila были выделены
другие микроорганизмы-возбудители внутрибольничных инфекций: P.aeruginosa,
Acinetobacter spp., Brevibacterium vesicularis, Micrococcus luteus.
2.7. Серологическое разнообразие выделенных штаммов L.pneumophila,
циркулирующих в градирнях и системах водоснабжения в Российской
Федерации.
37
Дрезденская панель моноклональных антител была использована для
таксономической
характеристики и оценки эпидемической значимости
выделенных в России штаммов L.pneumophila.. Выделенные штаммы
L.pneumophila принадлежат ко всем 14 серогруппам L.pneumophila, кроме 13
серогруппы.
В работе типировали 324 штамма L.pneumophila, выделенных в 2007 - 2014гг.
из потенциально опасных водных объектов Москвы, Екатеринбурга, Московской
и Свердловской области, Ямало-Ненецкого автономного округа, Самары, Твери.
Серотипирование выделенных штаммов L.pneumophila осуществляли с помощью
Дрезденской панели моноклональных антител иммуноферментным методом (С.
Luck, J. Helbig, 2002). Панель моноклональных антител любезно предоставлена
Ю. Хельбиг и К.Люк (Германский референс-центр по легионеллезу, Институт
медицинской микробиологии и гигиены, Технический университет, Дрезден,
Германия).
Типированию подлежали штаммы L.pneumophila, выделенные из 2-х типов
потенциально опасных водных систем (градирни промышленных предприятий и
системы горячего водоснабжения). Показано таксономическое разнообразие
штаммов L.pneumophila, циркулирующих в данных системах в Российской
Федерации (таблица 6).
Среди выделенных штаммов 26,5 % принадлежат к
L.pneumophila 1
серогруппы. Штаммы первой серогруппы являются основным возбудителем
внебольничных пневмоний легионеллезной этиологии. А штаммы 2-14 серогрупп
чаще вызывают внутрибольничную пневмонию. Обращает внимание
преобладание штаммов возбудителя первой серогруппы в градирнях
промышленных предприятий по сравнению с системами горячего водоснабжения
46% и 13% штаммов соответственно (ОШ 5,52; p=0,0001). Наряду со штаммами
серогруппы 1, наиболее широко в обоих типах водных систем представлены
штаммы серогруппы 6 (35% против 22%, ОШ 1,89; p=0,014) (рисунок 11).
Таблица 6. Таксономическое разнообразие выделенных штаммов L.pneumophila,
циркулирующих в градирнях и системах водоснабжения в Российской Федерации.
Серогруппа
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
Всего
2007-2014 гг
86
18
44
3
57
97
5
1
1
6
1
3
2
324
38
В воде градирен промышленных предприятий часто выделяли также штаммы
серогрупп 6 (22%) и 3 (10%) (рисунок 11). Для воды систем горячего
водоснабжения также характерно присутствие штаммов серогруппы
3 (16%
против 10%, ОШ 5,52; p=0,0001) (рисунок 12).
Рисунок 11.Распределение серотипов среди
штаммов L.pneumophila, выделенных из градирен.
Рисунок 12.Распределение серотипов
среди штаммов L.pneumophila,
выделенных из систем водоснабжения.
Для воды градирен характерен значительно более высокий уровень
серологического разнообразия выделенных штаммов легионелл. Если в образцах
воды градирен в 56% проб значительно чаще встречались штаммы 2-х и более
серотипов возбудителя, то в образцах воды из систем горячего водоснабжения
штаммы различных серотипов обнаружены лишь в 20% образцов (56% против
20%; ОШ 5,08; p=0,0001).
2.8. Создание национальной коллекции легионелл.
На момент начала исследований в коллекции лаборатории было 3 штамма
легионелл, выделенных в СССР и РФ и зарубежные штаммы.
Мы отработали методику выделения легионелл из окружающей среды и
клинического материала, которая позволила составить за 2005-2015гг. коллекцию
из 354 штаммов (339 и 15 соответственно). Коллекция выделенных нами культур
насчитывает 354 штамма, принадлежащих к 13 серогруппам L.pneumophila
(Таблица 7) и 15 штаммов 11 видов Legionella spp., выделенных из различных
водных объектов на территории Российской Федерации (градирни
промышленных предприятий, система водоснабжения зданий общественного
пользования – гостиницы, торговые центры, ЛПО).
Впервые на территории России выделены культуры легионелл, принадлежащие
к различным видам. Штаммы были охарактеризованы с помощью панели
моноклональных антител.
39
Таблица 7. Коллекция штаммов L.pneumophila и других видов легионелл.
Серогруппа
L. pneumophila
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
14
Legionella spp.
L.anisa
L.gratiana
L.dumoffii
L.gormanii
L.jordanis
L.londiniensis
L.brunensis
L.jamestowniensis
L.rubrilucens
L.feeleii
Всего
Количество
штаммов,
выделенных в
2005-2015гг.
93
18
52
3
57
97
5
1
1
6
1
3
2
3
3
2
1
1
1
1
1
1
1
354
40
ВЫВОДЫ
1. Впервые предложен дифференцированный подход для диагностики
внебольничных пневмоний (сочетание иммунохроматографического метода
выявления антигена легионелл в моче и бактериологических методов) и легочных
осложнений у пациентов с иммунодефицитами (внутрибольничные пневмонии)
легионеллезной
этиологии
(ПЦР
с
последующим
применением
бактериологических методов).
2. Алгоритм выявления легионелл в окружающей среде основан на
предварительном скрининге образцов воды в водных системах на наличие ДНК
легионелл с помощью ПЦР-РВ с последующим бактериологическим
подтверждением, при этом целесообразно
рассматривать ПЦР-РВ и
бактериологическое исследование воды не как альтернативные подходы, а как
единый комплекс методов.
3. Применение разработанного комплекса методов диагностики легионеллеза и
мониторинга объектов окружающей среды на наличие легионелл позволило
впервые в России выявить крупную эпидемическую вспышку внебольничных
пневмоний легионеллезной этиологии в Верхней Пышме и своевременно
осуществить необходимый комплекс противоэпидемических мероприятий.
4. Применение разработанного комплекса методов диагностики легионеллеза
позволило установить роль легионелл в этиологии легочных осложнений у
иммунокомпрометированных больных в ФГБУ «Гематологический научный
центр» Минздрава России: диагноз легионеллезной этиологии установлен у
10,5% больных с легочными осложнениями; впервые прижизненно выделены
клинические штаммы легионелл от больных с заболеваниями системы крови и
осуществлена эффективная антибиотикотерапия.
5. Применение мультилокусного секвенирования позволило подтвердить
идентичность штамма
(St87) L.pneumophila, выделенного от больных и
циркулирующего в системе горячего водоснабжения ГНЦ в качестве
госпитального штамма.
6. Сравнительное изучение особенностей колонизации легионеллами двух
типов потенциально опасных водных систем на территории Российской
Федерации (градирни промышленных предприятий
и системы горячего
водоснабжения общественных зданий) позволило установить, что при высоком
уровне контаминации легионеллами обоих типов систем выявлены существенные
различия в серологическом разнообразии выделенных штаммов возбудителя. Так,
в воде градирен преобладали штаммы L.pneumophila серогруппы 1 (46%). В
системе горячего водоснабжения 35% штаммов относились к серогруппе 6.
7. Изучены особенности формирования модельных биопленок легионелл в
экспериментальных условиях и природных биопленок легионелл в потенциально
опасных водных системах. Впервые показан различный уровень способности к
формированию моновидовых биопленок у штаммов L.pneumophila и Legionella
spp. Показана способность штаммов легионелл с высоким уровнем формирования
41
моновидовых биопленок персистировать в биопленках, образованных другими
микроорганизмами.
8. Показано, что природные биопленки легионелл на поверхности градирен
представляют собой совокупность нескольких систематических групп
микроорганизмов – грибов, бактерий (грамположительных и грамотрицательных),
сине-зеленых водорослей и включений металлов, окруженных экзоклеточным
матриксом. В системе горячего водоснабжения в ЛПО в течение 2-3 недель на
поверхности фильтров, установленных в водопроводном кране, формируется
массивная биопленка легионелл в ассоциации с другими грамположительными и
грамотрицательными бактериями.
9. Впервые создана национальная коллекция легионелл, насчитывающая 354
штамма, выделенных из окружающей среды (339) и клинического материала (15)
и охарактеризованных с помощью
панели моноклональных антител и
секвенирования. Входящие в коллекцию 354 штамма L.pneumophila принадлежат
к 13 серогруппам; 15 штаммов представлены 11 видами Legionella spр.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Карпова Т.И., Природные биопленки легионелл и их роль в эпидемиологии
инфекции: методы изучения и моделирования / Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина, И.С.
Тартаковский, Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // ЖМЭИ – 2008-2 - C.13-16.
2. Карпова Т.И., Лабораторная диагностика легионеллезной инфекции / Т.И.
Карпова, И.С. Тартаковский // Лабораторная служба – 2015 – 2 – C.30-34.
3. Карпова Т.И., Особенности эпидемиологии и лабораторной диагностики
легионеллеза / Т.И. Карпова, И.С. Тартаковский // Инфекционные болезни №4 –
2015 – C.51-59.
4. Тартаковский И.С., Легионеллез: проблемы и перспективы лабораторной
диагностики / И.С.Тартаковский, Н.Д. Темежникова, Т.И. Карпова // Проблемы
особо опасных инфекций - 2(90) – 2005 – C.17-23.
5. Аляпкина Ю.С., Применение ПЦР в реальном времени для выявления
легионелл в объектах окружающей среды / Ю.С. Аляпкина, Ю.Е. Дронина, Т.И.
Карпова, Ю.П. Пашко, Д.А. Варламов, Я.И. Алексеев, Ю.М. Романова, И.С.
Тартаковский // ЖМЭИ – 2009 – 2 – C.75-80.
6. Аляпкина
Ю.С.,
Методические
рекомендации
«Выявление
и
количественное и определение легионелл в водных образцах внешней среды
методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием
тест-систем производства ЗАО Синтол.» / Ю.С. Аляпкина, И.В. Новокшонова,
И.С. Тартаковский, Т.И. Карпова с соавт. // МР 02.039-09 Роспотребнадзора.
7. Воронина О.Л., Анализ распространения и изменчивости штаммов
Legionella pneumophila и Legionella spp. на основе изучения аллельных профилей /
О.Л. Воронина, М.С. Кунда, В.В. Биткина, Т.И. Карпова, В.В. Романенко, А.Л.
Дурасова, И.С. Тартаковский // ЖМЭИ - 2009 – 6 – C.17-21.
42
8. Воронина О.Л., Молекулярно-генетическое типирование штаммов
Legionella pneumophila и Legionella spp., выделенных на территории Российской
Федерации / О.Л. Воронина, М.С. Кунда, В.Г. Лунин, Т.И. Карпова, И.С.
Тартаковский // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия
– 2008 – 10 – 2 - C.154-163.
9. Галстян Г.М., Случай легионеллезной пневмонии, подтвержденный
выделением культуры L.pneumophila серогруппы 1 из бронхоальвеолярного
лаважа, леченный левофлоксацином и тигециклином / Г.М. Галстян, М.Ю.
Дроков, С.А. Катрыш, Г.А. Клясова, Е.А. Гилязитдинова, Т.И. Карпова, Б.И.
Маракуша, И.С. Тартаковский // Терапевтический архив №7 – 2011 - C.61-65
10. Галстян Г.М., Случай легионеллезной пневмонии, подтвержденный
выделением культуры L.pneumophila серогруппы 1 из бронхоальвеолярного
лаважа / Г.М. Галстян, М.Ю. Дроков, Т.И. Карпова, Б.И. Маракуша, И.С.
Тартаковский // Тезисы докладов IХ научно-практической конференции
«Внутрибольничные
инфекции
в
стационарах
различного
профиля,
профилактика, лечение осложнений – 2011 - C.32-33.
11. Галстян Г.М., Клинические проявления легионеллезной пневмонии у
гематологических больных / Г.М. Галстян, И.Э. Костина, Г.А. Катрыш, Г.А.
Клясова, Т.И. Карпова, И.С. Тартаковский // Терапевтический архив – 2014 - 3
– C.45-52.
12. Груздева О.В., Особенности эпидемиологии и методы профилактики
нозокомиального легионеллеза / О.В. Груздева, И.С. Тартаковский, Т.И.
Карпова, О.В. Мариненко // Эпидемиология и вакцинопрофилактика – 2014 1 (74) – C.19-23.
13. Груздева О.А., Анализ уровня и частоты контаминации Legionella
pneumophila систем горячего водоснабжения лечебно-профилактических
учреждений Москвы / О.А. Груздева, Н.Н. Филатов, О.В. Садретдинова, Т.И.
Карпова, Ю.Е. Дронина, Н.М. Шустрова, Ю.С. Аляпкина, В.Г. Фокина, Г.Ю.
Никитина, Н.Е. Дроздова, Ю.В. Никольская, И.С. Тартаковский //
Эпидемиология и инфекционные болезни – 2012 – 1 – C.10-14.
14. Диденко Л.В., Морфологические особенности биопленок в потенциально
опасных водных системах / Л.В. Диденко, О.В. Садретдинова, Н.В. Шевлягина,
Г.А. Автандилов, И.В. Новокшонова, Т.И. Карпова, О.А. Груздева, И.С.
Тартаковский // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2012 – 1 – C.15-20.
15. Дронина Ю.Е., Серологическая характеристика штаммов Legionella
pneumophila, выделенных из потенциально опасных водных систем в Российской
Федерации в 2007-2011годах / Ю.Е. Дронина, И.С.Тартаковский, О.В.
Садретдинова, Т.И. Карпова, И.В. Новокшонова, О.А. Груздева, Н.В. Каражас,
Т.Н. Рыбалкина // ЖМЭИ – 2012 – 2 – C.23-28.
16. Дронина Ю.Е., Особенности формирования биопленок легионелл в
искусственных и природных водных системах / Ю.Е. Дронина, Т.И. Карпова,
О.В. Садретдинова, Л.В. Диденко, И.С. Тартаковский // ЖМЭИ – 2012 – 4 –C.7680.
43
17. Дронина Ю.Е., Характеристика штаммов Legionella pneumophila,
выделенных в России с помощью международной панели моноклональных
антител. Дезинфекция / Ю.Е. Дронина, К. Люк, Ю. Хельбиг, И.С. Тартаковский,
О.В. Садретдинова, Т.И. Карпова, Н.В. Каражас, Т.Н. Рыбалкина, И.В.
Новокшонова, О.А. Груздева, С.С. Смирнова, Е.Ю. Кочеровская // Антисептика
№3 – 2010 – C.36-40.
18. Дронина Ю.Е., Оценка бактерицидной активности дезинфицирующих
средств против легионелл на модели биопленок / Ю.Е. Дронина, Л.Г. Пантелеева,
Т.И. Карпова, Н.М. Шустрова, Ю.М. Романова, И.С. Тартаковский, М.Г.
Шандала, А.Л. Гинцбург // ЖМЭИ– 2008-2 – C.117-119.
19. Лазикова Г.Ф., В.И.Покровский, И.С.Тартаковский, Т.И.Карпова с соавт.
Методические указания 3.1.2.2412-08 Роспотребнадзора «Эпидемиологический
надзор за легионеллезной инфекцией»
20. Романова Ю.М., Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте /
Ю.М. Романова, И.С. Тартаковский, Н.В. Алексеева, Т.И. Карпова, Ю.Е.
Дронина // ЖМЭИ №1 – 2008 – C.3-7.
21. Садретдинова О.В., Контаминация Legionella pneumophila систем горячего
водоснабжения зданий общественного назначения, в том числе лечебнопрофилактических учреждений / О.В. Садретдинова, О.А. Груздева, Т.И.
Карпова, Ю.С. Аляпкина, Ю.Е. Дронина, В.Г. Фокина, И.С. Тартаковский //
Клиническая микробиология и антимикробная терапия №2 – 2011 – C. 163168
22. Садретдинова О.В., Распространение глюкозилтрансферазы Lgt среди
штаммов Legionella pneumophila, выделенных из различных источников / О.В.
Садретдинова, К. Люк, Т.И. Карпова, Ю.Ф. Белый, И.С. Тартаковский // ЖМЭИ
- 2012 – 3 –C.8-12.
23. Тартаковский И.С., Особенности профилактики и диагностики легионеллеза
в лечебно-профилактических учреждениях / И.С. Тартаковский, О.А. Груздева,
Г.М. Галстян, Т.И. Карпова // Материалы 4 Всероссийского конгресса по
инфекционным болезням – C.26-28
24. Тартаковский И.С., Профилактика, диагностика и лечение легионеллеза /
И.С. Тартаковский, О.А. Груздева, Г.М. Галстян, Т.И. Карпова // Москва – 2013 Студия МДВ - 344 страниц, монография.
25. Тартаковский
И.С.,
Методические
особенности
диагностики
легионеллезной пневмонии в лечебно-профилактических учреждениях. Часть 2 /
И.С. Тартаковский, Р.Р. Адгамов, С.А. Ермолаева, Ю.Е. Дронина, Т.И. Карпова,
Г.М. Галстян, С.А. Катрыш, О.В. Садретдинова, В.Г. Савченко // Клиническая
микробиология и антимикробная химиотерапия - 2013 - 15 (3) – C.166-173.
26. Тартаковский И.С., Методические особенности диагностики легионеллеза в
лечебно-профилактических учреждениях / И.С. Тартаковский, Т.И. Карпова,
О.А. Груздева, Г.М. Галстян // Материалы VI ежегодного Всероссийского
конгресса по инфекционным болезням – Москва - март 2014 - С.304.
27. Тартаковский
И.С.,
Методические
особенности
диагностики
легионеллезной пневмонии в условиях ЛПУ / И.С. Тартаковский, Г.М. Галстян,
44
Т.И. Карпова С.А. Катрыш, Ю.Е. Дронина, О.В. Садретдинова // Клиническая
микробиология и антимикробная химиотерапия – 2012 – 2 – C.100-107.
28. Тартаковский И.С., Стандарты лабораторной диагностики легионеллеза и
их применение во время эпидемической вспышки пневмоний в г. Верхняя Пышма
/ И.С. Тартаковский, А.Л. Гинцбург, Г.Ф. Лазикова, Г.Г. Чистякова, Ю.В. Демина,
Ю.Е. Дронина, Т.И. Карпова и др. // ЖМЭИ №2 – 2008 – C.16-19.
29. Тартаковский И.С., Карпова Т.И., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. с соавт.
МУК 4.22.17.07 Роспотребнадзора «Определение бактерий Legionella рneumophila
в объектах окружающей среды»
30. Тартаковский И.С., Карпова Т.И., Дрониной Ю.Е.с соавт. Методические
рекомендации N01/14633-8-34 Роспотребнадзора «Выявление антигена бактерий
Legionella
pneumophila
серогруппы
1
в
клиническом
материале
иммунохроматографическим методом».
31. Тартаковский И.С., Болезнь легионеров как проблема биобезопасности /
И.С. Тартаковский, Ю.В. Демина, Т.И. Карпова, О.В. Садретдинова, Ю.Е.
Дронина // Материалы конференции Теоретические и практические аспекты
современной эпидемиологии, посвященной 75-летию академика РАМН
Б.Л.Черкасского – Москва – 2009 – C.95-99.
32. Тартаковский И.С., Применение дезинфицирующих средств
для
профилактики легионеллеза в градирнях промышленных предприятий / И.С.
Тартаковский, Л.Г. Пантелеева, Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина, И.В. Новокшонова,
А.Л. Гинцбург, М.Г. Шандала // В сборнике «Методологические проблемы
изучения, оценки и регламентирования биологических факторов в гигиене
окружающей среды» посвященном 130летию со дня рождения академика
А.Н.Сысина – Москва – 2009 – C.296-298.
33. Тартаковский И.С., «Легионеллез» в «Лабораторная диагностика опасных
инфекционных заболеваний» / И.С. Тартаковский, Т.И. Карпова, Н.Д.
Темежникова, Ю.Е. Дронина // Практическое руководство под ред. Г.Г.Онищенко,
В.В.Кутырева М.Медицина – 2009 – C.357-372.
34. Тартаковский И.С., Опыт применения в градирнях промышленного
предприятия дезинфицирующих средств для профилактики легионеллеза / И.С.
Тартаковский, Л.Г. Пантелеева, Ю.В. Демина, Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина, И.В.
Новокшонова, А.Л. Гинцбург, М.Г. Шандала // Дезинфекционное дело. №1 –
2010 – C.50-54.
35. Тартаковский И.С., Особенности профилактики легионеллеза в водных
системах охлаждения промышленных предприятий / И.С. Тартаковский, Т.И.
Карпова, Ю.Е. Дронина, И.В. Новокшонова, М.В. Зароченцев, Л.Г. // Пантелеева
Сборник научных трудов МПФ ППО ММА им.И.М.Сеченова - 2010 – C.230-233.
36. Тартаковский И.С., Профилактика легионеллеза / И.С. Тартаковский, Т.И.
Карпова, А.Л. Гинцбург, Ю.Е. Аляпкина, О.В. Садретдинова, Ю.Е. Дронина,
Ю.Е. Демина, В.И. Покровский, Ю.А. Рахманин, О.А. Груздева, И.В.
Новокшонова, А.И. Верещагин // Санитарные правила 3.1.2.2626-10, 24с.
37. Тартаковский И.С., Частота и уровень контаминации Legionella
pneumophila потенциально опасных водных объектов в московском регионе / И.С.
45
Тартаковский, И.В. Новокшонова, О.В. Садретдинова, О.А. Груздева, Ю.С.
Аляпкина, Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина, В.Г. Фокина, Н.М. Шустрова // ЖМЭИ
№6 – 2010 – C.21-26.
38. Тартаковский И.С., Влияние температуры на жизнеспособность
планктонных клеток и модельных биопленок Legionella pneumophila в воде / И.С.
Тартаковский, Т.И. Карпова, О.А. Груздева, О.В. Мариненко, Ю.Е. Дронина //
ЖМЭИ – 2015 – 5 – C.7-11.
39. Чучалин А.Г., Практические рекомендации по диагностике и лечению
легионеллезной инфекции, вызываемой Legionella pneumophila серогруппы1 /
А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, И.С. Тартаковский, Т.И. Карпова, Ю.Е.
Дронина, О.В. Садретдинова, Р.С. Козлов, З.Д. Бобылева, И.В. Лещенко, Д.О.
Михайлова, С.А. Рачина // Пособие для врачей. Российское Респираторное
общество - Москва - 2009.
40. Ярков С.П., Разработка технических средств иммунохроматографического
анализа для выявления возбудителя легионеллеза / С.П. Ярков, С.И. Третьяков,
Л.А. Башарова, И.С. Тартаковский, Т.И. Карпова, Ю.Е. Дронина // Материалы IХ
межгосударственной конференции стран участников СНГ «Современные
технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными
болезнями на территории государств участников содружества независимых
государств – 2008 – C.160-161.
41. Яцышина С.Б., Применение ПЦР для диагностики легионеллезной
инфекции у гематологических больных / С.Б. Яцышина, Т.И. Карпова, О.В.
Мариненко, Ю.Е. Дронина, Г.М. Галстян, И.С. Тартаковский // Клиническая
микробиология и антимикробная химиотерапия – 2015 – 17 – 1 – C.52-56.
42. Alyapkina Y., Quality and quantity detection of Legionella in environment water
samples / Y. Alyapkina, I. Tartakovskiy, T. Karpova, D. Varlamov, Y. Pashko, Y.
Dronina // In Abstracts 18th ERS Annual Congress, Berlin – 2008 - 385
43. Alyapkina Y., Quality and quanty detection of Legionella in environmental water
samples / Y. Alyapkina, I. Tartakovskiy, T. Karpova, O. Sadretdiniva, J. Alexeev, V.
Novokshonova // Abstracts of international conference Legionella – 2009 - Paris – 2009
– P.212.
44. Voronina O., Distribution of Legionella pneumophila serogroups and
monoclonal antibody subgroup in environmental isolates from Russia (2005-2009) / O.
Voronina, M. Kunda, V. Bitkina, V. Lunin, O. Sadretdinova, T. Karpova, Ch. Luck, I.
Tartakovskiy // Abstracts of international conference Legionella – 2009 - Paris – 2009 –
P.263.
45. Voronina O., The state of cooling towers Legionella population in Verhnaya
Pyshma after outbreak 2007 / O. Voronina, M. Kunda, V. Bitkina, T. Karpova, I.
Tartakovskiy, A. Ginsburg // Abstracts of international conference Legionella - 2009 Paris – 2009 – P.287.
46. Voronina O., Legionella pneumophila and Legionella spp. strains, isolated in
Russian Federation in 2005-2008 years: allelic profiles and features of distribution / O.
Voronina, M. Kunda, V. Lunin, T. Karpova, I. Tartakovskiy // Abstracts of 23th
EWGLI for Legionella infections – Madrid – 2008- P.53.
46
47. Dronina Yu., Sero- and subgroup distribution of Legionella pneumophila strains
isolated from potentially dangerous water systems in Russia during 2007-2011 / Yu.
Dronina, P.C. Luck, J. Helbig, O. Sadretdinova, T. Karpova, I. Tartakovskiy // Abstract
book of 26th meeting European working group on Legionella infection - 2011 - Vena,
Austria – P.79-80.
48. Tartakovskiy I., Lessons from large community outbreak in Verhnaja Pyshma,
Russia / I. Tartakovskiy, T. Karpova, Y. Demina, G. Lazikova, V. Romanenko // Abst.
Of 23th EWGLI for Legionella infections - Madrid – 2008 – P.20-21.
49. Tartakovskiy I., From large community outbreak in Verhnaya Pyshma to
effective prevention of legionellosis in Russia / I. Tartakovskiy, Yu. Demina, O.
Voronina, Y. Alyapkina, T. Karpova // Abstracts of international conference
Legionella – 2009 - Paris – 2009 – P.58.
50. Tartakovskiy I., Evaluation of Legionella pneumophila contamination of
potentially dangerous water systems in Moscow к region /
I.
Tartakovskiy,
O.
Sadretdinova, T. Karpova, Yu. Dronina, Yu. Alyapkina, I. Novokshonova, O.
Grusdeva // Abstracts of 25th EWGLI meeting - September 2010 – Copenhagen – 2010
– P.74.
51. Tartakovskiy I., Legionella pneumophila associated biofilms from potential
dangerous water systems: morphological aspects and serological diversity / I.
Tartakovskiy, Y. Didenko, Y. Dronina, O. Grusdeva, I. Novokshonova, T. Karpova //
Abstracts 1 meeting of the ESCMID study group of Legionella infection - Dresden,
Germany - September 2012 – P.35-36.
52. Tartakovskiy I., Legionellosis in patients with hemathologic diseases / I.
Tartakovskiy, T. Karpova, O. Grusdeva, G. Galstjan, R. Adgamov // 2th meeting of the
ESCMID Study group for Legionella infection - September 2014 - Barcelona, Spain P.23.
Список используемых сокращений
ПЦР-РВ
КОЕ
GICL
SBT
Sg
ЛПО
ЦТС
БАЛ
БУДРАГ
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
Колониеобразующая единица
Gamaleya Institute Collection of Legionellosis
Sequence-Based Typing
Серогруппа
Лечебно-профилактическая организация
системы централизованного водоснабжения
Бронхоальвеолярный лаваж
Буферный угольно-дрожжевой агар
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
46
Размер файла
970 Кб
Теги
водных, система, выявление, подход, диагностика, новый, легионелл, лабораторная, легионеллеза
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа