close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

РОЛЬ ЛАБОРАТОРНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В ОЦЕНКЕ ПРОГРЕССИИ ПАТОЛОГИИ ШЕЙКИ МАТКИ АССОЦИИРОВАННОЙ С ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
КУДЕЛЬКИНА СВЕТЛАНА ЮРЬЕВНА
РОЛЬ ЛАБОРАТОРНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В
ОЦЕНКЕ ПРОГРЕССИИ ПАТОЛОГИИ ШЕЙКИ МАТКИ,
АССОЦИИРОВАННОЙ С ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика
АВ ТО РЕ ФЕ РАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Нижний Новгород – 2016
Работа
выполнена
в
федеральном
государственном
бюджетном
образовательном учреждении высшего образования «Нижегородская
государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения
Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор
Конторщикова Клавдия Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
Горошинская Ирина Александровна
профессор, главный научный сотрудник
лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей, Федерального
государственного
бюджетного
учреждения
«Ростовский
научноисследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения
Российской Федерации.
доктор медицинских наук,
Головков Дмитрий Анатольевич
ассистент кафедры онкологии
института дополнительного профессионального образования Федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Воронежский государственный медицинский университет имени
Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Северо-Западный
федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита состоится «.......»............................20___ года в 14 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.08 на базе Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский
национальный исследовательский медицинский университет им.Н.И.Пирогова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г.
Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВО
РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул.
Островитянова, д. 1 и на сайте http://rsmu.ru
Автореферат разослан «.........» ............................ 20__ года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
И.Г. Гордеев
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
По современным данным возникновение значительной доли заболеваний
шейки
матки
связано
с
присутствием
вируса
папилломы
человека.
Папилломавирусная инфекция характеризуется широкой распространенностью,
большой способностью к передаче и выраженным онкогенным потенциалом.
Инфицированность сексуально активного населения планеты колеблется от 20
до 60% (Киселева В.И., 2010, Прилепская В.Н., 2009, Роговская С.И., 2008) и
составляет около 440 млн. человек (WHO, 2006). На данный момент оценить
реальный уровень заболеваемости папилломавирусной инфекцией невозможно,
так как отсутствуют меры по обязательному учету и государственной
регистрации этой патологии.
У 80% женщин происходит спонтанная элиминация вируса из организма в
период от 6 до 18 месяцев (в среднем), и только у 20% наблюдается
персистирующее течение инфекции, которое впоследствии может привести к
неопластической трансформации цервикальных эпителиоцитов (Frazer L.H.,
2009). Персистенция
более двух лет вируса папилломы человека 16 типа
составляет 40-50% риска развития цервикальной неоплазии, 56 типа – 30-40%,
31-го, 58-го, 82-го типов – по 20-30%, 18-го, 33-го, 35-го,51-го, 52-го типов – по
10-20% (Wheeler C.M., 2009; WHO, 2006).
Сейчас вопросы о происхождении механизмов, приводящих к тому или
иному варианту течения и исхода патологического процесса, изучены
недостаточно полно. Ряд авторов полагает, что неблагоприятному исходу
способствует
мультиинфицирование
высокоонкогенными
типами
вируса
папилломы человека и высокие цифры вирусной нагрузки, а также внедрение
ДНК ВПЧ в генетический аппарат клетки-хозяина (Бебнева Т.Н. и соавт., 2009;
Кисина В.И., Кубанов А.А., 2005; Прилепская В.Н. и соавт., 2011).
Особенностями жизненного цикла вируса папилломы человека являются
отсутствие виремии, цитолиза, низкие уровни вирусного белка, ограничение
репликационного цикла многослойным плоскими эпителием, иммуносупрессия
3
за счет вирусных белков. Все это приводит к длительному игнорированию
инфекционного агента иммунной системой организма-хозяина
(Бояринцев
В.В., 2009; Stanley M.A., 2009).
Поскольку вирус нарушает структуру слизистой оболочки шейки матки, это
способствует проникновению и развитию патогенных микроорганизмов
(Роговская С.И., 2012). Большой интерес представляет роль состояния
микробиоценоза влагалища в прогрессии цервикальных неоплазий (Коган Е.А.
и соавт., 2012; Олина А.А., 2008). Фоном для развития диспластических
состояний может служить воспаление - цервицит, при котором в процесс
вовлекаются слизистая, а затем и строма шейки матки. Большая часть женщин с
хроническим цервицитом (86%) инфицирована вирусом папилломы человека
(Ваганова И.Г., 2000; Ершов Ф.И. и соавт.).
инфекционно-воспалительного
процесса
Определение характера
вызывает
в
настоящее
время
определенные трудности. Не существует четких молекулярно-биологических,
иммунологических
критериев
того
или
иного
варианта
развития
папилломавирусной инфекции, что при ее широкой распространенности
определяет актуальность данной исследовательской работы.
Цель работы
Сравнительная оценка молекулярно-биологических, иммунологических,
биохимических, микробиологических факторов в анализе течения патологии
шейки матки, вызванной папилломавирусной инфекцией.
Задачи
1.
Установить
папилломавирусной
качественные
инфекции
у
и
количественные
женщин
с
характеристики
воспалительными
и
неопластическими процессами шейки матки.
2. Выявить важность определения онкобелка Е7 ВПЧ 16,18 типов, как
индикатора интегративной формы существования вируса.
3. Исследовать характер повреждений в работе иммунной системы при
патологии шейки матки, вызванной инфекционным компонентом.
4
4. Провести множественный анализ исследованных биохимических,
иммунологических, молекулярно-биологических, бактериологических маркеров
и проанализировать корреляции между выявленными значимыми показателями.
Научная новизна работы
Установлено
наличие
прямой
связи
между
онкопротеинами
папилломавируса 16 типа: Е7 и р16, что доказывает значимость этих маркеров в
оценке тяжести цервикального поражения.
Впервые обнаружено наличие сходных показателей в группах цервицитов и
дисплазий, что позволяет включить вирусные цервициты в группу риска
развития цервикальной неоплазии.
Впервые дана комплексная оценка таких характеристик папилломавирусной
инфекции, как вирусная нагрузка и частота встречаемости определенных типов
вируса, моно- и мультиинфицирование, состояние м/биоценоза влагалища, что
возможно
послужит
новым
диагностическим
критерием
в
оценке
возникновения и развития папилломавирусной инфекции.
Впервые определено сходство групп легких дисплазий и цервицитов по
уровню лактоферрина, что свидетельствует о большой доле реактивного
характера диспластического процесса, в отличие от глубокого поражения при
тяжелых дисплазиях.
Практическая значимость работы
Для выявления группы риска и определения возможной прогрессии
цервикальной
неоплазии
рекомендуется
использовать
качественные
и
количественные характеристики папилломавирусной инфекции (скрининг,
генотипирование, определение вирусной нагрузки); выяснить статус ДНК
вируса (эписомальная или интегративная формы) по экспрессии онкобелка Е7 и
р16. С помощью методов ПЦР возможно исследование микробиоценоза
влагалища, что играет немаловажную роль в течении папилломавирусной
инфекции.
Определение трансформирующего фактора роста TGFβ в цервикальной
слизи
позволяет проводить оценку уровня локальной иммуносупрессии, а
5
определение лактоферрина – оценку выраженности воспалительного процесса
цервикса.
Эффективная диагностика позволит снизить показатели заболеваемости и
смертности среди женщин с вирусными поражениями шейки матки.
Положения, выносимые на защиту
1. Экспрессия онкопротеинов Е7, р16, величина вирусной нагрузки,
мультиинфицирование вирусами папилломы человека и зависимость данных
показателей
от
состояния
биоценоза
влагалища
являются
клинико-
лабораторными характеристиками неопластических процессов шейки матки.
2.
Характер
нарушений
в
системе
местного
иммунитета
при
папилломавирусной инфекции имеет различную выраженность в зависимости
от стадии инфекционного процесса.
Апробация работы
Результаты работы доложены на заседании кафедры клинической
лабораторной диагностики факультета повышения квалификации врачей
Государственного
образования
бюджетного
«Нижегородская
учреждения
высшего
государственная
профессионального
медицинская
академия»
Министерства здравоохранения Российской Федерации» (июнь 2016г).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа в объеме 120 страниц состоит из введения, обзора
литературы, описания материалов и методов исследования, собственных
результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и
списка литературы. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 14
таблицами. Библиографические указания включают 283 источника литературы
(208 отечественных и 75 иностранных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В результате определенного отбора пациенток, прошедших консультации у
гинекологов различных медицинских учереждений города Нижнего Новгорода
6
за период с 2010 по 2014 годы, для научного наблюдения была сформирована
группа женщин. Возраст обследуемых составлял от 17 до 60 лет. У всех
женщин присутствовали различные варианты патологии шейки матки,
обусловленные папилломавирусной инфекцией. Для исследования были
использованы образцы сыворотки крови и цервикальной слизи 140 пациенток:
40 женщин с диагнозом плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия
высокой степени тяжести (HSIL), 40 - плоскоклеточная интраэпителиальная
неоплазия низкой степени тяжести (LSIL), 30 человек — с хроническими
цервицитами вирусной этиологии. Контрольная группа включала 30 здоровых
женщин, с отрицательным ВПЧ-тестом. Все диагнозы имели цитологическое и
гистологическое подтверждение.
Диагностика инфекций, передаваемых половым путем, проводилась из
материала урогенитальных мазков с использованием метода полимеразной
цепной реакции формат «реальное время» на наборах фирмы «ДНКтехнология», «Интерлабсервис» (Москва). Для проведения ПЦР использовали
амплификаторы детектирующий ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология»), iQ5
(Bio-RAD, США).
Материалом для молекулярно-биологического исследования являлись
клеточные образцы эпителия шейки матки. Исследование проводилось методом
ПЦР в режиме «реального времени» на анализаторе «iQ5» Cycler («Bio-RAD»,
США)
комплекта
тест-ситем
ФГУН
«ЦНИИ
эпидемиологии»
Роспотребнадзора. ВПЧ-тестирование включало в себя ВПЧ-скрининг на
вирусы высокого канцерогенного риска, генотипирование и определение
вирусной нагрузки.
ВПЧ-скрининг осуществлялся с применением набора реагентов для
выявления ДНК ВПЧ ВКР 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 56, 58, 59, 60, 70
типов с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном
геле «Ампли Сенс ВПЧ ВКР скрин-EPh».
Для выявления и количественного определения ДНК вируса папилломы
человека использовали тест-систему «Ампли Сенс ВПЧ ВКР генотип-Fl»,
7
«Ампли Сенс ВПЧ ВКР скринтитр-Fl» для гибридизационно-флюоресцентной
детекции.
Исследование влагалищного биоценоза проводилось из биоматериала с
заднебоковой
поверхности
стенки
влагалища
методом
ПЦР-РВ
с
использованием реагентов Фемофлор (ООО «НПО ДНК-Технология») в
детектирующем амплификаторе ДТ-96 согласно инструкции производителя
(ООО «НПО ДНК-Технология»).
Определение онкобелка Е7 ВПЧ 16 и 18 типов в образцах цервикальной
слизи осуществляли с применением набора реагентов для иммуноферментного
выявления – «Е7-ВПЧ-16/18-Диагност» производства ОАО «Биомед» им. И.И.
Мечникова, Россия, регистрационное удостоверение №ФСР 2010/07581 от 24
мая 2010 года.
Иммуноцитохимическое определение онкомаркера р16ink4a выполнялось
при помощи наборов Cintec компании «Биолайн», являющейся эксклюзивным
дистрибьютором компании МТМ laboratories AG (Германия). Оценивалась
ядерная реакция и ядерная реакция одновременно с цитоплазматической.
Для оценки иммунологических
показателей у испытуемых женщин
исследовались кровь и цервикальная слизь.
Количественное исследование цитокина TGFβ
проводилось в образцах
цервикальной слизи иммуноферментным методом с использованием тестсистемы DRG-ELISA- TGFβ1, Германия.
Количественное исследование лактоферрина проводилось в образцах
сыворотки крови методом иммуноферментного анализа с использованием тестсистем ЗАО «Вектор-Бест», Россия.
Для статистической обработки использовался параметрический критерий
Стьюдента
для
выборок
с
нормальным
распределением
и
метод
множественного сравнения с применением критерия Ньюмена-Кейлса. Для
определения взаимосвязей между рассматриваемыми параметрами применялся
коэффициент
ранговой
корреляции
Спирмена.
8
Для
построения
прогностических
моделей
был
использован
регрессионный
анализ.
Статистическая обработка проводилась с помощью программы Statistica.
Результаты и их обсуждение
По частоте выявления во всех группах обследуемых женщин (кроме
контрольной) лидирует ВПЧ 16 типа. В группе женщин с легкими дисплазиями
(LSIL) ВПЧ 16 типа обнаружен в 30% случаев, с тяжелыми дисплазиями (HSIL)
– 85%, с цервицитами - 52,5% (рис. 1). Частота встречаемости ВПЧ 16 типа в
группе легкие дисплазии (LSIL) статистически значимо ниже, чем в группах
тяжелые дисплазии (HSIL) и группе цервицитов, а в группе цервицитов
статистически значимо ниже, чем в группе тяжелых дисплазий (HSIL)
(р<0,0001 при всех указанных вариантах сравнений).
Рис.1 - Частота встречаемости ВПЧ 16 типа в группах испытуемых
женщин
к – группа контроля; 1- легкие дисплазии (LSIL); 2 – тяжелые дисплазии
(HSIL); 3 – цервициты
Заслуживает внимания высокий процент выявления ВПЧ высокого
канцерогенного риска в группе цервицитов, так как присутствие вируса в
условиях хронического воспаления вызывает генетическую нестабильность и
увеличивает вероятность возникновения трансформированных клеток, что
9
согласуется с данными литературы (Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004).
Наибольший процент выявления ВПЧ 16 типа наблюдается в группе тяжелых
дисплазий (HSIL), что доказывает участие вируса в формировании тяжелой
пролиферативной патологии шейки матки.
Тяжелые дисплазии (HSIL) и цервициты характеризуются высокими
показателями инфицирования несколькими типами ВПЧ (рис. 2). В группе
тяжелых дисплазий 87,5% случаев представлены мультиинфекцией, в группе
цервицитов – 86,7%. В группе легких дисплазий (LSIL) показатель
мультиинфицирования составляет 50%.
Рис.2 - Частота встречаемости мультиинфицирования
папилломы человека в группах испытуемых женщин
вирусом
к – группа контроля; 1- легкие дисплазии (LSIL); 2-тяжелые дисплазии (HSIL);
3-цервициты
Группы тяжелых дисплазий (HSIL) и цервицитов статистически значимо
отличаются по показателю мультиинфицирования от группы легких дисплазий
(LSIL) (р<0,0001 и в том, и в другом случае). При цервикальных неоплазиях
мультиинфекция характеризует степень тяжести цервикального поражения,
однако и цервициты по этому показателю приближены к тяжелым дисплазиям,
10
что позволяет отнести их к группе риска по возникновению злокачественной
трансформации шейки матки.
Вирусная нагрузка определялась во всех группах испытуемых женщин
(табл.1). За исключением группы контроля, везде средний показатель вирусной
нагрузки превысил клинически значимый порог, который составляет 3 lg ГЭ на
10^5.
Таблица 1.
Величина вирусной нагрузки в группах испытуемых женщин, логарифм
геномов ВПЧ на 100 тысяч клеток человека
Контрольная
группа
Группа 2
тяжелые
дисплазии
(HSIL)
Группа 1 легкие
дисплазии (LSIL)
Группа 3
цервициты
0,00
4,14 *
4,68 *
3,92 *
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы
При сопоставлении исследуемых групп между собой статистически
значимые отличия не обнаружены (р1,2=0,124; р1,3=0,630; р2,3=0,108). Этот
показатель не является
диагностически
значимым
критерием отличия
воспалительных и неопластических заболеваний шейки матки. В дальнейшем
при анализе вирусной нагрузки мы использовали
объединенную группу, в
которую вошли группа легких дисплазий (LSIL), тяжелых дисплазий (HSIL) и
цервицитов.
Высокоонкогенные типы вируса папилломы человека характеризуются
большим количественным выражением, чем низкоонкогенные независимо от
воспалительного или неопластического характера патологического процесса
шейки матки, причем степень цервикальной неоплазии в данном случае не
играет роли (рис. 3). В условиях длительного времени пребывания вируса в
организме
человека
множественная
экспрессия
онкогенов
может
способствовать увеличению вероятности возникновения и прогрессирования
неопластических процессов шейки матки.
11
5,2
5,0
4,8
Вирусная нагрузка
4,6
4,4
4,2
4,0
3,8
3,6
3,4
3,2
3,0
1
2
Группа ис пытуемых
Рис.3 – Связь между показателем вирусной нагрузки и присутствием
вируса папилломы человека 16, 18 типа в объединенной группе
испытуемых женщин
1 - Отсутствие вируса папилломы человека 16,18 типа
2 - Наличие вируса
Установлено, что мультиинфицирование при папилломавирусной инфекции
характеризует
степень
тяжести
цервикального
поражения,
поэтому
мультиинфекция в сочетании с высокой вирусной нагрузкой служит
неблагоприятным прогностическим признаком при ВПЧ-ассоциированном
поражении шейки матки (рис. 4).
12
Рис.4 - Связь между показателем вирусной нагрузки и наличием монои мультиинфицирования вирусом папилломы человека в объединенной
группе испытуемых женщин
1- моноинфекция; 2- мультиинфекция
В ходе исследования проведен анализ экспрессии биомаркеров Е7 и р16
ВПЧ 16/18 типов. Позитивный тест на наличие Е7 отмечен во всех группах,
исключая группу контроля (здоровые), где наблюдались негативные результаты
(рис. 5).
13
Рис.5 – Частота встречаемости белка Е7 в группах испытуемых
женщин
к – группа контроля; 1 - легкие дисплазии (LSIL); 2 - тяжелые дисплазии
(HSIL); 3 – цервициты
Число позитивных тестов на наличие Е7 составляет в группах легких
дисплазий (LSIL) 27,5% и цервицитов 30%, что статистически значимо ниже по
сравнению с группой тяжелых дисплазий (HSIL), где этот показатель 82,5%
(р<0,0001). При сравнении групп легкие дисплазии (LSIL) и цервициты
достоверно значимые отличия не выявлены (р>0,05). В группе тяжелых
дисплазий
(HSIL)
характеризует
процент
интегративную
выявления
фазу
онкопротеина
папилломавирусной
Е7
высок,
что
инфекции.
Это
впоследствии может привести к злокачественному характеру инфекционного
процесса. Сходный в группах легких дисплазий (LSIL) и цервицитов процент
интегративной формы заболевания позволяет отнести цервициты к группе
риска по возникновению цервикальных неоплазий.
Исследование зависимости уровня вирусной нагрузки от наличия или
отсутствия онкопротеина Е7 проводилось в совокупности всех результатов
исследования (рис.6).
14
- Точка посреди прямоугольника - среднее значение каждой выборки
- Границы прямоугольника – среднее ± стандартная ошибка
- Минимум и максимум - среднее ± 1,96*стандартную ошибку
Рис.6 – Связь уровня вирусной нагрузки и наличия онкобелка Е7
вируса папилломы человека в объединенной группе испытуемых женщин
1 – отсутствие онкобелка Е7; 2 – наличие онкобелка Е7
Установлено, что при наличии белка Е7 независимо от характера течения
папилломавирусной инфекции вирусная нагрузка статистически значимо выше
по критерию Стьюдента (р=0,00001). Высокое количественное выражение ВПЧ
на
фоне
присутствия
прогностическим
онкопротеина
критерием,
что
Е7
является
может
неблагоприятным
способствовать
развитию
неопластических процессов шейки матки.
В ходе иммуноцитохимического определения онкопротеина р16 в группе
тяжелых дисплазий (HSIL) позитивный результат отмечен в 85% случаев, что
статистически достоверно отличается от групп контроля (здоровые), легких
дисплазий (LSIL) и группы цервициты (р<0,00001), где все результаты
негативные (табл. 2).
Таблица 2.
Частота выявления онкомаркера р16 в группах испытуемых женщин.
Контрольная
группа
Группа 1 легкие
дисплазии (LSIL)
Группа 2
тяжелые
дисплазии
(HSIL)
0%
0%
85%*
Группа 3
цервициты
0%
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы, групп цервициты
и легкие дисплазии.
Достоверно доказано, что экспрессия р16 связана с тяжелыми дисплазиями
(HSIL) и зависит от степени тяжести цервикального интраэпителиального
поражения.
15
В работе выполнена оценка состояния биоценоза урогенитального тракта от
состояния абсолютного нормоценоза до выраженного дисбиоза (рис.7).
Рис.7 – Частота встречаемости дисбиозов в группах испытуемых женщин
к - группа контроля; 1 – группа легких дисплазий (LSIL); 2 - группа тяжелых
дисплазий (HSIL); 3 - группа цервицитов
В контрольной группе состояние нормоценоз отмечено в 100 % случаев. В
группах легкие дисплазии (LSIL) и цервициты дисбиозы составляют 52,5% и
50% соответственно. Их частота в группе тяжелых дисплазий (HSIL) — 85%,
что статистически значимо выше чем в группах легких дисплазий (LSIL),
цервицитов и в группе здоровых женщин (р=0,011; р=0,008 и р<0,0001
соответственно). Нарушение баланса влагалищной микрофлоры, накопление
продуктов жизнедеятельности патогенных микроорганизмов приводит к
нарушению функциональной активности эпителиоцитов, неадекватной реакции
местного иммунного ответа. На этом фоне создаются благоприятные условия
для инфицирования эпителиальных клеток вирусом папилломы человека и
дальнейшего развития инфекции.
При высокой степени интраэпителиального поражения наблюдается
наибольший процент дисбиотических состояний, что увеличивает риск
16
прогрессии цервикальной неоплазии. Хроническое воспаление способствует
возникновению дистрофических процессов в эпителиоцитах, нарушению
дифференцировки клеток в ходе созревания, изменению их функций.
Сочетание воспаления и дисбиоза может привести к возникновению
благоприятных условий для развития неопластической патологии шейки матки.
Сходная картина нарушений микробиоты при цервицитах и легких
дисплазиях (LSIL), наличие воспаления цервикального канала позволяет
отнести цервициты к группе заболеваний с большой долей вероятности
предшествующих интраэпителиальному поражению шейки матки.
Наряду с вышеперечисленными факторами возникновение и развитие
инфекционного процесса определяется адекватностью иммунного ответа
организма, в первую очередь локального иммунного ответа.
В качестве исследуемых агентов были выбраны трансформирующий фактор
роста (TGFβ) и острофазовый белок лактоферрин (ЛФ).
TGFβ является как супрессором, так и промоутером опухолевого процесса:
он участвует в остановке клеточного цикла в пораженной вирусом клетке и
индуцирует ее апоптоз, одновременно блокирует выработку некоторых
провоспалительных
цитокинов,
способствует
нераспознаванию
вируса
папилломы человека иммунной системой организма-хозяина на местном
уровне. Лактоферрин, препятствуя выработке цитокинов, активирующих
воспаление, тормозит весь воспалительный процесс, что способствует
восстановлению
нормального
функционирования
тканей.
Лактоферрин
способствует созреванию Т- и В-лимфоцитов, тем самым повышая активность
иммунной системы.
Показатель TGFβ в цервикальной слизи в группе тяжелых дисплазий (HSIL)
в 7 и более раз превышает аналогичные в группе легких дисплазий (LSIL),
цервицитов и здоровых женщин (р3,1<0,0001; р3,2<0,0001; p3,к<0,0001).
Статистически
значимые отличия между группами легких
цервицитов и группой контроля не выявлены (р>0,05) (табл. 3).
17
дисплазий,
Таблица 3.
Концентрация трансформирующего фактора роста TGFβ в группах
испытуемых женщин, пг/мл
Контрольная
группа
Группа 1
легкие дисплазии
(LSIL)
Группа 2
тяжелые
дисплазии
(HSIL)
Группа 3
цервициты
101,1±20,7
210,0±33,2
1560,8±246,8*
151,2±27,6
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы
Увеличение
локальной
продукции
в
цервикальной
слизи
трансформирующего фактора роста (TGFβ) следует считать аналитическим
критерием тяжести поражения при эпителиальных дисплазиях.
Лактоферрин определялся в сыворотке крови испытуемых женщин (табл.4).
Таблица 4.
Концентрация лактоферрина в группах испытуемых женщин, нг/мл
Контрольная
группа
844,0±59,3
Группа 1
легкие дисплазии
Группа 2
тяжелые
дисплазии
Группа 3
цервициты
3142,3±496,8**
2462,8±389,4*
3543,3±646,9**
Примечание:
* - статистически значимые отличия от контрольной группы
** - статистически значимые отличия от контрольной группы и группы
тяжелых дисплазий
Самые высокие показатели ЛФ отмечены в группе цервицитов, что
статистически значимо отличается от групп контроля, тяжелых дисплазий
(HSIL) (p3,k<0,0001; p3,2<0,003). Для группы легких дисплазий (LSIL) эти
отличия не значимы (p=0,324). Воспалительный процесс является фактором,
позволяющим отнести цервициты к группе риска по возникновению
цервикальных неоплазий, а также фактором, способствующим дальнейшему
прогрессированию
уже
имеющейся
цервикальной
18
патологии,
о
чем
свидетельствуют сходные показатели ЛФ в группах легких дисплазий и
цервицитов.
Для поиска наилучших прогностических параметров был использован метод
регрессионного
анализа,
который
позволил
выделить
переменные
последовательно одну за другой, начиная с наиболее значимой, отличающей
хронический цервицит от предраковых состояний. На первом этапе было
включено значение трансформирующего фактора роста (TGF-b), на втором наличие вируса папилломы человека 16, 18 типа, затем — наличие онкобелка
Е7, вирусная нагрузка, значение лактоферрина, дисбиотические состояния и
мультиинфицирование. Было выявлено, что наибольшую роль в развитии
дисплазии играет такой фактор, как величина трансформирующего фактора
роста (TGF-b), далее идут наличие вируса папилломы человека 16, 18 типа и
наличие онкобелка Е7. Остальные параметры не значимо отличают цервициты
от неопластических состояний.
При расчете корреляционной связи была установлена прямая зависимость
между величиной вирусной нагрузки, состоянием микроценоза влагалища,
мультиинфицированием
несколькими
типами
вируса,
маркерами
интегративной формы инфекции. Значимая корреляционная связь отмечена
между онкомаркерами Е7 и р16 (р<0,05). Онкобелок Е7 свидетельствует о
предпосылке развития процесса малигнизации, а онкобелок р16 уже отражает
наличие злокачественного процесса. Выявлена высокая значимая корреляция
между величиной вирусной нагрузки и наличием высокоонкогенных типов
вируса папилломы человека 16,18 типа (p<0,01). Высокое количество вирусных
частиц обеспечивает вирусам папилломы человека 16,18 типа большую
возможность
поражения
клеток
многослойного
плоского
эпителия
с
последующими морфологическими изменениями ткани. Между состоянием
дисбиоза влагалища и присутствием в цервикальных пробах онкобелка Е7
выявлена значимая корреляция (р<0,05). Дисбиотические процессы могут быть
показателем
степени
выраженности
поражения
папилломавирусной инфекции.
19
шейки
матки
при
ВЫВОДЫ
1.
По качественным и количественным характеристикам папилломавирусной
инфекции группа цервицитов приближена к группам легких и тяжелых
дисплазий, что позволяет включить цервициты вирусной этиологии в
группу риска возникновения неопластических клеточных изменений.
Онкопротеин р16 вируса папилломы человека 16,18 типа определяется в
группе
тяжелых
выраженности
дисплазий
(HSIL),
неопластического
что
процесса
характеризует
и
степень
может
служить
диагностическим признаком тяжести цервикального поражения.
2. Экспрессия онкопротеина Е7 вируса папилломы человека 16,18 типа в
цервикальных
пробах
служит
маркером
существования
вируса
папилломы
интегративной
человека,
при
формы
которой
вирус
встраивается в геном клетки. Наличие онкопротеина Е7 свидетельствует о
высоком риске злокачественной трансформации эпителиоцитов,
но не
может считаться диагностическим признаком цервикальной неоплазии.
3. Высокие
показатели
трансформирующего
фактора
роста
TGFβ
в
цервикальной слизи при тяжелых дисплазиях (HSIL) обусловлены
локальной иммуносупрессией, что может служить критерием тяжести
поражения шейки матки. Высокие значения лактоферрина в сыворотке
крови при легких дисплазиях (LSIL) и цервицитах по сравнению с
тяжелыми дисплазиями (HSIL) будут означать активный иммунный ответ
организма.
4. Установлены
прямые
корреляционные
связи
между
наличием
онкопротеинов Е7 и р16; величиной вирусной нагрузки и присутствием
вируса
папилломы
человека
16,18
типов,
мультиинфицированием
различными типами вируса; дисбиотическими нарушения микробиоценоза
влагалища и наличием онкопротеина Е 7.
20
Практические рекомендации
Метод ПЦР используется для определения наличия вируса папилломы
человека, его типа, количества, состояния микробиоценоза. Типирование
позволяет выявить персистенцию вируса, что имеет решающее значение для
его
онкогенных
совокупности с
вариантов.
Методом
иммуноферментного
анализа
в
иммуноцитохимическим исследованием материала можно
определить формы существования вируса папилломы человека. Все эти методы
не
требуют
оперативного
вмешательства,
нетрудоемки
в
исполнении,
выполняются в короткие сроки.
Работы, опубликованные по теме диссертации
Издания, рекомендованные ВАК
1. Использование онкопротеина p16INK4a и ПЦР-анализа вирусов
папилломы человека в диагностике дисплазий и рака шейки матки //
Медицинский альманах. – 2010. - № 4 (3). – С. 143-145. (Соавт. Андосова Л.Д.,
Конторщикова К.Н., Блатова О.Л., Михалева О.В. и др., всего 6 человек).
2. Выявление вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска у
женщин репродуктивного возраста // Медицинский альманах. – 2010. - № 4 (3).
– С. 155-157. (Соавт. Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Блатова О.Л.,
Михалева О.В. и др., всего 6 человек).
3.
Характеристика
биоценозов
урогенитального
тракта
у
женщин
репродуктивного возраста с применением теста «Фемофлор» возраста //
Медицинский альманах. – 2010. - № 4 (3). – С. 177-179. (Соавт. Андосова Л.Д.,
Конторщикова К.Н.).
4. Анализ частоты выявления онкогенных типов вируса папилломы
человека у женщин с гинекологической патологией // Вестник дерматологии и
венерологии. – 2011. - № 1. - С. 66-68. (Соавт. Блатова О.Л., Конторщикова
К.Н., Андосова Л.Д., Михалева О.В.).
5.
Генодиагностика
папилломавирусной
инфекции
высокого
канцерогенного риска // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2011. - № 2.
21
- С. 13-15. (Соавт. Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Блатова О.Л., Михалева
О.В., и др., всего 7 человек).
6. Новый подход к исследованию биоценоза урогенитального такта у
женщин с инфекционно-воспалительными процессами репродуктивной сферы
// Уральский медицинский журнал. – 2011. - № 03 (81)’11. - С. 19-21. (Соавт.
Андосова Л.Д., Белов А.В., Михалева О.В).
7. Исследование биоценозов урогенитального тракта у женщин с
патологией шейки матки с использованием метода полимеразной цепной
реакции в реальном масштабе времени // Современные технологии в медицине.
– 2011. - № 4. - С. 113-116. (Соавт. Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н.,
Михалева О.В., Блатова О.Л. и др., всего 6 человек).
8. Показатели гуморального иммунитета при заболеваниях шейки матки
инфекционного генеза // Вестник новых медицинских технологий. - 2011. - №
4. - С. 175-177. (Соавт. Андосова Л.Д., Качалина О.В., Михалева О.В).
9. Использование технологии ПЦР-реальное время для выявления и
дифференциации вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска
// Клиническая лабораторная диагностика. – 2011. - № 7. - С. 42-43. (Соавт.
Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Блатова О.Л., Кузнецова И.А. и др., всего 7
человек).
10. Характеристика биоценозов урогенитального тракта у женщин с
заболеваниями шейки матки // Клиническая лабораторная диагностика. – 2011.
- № 9. - С. 42. (Соавт. Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Белов А.В.).
11. Изменение вагинальной микробиоты у женщин с заболеваниями шейки
матки // Казанский медицинский журнал. – 2012. - № 1. - Том XCIII. - С. 76-79.
(Соавт. Андосова Л.Д., Качалина О.В., Белов А.В.).
12. Генодиагностика папилломавирусной инфекции гениталий // Вестник
новых медицинских технологий. – 2012. - № 1. - С. 67-68. (Соавт. Андосова
Л.Д., Качалина О.В., Белов А.В.).
13. Выявление онкогенных типов вируса папилломы человека у женщин с
патологией шейки матки // Вестник новых медицинских технологий.
22
Электронное издание. – 2012. - № 1 (свидетельство о регистрации средства
массовой
информации
Эл
№ФС
77-33559
от
18.09.2008г.)
http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/index.html. (Соавт. Андосова Л.Д., Качалина
О.В., Михалева О.В., Гонова Е.С.).
14. Генодиагностика папилломавирусной инфекции у женщин с различной
патологией репродуктивной системы // Медицинский альманах. – 2012. - № 2
(21). – С. 71-73. (Соавт. Андосова Л.Д., Качалина О.В., Гонова Е.С.).
15. Характеристика биоценозов урогенитального тракта у женщин
репродуктивного возраста // Клиническая лабораторная диагностика. – 2013. № 1. - С. 51-53. (Соавт. Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Качалина О.В.,
Белов А.В., Гонова Е.С.).
Тезисы по ключевым моментам работы
1. Генодиагностика папилломавирусной инфекции гениталий (тезисы) //
Материалы XII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - Москва,
2011. – С. 256-257. (Соавт. Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Качалина О.В.,
Белов А.В.).
2. Исследование биоценозов урогенитального тракта у женщин с
патологией шейки матки (тезисы) // Материалы всероссийского конгресса с
международным участием «Новые технологии в диагностике и лечении
гинекологических заболеваний». - Москва, 2011. – С. 47-48. (Соавт. Андосова
Л.Д., Белов А.В.).
3. Использование онкопротеина p16ink4a в диагностике дисплазий и рака
шейки матки (тезисы) // Материалы XIII Всероссийского научного форума
«Мать и дитя». - Москва, 2012. - С. 218-219. (Андосова Л.Д., Конторщикова
К.Н., Качалина О.В., Качалина Т.С.и др., всего 7 человек).
4.
Экспрессия
онкобелка
Е7
у
пациенток
с
урогенитальной
папилломавирусной инфекцией (тезисы) // Материалы XIII Всероссийского
научного форума «Мать и дитя». -
Москва, 2012. - С. 269-270. (Соавт.
23
Качалина О.В., Качалина Т.С., Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н. и др., всего 7
человек).
Перечень сокращений
ГЭ – геномный эквивалент
ВКР – высокий канцерогенный риск
ВПЧ – вирус папилломы человека
ЛФ – лактоферрин
ПЦР – полимеразная цепная реакция
HSIL - high grade squamous intraepithelial lesions (плоскоклеточное
интраэпителиальное поражение высокой степени)
LSIL – low grade squamous intraepithelial lesions (плоскоклеточное
интраэпителиальное поражение низкой степени)
TGFβ – трансформирующий фактор роста бэта
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа