close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Роль кальций-зависимой фосфатазы кальцинейрина в регуляции секреции медиатора в моторных синапсах мыши

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ТАРАСОВА ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА
РОЛЬ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМОЙ ФОСФАТАЗЫ КАЛЬЦИНЕЙРИНА В
РЕГУЛЯЦИИ СЕКРЕЦИИ МЕДИАТОРА В МОТОРНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ
03.03.01 - Физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Москва-2016
2
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического
факультета (заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский)
Федерального государственного бюджетного учреждения высшего образования
«Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова»
Научный руководитель:
Балезина Ольга Петровна
доктор биологических наук, профессор,
профессор кафедры физиологии человека
и животных ФГБУ ВО МГУ имени М.В.
Ломоносова, г. Москва
Официальные оппоненты:
Ситдикова Гузель Фаритовна
доктор биологических наук, профессор,
заведующий
кафедрой
физиологии
человека и животных ФГАОУ ВО ИФМиБ
КФУ, г. Казань
Шенкман Борис Стивович
доктор биологических наук, профессор,
заведующий
лабораторией
миологии
ФГБУН ГНЦ РФ ИМБП РАН, г. Москва
Ведущее научное учреждение:
Государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального
образования Казанский государственный
медицинский университет Минздрава России,
г. Казань
Защита состоится 03.10.2016 в 1530 на заседании диссертационного совета Д
501.001.93 при биологическом факультете Федерального государственного
бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Московский
Государственный Университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991, Москва,
Ленинские горы, д.1, строение 12, аудитория М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского
государственного университета имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная
библиотека, Ломоносовский проспект, д. 27) и на сайте http:// www.bio.msu.ru/.
Автореферат разослан ___________
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук
Б.А. Умарова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В современных исследованиях механизмов
секреции медиатора большое внимание уделяется Са2+-зависимым киназам как
регуляторам выброса медиатора (Wang, 2008; Lisman et al., 2012; Chu et al.,
2014; Fioravante et al., 2014). Роль антагонистов киназ – Са2+-зависимых
фосфатаз, осуществляющих дефосфорилирование внутриклеточных мишеней,
остаётся значительно менее изученной. Возрастающий интерес к Са2+зависимым фосфатазам в синапсах связан с обнаружением их способности не
просто инвертировать эффекты киназ (D'Alcantara et al., 2003; Bastan et al.,
2014), но и выступать в качестве относительно самостоятельных
высокоэффективных регуляторов синаптических процессов (Hogan, Li, 2005;
Woolfrey, Dell’Acqua 2015). Какова специфическая роль Са2+- зависимых
фосфатаз, каков характер их взаимодействия с киназами и кальциевыми
сигналами в работающих синапсах, представляет собой актуальную и мало
изученную проблему современной физиологии синапсов. Это в полной мере
относится и к Са2+-зависимой фосфатазе РР2B (РР3) типа - кальцинейрину (Li et
al., 2012).
Кальцинейрин (CaN) – Са2+/кальмодулин-активируемая серин-треониновая
фосфатаза, впервые обнаруженная в нервной ткани (Klee, Krinks, 1978), в
настоящее время описана в разных типах клеток (Rusnak, Mertz, 2000; Hogan, Li,
2005). Наряду с Са2+-зависимыми киназами, фосфатаза CaN способна
участвовать в регуляции широкого спектра процессов, включая формирование
памяти и пластичность синапсов (Yakel, 1997; Marks, McMahon, 1998; Herzig,
Neumann, 2000; Sun et al., 2010; Sanderson, Dell’Acqua, 2011). В центральных
синапсах раскрыто равнозначное с киназами участие постсинаптического CaN в
регуляции долговременной депрессии передачи, активности Са2+-каналов Lтипа, деградации постсинаптических NMDA-рецепторов и снижении
входящего по ним тока (Yuen, 2008; Jurado et al., 2010; Fujii et al., 2013; Dittmer
et al., 2014; Murphy et al., 2014). На пресинаптическом уровне обнаружено
участие CaN в регуляции эндоцитоза везикул при долговременной
высокочастотной активности синапсов (Wu et al., 2014).
В отличие от успехов в выявлении активности CaN в ЦНС, его присутствие
и роль в периферических нервно-мышечных синапсах скелетных мышц
практически не изучена. Отмечено участие CaN в регуляции мышечной NOсинтазы (Etherington, Everett, 2004). Однако ничего не известно о
пресинаптической активности CaN в моторных синапсах. Как регулируется эта
фосфатаза со стороны кальциевых сигналов в терминалях, каковы её мишени и
участие в регуляции секреции АХ, остаётся неизученным в современной
нейрофизиологии. Не определены и особенности сопряжения активности CaN с
Са2+-зависимыми и другими киназами, описанными в моторных нервных
4
терминалях. Все эти актуальные и нерешённые вопросы и составили предмет
рассмотрения в данной работе.
Цель и задачи работы. Целью работы было выявить пресинаптическую
активность CaN, его внутриклеточные мишени и CaN/киназные взаимодействия,
направленные на регуляцию секреции АХ в моторных синапсах мыши. В связи
с поставленной целью в работе решались следующие конкретные задачи:
1) Исследовать влияние избирательной фармакологической блокады CaN на
параметры: а) спонтанной секреции АХ, б) вызванной секреции АХ при
залповой ритмической активности синапсов.
2) Исследовать роль регуляторов CaN - кальмодулина и Са2+-зависимой
протеазы кальпаина в обеспечении активности CaN в нервно-мышечных
синапсах мыши.
3) Исследовать роль потенциал-зависимых Саv1-каналов (L-типа) и
сопряжённых с ними рианодиновых рецепторов (РиР) Са2+-депо как возможных
мишеней тормозного действия CaN на секрецию АХ.
4) Исследовать возможность активации Са2+-зависимых киназ - РКС и
СаМКII - при работе разных кальциевых входов терминалей, особенности
сопряжения этих киназ с CaN в регуляции секреции АХ.
5) Исследовать, как тормозное влияние CaN на L-тип Са2+-каналов
сопряжено с действием на них цАМФ-зависимой киназы РКА и ее активацией
со стороны метаботропных пресинаптических аденозиновых рецепторов А2Атипа.
Положения, выносимые на защиту.
1) В моторных нервных терминалях мыши CaN тормозит вызванный выброс
АХ. Мишенью действия CaN являются медленные потенциал-активируемые
Саv1-каналы.
2) Растормаживание активности Са2+-каналов L-типа при блокаде CaN
сопровождается активацией РиР, выбросом депонированного кальция и
активацией Са2+-зависимых киназ - РКС и СаМКII, участвующих в облегчении
секреции АХ.
3) Тормозное действие CaN является доминирующим и препятствует
проявлению облегчающего киназного действия на L-тип Са2+-каналов и
вызванный выброс АХ со стороны РКА, работа которой контролируется
пресинаптическими аденозиновыми рецепторами А2А-типа.
Научная новизна полученных результатов. В работе выявлена ранее не
известная пресинаптическая активность CaN в составе моторных терминалей
периферических синапсов мыши. Впервые установлено, что мишенью
тормозного действия CaN являются потенциал-зависимые Са2+-каналы L-типа.
Впервые показано, что при блокаде CaN растормаживание активности L-типа
Са2+-каналов сопряжено с активацией РиР и выбросом депонированного
кальция. Это влечёт за собой Са2+-зависимую активацию РКС и СаМКII и
5
усиление вызванной секреции АХ при работе синапсов в режиме коротких
ритмических залпов. Выявлено ранее не известное антагонистическое действие
CaN и РКА, регулирующее активность L-типа Са2+-каналов и уровень выброса
АХ в нервно-мышечных синапсах мыши. Установлено, что в нервномышечных синапсах активность самого CaN может быть подвержена регуляции
со стороны эндогенной Са2+-зависимой протеазы кальпаина.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные
представляют интерес как с общенаучной, так и прикладной точки зрения. Для
фундаментальной физиологии ценным является обнаружение в моторных
терминалях мыши специфического статуса CaN, его базальной активности,
управляемой кальпаином. Данная активность направлена на подавление работы
комплекса L-тип Са2+-каналов/РиР, выброса депонированного Са2+ , а также
активности РКС и CaMKII. Заслуживает внимания впервые обнаруженный
факт, что при подавлении активности CaN возможно вовлечение в регуляцию
секреции медиатора Са2+-зависимых киназ РКС и СаМКII, что обеспечивает
усиление нервно-мышечной передачи и выброса АХ в ритмически активных
синапсах. Научно значимым является развиваемое в работе представление о
наличии в моторных терминалях баланса противоположно направленных
воздействий на Са2+-каналы L-типа и секрецию АХ со стороны ферментов фосфатазы CaN и киназы РКА, с преобладанием тормозной активности CaN.
Представляет интерес обнаруженная возможность сдвигать баланс
антагонистических воздействий на L-тип каналов в сторону облегчения их
активности и секреции АХ в случае усиления активности PКА путем ее
избирательной активации со стороны пресинаптических аденозиновых
рецепторов А2А-типа.
Обнаруженная возможность значительно облегчать передачу в моторных
синапсах с помощью блокаторов CaN либо кальпаина может в дальнейшем
быть использована при разработке нового класса фармакологических
препаратов, поддерживающих нервно-мышечную передачу в клинике
периферических двигательных расстройств.
Личный вклад диссертанта в исследования. Приведённые в работе
данные получены при личном участии соискателя на всех этапах исследования.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на III
международном съезде физиологов СНГ "Физиология и здоровье человека"
(Ялта, 2011), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых
учёных «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), 8-ом Форуме Федерации
Европейских Нейронаук (Барселона, Испания, 2012), Международной
конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013),
XXII-ом съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград,
2013), 18-ой Международной школы-конференции «Биология - Наука 21 века»
(Пущино, 2014), 44-ом Международном съезде Сообщества Нейронаук
6
(Вашингтон, США, 2014), Международной конференции «Рецепторы и
внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015), 19-ой Международной
школы-конференции «Биология- Наука 21 века» (Пущино, 2015), VI-ой
Российской, с международным участием, научной конференции по управлению
движением (Казань, 2016), 20-ой Международной школы-конференции
«Биология - Наука 21 века», (Пущино, 2016), ХI-ом Международном
Симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2016), 10-ом Форуме
Федерации Европейских Нейронаук (Копенгаген, Дания, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ,
в их числе 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из списка сокращений,
введения, обзора литературы, описания методов, объектов и материалов
исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов,
списка цитируемой литературы. Работа изложена на 132 листах, содержит 40
рисунков. Список литературы включает 260 источников.
ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования. Эксперименты проводили на изолированных нервномышечных препаратах диафрагмальной мышцы (m. diaphragma–n. phrenicus)
взрослых (P30) беспородных мышей. Животные содержались в соответствии с
директивой 86/609/EEC по обращению человека с лабораторными животными,
протокол был одобрен комиссией по биоэтике Биологического факультета МГУ.
Мыши умерщвлялись посредством быстрого обезглавливания.
Внутриклеточная регистрация спонтанных и вызванных потенциалов
концевой пластинки. Для предотвращения мышечных сокращений при
регистрации вызванных потенциалов концевой пластинки в ответ на
стимуляцию диафрагмального нерва (n. phrenicus), проводили рассечение
мышечных волокон (Barstad, Lilleheil, 1968; Flink, Atchison, 2003). Cразу после
поперечного рассечения мышечных волокон (до начала регистрации
синаптических ответов) нервно-мышечный препарат непрерывно промывали
при комнатной температуре на протяжении не менее 1 ч в значительном объёме
(более 250 мл) раствора Лайли для теплокровных животных (мМ): NaCl – 135,0,
KCl – 4,0, CaCl2 – 2,0, MgCl2 – 1,0, NaH2PO 4 – 1,0, NaHCO3 – 16,0, глюкоза –
11,0. Раствор аэрировали карбогеном (95%О 2/5%СО2), pH раствора доводили до
7,2-7,4.
«Рассеченный» препарат помещали в экспериментальную камеру объёмом 3
мл, перфузируемую физиологическим раствором Лайли, и далее проводили
внутриклеточную регистрацию синаптических потенциалов.
Для этого использовали стандартную микроэлектродную технику отведения
биопотенциалов с помощью стеклянных микроэлектродов, заполненных 2,5 М
7
КCl (сопротивление кончика микроэлектрода составляло 15–20 МОм). В
каждом исследованном синапсе приблизительно в течении 100 сек
регистрировали спонтанную активность в виде миниатюрных потенциалов
концевой пластинки (МПКП). Раздражение нерва проводили хлор-серебряными
проволочными электродами сверхпороговыми электрическими стимулами
длительностью 0,1 мс. В зависимости от выбранного режима раздражения
нерва, проводили регистрацию вызванных потенциалов концевой пластинки
(ПКП) либо при стимуляции нерва одиночными стимулами с частотой 0,3 Гц,
либо короткими (1 секунда) ритмическими пачками импульсов с частотой 50 Гц.
Сигналы регистрировали при помощи усилителя Axoclamp2B (Molecular
Devices, США) или Neuroprobe Amplifier Model1600 (A-M Systems, США) и
записывали их с помощью аналого-цифровых преобразователей Е154 (L-Card,
Россия) с интерфейсом PowerGraph на жесткий диск компьютера для
последующего анализа в программе MiniAnalysis (Synaptosoft, США).
Зарегистрированную амплитуду ПКП корректировали на нелинейную
суммацию (Flink, Atchison, 2003). На основе корректированной амплитуды
ПКП и амплитуды МПКП также рассчитывали квантовый состав (КС) ПКП,
используя прямой метод - А(ПКП)ср/А(МПКП)ср. Для МПКП проводили оценку
их частоты и временных параметров.
Статистическая обработка экспериментальных данных. Достоверность
различий между выборками МПКП и одиночных ПКП оценивали при помощи
t-теста или one-way ANOVA (в случае нормального распределения) и их
непараметрических аналогов (для независимых выборок). Для оценки
достоверности различий между залпами ПКП использовалась two-way ANOVA
c последующим апостериорным анализом. Различия считали статистически
значимыми при уровне различий между выборками р<0,05 (n –количество
исследованных синапсов). Все данные представлены как средние значения ±
стандартные ошибки среднего.
Используемые в работе вещества: CsA (циклоспорин А), CN412
(кальцинейрин-ингибирующий пептид), Н-89, KN-62, PD 150606, нитрендипин,
рианодин (все - Enzo Life Science, USA); W-7 (Biomol); CGS-21680, S(-) BAY
K8644, ZM241385, хелеритрин (все -Sigma-Aldrich, USA).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Влияние ингибиторов кальцинейрина (СаN) на спонтанную и
вызванную секрецию АХ в моторных синапсах мыши.
Для выявления присутствия и активноcти кальцинейрина (CaN) в нервномышечных синапсах диафрагмы мыши мы исследовали изменения в секреции
АХ на фоне действия двух различных по химической структуре избирательных
8
ингибиторов данной фосфатазы – циклоспорина А (CsA) и кальцинейринингибирующего пептида (CN412).
1.1. Влияние CsA (1 мкМ) и CN412 (2,3 мкМ) на спонтанную секрецию АХ
Аппликация 1 мкМ циклоспорина А (CsA) в течение всего времени
эксперимента (60-90 мин) не приводила к изменению величины среднего
значения МП по сравнению с контролем (-41,00±1,63 мВ (n=26) и -40,71±1,89
мВ (n=15, p>0,05), соответственно), а также средней амплитуды (в контроле –
0,8±0,07 мВ, на фоне CsA - 0,84±0,05 мВ), и временных характеристик МПКП времени нарастания (в контроле – 0,95±0,01 мсек, на фоне CsA - 1,01±0,03
мсек), времени полуспада (в контроле – 1,62±0,13 мсек, на фоне CsA –
1,95±0,11 мсек) и частоты МПКП (в контроле - 0,86±0,13 Гц, на фоне CsA –
0,92±0,14 Гц) (p>0,05)).
На фоне действия кальцинейрин-ингибирующего пептида CN412 (2,3 мкМ)
также не обнаружено достоверных изменений ни МП (контроль – -39,5±2,9 мВ
(n=15); CN412 – -41,44±2,9 мВ (n=16), p>0,05), ни амплитудно-временных
характеристик мПКП (амплитуда МПКП в контроле - 1±0,1 мВ, на фоне CN412
– 0,96±0,06 мВ; время нарастания: 1±0,01 мсек, на фоне CN412 – 1,01±0,01
мсек; время полуспада: контроль - 2±0,13 мсек, CN412 – 2,17±0, 13 мсек;
частота: в контроле - 0,81±0,12 Гц, CN412 – 0,88±0,1 Гц, p>0,05).
Таким образом, ингибирование CaN никак не отразилось на спонтанной
секреции АХ в моторных синапсах мыши. Далее мы исследовали возможное
участие кальцинейрина в регуляции вызванной залповой активности синапсов,
при которой в терминали наблюдается совершенно иной профиль кальциевых
сигналов, чем в покое (Catterall, Few, 2009; Catterall, 2011).
1.2. Влияние CsA (1 мкМ) и CN412 (2,3 мкМ) на вызванную секрецию АХ
Эффекты ингибиторов CaN исследовали в условиях ритмической
стимуляции диафрагмального нерва с частотой 50 Гц. Стимуляция проводилась
в течение 1 секунды, при этом мы регистрировали залп из 50 ПКП,
обладающий характерной формой (рис. 1).
На начальных стадиях залпа наблюдается кратковременное облегчение
передачи (фасилитация), выражающееся в увеличении амплитуды ПКП2-ПКП3
по сравнению с первым ПКП, затем наступает депрессия, в ходе которой
амплитуда каждого последующего ПКП снижается по сравнению с
предыдущим, и, в конечном итоге, амплитуда ПКП в залпе выходит на
постоянный уровень - стадию «плато». Изменения амплитуды ПКП по ходу
залпа отражают изменения квантового состава (КС) ПКП (Балезина, Букия,
2005). При этом все фазы залпа являются Са2+-зависимыми (Rozov et al., 2001;
Ruiz et al., 2011).
9
Рис. 1. Оригинальная запись залпа ПКП при ритмической стимуляции
диафрагмального нерва с частотой 50 Гц. На рисунке отмечены фаза фасилитации,
депрессии и выхода амплитуды ПКП на фазу плато. Часть ПКП на стадии плато
опущена, чтобы избежать загромождения рисунка.
На фоне аппликации СsA (1мкМ) КС первого ПКП в залпе (ПКП1) возрастал
от 31,91±2,95 (n=26) в контроле до 37,85±1,82 (n=15). Аналогично - в среднем
на 30% - возрастал КС и всех последующих ПКП в залпе (рис. 2А).
Использование другого ингибитора CaN, CN412 (2,3 мкМ), приводило, как и
в случае с CsА, к увеличению КС ПКП на 37,92% по всему ходу ритмического
залпа (рис. 2Б).
Таким образом, при помощи двух разных по химической природе и
механизму блокирующего действия ингибиторов CaN мы впервые установили,
что блокада активности СaN приводит к облегчению передачи,
заключающемуся в возрастания КС ПКП на 30% по всему ходу ритмического
залпа ПКП. Судя по отсутствию при этом изменений амплитудно-временных
характеристик МПКП и МП мышечных волокон, обнаруженный эффект
ингибиторов имеет пресинаптическую природу.
Таким образом, в терминалях присутствует фосфатазная активность CaN,
способная существенно подавлять вызванную секрецию АХ.
2. Исследование эндогенных регуляторов активности CaN
Известно, что активность CaN может контролироваться как Ca2+/CaM, так и
Ca2+-зависимой цистеин-протеазой кальпаином (Klee, Krinks, 1978, SilvermanGavrila et al., 2013). Поэтому далее мы проверили, как влияет ингибирование
двух потенциально возможных регуляторов CaN - CaM (при помощи W-7 (10
мкМ)) и кальпаина (при помощи специфического ингибитора кальпаина
PD150606 (100 мкМ)) - на тормозное действие CaN на секрецию АХ.
На фоне действия W-7 (10 мкМ) МП мышечных волокон и амплитуда
МПКП не претерпевали достоверных изменений по сравнению с контролем. W7 не вызвал также и достоверных изменений квантового состава ПКП по ходу
10
Рис. 2. Влияние ингибиторов кальцинейрина на квантовый состав ПКП в залпе А)
Изменение квантового состава ПКП в контроле (n=26) и на фоне CsA (1 мкМ)
(n=15); Б) Изменение квантового состава ПКП в контроле (n=16) и на фоне CN412
(2,3 мкМ) (n=15); *-p<0,05; На врезках показаны соответствующие средние
амплитуды МПКП.
всего высокочастотного ритмического залпа (50 Гц). КС ПКП1 составил в
контроле 32,62±3,72 (n=12) и 33,14±2,28 (n=16) при аппликации блокатора СаМ.
Аппликация ингибитора кальпаина PD150606 (100 мкМ) также не оказывала
влияния ни на МП, ни на амплитуду МПКП. При этом ингибирование
кальпаина приводило к существенному облегчению вызванной секреции АХ и
приросту КС каждого ПКП в залпе в среднем на 32% (рис. 3). Такой прирост
сопоставим с приростом КС ПКП при прямом ингибировании самого CaN с
помощью СsA. Таким образом, мы впервые обнаружили активность кальпаина
в нервно-мышечных синапсах, выражающуюся в торможении вызванного
выброса квантов АХ. Поскольку последствия блокады кальпаина сходны с
эффектами прямого ингибирования CaN, можно предположить, что роль
кальпаина заключается в поддержании активного состояния CaN, как это было
установлено и в нервно-мышечных синапсах ракообразных. В этих синапсах
была показана способность кальпаина обеспечивать независимую от Ca2+/CaM
активность СаN за счёт отщепления его аутоингибирующего домена (SilvermanGavrila et al., 2013).
Поскольку на нашем объекте мы также не обнаружили последствий
ингибирования CaM, сказывающихся на активности CaN, не исключено, что и в
нервно-мышечных синапсах мыши присутствует независимая от Ca2+/CaM
активность CaN, направленная на торможение секреции медиатора и
обусловленная наличием в терминалях тонического активирующего
воздействия на эту фосфатазу со стороны кальпаина.
11
Рис. 3. Изменение квантового состава ПКП в контроле (n=22) и на фоне ингибитора
кальпаина PD150606 (100 мкМ) (n=19); *- p<0,05; На врезке показаны средние
значения амплитуды МПКП.
3. L-тип Са2+-каналов как мишень действия CaN в моторных
терминалях
Оставался открытым вопрос, каковы могут быть мишени обнаруженного
нами фосфатазного действия CaN, приводящего к подавлению вызванного
выброса АХ в моторных терминалях?
Рисунок облегчения залповой активности синапсов на фоне действия
ингибиторов CaN напоминал таковой при растормаживании медленных
потенциал-зависимых Cаv1-каналов L-типа в моторных синапсах мыши
(Гайдуков и др., 2009, Гайдуков и др., 2012). В отличие от основного пула
быстрых Cаv2.1-каналов (P/Q-типа), L-тип Cа2+-каналов хоть и описан в
терминалях, но находится обычно в латентном, подавленном состоянии и не
влияет на секрецию АХ (Urbano et al., 2001, Flink, Atchison, 2003). В связи с
этим, мы решили проверить, не служат ли потенциал-зависимые Cа2+-каналы Lтипа одной из мишеней тормозного действия CaN в моторных синапсах мыши.
Для этого мы исследовали последствия ингибирования CaN при избирательном
блокировании Cа2+-каналов L-типа нитрендипином.
3.1. Влияние CsА (1 мкМ) на активность моторных синапсов мыши при
блокировании L-типа кальциевых каналов нитрендипином (1 мкМ)
Блокирование L-типа Са2+-каналов нитрендипином (1мкМ) не оказывало
достоверного влияния на квантовый состав ПКП в залпе - их значение
оставалось на контрольном уровне (рис. 4). Эти результаты согласуются с
данными литературы о том, что, несмотря на присутствие L-типа Са2+-каналов
в терминалях (Giovannini et al., 2002; Perissinotti et al., 2008), в норме эти каналы
12
не активны или не принимают участия в регуляции секреции АХ (Urbano et al.,
2001, Flink, Atchison, 2003).
На фоне нитрендипина аппликация CsA не приводила к приросту КC ПКП,
наблюдаемого при действии CsA в отсутствии блокатора L-типа Cа2+-каналов
(рис. 4). В следующей серии экспериментов мы сначала ингибировали CaN и
лишь затем - L-тип Cа2+-каналов. Как и ожидалось, на фоне аппликации 1 мкМ
CsA наблюдался прирост КС ПКП на приблизительно 28% при неизменных
параметрах спонтанной секреции медиатора (рис. 4). Последующая аппликация
нитрендипина (1 мкМ) приводила к снижению КС каждого ПКП в залпе вплоть
до контрольных значений: КС ПКП1 составил в контроле – 30,62±2,53 (n=11),
при действии СsA – 39,24±2,3 (n=15, p<0,05) и 30,48±2,29 (n=14, p>0,05) на
фоне совместного действия СsA и нитрендипина (рис. 4).
Из
полученных
данных
следует,
что
в
моторных
терминалях
мыши
CaN
действительно подавляет именно
работу Са2+-каналов L-типа и
вход по ним ионов Ca2+.
Известно, что отсутствие вклада
данных каналов в регуляцию
секреции АХ в моторных
синапсах млекопитающих в
норме связывают с наличием в Рис. 4. Изменение КС первых ПКП в залпах
терминалях следовой калиевой (ПКП1), нормализованных по отношению к
гиперполяризации.
Данная контролю (принят за 100%): на фоне 1 мкМ
гиперполяризация создаётся за нитрендипина (n=15) и при действии на его
счёт активности КСа-каналов BK- фоне 1 мкМ CsA (n=16); на фоне 1 мкМ CsA
(n=15) и при действии 1 мкМ нитрендипина на
типа и не позволяет медленным его фоне (n=14); *- p<0,05 .
Са2+-каналам
L-типа
активироваться при спаде пресинаптических ПД терминалей (Urbano et al., 2001,
Flink, Atchison, 2003). Однако мы впервые показали, что тоническое тормозное
действие на L-тип Са2+-каналов со стороны CaN, которое осуществляется
независимо от сдвигов потенциала на мембране, играет равноценную по
значимости с ВК-каналами и калиевым током роль в поддержании L-типа Са2+каналов в неактивном состоянии.
4. Роль РиР внутриклеточных кальциевых депо в облегчении секреции
медиатора при ингибировании CaN
В работах группы О.П. Балезиной показано, что в нервно-мышечных
синапсах мыши при растормаживании L-типа Cа2+-каналов путем
блокирования активности пресинаптических BK-каналов входящий по L-типу
13
каналов ток Cа2+ приводит к активации рианодиновых рецепторов (РиР)
внутриклеточных Са2+-депо терминалей и выбросу депонированного кальция,
что и лежит в основе значительного (на 30%) облегчения выброса АХ (Балезина,
2012; Gaydukov et al., 2009). Поэтому мы решили проверить, происходит ли
аналогичная Са2+-зависимая активация РиР и сопряжённая с выбросом Са2+ из
депо потенциация секреции медиатора и при другом способе растормаживании
L-типа каналов - путём ингибирования активности CaN. Для этого мы
исследовали эффекты аппликации CsA 1 мкМ на фоне блокирования
рианодиновых рецепторов высокой концентрацией рианодина (3 мкМ).
Рианодин, блокирующий выброс из Са2+-депо, приводит к снижению КС
первого ПКП в залпе и менее выраженному, по сравнению с контролем,
развитию начального облегчения, выброса АХ, в то время как уровень фазы
плато остаётся без изменений (рис. 5).
На фоне совместного действия рианодина (3 мкМ) и CsA не наблюдалось
прироста КС ПКП и облегчения передачи в залпе (рис. 5). Таким образом,
результаты данной серии экспериментов подтвердили, что для усиления
секреции АХ при растормаживании L-типа Ca2+-каналов путём блокирования
CaN, необходима активации РиР и выброс Са2+ из рианодин-чувствительных
кальциевых депо. Такие же результаты были получены и с использованием
другого блокатора РиР – TMB-8 (1 мкМ).
Рис. 5. Изменение квантового состава ПКП в ритмическом коротком залпе в контроле
(n=17) и при действии CsA (1 мкМ) на фоне блокирования РиР высокой
концентрацией рианодина (3 мкМ) (n=15). Показано гипотетическое изменение КС
ПКП при действии отдельно CsA (1 мкМ) - штрихпунктирной линией - и рианодина
(3 мкМ) – линией с треугольными маркерами. На врезке - соответствующие
амплитуды МПКП.
14
5. Исследование характеристик Са2+-сигнала, формируемого в
терминали при ингибировании CaN, при помощи кальциевых буферов
BAPTA-AM и EGTA-AM
Итак, мы установили, что ингибирование кальцинейрина приводит к
формированию нового кальциевого сигнала в терминали – за счёт входа
кальция по L-типу каналов и сопряженного с этим выброса кальция из депо
через рианодиновые рецепторы. Именно такой комплексный кальциевый
сигнал и лежит в основе наблюдаемого усиления секреции медиатора. В связи с
этим, было интересно исследовать характеристики данного кальциевого
сигнала. Какова его кинетика и находится ли он на удалении от активных зон,
как это было показано для кальциевых каналов L-типа (Polo-Parado et al., 2001;
Flink, Atchison, 2003)?
Для ответа на этот вопрос мы использовали кальциевые буферы с разной
кинетикой связывания кальция: быстрый буфер BAPTA-АМ (50 мкМ) и
медленный – EGTA-АМ (50 мкМ). Оказалось, что на фоне предварительной
загрузки терминалей BAPTA-AM действие CsА не проявлялось, то есть не
наблюдалось подъёма КС ПКП. Ингибирование CaN при помощи CsA не
приводило к потенциации вызванного выброса медиатора и на фоне
медленного буфера EGTA-AM (рис. 6). Если бы подействовал только быстрый
буфер ВАРТА-АМ, это означало бы, что исследуемый источник кальция быстродействующий и находится вблизи от активных зон (Eggermann, Jonas,
2011; Eggermann et al., 2011). Обнаруженное нами одинаковое действие
быстрого и медленного буферов означает, во-первых, что ингибирование
кальцинейрина запускает медленный вход кальция в терминаль, а во-вторых,
что этот вход находится вдали от активных зон.
Рис. 6. Изменение квантового состава ПКП в ритмическом коротком залпе в контроле
(n=28), на фоне медленного кальциевого буфера EGTA-AM (50 мкМ) (n=15) и при
действии 1 мкМ CsA на фоне EGTA-AM (n=32). На врезке показаны средние значения
амплитуд МПКП.
15
6. Взаимодействие CaN и Са2+-зависимых протеинкиназ терминали
Полученные
в
предыдущих
сериях
экспериментов
результаты,
2+
свидетельствующие о «растормаживании» новых Ca -входов в терминали (Lтип каналов и РиР) при ингибировании CaN, породили вопрос, является ли
наблюдающийся при этом генерализованный подъём Са2+ самим по себе
достаточным для обеспечения значительного (на 30%) усиления выброса АХ?
В большинстве известных случаев функционирования Са2+-каналов L-типа
(в нейронах ЦНС или мышцах) описано сопряжение данного кальциевого входа
с активацией Са2+-зависимых ферментов (РКС и СаМКII), действие которых
может быть направлено как на сами каналы L-типа (по принципу
положительной обратной связи), так и на другие мишени (Urbano et al., 2001;
Tang et al., 2008; Wheeler et al., 2008; Gaydukov et al., 2012). Для проверки
возможного участия Са2+-зависимых киназ, РКС и СаМКII, в облегчении
секреции АХ при растормаживании L-типа Са2+-каналов, мы исследовали
эффекты специфических ингибиторов этих протеинкиназ в сочетании с
действием ингибитора CaN - CsA (1 мкМ).
6.1. Влияние ингибитора РКС хелеритрина (4 мкМ) при ингибировании
CaN циклоспорином А (1 мкМ) на секрецию АХ
На фоне действия хелеритрина КС ПКП в залпе не менялся по сравнению с
контролем (рис. 7). Однако предварительная аппликация хелеритрина не давала
проявиться потенцирующему действию CsA на секрецию АХ (рис. 7), что
говорит об обязательном участии РКС в усилении секреции медиатора при
ингибировании CaN. На это же указывает и тот факт, что прирост квантового
состава каждого ПКП (в том числе и ПКП1) в залпе при аппликации CsA (1
мкМ) нивелируется последующим действием хелеритрина (рис. 7).
Рис. 7. Изменение КС первых ПКП в залпах (ПКП1), нормализованных по
отношению к контролю (принят за 100%): на фоне 4 мкМ хелеритрина (n=17) и при
действии на его фоне 1 мкМ CsA (n=14); на фоне 1 мкМ CsA (n=29) и при действии на
его фоне 4 мкМ хелеритрина (n=26); *- p<0,05.
16
6.2. Влияние ингибитора CaMKII KN-62 (3 мкМ) на секрецию АХ при
ингибировании CaN при помощи CsA (1 мкМ)
CaMKII – широко известная Ca2+/CaM-активируемая протеинкиназа нервных
клеток (Merrill et al., 2005; Callin et al., 2008; Tang et al., 2012). Особенностью
этого фермента является то, что будучи активированным Ca2+/CaM, его
дальнейшая активность становится независимой от изменений уровня Ca2+/CaM
в клетке и сохраняется длительное время (Merrill et al., 2005).
Мы установили, что на фоне ингибирования CaMKII при помощи KN-62 (3
мкМ) ни КС каждого ПКП в залпе, ни рисунок залповой активности не
претерпевали достоверных изменений по сравнению с контролем (рис. 8). Это
означает, что при залповой активности синапсов основной вход Са2+ по P/Qтипу каналов не приводит к активации СаМКII и её вовлечению в регуляцию
выброса медиатора. Однако в случае растормаживания L-типа Са2+-каналов на
фоне блокады CaN мы получили свидетельства активации СаМКII и ее участия
в облегчении секреции АХ. В
присутствии KN-62 аппликация
CsA (1 мкМ) не приводит к
увеличению КС ПКП1 (рис. 8).
КС всех остальных ПКП в залпе
также не отличался от контроля.
Таким образом, мы впервые
установили, что в моторных
синапсах мыши при блокаде CaN
и растормаживании входа Са2+ по
каналам
L-типа
возрастание
вызванного
выброса
АХ Рис. 8. Изменение КС первых ПКП в залпах
(ПКП1), нормализованных по отношению к
предполагает участие активной
контролю (принят за 100%): на фоне 3 мкМ
СаМКII.
Однако
же,
при KN-62 (n=16) и при действии на его фоне 1
предварительном увеличении КС мкМ CsA (n=18); на фоне 1 мкМ CsA (n=12) и
ПКП за счёт действия CsA, при действии на его фоне 3 мкМ KN-62
дальнейшая
аппликация (n=22); *- p<0,05
ингибитора CaMKII не приводила к изменению вызванного выброса медиатора
по сравнению с действием CsA (1 мкМ) (рис. 8).
Скорее всего, это связано с тем, что для активации CaMKII ионы Ca2+
требуются только на начальных этапах ее работы, а после связывания Ca2+/CaM
фермент переходит в конститутивно активную автофосфорилированную форму,
независимую от концентрации Ca2+ (Merill et al., 2005). Кроме того, показано,
что KN-62 ингибирует активность фермента, взаимодействуя именно с
Ca2+/CaM-связывающим сайтом СаМКII, и, тем самым, предотвращает только
начальный этап активации этой киназы (Pellicena, Schulman, 2014). Поэтому
при растормаживании входа Ca2+ по каналам L-типа, СаМКII, связывая этот
17
Ca2+, становится автономно активной и последующая аппликация её
ингибитора (KN-62) может оказаться неэффективной.
Итак, нам удалось показать, что для усиления секреции АХ, наблюдаемой
при ингибировании CaN, наряду с растормаживанием L-типа Ca2+-каналов,
активированием РиР и выбросом депонированного Ca2+, требуется активация и
участие двух Ca2+-зависимых киназ терминали: РКС и CaMKII. Эти ферменты,
действуя на свои (пока не идентифицированные) мишени в терминалях, вносят
вклад в прирост КС ПКП и участвуют в поддержании облегчения передачи в
ходе залповой активности синапсов. Поскольку активность РКС и СаМКII
проявляется только на фоне растормаживания L-типа Ca2+-каналов, можно
заключить, что именно этот вход Ca2+ (в отличие такового по P/Q-типу каналов)
служит триггером для активации этих ферментов в моторных терминалях
мыши.
7. Реципрокные взаимодействия CаN и РКА в регуляции активности Lтипа Са2+-каналов и секреции АХ
Хорошо известно, что в регуляции активности белков функциональными
антагонистами фосфатаз являются протеинкиназы (Sim, 2003; Bastan et al.,
2014). В частности, в ЦНС в регуляции активности Ca2+-каналов L-типа, наряду
с CaN, как правило участвует и протеинкиназа А (РКА) (Sanderson and
Dell'Acqua, 2011; Oliveria et al., 2012; Murphy et al., 2014, Dittmer, 2014).
Поэтому в последней части нашей работы мы исследовали возможность
взаимодействия между CaN и PКА в управлении работой Ca2+-каналов L-типа.
7.1. Влияние ингибитора РКА H-89 (1 мкМ) на вызванную секрецию АХ
при ингибировании CaN при помощи CsA (1 мкМ)
Для выявления вклада активности РКА в усиление секреции АХ,
вызываемой блокадой CaN, мы исследовали эффекты CsA (1 мкМ) на фоне
действия ингибитора РКА – Н-89 (1 мкМ). Сам по себе Н-89 (1 мкМ) не
оказывал влияния на вызванную секрецию АХ: не наблюдалось изменений КС
ПКП (как первого, так и всех последующих ПКП) в залпе (рис. 9). Таким
образом, в условиях одиночной и кратковременной залповой активности
синапсов не удалось обнаружить выраженной регуляторной роли РКА,
связанной с выбросом АХ. Вместе с тем, мы обнаружили, что ингибирование
РКА предотвращало увеличение КС ПКП, обычно наблюдаемое при
аппликации CsA (1 мкМ) (рис. 9).
Эти данные позволяли предполагать, что РКА действительно задействована
в регуляции L-типа Ca2+-каналов в терминалях наряду с одновременно
существующей активностью CaN. В отличие от CaN, РКА оказывает
облегчающее действие на работу Ca2+-каналов L-типа, хоть это действие и
можно выявить лишь при отключении тормозного влияния CaN на L-тип
каналов. Отсюда следует, что в терминалях существует баланс +/- воздействий
18
на функциональное состояние Ca2+-каналов L-типа с участием соответственно
РКА и CaN. Причём в этом балансе обычно преобладает тормозное действие
CaN, что и обеспечивает подавленное латентное состояние L-типа Ca2+-каналов
в моторных терминалях. В таком случае, согласно нашим предположениям,
избирательное усиление активности РКА могло бы приводить к
растормаживанию входа кальция по L-типу каналов и усилению выброса АХ независимо от присутствия и сохранения активности CaN.
Рис. 9. Изменение квантового состава ПКП в контроле (n=15), на фоне ингибитора
РКА H-89 (1 мкМ) (n=19) и при действии CsA (1 мкМ) на фоне H-89 (n=15); На врезке
показаны средние значения амплитуды МПКП.
Для активации РКА требуется увеличение уровня цАМФ в цитоплазме
клетки, сопряжённое с активностью аденилатциклазы. Известно, что в
моторных терминалях присутствуют метаботропные рецепторы к аденозину
А2А-типа. Их активация эндогенным аденозином, образующимся в
синаптической щели при длительной работе синапса за счёт гидролиза
комедиатора АТФ, способна приводить к увеличению уровня цАМФ и
активации РКА в клетке (Oliveira et al., 2004; Oliveira, Correia-de-Sa, 2005).
7.2. Роль аденозиновых рецепторов А2А-типа в активации РКА и
регуляции секреции АХ
Для того чтобы выявить, участвуют ли аденозиновые рецепторы А2А-типа в
активации РКА и регуляции секреции АХ в моторных синапсах мыши,
работающих в режиме коротких залпов, мы исследовали действие антагониста
этих рецепторов ZM241385 (10 нМ) на КС ПКП. При блокировании А2Арецепторов при помощи ZM241385 КС ПКП в залпе не менялся по сравнению с
контролем (рис. 10).
Это говорит о том, что активация А2А-рецепторов эндогенным аденозином
при выбранном режиме работы моторных синапсов мыши в виде коротких
залпов не достаточна для оказания влияния на вызванный выброс АХ. Однако
19
мы установили, что предварительное блокирование А2А-рецепторов в этих же
условиях способно полностью предотвратить усиление выброса квантов
медиатора при аппликации CsA (1 мкМ) (рис. 10).
Отсюда следует, что активация А2А-типа рецепторов эндогенным
аденозином имеет место в терминалях и необходима для растормаживания
кальциевых каналов L-типа при ингибировании CaN и последующего усиления
секреции АХ.
Рис. 10. Изменение квантового состава ПКП в контроле (n=21), на фоне
антагониста А2А-рецепторов ZM241385 10 нМ (n=19) и при действии CsA (1 мкМ) на
фоне антагониста А2А-рецепторов (n=18); На врезке показаны средние значения
амплитуды МПКП.
Необходимо отметить, что действие антагониста А2А-рецепторов повторяло
картину действия ингибитора РКА, то есть само по себе оно никак не
сказывалось на секреции АХ, но предотвращало потенциацию секреции
медиатора при ингибировании CaN. Данный факт указывает на связь между
активацией A2A-рецепторов и активностью РКА, направленной на регуляцию
L-типа Ca2+-каналов и секрецию АХ.
Аппликация 1 мкМ CGS-21680 (агониста А2А-рецепторов) приводила к
достоверному увеличению КС каждого ПКП в залпе на 18-20% по сравнению с
контролем (для первого ПКП в залпе квантовый состав составил 33,29±1,41
(n=19) в контроле и 39,42±1,81 (n=28, p<0.05) на фоне CGS-21680) (рис. 11А).
Иными словами, дополнительная активация рецепторов А2А-типа их
экзогенным агонистом способна привести к существенному усилению секреции
АХ в ритмически активных нервно-мышечных синапсах мыши, несмотря на
присутствие активности CaN в терминалях.
Нам предстояло выяснить, осуществляется ли данный эффект CGS-21680
благодаря усиленной активации РКА, преодолевающей тормозное действие
CaN на L-тип Ca2+-каналов и облегчающей их работу. Для этого мы
20
исследовали действие CGS-21680 при селективном ингибировании РКА при
помощи H-89 или блокировании Ca2+-каналов L-типа нитрендипином.
На фоне блокады РКА активация A2A-рецепторов при помощи CGS-21680
не приводила к увеличению КС ПКП в залпе (рис. 11А). Помимо этого, прирост
КС ПКП, наблюдаемый при аппликации CGS-21680, возвращался к
контрольному уровню при добавлении 1 мкМ нитрендипина (рис. 11А).
В отдельной серии экспериментов мы показали, что блокирование РиР
рианодином (3 мкМ) также предотвращает вызываемое CGS-21680 облегчение
секреции АХ (рис. 11Б).
Рис. 11. Участие А2А-рецепторов в регуляции секреции АХ в нервно-мышечных
синапсах мыши. А) Изменение КС первых ПКП в залпах (ПКП1), нормализованных
по отношению к контролю (принят за 100%), на фоне CGS-21680 1 мкМ (n=28); на
фоне H-89 1 мкМ (n=11) и при действии CGS-21680 на фоне H-89 (n=21); а также при
действии нитрендипина (1 мкМ) на фоне CGS-21680 (n=14). *- p<0,05; Б) Изменение
КС ПКП по ходу ритмического залпа ПКП в контроле (n=24), на фоне 3 мкМ
рианодина (n=16) и при действии CGS-21680 мкМ на фоне рианодина (n=11). На
врезке показаны средние значения амплитуды МПКП.
21
Таким образом, дополнительная активация А2А-рецепторов и РКА приводит
к сдвигу баланса влияний на L-тип Ca2+-каналов в сторону облегчающего
влияния на них со стороны РКА, и это лежит в основе дальнейшей активации
РиР, выброса депонированного кальция через РиР и усиления секреции АХ.
Следующая серия подтвердила наше предположение о равноценности двух
способов растормаживания L-типа Ca2+-каналов (и усиления секреции АХ):
либо путем блокирования активности CaN, либо путем избирательного
усиления активности РКА. Мы показали, что на фоне предварительного
растормаживания входа Ca2+ по каналам L-типа (за счёт действия CsA) не
наблюдалось дополнительного прироста КС ПКП при действии CGS-21680
(рис. 12).
Рис. 12. Изменение квантового состава ПКП в контроле (n=29), на фоне CsA 1 мкМ
(n=34) и при действии CGS-21680 1 мкМ на фоне CsA (n=27). *- p<0,05; На врезке
показаны средние значения амплитуды МПКП.
Таким образом, мы показали, что в моторных терминалях мыши CaN и РКА
являются антагонистами в их влиянии на активность L-типа Ca2+-каналов и
далее
на
секрецию
АХ.
Наличие
аналогичного
баланса
2+
облегчающих/тормозных ферментативных воздействий на L-тип Ca -каналов и
секрецию медиатора описано недавно и в хромаффинных клетках мыши
(Mahapatra et al., 2012).
Суммируя полученные в работе данные, можно сказать, что впервые в
моторных нервных терминалях мыши удалось обнаружить многокомпонентный
каскад, находящийся под тормозным влиянием CaN. Данный каскад включает
активность L-типа кальциевых каналов, сопряженный выброс депонированного
кальция через РиР, а также активацию кальций-зависимых ферментов РКС и
СаМКII, оказывающих регулирующее влияние на вызванный выброс АХ при
ритмической активности моторных синапсов (рис. 13).
22
Рис. 13. Схема мишеней CaN и его взаимодействия с протеинкиназами и рецепторами
нервной терминали, участвующими в регуляции квантовой секреции АХ в моторных
синапсах мыши.
Заключение
В проведенной работе впервые обнаружено присутствие и специфическая
активность Са2+/CaM-зависимой фосфатазы – кальцинейрина (CaN) в моторных
терминалях мыши. Установлено, что пресинаптическая активность CaN
направлена на ограничение вызванной секреции АХ, судя по увеличению КС
ПКП на 30% при блокаде CaN. При этом, обнаруженная в терминалях
тормозная активность CaN не подавляется ингибированием кальмодулина, но
предотвращается блокадой протеазы кальпаина. Поэтому предполагается, что в
моторных терминалях основным способом поддержания активности CaN
является воздействие на кальцинейрин тонически активной протеазы кальпаина.
Такой кальпаин-зависимый тип активирования и поддержания активности CaN
недавно показан и в других моторных терминалях - в синапсах ракообразных
(Silverman-Gavrila et al., 2013).
В нашей работе впервые установлено, что мишенью тормозного действия
CaN в моторных терминалях являются медленные потенциал-активируемые
Саv1-каналы. Обычно при одиночной или залповой активности синапсов эти
каналы (в отличие от каналов P/Q-типа) не участвуют в запуске и регуляции
секреции АХ, являясь своего рода резервным пулом Са2+-каналов. Однако
показано, что растормаживание этого пула каналов (при определенных
воздействиях) существенно усиливает выброс АХ (Urbano et al., 2001; Gaydukov
23
et al., 2009). До сих пор считалось, что подавленное состояние (и неучастие
Са2+-каналов L-типа в регуляции секреции АХ) контролируется следовой К+гиперполяризацией, создаваемой активностью КСа–каналов ВК-типа,
активирующихся на спаде пресинаптического ПД (Flink, Atchison, 2003). Мы
впервые показали, что другим, не менее эффективным механизмом
удерживания L-типа Са2+-каналов в подавленном состоянии является их
дефосфорилирование со стороны фосфатазы CaN. Соответственно, подавление
активности
CaN
оказывается
не
менее
эффективным
способом
2+
растормаживания Са -каналов L-типа и выброса АХ, чем блокада ВКCaканалов.
Мы впервые установили, что наблюдаемое при блокаде CaN облегчение
секреции АХ включает наряду с растормаживанием и входом Са2+ по L-типу
Са2+-каналов еще и сопряженную с этим активацию РиР и выброс
депонированного кальция в терминалях. Такое функциональное сопряжение
Са2+-каналов L-типа и РиР кальциевых депо описано в нейронах мозга и
большинстве других возбудимых клеток, где имеется активность L-типа Са2+каналов (Mouton et al., 2001; Hu et al., 2015).
Мы обнаружили, что именно кальциевый сигнал, формируемый входом Са2+
по L-типу Са2+-каналов в сопряжении с выбросом депонированого Са2+
является необходимым условием для вовлечения в активность двух Са2+зависимых ферментов - РКС и СаМКII, которые в этом случае становятся
участниками процесса усиления выброса АХ. Действительно, блокада каждого
из них предотвращает усиленный выброс АХ только при входе ионов Са2+ по
активным каналам L-типа, но не влияет на выброс АХ при входе Са2+ по P/Qтипу Са2+-каналов. Такой избирательный способ активации внутриклеточным
кальцием СаМКII и РКС с последующим вовлечением их в потенцирование
секреции АХ в моторных нервных терминалях мыши описан впервые.
Медленные Са2+-каналы L-типа в возбудимых клетках обычно являются
объектом комплексной фосфатазно-киназной регуляции (Mahapatra et al., 2012;
Murphy et al., 2014, Dittmer et al., 2014). В моторных терминалях мыши мы
также обнаружили наряду с тормозной активностью CaN наличие
одновременного облегчающего влияния на L-тип Са2+-каналов со стороны
цАМФ-зависимой протеинкиназы А. В обычных условиях в балансе этих
одновременно и противоположно направленных воздействий преобладает
тормозная активность CaN на L-тип каналов, что и обеспечивает их
«замаскированное» состояние и отсутствие вклада в секрецию АХ. Мы
показали, что можно сдвинуть этот баланс в сторону растормаживания L-типа
Са2+-каналов и усиления выброса АХ либо за счёт подавления фосфатазной
активности CaN, либо – усиления облегчающей киназной активности РКА.
Последнее достигается путем избирательной добавочной активации
пресинаптических
метаботропных
А2А-аденозиновых
рецепторов,
24
контролирующих (через АЦ/цАМФ) активность РКА, направленную на
фосфорилирование L-типа Са2+-каналов в моторных терминалях мыши.
Таким образом, в нервно-мышечных синапсах мыши впервые описан
механизм управления секрецией АХ с участием фосфатазы CaN и
сопряженного с ней комплекса киназ, каналов и рецепторных структур нервных
терминалей.
ВЫВОДЫ
1. Ингибирование фосфатазной активности CaN (при помощи CsA, 1 мкМ
или CN412, 2,3 мкМ) приводит к значительному, на 30-37%, приросту
вызванного выброса АХ, что говорит о наличии тормозного действия
фермента на секрецию медиатора АХ в нервно-мышечных синапсах мыши.
Тормозная активность CaN контролируется со стороны протеазы кальпаина,
ингибирование которой воспроизводит эффекты блокады самого CaN.
2. Мишенью тормозного действия CaN в терминалях являются медленные
Cav1-каналы (L-типа): их растормаживание путем подавления активности CaN
(CsA, 1 мкМ) усиливает выброс АХ, который полностью блокируется
действием нитрендипина, 1 мкМ – блокатора L-типа Ca2+-каналов.
3. Вызываемое ингибированием CaN (CsA, 1 мкМ) облегчение секреции АХ
предотвращается
блокированием
рианодиновых
рецепторов
(РиР)
2+
внутриклеточных Са -депо при помощи рианодина, 3 мкМ или TMB-8, 1 мкМ.
4. Действие внутриклеточных Ca2+-буферов (ВАРТА-АМ и EGTA-АМ)
полностью
предотвращает
облегчение
секреции
АХ,
вызванное
2+
растормаживанием Ca -каналов L-типа при выключении активности CaN.
5. В моторных терминалях мыши ингибиторы двух Ca2+-зависимых киназ –
хелеритрин, 4 мкМ (ингибитор РКС) и KN-62, 3 мкМ (ингибитор CaMKII) - не
оказывают самостоятельного действия на КС ПКП, но способны полностью
подавить потенцирующий эффект СsA (1 мкМ) на вызванный выброс АХ.
6. Ингибирование РКА напрямую с помощью Н-89, 1 мкМ, или за счёт
блокады пресинаптических аденозиновых А2А-рецепторов, не влияет на
вызванный выброс АХ, но предотвращает облегчение секреции АХ при
ингибировании СaN.
7. Дополнительное стимулирование РКА при активации А2А-типа
рецепторов их агонистом CGS-21680, 1 мкМ растормаживает работу L-типа
Ca2+-каналов и вызывает облегчение секреции АХ на 30%, несмотря на
присутствие тормозного действия CaN на L-тип каналов.
25
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Гайдуков А.Е. Участие кальций-зависимой фосфатазы кальцинейрина в
регуляции работы нервно-мышечных синапсов мыши / Гайдуков А.Е., Тарасова
Е.О., Балезина О.П // Научные труды III съезда физиологов СНГ "Физиология и
здоровье человека", Ялта, Украина, 1-6 октября 2011, Москва. – 2011. - С. 51.
2. Тарасова Е.О. Участие кальций-зависимой фосфатазы кальцинейрина в
регуляции работы нервно-мышечных синапсов мыши // Тезисы докладов XIX
Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов-2012», 9-13 апреля 2012, Москва, Россия, 2012. - С. 260.
3. Tarasova E.O. The role of calcineurin (calcium/calmodulin dependent phosphatase
PP2B) in transmitter release regulation in mouse neuromuscular junctions / Tarasova
E.O., Gaydukov A.E., Balezina O.P. // 8th FENS Forum of neuroscience, Barcelona,
14-18 July 2012, Presentation Code: p052.31 - Abstract Number: 695 - Poster Board
Number: B53.
4. Гайдуков А.Е. Кальций-зависимая фосфатаза кальцинейрин тормозит вызванную
секрецию медиатора в нервно-мышечных синапсах мыши / Гайдуков А.Е.,
Тарасова Е.О., Балезина О.П. // Нейрохимия. – 2013. - Т. 30. - № 1. - С. 1-6.
5. Тарасова Е.О. Функциональное взаимодействие пресинаптической фосфатазы
кальцинейрина и протеинкиназ в моторных синапсах мыши / Тарасова Е.О.,
Гайдуков А.Е., Балезина О.П. // Сборник статей международной конференции
"Рецепторы и внутриклеточная сигнализация", Пущино, 27-30 мая 2013 г., M.:
ООО «ИД В. Ема». – 2013. -Т.1. - С. 393.
6. Гайдуков А.Е. Механизм тормозного действия кальцинейрина в моторных
синапсах мыши / Гайдуков А.Е., Тарасова Е.О., Балезина О.П. // Сборник тезисов
XXII съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Волгоград, 16-20
сентября 2013. – С.112.
7. Тарасова Е.О. А2А-рецепторы и кальцинейрин – функциональные антагонисты в
отношении активности L-типа кальциевых каналов в моторных синапсах мыши /
Тарасова Е.О., Гайдуков А.Е., Балезина О.П // Сборник тезисов 18-ой
Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология –
наука XXI века», Пущино, 21-25 апреля 2014. - С. 363-364.
8. Тарасова Е.О. Участие пресинаптических аденозиновых рецепторов А2А-типа в
модулировании секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах мыши /
Тарасова Е.О., Гайдуков А.Е., Балезина О.П // Современные проблемы науки и
образования. – 2014. - №3; URL: http://www.science-education.ru/117-13621 (дата
обращения: 20.06.2014).
9. Tarasova E. Presynaptic adenosine A2A-receptor mediated pathway acts as an
counteragent of calcineurin based downregulation of L-type calcium channel activity in
mouse neuromuscular junctions / Tarasova E., Gaydukov A., Balezina O // Thesis of
the 44th annual meeting of the Society for Neuroscience (SfN), Washington, USA, 1519 November 2014, Abstr. № 599, Synaptic Transmission: Modulation III, Tue, Nov
18, 1.00 – 5.00 PM.
26
10. Тарасова Е.О., Гайдуков А.Е., Балезина О.П. Способы активации и роль
кальмодулинкиназы II в регуляции секреции ацетилхолина в моторных синапсах
мыши // Нейрохимия. – 2015. – Т.32. - №2. – С. 123.
11. Тарасова Е.О. Роль пресинаптических кальциевых каналов L-типа и
рианодиновых рецепторов внутриклеточных кальциевых депо в регуляции
секреции ацетилхолина аденозиновыми рецепторами А2А- и А1-подтипов /
Тарасова Е.О., Митева А.С., Гайдуков А.Е., Балезина О.П. // Сборник статей
международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация",
Пущино, 25-28 мая 2015 г., цифровая типография Fix-Print, 2015. - Т.2. - С. 408413
12. Тарасова Е.О. Роль баланса активности аденозиновых рецепторов А2А- и А1типа в механизме регуляции секреции медиатора в нервно-мышечных синапсах
мыши / Тарасова Е.О., Митева А.С., Гайдуков А.Е.// Сборник тезисов 19-ой
Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология –
наука XXI века», Пущино, 20-24 апреля 2015. - С. 372.
13. Тарасова Е.О. Роль аденозиновых рецепторов и кальциевых каналов L-типа в
регуляции секреции медиатора в моторных синапсах мыши / Тарасова Е.О.,
Митева А.С., Гайдуков А.Е., Балезина О.П. // Биологические мембраны: журнал
мембранной и клеточной биологии. 2015. – Т.32. - № 5-6. – С. 1-12.
14. Тарасова Е.О. Роль аденозиновых рецепторов А1- и А2А-типа в регуляции
секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах мыши / Тарасова Е.О.,
Митева А.С., Гайдуков А.Е., Балезина О.П. // Motor Control 2016: материалы VI
Российской с международным участием конференции по управлению движением,
Казань, 14–16 апреля 2016, под общ. ред. Т.В. Балтиной, С.Г. Розенталь, А.В.
Яковлева, Г.Г. Яфаровой, Казань: Изд-во Казан. ун-та, 2016. - С. 109.
15. Тарасова Е.О. Участие кальмодулинкиназы II типа в регуляции секреции
медиатора в нервно-мышечных синапсах мыши // Тарасова Е.О., Гайдуков А.Е.,
Балезина О.П. // Сборник тезисов 20-ой Международной Пущинской школыконференции молодых учёных «Биология – наука XXI века», Пущино, 18-22
апреля 2016. - С. 290.
16. Tarasova E.O. Role of calcineurin and adenosine receptors in regulation of
acetylcholine release in mouse neuromuscular junctions // Tarasova E.O., Miteva A.S.,
Gaydukov A.E., Balezina O.P. // Biological Motility. – Puschchino: SYNCHROBOOK
– 2016. –242 p.
17. Tarasova E.O. Regulation of L-type calcium channel (Cav1) activity and acetylcholine
release by a balance of presynaptic calcineurin/PKA activity in mouse neuromuscular
junctions / Tarasova E.O., Gaydukov A.E., Balezina O.P. // 10th FENS Forum of
neuroscience, Copenhagen, 2-6 July 2016. - Abstract Number: FENS-0717 - Poster
Board Number: B035.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
8
Размер файла
1 035 Кб
Теги
кальций, зависимого, синапсах, фосфатазы, медиаторов, секреции, мыши, роль, кальцинейрина, регуляции, моторных
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа