close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Разработка технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской (Pelargonium grandiflorum (ANDREWS) WILLD) в культуре микроспор

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
КОРЧАГИН
Антон Владимирович
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ
УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ ПЕЛАРГОНИИ КОРОЛЕВСКОЙ
(PELARGONIUM GRANDIFLORUM (ANDREWS) WILLD.)
В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР
06.01.05 - селекция и семеноводство
сельскохозяйственных растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва – 2015
Работа выполнена в Федеральном
научном
государственном
бюджетном
учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт
овощеводства»
Научный руководитель:
Поляков Алексей Васильевич
доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Соловьев Александр Александрович
доктор биологических наук, профессор,
ФГБОУ ВО Российский государственный
аграрный университет – МСХА имени К.А.
Тимирязева,
декан факультета агрономии и биотехнологии,
заведующий
кафедрой
генетики,
биотехнологии, селекции и семеноводства
Пугачева Галина Михайловна
кандидат сельскохозяйственных наук,
ФГБНУ
«Всероссийский
научноисследовательский
институт
садоводства
имени И.В. Мичурина»
Ведущая организация:
ФГБНУ
«Всероссийский
научноисследовательский институт селекции и
семеноводства овощных культур»
Защита диссертации состоится «____» __________ 2015 года в ____ часов на
заседании диссертационного совета Д 006.022.01 при Всероссийском научноисследовательском институте овощеводства по адресу: 140153 Московская
обл., Раменский район, д. Верея, строение 500, ВНИИО.
Факс (496) 462-43-64
E-mail: vniio@yandex.ru, сайт: www.vniioh.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научноисследовательского института овощеводства.
Автореферат разослан «____» сентября 2015 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
Девочкина Наталия Леонидовна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Представители рода Pelargonium L’Her относятся к
одной из самых распространенных цветочных культур. Отсутствие проблем с
размножением и нетребовательность к условиям выращивания достаточно
быстро сделали ее одним из самых любимых комнатных растений. Сегодня
тысячи высокодекоративных сортов пеларгоний (зональных, крупноцветковых,
плющелистных, душистых, уникумов, и ангелов) используются в озеленении
городов всего мира (Гутиева Н.М., 2011).
Пеларгония королевская (Pelargonium grandiflorum (Andrews) Willd.)
является важнейшей горшечной цветочной культурой в России, на нее
приходится более 15 % рынка декоративных растений (Широкова Н.В., 2006). В
этот вид растений входят самые эффектные и изысканные сорта, которые
обладают мощным, но не обязательно высоким «кустом» с прямыми, ровными
побегами, крупными зазубренными складчатыми листьями и огромными
цветками, достигающими размера до 7 см. Окраска яркая, двухцветная или
пятнистая (Эсер М., 2003). Пеларгония королевская представлена в основном
сортами немецкой и голландской селекции (Гутиева Н.М., 2014).
В нашей стране опубликовано несколько монографий (Эсер М., 2003;
Клименко З.К., 2003; Широкова Н.В., 2006) по культуре представителей рода
Pelargonium. В основном в них затрагиваются вопросы ассортимента и
агротехнических приемов выращивания различных групп пеларгоний в
условиях закрытого грунта (Гутиева Н.М., 2010). В последние годы появились
публикации (Гутиева Р.М., 2010; 2011; 2014) о начале селекционных работ по
созданию гибридов пеларгонии королевской для открытого грунта с целью
озеленения садов и парков Черноморского побережья. Таким образом,
отсутствие сортов отечественной селекции подтверждает актуальность
селекционных исследований данной культуры.
Для получения новых конкурентоспособных отечественных сортов с
высокими декоративными качествами, а также устойчивыми к болезням и
вредителям необходимо создание нового исходного материала. Использование
биотехнологических подходов в селекции пеларгонии королевской позволит
значительно уменьшить затраты времени и средств на выведение новых сортов
и изменить акценты в селекционном процессе.
К наиболее перспективным методам ускорения селекционного процесса
относится метод гаплоидии, интерес к которому все более возрастает в
последнее время, когда с особой остротой встал вопрос сокращения сроков
выведения новых сортов и гибридов, наиболее полно отвечающих
современным требованиям производства (ВанУнкан Н.Ю., 2014). Применение
гаплоидов
в селекции позволяет быстрее найти нужную комбинацию,
обнаружить рецессивные мутации, и как следствие выявить ценные признаки,
создавать стабильные гомозиготные линии (Касаева К.А., 1988), для получения
которых традиционными методами гибридизации и отбора требуется
длительный инбридинг (Lespinasse Y., 1980). С помощью культуры пыльников
и микроспор (андрогенез in vitro) от гибридных растений первого поколения,
можно получать гомозиготные растения в первой генерации и, таким образом,
3
сократить селекционный процесс на 3-4 генерации, необходимые для обычной
схемы селекции (ВанУнкан Н.Ю., 2014). Мутации, возникающие на уровне
гаплоидов - быстродоступны для отбора и диагностики (Поляков А.В. и др.,
2007). Полученные удвоенные гаплоиды можно использовать непосредственно
для создания сортов, либо в качестве исходного материала для последующей
селекции путем вовлечения их в скрещивания.
Однако, несмотря на перспективы метода гаплоидии, использование его
на представителях рода Pelargonium достаточно ограничено. Работы по
культуре пыльников пеларгонии проводятся в Германии, Польше, Китае,
Японии и других странах, но достигнутые результаты весьма ограничены:
только у отдельных генотипов получены с небольшой частотой андрогенные
новообразования – каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и
побеги-регенеранты, среди которых обнаружены удвоенные гаплоиды (AboElNil M.M., 1976; 1983; Satoru Tokumasu, 1979; Becker Zens R., 1996; Tuleja М.,
2014). Это связано с тем, что в настоящее время не достаточно эффективно
разработана система получения гаплоидов при культивировании пыльников и
микроспор, не решены проблемы состава питательных сред и регуляторов
роста для данной культуры, регенерации и других факторов, влияющих на
процесс культивирования пыльников и микроспор in vitro (AboEl-Nil M.
M.,1976; 1983; Satoru Tokumasu, 1979; Becker Zens R., 1996; Tuleja М., 2014;
Mithila J., 2001; Wojtania A., 2004; Acharjee S., 2012). Недостаточно изученными
являются вопросы, связанные с индукцией первичных андрогенных
образований (каллусов, эмбриоидов), а также прямого и непрямого
эмбриоидогенеза (Aboel-Nil M.M., 1973; Bennici A., 1968; 1974; Li M., 2005;
Tuleja М., 2014).
Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований является
разработка технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии
королевской в культуре микроспор для последующего использования в
селекционном процессе.
Задачи исследований:
1. Выявить сорта пеларгонии королевской, наиболее подходящие для
использования в культуре микроспор.
2. Изучить факторы, влияющие на культивирование микроспор in vitro и
получение удвоенных гаплоидов.
3. Изучить особенности морфогенеза в культуре микроспор на питательных
средах различного состава и установить оптимальные концентрации и
соотношения регуляторов роста для индукции этого процесса.
4. Получить и оценить растения-регенеранты.
5. Разработать лабораторный технологический регламент получения
удвоенных гаплоидов в культуре микроспор пеларгонии королевской.
Научная новизна работы. Впервые в России разработана технология,
позволяющая получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды пеларгонии
королевской в культуре микроспор. В результате проведённых исследований
оптимизированы факторы, влияющие на культивирование микроспор
пеларгонии королевской in vitro:
4
 установлена оптимальная длина бутона пеларгонии королевской – 10 мм,
содержащая
невакуолизированные
микроспоры,
обладающие
морфогенетической активностью;
 установлено, что для индукции андрогенеза в культуре пыльников и
микроспор пеларгонии королевской не требуется воздействия шоковыми
температурами, что позволяет исключить из технологии предварительное
выдерживания пыльников при шоковых температурах;
 определена оптимальная питательная среда MS, содержащая сахарозу —
120 г/л, аскорбиновую кислоту — 100 мг/л, агар – 5 г/л для
эмбриоидогенеза микроспор пеларгонии королевской in vitro;
 установлены оптимальные концентрации и соотношения регуляторов
роста для индукции прямого эмбриоидогенеза [0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л
BAP]; [0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [4 мг/л BAP + 0,3 мг/л НУК] и
непрямого эмбриоидогенеза [2 мг/л BAP + 0,1 мг/л НУК].
Проведена оценка с помощью RAPD-анализа полученных растенийрегенерантов, в результате которой установлена их генетическая
гетерогенность в сравнении с исходными сортами. С помощью
цитологического анализа доказана гаплоидная природа растений-регенерантов
пеларгонии королевской, полученных в культуре микроспор. Получены
гаплоиды и удвоенные гаплоиды.
Практическая ценность.
1. Разработана технология получения удвоенных гаплоидов пеларгонии
королевской, которая может быть применена и к другим представителям
рода Pelargonium.
2. Элементы технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии
королевской в части получения маточных растений и клонального
микроразмножения ценного селекционного материала используются в
работе тепличного комбината ООО «ПО Егорьевское».
3. Получены удвоенные гаплоиды пеларгонии королевской сортов Лотос,
Шоко, Петтикот, которые могут быть использованы в селекционном
процессе данной культуры.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования
выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны.
Все
выводы
и
предложения
подтверждены
экспериментальными
исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по
диссертации доложены на VIII Международном симпозиуме «Фенольные
соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (г. Москва, 2-5 октября
2012 г.); XI Международной научно-практической конференции «Становление
современной науки -2015» (г. Прага. Чехия, 20-30 сентября 2015 г.).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Определение
оптимальной
длины
бутона,
содержащую
невакуолизированные микроспоры;
5
2. обоснование необходимости предварительного выдерживания пыльников
при пониженных и повышенных температурах;
3. разработка состава питательных сред и оптимальных концентрации и
соотношения регуляторов роста для индукции прямого и непрямого
эмбриоидо- и каллусогенеза;
4. сорта
пеларгонии
королевской,
характеризующиеся
высоким
андрогенным потенциалом in vitro;
5. растения-регенеранты (R1) пеларгонии королевской, полученные на
основе
удвоенных
гаплоидов,
характеризующиеся
высокой
выравненностью по декоративным и хозяйственно-ценным признакам.
Публикации результатов исследований. По материалам исследований
опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 работы в изданиях,
рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на
170 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 23
рисунками и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, предложений
для использования в селекционной практике, приложения и списка
использованных источников, содержащего 269 наименований, в том числе 168
иностранных авторов.
УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проведены в отделе биотехнологии ФГБНУ ВНИИО
(Московская область, Раменский район, д. Верея) и в тепличном комбинате
ООО «ПО Егорьевское» (Московская область, Егорьевский район, поселок
Новый, Промзона, 9) в период с 2009 по 2011 гг. Материалом исследований
служили пыльники и микроспоры пеларгонии королевской (P. grandiflorum)
сортов немецкой селекции: Лотос, Априкот, Петтикот, Шоко (Рисунок 1). Это
хорошо зарекомендовавшие себя коммерческие сорта, активно применяемые в
декоративном садоводстве и имеющие схожие биологические и
морфологические признаки. Предметом исследований служили
бутоны,
пыльники, микроспоры, эмбриоиды, растения – регенеранты пеларгонии
королевской.
6
Лотос
Априкот
Петтикот
Шоко
Рисунок 1 – Исходные сорта пеларгонии королевской
Лабораторные
исследования
проводили
в
соответствии
с
«Методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции
растений» (Бутенко Р. Г., 1964; 1999). Приготовление питательных сред,
введение в культуру и пассирование осуществлялось с применением
традиционных методик, принятых в работах по культуре тканей и органов
(Калинин Ф. Л., 1980; Поляков А.В., Зонтиков Д.Н., 2007). В опытах
использовали модифицированные питательные среды, приготавливаемые на
основе среды MS (Murashige T., Skoog F., 1962), Гамборга В5 (Gamborg O.L.,
1968), NLN (Nitsch J.P., 1967; Lichter R., 1982), состав которых изменялся в
зависимости от этапа культивирования.
Исследования проводили на бутонах длиной 5-15 см, изолированных из
соцветий. Согласно схеме опыта предобработку бутонов проводили при
температуре +40С и +320С в течение 24 и 48 часов. В контроле бутоны
выдерживали при комнатной температуре (200С) в течение 1 суток. После
предобработки из бутонов выделяли пыльники по стандартной методике
(Домблидес Е.А., 2000; Зонтиков Д.Н., 2009). Плотность суспензии микроспор
при этом составляла 45 000-50 000 штук в одном мл питательной среды. Затем
суспензию микроспор помещали на среду МS, содержащую регуляторы роста в
концентрации BAP – 4 мг/л и NAA— 0,3 мг/л, а также сахарозу в концентрации
120 г/л и агар — 5 г/л (рН=5,8). Микроспоры первые двое суток выдерживали в
темноте, затем культивировали при температуре 250С, освещении 5000 – 6000
Люкс, фотопериоде 16 часов день, 8 ч. - ночь. Каждые 7 суток отмечали гибель
или дальнейшее развитие эксплантов.
Для получения фертильных соцветий растения-регенеранты пеларгонии
королевской обрабатывали в течение 7 дней 0,5%-ным колхицином в
сочетании с 4%-ным раствором диметилсульфоксида (ДМСО) путем
нанесения раствора на пазушные почки. Далее растительный материал
переносили в условия холодовой обработки (+40С) на 30 суток. По
истечении срока стратификации растения пересаживали в теплицу.
Цитологический анализ растений-регенерантов проводили путем
подсчета хромосом в корневых меристемах, а также количества хлоропластов в
замыкающих клетках устьиц (Практикум по цитологии и цитогенетике
растений, 2007).
Выделение растительной ДНК проводили по методике Edwards et al.
(1991). В работе использовали праймер Paw S16 семейства R 173: 5′ACCTCTGCGCTTGGAGGC-3′(ACCTCTGCGCTTGGAGGC), синтезированный
7
в ЗАО «Синтол» (Москва). Амплификацию проводили на амплификаторе
«Терцик» («ДНК-технология», Москва), используя следующий используя
следующий температурный профиль: начальная денатурация при 940С – 4
мин; затем 40 циклов, включающих денатурацию при 940С – 45 с, отжиг
праймеров в течение 45 с и элонгацию при 720С в течение 4 мин. Температуры
отжига Paw S16 – 560С. Продукты амплификации разделяли с помощь
электрофореза с помощью гель-документирующей видеосистемы «VitranFoto»
(ООО «Компания Биоком», Москва). Длину фрагментов ДНК определяли с
использованием маркеров молекулярной массы Gene RulerТМ 1кb DNA Ladder
(Fermentas, Латвия).
Оценку селекционного материала по декоративным и хозяйственноценным признакам проводили по общепринятым методикам для цветочных
культур (Былов В.Н., 1978; Зинина В.Ф., 1985; Методические рекомендации по
культуре декоративных пеларгоний, 1983). Всхожесть семян определяли
согласно ГОСТ 24933.2-81.
Математическая обработка данных проведена по общепринятым
методикам (Доспехов Б.А., 1979; Лакин Г.Ф., 1980; Литвинов С.С., 2011).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Разработка элементов технологии получения удвоенных гаплоидов
пеларгонии королевской (P. grandiflorum) в культуре микроспор
Оптимизация режимов стерилизации эксплантов для введения в
культуру in vitro. Установлено, что оптимальным режимом стерилизации
бутонов пеларгонии является использование гипохлорита кальция в
концентрации 1% при экспозиции 20 минут (2 раза по 10 мин), что позволяет
получить 39,5±9,8% и 42,3±9,7% стерильных морфогенных эксплантов в
культуре пыльников и культуре микроспор соответственно (Рисунок 2).
культура пыльников
В
внешняя инфекция
культура микроспор
внутренняя инфекция
80
70
70
60
50
40
50
43,7
39,5
40
30
48,6
42,3
30
20
20
11,8
10
0
морфогенные экспланты
66,3
60
53,8
48,6
неморфогенные
экспланты
17,6
16,1
10
2,5
0
морфогенные экспланты
инфицированные
экспланты
9,1
неморфогенные
экспланты
инфицированные
экспланты
Рисунок 2- Характеристика эксплантов пеларгонии королевской по
морфогенной активности после стерилизации 1% раствором гипохлорита
кальция в экспозиции 2 раза по 10 мин (20 минут) в культуре пыльников и
микроспор
Влияние температуры на эмбриоидогенез в культуре микроспор.
Предобработка бутонов, пыльников и микроспор оказывает существенное
8
влияние на переключение развития микроспор с гаметофитного пути на
спорофитный. Выдерживание цветочных бутонов в условиях высоких или
низких температур, изменяет метаболические процессы в пыльцевых зернах и
направление андрогенеза. Для многих видов растений наибольший выход
эмбриоидов, образующихся из микроспор, был получен из пыльников, которые
перед культивированием выдерживали при низкой положительной температуре
(Беккужина, С.С., 2014; Нуржанова А.А., 2013; Размахин, Е. П., 2004; Тюкавин,
Г. Б., 2006; Шмыкова, Н.А., 2015). На примерах рапса (Segui-Simarro J.M., 2003;
Cordewener J.H.G., 1995), перца (Ли И., 2009; Barany I., 2001), табака (Zarsky V.,
1995), рапса (Грибова Т.Н., Князев А.Н., 2012; Tsuwamoto R., 2007) и других
растений (Ouyan g J.W., 1987) отмечено индуцирование образования
эмбриогенных структур при предобработке повышенными температурами.
Анализ частоты образования различных андрогенетических структур
показал, что для индукции андрогенеза в культуре пыльников пеларгонии
королевской не требовалось воздействия шоковыми температурами. У
генотипов Шоко и Лотос спорофитное развитие микроспор происходило только
в пыльниках свежесрезанных бутонов, не подвергавшихся хранению при
пониженных и повышенных положительных температурах (частота
соответственно 2,96% и 7,8 %) (Таблица 1). При этом, цитологические события
выявили различные стадии спорофитного развития микроспор, характерные для
пыльников других культур, подвергающихся стрессовому воздействию.
Таблица 1 – Влияние температуры на эмбриоидогенез пеларгонии королевской
в культуре микроспор (n≈50000)
Вид
обработки
Без обработки
Режим
Сорт
Количество эмбриоидов
шт.
%±Sp
Шоко
23,1± 0,5
0,043±0,0012
Общая
частота
новообразов
аний, %
2,96*
Лотос
24,0± 0,4
0,040±0,0010
7,8*
Априкот
Шоко
Лотос
Априкот
Шоко
Лотос
Априкот
Априкот
Лотос
Априкот
Априкот
Лотос
Априкот
24,5± 0,4
19,2± 0,5
19,8± 0,6
20,2± 0,6
22,3± 0,6
24,2± 0,6
26,3± 0,6
31,0± 0,7
32,6± 0,7
30,6± 0,7
24,1± 0,6
26,2± 0,6
25,3± 0,6
0,041±0,0010
0,043±0,0012
0,043±0,0010
0,044±0,0010
0,045±0,0010
0,048±0,0012
0,050±0,0012
0,074 ± 0,0014
0,075 ± 0,0014
0,064 ± 0,0014
0,047±0,0013
0,049±0,0013
0,048±0,0013
1,75
0,23
0,15
0,26
0,23
0,15
0,26
1,29
1,56
1,59
2,13
1,55
2,30
0,56
Н.у.
1 сутки,
+40С
Холодовая
2 суток,
+40С
1 сутки,
+320С
Тепловая
2 суток,
+320С
НСР05
* - различия существенны при p0.05
9
Полученные нами данные по культивированию микроспор и пыльников
пеларгонии королевской не подтвердили точку зрения о роли пониженных и
повышенных положительных температур как триггера спорофитного развития
микроспор. Видимо, удаление бутонов с донорного растения уже является
стрессом, который в сочетании с культивированием пыльников и микроспор в
in vitro способствует переключению с гаметофитного на спорофитный путь
развития.
Таким образом, для индукции андрогенеза в культуре пыльников и
микроспор пеларгонии королевской не требуется воздействия шоковыми
температурами. За счет исключения этапа предварительного воздействия
стрессовыми температурами процедура культивирования пыльников и
микроспор упрощается.
Определение стадии развития микроспоры в зависимости от длины
бутона. Развитие гаплоидов in vitro в значительной степени зависит от стадии
развития микроспор в момент их введения в культуру in vitro (Круглова Н.Н.,
2001; Чуйкина А.Ю., 2007; Шмыкова Н.А., 2015). Согласно данных литературы
для P. crispum (Tokumasu S., 1976) и P. hortorum Bailey (Aboel-Nil M.M., 1973,
1976) нормальный рост микроспор был отмечен при инокуляции их на ранних
стадиях развития (тетрады и одноядерная микроспора).
Для исследования распределения микроспор пеларгонии королевской,
находящихся в бутонах разного размера, было взято с нескольких соцветий
одного сорта по 10 бутонов размером от 5 до 15 мм. Изучение
проводилось на сортах Шоко и Петтикот. Пыльники помещали с момента
инокуляции на питательную среду и через каждые 3 суток в течение 30 суток
проводили скрининг стадий развития микроспор.
Исследования показали, что в бутонах длиной 5 мм наблюдались
микроспоры в стадии тетрады (75%) и ранней одноядерной пыльцы (25%). В
бутонах длиной 10 мм присутствовали три стадии развития микроспор:
тетрады (15%), одноядерная пыльца (70%) и двуядерная пыльца (15%). В
крупных бутонах длиной 15 мм отмечены двуядерная (80%) и одноядерная
(20%) пыльца (Рисунок 3). Таким образом, для дальнейших исследований было
решено использовать пыльники, находящиеся в бутонах длиной 10 мм, т.к. они
имеют максимальную долю одноядерных микроспор.
тетрада
одноядерная микроспора
двуядерная микроспора
90
80
80
75
70
70
60
50
40
30
25
15
20
10
20
15
0
0
0
5 мм
10 мм
10
15 мм
Рисунок 3 - Соотношение различных стадий развития микроспор в пыльниках
пеларгонии королевской сорта Петтикот в зависимости от длины бутона
Изучение влияния стадии развития микроспор на интенсивность
эмбриоидогенеза. Способность к эмбриоидогенезу напрямую зависит от
стадии развития, на которой находится микроспора (Ермаков И.П., 1986;
Шмыкова, 2015).
В наших исследованиях установлено, что наибольшей способностью к
эмбриоидогенезу обладали микроспоры, выделенные из бутонов длиной 10 мм
сортов Лотос, Шоко, Петтикот, т.е. находящиеся на стадии одноядерной
микроспоры, не переходящие в стадию пыльцевого зерна. При этом,
максимальный показатель эмбриоидогенеза (0,117±0,008% и 0,114±0,008%) и
каллусогенеза (012-±0,002% и 0,010±0,002%) отмечен у сортов Лотос и
Петтикот соответственно. Наименьшей компетентностью к эмбриоидогенезу и
каллусогенезу характеризовались микроспоры, выделенные из бутонов
длинной 5 мм и 15мм (Рисунок 4).
Эмбриоидогенез
80
Каллусогенез
7
70
10 мм
6
10 мм
60
10 мм
10 мм
5
50
10 мм
4
40
15 мм
15 мм
30
20
5 мм
10 мм
10 мм
3
5 мм
5 мм
5 мм
15 мм
1
0
0
Лотос
Петтикот
15 мм
2
15 мм
10
Шоко
10 мм
Априкот
5 мм
5 мм
15 мм
5 мм
15 мм
Шоко
5 мм
15 мм
Лотос
Петтикот
Априкот
Рисунок 4 – Эмбриоидо- и каллусогенез различных генотипов пеларгонии
королевской в зависимости от длины бутона (30-е сутки культивирования)
Влияние питательной среды на эмбриоидогенез и каллусогенез
пеларгонии королевской в культуре микроспор. Из данных литературы
следует, что наиболее успешно при культировании различных эксплантов
представителей рода Pelargonium (Aboel-Nil M.M., 1973; Arshad M., 2012;
Begoña García-Sogo, 2012; Acharjee S., 2012; Tuleja М., 2014; Li Mingyin, 2005)
используются питательные среды МS, Гамборга В5 и NLN. Именно эти среды
мы изучали в нашей работе (Рисунок 5). В качестве регуляторов роста в
состав питательной среды входили 2 мг/л BAP и 0,05 мг/л NAA, а также
сахароза (30 г/л) и агар (8 г/л).
11
12
каллусогенез
25
эмбриоидогенез
20
15
10
Частота каллусо- и эмбриоидогенеза, %
Частота каллусо- и эмбриоидогенеза, %
30
5
10
8
6
4
2
0
0
MS
B5
NLN
MS
культура пыльников
B5
NLN
культура микроспор
Рисунок 5 - Частота эмбриоидо- и каллусогенеза в культуре пыльников и
микроспор пеларгонии королевской сортов Шоко, Лотос, Априкот, Петтикот в
зависимости от минерального состава питательной среды.
В результате исследований установлено, что оптимальной средой для
культивирования пыльников и микроспор пеларгонии королевской являлась
среда MS. Частота образования эмбриоидов на ней была 2 раза и 4 раза выше,
чем на средах В5 и NLN соответственно (p0.05).
Изучение влияния регуляторов роста на эмбриоидо- и каллусогенез
пеларгонии королевской
в культуре микроспор. Целью наших
исследований являлось разработка эффективной регенерационной системы для
культуры пыльников и микроспор пеларгонии королевской. В связи с эти были
проведены предварительные эксперименты по апробированию в культуре
пыльников пеларгонии королевской сочетаний и концентраций регуляторов,
известных для растений рода Pelargonium, известных по литературным
источникам.
Изучены 3 варианта регенерационной системы с сочетаний регуляторов
роста: 1) 2,4-D и BAP (Klaus-Thomas Haensch, 2007), 2) Kin и NАА (Aboel-Nil
M.M.,1973; 1976); 3) BAP и NАА (Arshad M., 2012; Begoña García-Sogo, 2012;
Li Mingyin, 2005) для установления «эмбриогенного окна».
После уточнения эффективных сочетаний регуляторов роста в культуре
пыльников, лучшие варианты сочетаний и концентраций регуляторов роста
были использованы в культуре микроспор пеларгонии королевской (Таблица
2).
Образование эмбриоидов в культуре микроспор наиболее активно
проходило на питательных средах, содержащих 0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP
(вариант 1) и 0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP (вариант 2). Частота
эмбриоидогенеза у сорта Шоко составляла соответственно 0,54±0,05% и
0,56±0,09% (p0.05); сорта Петтикот - 0,64±0,05 и 0,66±0,07 (p0.05), сорта
Лотос -0,57±0,05 и 0,64±0,09 (p0.05). Первые эмбриоиды образовывались на
20-е или 25-е сутки культивирования.
12
На питательной среде, содержащей 4 мг/л BAP + 0,3 мг/л NАА (вариант
9) также преобладал процесс эмбриоидогенеза, но частота образования
эмбриоидов у изучаемых сортов была несколько ниже, чем в вариантах 1 и 2 и
находилась в диапазоне 0,49±0,08% - 0,56±0,08% (p0.05). В вариантах сред
№3-8 эмбриоиды на стадии глобулы останавливались в развитии или погибали
в возрасте 20-26 суток. В вариантах №7 и №8 отмечена наибольшая частота
каллусогенеза (0,49±0,08% - 0,71±0,04% соответственно). На поверхности
каллусных тканей наблюдали появление эмбриоидов на разных стадиях
развития. Таким образом, в культуре микроспор пеларгонии королевской для
индукции
прямого эмбриоидогенеза наиболее эффективным сочетанием
регуляторов роста являются: [0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [0,5 мг/л 2,4-D +
1,0 мг/л BAP]; [4 мг/л BAP + 0,3 мг/л NАА]. На среде MS, содержащей
регуляторы следующих сочетаниях и концентрациях: [0,5 мг/л 2,4-D + 1,5 мг/л
BAP]; [3,0 мг/л Kin + 0,1 мг/л NАА]; [2 мг/л BAP + 0,05 мг/л NАА]; [2 мг/л BAP
+ 0,1 мг/л] NАА наблюдается активное образование эмбриогенного каллуса.
13
Таблица 2 – Влияние регуляторов роста на эмбриоидогенез и каллусогенез микроспор пеларгонии королевской
сортов Шоко, Лотос, Петтикот. Среда MS, 120 г/л сахароза, 7 г/л агар (n=50 000), 30-е сутки культивирования
Вари
ант
Шоко
Петтикот
Лотос
Регуляторы
число эмбриоидов
число каллусов
число эмбриоидов
число каллусов
число эмбриоидов
число каллусов
роста, мг/л
шт.
%±Sp
шт.
%±Sp
шт.
%±Sp
шт.
%±Sp
шт.
%±Sp
шт.
%±Sp
1
0,25 2,4-D + 1,0 BAP
69±6
0,54±0,05*
6±2
0,14±0,01
72±6
0,64±0,05*
7±1
0,14±0,01
85±6
0,57±0,05*
10±2
0,14±0,01
2
0,5 2,4-D + 1,0 BAP
72±4
0,56±0,09*
9±3
0,22±0,02
76±4
0,66±0,07*
11±3
0,22±0,02
92±4
0,64±0,09*
13±3
0,22±0,02
3
0,5 2,4-D + 1,5 BAP
26±9
0,22±0,89
31±4
0,33±0,08*
26±9
0,28±0,07
38±4
0,32±0,08*
26±9
0,25±0,89
42±6
0,32±0,08*
4
2,0 Kin + 0,1 NАА
58±7
0,32±0,06
12±1
0,22±0,04
54±7
0,33±0,06
12±1
0,22±0,04
60±8
0,39±0,06
15±2
0,28±0,04
5
2,5Kin + 0,1 NАА
65±6
0,42±0,05
14±1
0,23±0,06
65±6
0,46±0,05
14±1
0,23±0,06
68±6
0,50±0,05
18±2
0,26±0,06
6
3,0 Kin + 0,1 NАА
18±9
0,12±0,04
36±2
0,31±0,06*
18±9
0,13±0,04
36±2
0,31±0,06*
18±9
0,12±0,04
42±5
0,32±0,06*
7
2 BAP + 0,05 NАА
26±9
0,24±0,06
32±2
0,52±0,08*
26±9
0,28±0,06
32±2
0,69±0,04*
31±9
0,26±0,07
33±2
0,71±0,04*
8
2 BAP + 0,1 NАА
28±9
0,32±0,06
56±4
0,49±0,08*
28±9
0,33±0,06
56±4
0,62±0,04*
32±9
0,32±0,06
58±4
0,65±0,04*
9
4 BAP + 0,3 NАА
71±9
0,49±0,08*
12±3
0,24±0,01
76±9
0,56±0,08*
12±3
0,24±0,01
77±2
0,52±0,08*
12±3
0,24±0,01
Примечание - * различия существенны между вариантами сред (p0.05)
Изучение регенерационной активности каллусных тканей пеларгонии
королевской, полученных в культуре микроспор. Эмбриоидные кластеры и
каллусные ткани четырех сортов пеларгонии королевской (Шоко, Лотос,
Петтикот и Априкот), полученные при первом субкультивировании из
микроспор, переносили на среду MS, дополненную следующими сочетаниями
регуляторами роста (BAP + NАА) и (BAP + NАА + ТDZ) в различных
концентрациях. Всего изучалось 20 вариантов (Таблица 3).
Таблица 3 - Влияние регуляторов роста на регенерационную активность
каллусных тканей пеларгонии королевской, полученных в культуре микроспор
(среда MS, сахароза 30 г/л, 4-я неделя культивирования, (n=30))
Вариант
Регуляторы
Регенерационная активность, %±2Sp
роста, мг/л
BAP
NAA ТDZ
Шоко
Лотос
Петтикот
Априкот
1
0,5
0,05
19,30,4
20,30,4
21,30,6
11,30,3*
2
1
0,05
26,31,4
20,31,4
26,31,6*
22,31,1*
3
2
0,05
39,31,4
40,31,4
41,31,6
29,31,1*
4
0,5
0,1
25,31,4
22,31,4
24,31,6
16,31,3
5
1
0,1
28,31,6
24,31,6
26,31,6
18,31,5*
6
2
0,1
40,32,4
46,32,4
49,32,4
32,12,2*
7
0,5
10,30,3
9,30,3
12,30,3
6,90,2*
8
1,0
12,30,3
10,30,3
11,30,3
5,60,2*
9
0,5
0,05
0,5
24,30,4
26,30,4
28,30,6
19,30,3*
10
1
0,05
0,5
28,31,4
25,31,4
31,31,4
22,731,1*
11
2
0,05
0,5
41,32,4
44,31,4
48,31,4
36,31,4*
12
0,5
0,1
0,5
28,61,4
32,31,4
34,31,6
26,31,3*
13
1
0,1
0,5
48,32,4
44,32,4
46,32,4
38,32,3*
*
a,b,f
*
a,b,f
*
a,b,f
14
2
0,1
0,5
56,35,4
59,35,4
61,35,4
42,34,4* a,b,f
15
0,5
0,05
1,0
20,31,4
21,31,4
23,31,6
17,61,3*
16
1
0,05
1,0
24,31,4
25,71,4
33,31,4*
21,731,1*
17
2
0,05
1,0
37,32,4
41,31,4
43,31,4
34,31,4*
18
0,5
0,1
1,0
23,61,4
30,31,4
31,31,6
22,31,3*
19
1
0,1
1,0
32,32,4
34,32,4
36,32,4
28,32,3*
*
a,b,f
*
a,b,f
*
a,b,f
20
2
0,1
1,0
42,32,4
49,32,4
51,32,4
32,32,4* a,b,f
Примечание - a,b,f - различия существенны между вариантами 3,6,14 (p0.05); * - различия
существенны между генотипами (p0.05)
Высокая частота эмбриоидов (30,89 ± 1.88) наблюдалась через 6 недель.
Зрелые эмбриоиды прорастали в побеги через 4 недели (Рисунок 6). Процесс
дифференциации вторичных эмбриоидов происходил из эпидермальных
клеточных слоев изолированных эксплантов. Наивысшая частота регенерации
отмечалась к 6 неделе на среде MS, содержащей 2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА
(Рисунок 7).
Результаты проведенных исследований показали, что в культуре микроспор
пеларгонии королевской для индукции непрямого эмбриоидогенеза наиболее
эффективным сочетанием регуляторов роста является 2 мг/л BAP + 0,1 мг/л
15
NАА, при этом процесс дифференциации вторичных эмбриоидов происходит
из эпидермальных клеточных слоев изолированных эксплантов. Перенос
эмбриогенных кластеров и каллусов на среду с тидиазуроном (2 мг/л BAP + 0,1
мг/л NАА и 0,5 мг/л TDZ) сопровождается перестройкой в процессе
пролиферации каллусной ткани с эмбриогенного на морфогенный тип развития
с геммогенезом и пролонгированной регенерацией побегов.
а
а
Рисунок 6 – Образование вторичных
эмбриоидов на основе каллусных
тканей пеларгонии королевской
(сорт Петтикот) на среде MS,
содержащей 2 мг/л BAP + 0,1 мг/л
NАА: а) эмбриоиды на 4 неделе
культивирования;
б)
массовая
регенерация побегов из эмбриоидов
на 6 неделе культивирования.
б
б
Рисунок 7 – Геммогенез на основе
каллусных
тканей
пеларгонии
королевской (сорт Петтикот) на
среде MS, содержащей 2 мг/л BAP +
0,1 мг/л NАА и 0,5 мг/л TDZ: а)
почка; б) прорастающая почка; в)
конгломерат почек и побегов.
в
Сравнение морфогенного потенциала изучаемых сортов пеларгонии
королевской показало, что сорт Петтикот обладал наивысшей
регенерационной активностью (от 42% до 62 % в зависимости от питательной
среды), а сорт Априкот – самой низкой (от 29% до 42%) (Рисунок 8).
80
Регенерационная активность, %
Шоко
Лотос
Петтикот
Априкот
Линейный (Петтикот)
Линейный (Априкот)
70
60
56,3
50
40
30
46,3
41,3
39,3 40,3
61,3
49,3
49,3
42,3
40,3
29,3
59,3
32,1
51,3
42,3
32,3
20
10
0
2 мг/л BAP + 0,05 мг/л NАА
(в ариант 3)
2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА
(в ариант 6)
2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА + 0,5 2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА + 1,0
мг/л TDZ (в ариант 14)
мг/л TDZ (в ариант 20)
Рисунок 8 – Регенерационная активность различных сортов пеларгонии
королевской
16
Получение
растений-регенерантов
пеларгонии
королевской.
Установлено, что на этапе микроразмножения для получения максимального
количества почек и побегов концентрацию минеральных веществ в
питательной среде МS целесообразнее снижать до 50% и 25%. Оптимальное
сочетание и концентрация регуляторов роста на этапах микроразмножения
составляет: BAP- 1,0 мг/л; NAA- 0,05 мг/л.
Укоренение побегов проводили на безгормональной среде MS0,
содержащей 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. В ходе укоренения побегов на среде
MS0 отмечено, что побеги сорта Априкот плохо укоренялись (50%), в то же
время процент укоренившихся растений сорта Петтикот составил 89,4%.
Укоренение побегов происходило в среднем за 10-14 дней.
Для адаптации растения-регенеранты высаживали в торфяные таблетки и
выдерживали в условиях влажной камеры в течение 7-14 дней при
освещенности 4000 – 5000 Люкс, температуре 18 – 20 0С и 16 - ти часовом
фотопериоде. В результате проведенных исследований было установлено, что
адаптация микрорастений пеларгонии королевской в торфяных таблетках
проходила успешно. Через 14 дней средняя приживаемость растений
составляла 88,8 %. Наименьший процент адаптированных растений (75%)
отмечен у сорта Априкот, наибольший (100%) – у сорта Петтикот. Всего
получено 127 растений-регенерантов, из них 119 были жизнеспособными
(Рисунок 9).
а
б
в
Рисунок 9 – Этапы получения растений-регенерантов пеларгонии королевской
в культуре микроспор: а) конгломерат почек; б) побеги; в) растение-регенерант
Оценка растений-регенерантов пеларгонии королевской
Доказательств
гаплоидной
природы
растений-регенерантов
пеларгонии королевской проводили с помощью метода подсчета количества
хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и числа хромосом в меристеме
корня. В результате исследований установлено, что число хлоропластов у
гаплоидных растений - регенерантов находилось в диапазоне от 9 до 12 шт.; у
удвоенных гаплоидов – от 16 до 24; у тетраплоидных растений – от 28 до 38
шт., в то время как у исходных донорных растений - от 36 до 44 шт.
У растений – регенерантов, полученных от сортов Лотос, Петтикот и
Шоко имелось три уровня плоидности: гаплоид (n=11), удвоенный гаплоид
(2n=22), тетраплоид (4n=44), что было подтверждено с помощью
цитологического анализа (Рисунок 10). Между гаплоидными растениями17
регентами
изучаемых сортов в отличие от удвоенных гаплоидов не
существовало достоверных различий по числу хлоропластов (p=0,05). Число
хлоропластов растений удвоенных гаплоидов от сорта Шоко составило 22,5
±1,6 шт., Лотос - 16,5 ±0,6 шт.; Петтикот - 21±1,1 шт.; Априкотт - 24±0,6 шт.
(Рисунок 10). Уменьшенным количеством хлоропластов отличались растения,
полученные из вторичных эмбриоидов, у данных растений-регенерантов
содержался одинарный набор хромосом (n=11).
В результате подсчете числа хромосом в делящихся клетках пыльников
молодых бутонов выявлено, что эти растения имели 11 хромосом (n=11) и в
фазе цветения растения
формировали мелкие стерильные цветки, что
подтвердило их гаплоидное происхождение. Среди проанализированных
растений-регенерантов частота встречаемости гаплоидов составила в среднем
23,5%, дигаплоидов – 54%, тетраплоидов – 22,5%.
а
в
б
г
д
Рисунок 10 Доказательство гаплоидной природы растений-регенерантов
пеларгонии королевской: Хромосомы в меристеме корня а) гаплоидный набор
(n=11), б) диплоидный набор (n=22); в) тетраплоидный набор
(n=44);
Хлоропласты в замыкающих клетках устьиц г) с 6-12 хлоропластами
гаплоидного растения-регенеранта от сорта Петтикот, д) с 19 хлоропластами
удвоенного гаплоида от сорта Лотос
Характеристика удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской по
морфологическим признакам. Полученные гаплоидные растения были более
слабыми и плохо выдерживали перевод в почвенную культуру. По
морфологическимх признакам гаплоиды были сходны с исходными
диплоидными растениями и отличались от них более мелкими размерами
клеток и вегетативных органов. После обработки раствором колхицина около
60% из них сформировали фертильные цветки и завязали семена, из которых
были получены удвоенные гаплоиды (R1) (Рисунок 11).
Морфологическая оценка 24 растений (R1) показала, что удвоенные
гаплоиды пеларгонии королевской были выровнены по декоративным и
хозяйственно-ценным признакам. Некоторые из них (ШR11-4, ШR17-1, ПR138, ЛR11-1) по ряду признаков не уступали и даже превосходили исходные
сорта. По продуктивности цветения выделялись ШR17-1, ЛR2-25, ЛR11-1,
ПR3-2, ПR14-4, которые имели более 30 соцветий. Максимальной
продолжительностью жизни соцветий (20-29 дней) характеризовались ЛR9-3,
ЛR11-1, ПR13-3, ПR13-4, ПR30-2. При выращивании растений в теплице
18
наблюдалась высокая семенная продуктивность (до 260 семян с одного
растения) у ЛR2-1, ПR3-1, ПR13-4.
а
б
в
Рисунок 11- Растения-регенеранты R1 пеларгонии королевской, полученные в
культуре микроспор на основе сорта а) Шоко - ШR17-1, б) Петтикот - ПR14-4;
в) Лотос - ЛR11-1
Идентификацию селекционного материала пеларгонии королевской
проводили с помощью ПЦР-анализа (Рисунок 12). Выявленные различия
между растениями-регенерантами и исходными формами свидетельствуют о
генетической изменчивости, полученных в культуре микроспор и культуре
тканей, которые могут быть связаны с активацией процессов реорганизации
генома в ходе эмбриодогенеза, каллусообразования, морфогенеза и
увеличением плоидности.
Рисунок 12 – Электрофореграмма ПЦР-фрагментов,
амплифицированных с праймером PawS16 на
геномной ДНК пеларгонии королевской сорта Лотос:
М – маркер молекулярной массы Gene Ruler 1кb
DNA Ladder (Fermentas, Латвия); 1-2 – растениярегенеранты (ЛR4; ЛR5), полученные в культуре
микроспор
из
морфогенного
каллуса
и
размноженные
с
помощью
клонального
размножения; 3-5– исходный образец (контроль); 67– взрослые растения (ЛR2-1; ЛR2-25) из теплицы,
полученные на основе растений-регенерантов, 8-9 растения-регенеранты, полученные в культуре
микроспор из эмбриоидов (ЛR2; ЛR9).
Таким образом, цитологический анализ и морфологическая оценка растений
регенерантов свидетельствует о том, что удвоенные гаплоиды пеларгонии
королевской поколения R1 имели набор генов, характерный для гамет.
Технология получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской
в культуре микроспор
Таким образом, в ходе проведения исследований разработана технология
получения удвоенных гаплоидов пеларгонии королевской в культуре
19
микроспор, включающая: прямой эмбриоидонегез (непосредственно из
микроспор); непрямой эмбриоидонегез (из эмбриогенной каллусной ткани).
Технология апробирована на четырех сортах (Лотос, Шоко, Петтикот,
Априкотт) и оформлена в виде лабораторного технологического регламента с
учетом требований ОСТ 64-02-003003-2002. Технологическая схема отображает
последовательность выполнения работ с подразделением их по стадиям и
операциям технологического процесса, каждый из которых
имеет свои
отличительные особенности:
 для индукции андрогенеза не требуется воздействия шоковыми
температурами;
 пыльники в бутонах длиной 10 мм имеют максимальную долю
одноядерных микроспор, при отборе бутонов, содержащих оптимальную
для эмбриогенеза стадию;
 оптимальной средой для культивирования микроспор является среда MS
(на ней на протяжении длительного периода выращивания в условиях in
vitro микроспоры большей частью репрограммированы на эмбриоидо- и
каллусогенез);
 добавление аскорбиновой кислоты в питательную среду в концентрации
100 мг/л на 50% снижает выделение фенольных соединений, тем самым
повышая способность к морфогенезу;
 добавление в питательную среду сахарозы в концентрации 120 г/л на
первых этапах культивирования микроспор, позволяет на 30% повысить
частоту эмбриоидо- и каллусогенеза;
 для
индукции
прямого эмбриоидогенеза наиболее эффективным
сочетанием регуляторов роста являются: [0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP];
[0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP]; [4 мг/л BAP + 0,3 мг/л NАА];
 для индукции эмбриогенного каллуса оптимальным является сочетание
регуляторов роста: [0,5 мг/л 2,4-D + 1,5 мг/л BAP]; [3,0 мг/л Kin + 0,1 мг/л
NАА]; [2 мг/л BAP + 0,05 мг/л NАА]; [2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА];
 на этапе микроразмножения для получения максимального количества
почек и побегов концентрацию минеральных веществ в питательной среде
МS целесообразнее снижать до 50% и 25%. Оптимальное сочетание и
концентрация регуляторов роста на этапах микроразмножения составляет:
BAP- 1,0 мг/л; NAA- 0,05 мг/л;
 адаптация микрорастений пеларгонии королевской в торфяных таблетках
позволяет достичь 90% приживаемости за 14 дней.
Экономическая эффективность технологии получения удвоенных
гаплоидов пеларгонии королевской. При расчёте экономической
эффективности разработанной нами технологии получения удвоенных
гаплоидов пеларгонии королевской в культуре микроспор основывались на
данных расчёта затрат при выведении новых линий пеларгонии королевской
методами традиционной селекции (Гутиева Н.М., 2011, 2014). Затраты на
содержание теплиц брались из полученных затрат тепличного комбината ООО
«ПО Егорьевское» за 2014 год (Таблица 4)
20
Таблица 4 - Расчёт экономической эффективности применения технологии получения удвоенных гаплоидов пеларгонии
королевской при получении родительских линий
№
Виды затрат, наименование работ и Затраты
основные этапы получения родительских млн. руб.
линий традиционными методами селекции
Продолжи
тельность
работы
Виды затрат, наименование работ и Затраты руб.
основные
этапы
получения
линий
методами биотехнологии
1
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Площадь
теплицы
–
1000
м2,
амортизационные отчисления составляют в
год
Затраты на отопление в год
Генетические исследования (правильный
подбор родительских пар, гены которых
должны быть рекомбинированы в новом
сорте)
Изучение комбинационной способности
родительских
линий
по
основным
декоративным и
хозяйственно-ценным
признакам.
Гибридологический анализ в линиях.
Отбор элитных гибридных форм и
первичное
сортоизучение.
Отбор
перспективных гибридов
Выращивание маточников родительских
линий.
Затраты на амортизационные отчисления в
течение 10 лет.
Затраты на отопление 10 лет
Продолжитель
ность
выполнения
работы
0,3
----------
0,3
0,85
0,85
7,2
3 года
10,5
3 года
7,2
3 года
-
-
0,5
1 год
0,5
1 год
0,9
3 года
2,5
3 года
7,2
3 года
Культивирование микроспор на
питательных средах. Получение растенийрегенерантов. Размножение растенийрегенерантов
4,5
1 год
3
10 лет
8,5
10 лет
Клональное
микроразмножение
родительских линий родительских линий
Затраты на амортизационные отчисления в
течение 3 года
Затраты на отопление 3 года
8.
Итого прямые расходы
37,3
--------
Итого прямые расходы
14,9
---------------
7.
Затраты с учётом прочих прямых (20%)
44,8
---------
Затраты с учётом прочих прямых (20%)
17,9
----------------
7.
Затраты с учётом накладных (20%)
53,7
---------
Затраты с учтом накладных (20%)
21,5
-----------------
Проведённые расчёты показали, что использование культуры микроспор
позволяет сократить время на создание исходного селекционного материала на
5 лет (с 10 лет до 5 лет) и в 3 раза (с 53,7 млн. руб. до 17,1 млн. руб.)
уменьшить экономические затраты на его производство (Таблица
4).
Использование этапа клонального микроразмножения ценного селекционного
материала (линии, гибриды, сорта) дает еще одно важное преимущество
разработанной технологии (Таблица 5).
Таблица 5 – Экономическая эффективность выращивания ценного
селекционного материала пеларгонии королевской
Показатель
Исходное количество материала на 1 м2 конечного
продукта, шт.
Выход материала с 1 м2 теплицы или
культуральной комнаты за 1 пассаж, шт.
Затраты на производство, руб
Количество адаптированных растений на 1 м2, шт.
Затраты на адаптирование на 1 м2, руб
в т.ч. общехозяйственные затраты, руб
в т.ч. заработная плата, руб
Итого затраты на 1 м2 конечного продукта, руб.
Себестоимость единицы продукции, руб
Рыночная цена реализации продукции, руб
Прибыль с единицы продукции, руб
Уровень рентабельности, %
Технология размножения
традиционное
клональное
черенкование
микроразмножение
in vivo
in vitro
427
9
341
43
11503
39000
4267
15128
6795
8333
54128
12,7
45
32,3
255%
87,5
11503
33,7
45
11,3
34%
Результаты расчета экономической эффективности производства
селекционного материала пеларгонии королевской (линии, гибриды, сорта)
через культуру in vitro с последующей адаптацией к условиям in vivo показали,
что технология микроразмножения требует меньших капиталовложений на
единицу площади с одновременно большим конечным выходом растительного
материала, что существенно снижает себестоимость саженца по сравнению с
традиционной
методикой, в результате чего себестоимость продукции
снижается в 2,7 раза.
Таким образом, полученные данные позволяют уже в настоящее время
сделать сложный процесс морфогенеза микроспоры пеларгонии королевской по
спорофитной программе in vitro управляемым и получать полноценные
андроклинные гаплоидные растения-регенеранты в большом количестве для
внедрения их в селекционную практику. При этом, использование
разработанной технологии получения удвоенных гаплоидов в культуре
микроспор позволяет существенно повысить эффективность селекционного
процесса пеларгонии королевской и рентабельность производства за счет
снижения в 1,5-2 раза сроков создания новых линий для последующей
селекции; в 3 раза материальных и энергетических затрат тепличного
хозяйства; в 2,7 раза себестоимости получаемой продукции.
1.
2.
3.
4.
5.
ВЫВОДЫ
Разработана технология получения удвоенных гаплоидов пеларгонии
королевской в культуре микроспор, позволяющая получать генетически
гетерогенный материал в сравнении с исходными сортами.
Использование данной технологии позволит сократить: в 1,5-2 раза
сроки
создания новых гомозиготных линий для дальнейшего
использования в селекционном процессе; в 3 раза - материальные и
энергетические затраты тепличного хозяйства; в 2,7 раза - себестоимость
получаемой продукции.
Выявлены сорта пеларгонии королевской (Лотос, Шоко, Петтикот) с
высоким андрогенным потенциалом, способностью к эмбриоидо- и
каллусогенезу в культуре пыльников и микроспор, а также способностью
к регенерации и клональному микроразмножению.
Установлено, что для индукции андрогенеза в культуре микроспор
пеларгонии королевской не требуется воздействия шоковыми
температурами, что позволяет сократить процедуру культивирования
микроспор за счет предварительного выдерживания пыльников при
пониженных или повышенных положительных температурах.
Морфогенетическая активность микроспор пеларгонии королевской
зависит от стадии развития бутона, вида питательной среды,
концентрации регуляторов роста, сахарозы, аскорбиновой кислоты.
Установлено, что:
 оптимальная длинна бутона, при которой микроспоры
преимущественно находятся на невакуолизированной стадии
развития составляет – 10 мм;
 для культивирования микроспор пеларгонии королевской
оптимальной является питательной среде MS: частота образования
эмбриоидов на среде MS была 2 и 9 раз выше, чем на средах В5 и
NLN соответственно (p0.05);
 добавление
аскорбиновой кислоты в питательную среду в
концентрации 100 мг/л позволяет на 50% снизить выделение
фенольных соединений, образующихся в процессе культивирования
и тем самым повысить интенсивность эмбриоидо- и каллусогенеза;
 добавление в питательную среду сахарозы в концентрации 120 г/л
на первых этапах культивирования микроспор, позволяет на 30%
повысить выход эмбриоидов в сравнении с контрольным вариантом
(30 г/л).
Для
индукции прямого эмбриоидогенеза оптимальным сочетанием
регуляторов роста в питательной среде являются: [0,25 мг/л 2,4-D + 1,0
мг/л BAP] или [0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP] или [4 мг/л BAP + 0,3 мг/л
NАА]. Культивировании микроспор на данных питательных средах
позволяет повысить частоту эмбриоидогенеза до 0,66±0,07% (p0.05) и
каллусогенеза до 0,71±0,04% (p0.05). Для
индукции непрямого
эмбриоидогенеза оптимальным сочетанием и концентраций регуляторов
роста в питательной среде являются: [0,5 мг/л 2,4-D + 1,5 мг/л BAP]; [3,0
мг/л Kin + 0,1 мг/л NАА]; [2 мг/л BAP + 0,05 мг/л NАА]; [2 мг/л BAP +
0,1 мг/л NАА].
6. Культивирование каллусов на питательной среде, содержащей 2 мг/л
BAP + 0,1 мг/л NАА позволяет повысить их регенерационную активность
до 40-50% (p0.05). Перенос эмбриогенных кластеров и каллусов на
аналогичную среду, дополненную 0,5 мг/л TDZ сопровождается
перестройкой в процессе пролиферации каллусной ткани с
эмбриогенного на морфогенный тип развития с геммогенезом и
пролонгированной регенерацией побегов.
7. На этапе размножения для получения максимального количества почек и
побегов концентрацию минеральных веществ в питательной среде МS
целесообразнее снижать до 50% и 25%. Оптимальное сочетание и
концентрация регуляторов роста на этапах микроразмножения
составляет: BAP-1,0 мг/л; NAA- 0,05 мг/л.
8. ПЦР-анализ растений-регенерантов пеларгонии королевской от сорта
Лотос, полученных в культуре микроспор, показал значительное
снижение гетерогенности в спектрах ДНК в сравнении с исходным
сортом. Проведенный цитологический анализ (подсчёт устьиц, числа
хлоропластов в замыкающих клетках устьиц и хромосом) подтвердил их
гаплоидную природу. Оценка удвоенных гаплоидов (R1) пеларгонии
королевской по декоративным и хозяйственно-ценным показала, что
удвоенные гаплоиды были выровнены по изучаемым признакам.
РЕКОМЕНДАЦИИ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ
1. Для использования в селекционной и биотехнологической работе
рекомендуются сорта пеларгонии королевской Лотос, Шоко и Петтикот,
обладающие повышенной способностью к андрогенезу и регенерации in
vitro.
2. В исследованиях по андрогенезу in vitro у пеларгонии королевской
следует использовать пыльники на невакуолизированной стадии развития
микроспор (размер бутона 10 мм), без температурной предобработки и
культивировать на питательной среде MS, содержащей [0,25 мг/л 2,4-D +
1,0 мг/л BAP] или [0,5 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP] или [4 мг/л BAP + 0,3
мг/л NАА], сахарозы 120 г/л; рН 5,8; аскорбиновой кислоты 100 мг/л;
агар 5 г/л, при температуре +250С и фотопериоде 16/8, до образования
эмбриоидов или эмбриоидных кластеров.
24
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Корчагин А.В. Влияние аскорбиновой кислоты на образование фенолов и
морфогенез эксплантов Пеларгонии королевской (P. grandiflorum) in vitro
/А.В. Корчагина, А.В. Корчагин А.В., А.В. Поляков //Тез. док. VIII
Международного
симпозиума
«Фенольные
соединения:
фундаментальные и прикладные аспекты» (2-5 октября 2012 г).-М., 2012.С.337-341.
2. Корчагин А.В. Features of doubled haploid technology obtaining of royal
geranium (Pelargonium grandiflorum) in microspore culture /А.В. Корчагин,
А.В. Поляков, О.Ф. Шарафова //Картофель и овощи.-2015.-№9.-С.36-38.
(рек. ВАК).
3. Корчагин А.В. Влияние температуры на эмбриоидогенез пеларгонии
королевской (Pelargonium grandiflorum) в культуре микроспор /А.В.
Корчагин, А.В. Поляков, О.Ф. Шарафова //Естественные и технические
науки. – 2015.-№ - С. (в печати) (рек. ВАК).
4. Корчагин А.В. Изучение влияния регуляторов роста на морфогенез
пеларгонии королевской
(Pelargonium grandiflorum) в культуре
пыльников и микроспор /А.В. Корчагин, А.В. Поляков //Материалы XI
Международной научно-практической конференции «Становление
современной науки-2015» (г. Прага, Чехия, 20-30 сентября 2015 г.).- Т .С. (в печати).
25
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа