close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate у Drosophyla melanogaster

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ОЛЕНКИНА ОКСАНА МИХАЙЛОВНА
ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ КЛАСТЕРОВ СЕМЕННИКСПЕЦИФИЧНЫХ ГЕНОВ STELLATE У DROSOPHYLA
MELANOGASTER
(03.01.03 – молекулярная биология)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА — 2014
Работа выполнена в Лаборатории биохимической генетики животных Отдела
молекулярной генетики клетки Федерального государственного бюджетного учреждения
науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.
Научный руководитель:
кандидат биологических наук,
Людмила Владимировна ОЛЕНИНА,
с. н. с. Лаборатории биохимической генетики животных
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Института молекулярной генетики Российской академии наук
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор, академик РАН
Владимир Алексеевич ГВОЗДЕВ
зав. Отдела молекулярной генетики клетки
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Института молекулярной генетики Российской академии наук
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор,
Андрей Георгиевич ЗАРАЙСКИЙ
зав. Лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза
Федерального государственного бюджетного
учреждения науки Института биоорганической химии
им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Российской академии наук
доктор биологических наук
Алексей Михайлович КУЛИКОВ
зав. Лабораторией эволюционной генетики развития
Федерального государственного бюджетного учреждения науки
Института биологии развития им. Н.К. Кольцова
Российской академии наук
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт биологии гена Российской академии
наук
Защита диссертации состоится «____» _____________ 2015 г. в _____ часов на заседании
диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном
учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской
академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта
Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
Автореферат разослан «___» __________ 2015 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат химических наук
А.М. Крицын
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Расположение генов в геноме эукариот носит неслучайный характер.
Для
генов,
обладающих
сходными
профилями
экспрессии
и/или
координированной экспрессией, характерно образование кластеров (Hurst et
al., 2004). По данным геномного анализа с применением ДНК-микрочипов,
свыше 20% генов Drosophila melanogaster образуют коэкспрессирующиеся
кластеры, состоящие в среднем из 10-30 генов (Spellman and Rubin, 2002;
Boutanaev et al., 2002). Кластеры дуплицированных генов приводят к
увеличению сложности организмов и вносят существенный вклад в
эволюцию видов. Тандемно организованные семенник-специфичные гены
Stellate представляют собой уникальное явление и являются частью
генетической
системы
Ste-Su(Ste),
необходимой
для
поддержания
фертильности самцов у Drosophila melanogaster.
Гены Stellate формируют два кластера в Х-хромосоме, один находится в
эухроматине (участок 12Е1-2 карты политенной Х-хромосомы), другой в
гетерохроматине (участок h26 митотической прометафазной карты Ххромосомы) (Hardy et al., 1984; Livak 1984; Palumbo et al., 1994; Tulin et al.,
1997). Различные линии D.melanogaster несут разное число повторов Stellate,
от 15-50 до 150-400 копий (Palumbo et al., 1994). Кодируемый ими белковый
продукт гомологичен регуляторной β-субъединице протеинкиназы CK2, CK2β
(Livak
1990;
Bozzetti
et
al.,
1995).
В
Y-хромосоме
расположены
высокогомологичные генам Stellate повторы Su(Ste) (Suppressor of Stellate)
также известные как локус crystal (Hardy et al., 1984). Повторы Su(Ste) несут
нарушенные ОРС и не транслируются, но транскрибируются в обоих
направлениях (Balakireva et al., 1992; Aravin et al., 2001). В норме экспрессия
генов Stellate в семенниках подавлена посттранскрипционно с помощью
коротких
piРНК,
образующихся
при
процессинге
антисмысловых
транскриптов Su(Ste) (Aravin et al., 2001; Vagin et al., 2006). Полная или
частичная потеря повторов Su(Ste) приводит к гиперэкспрессии генов Stellate,
к нарушениям мейоза и частичной или полной стерильности самцов. При
3
этом белок Stellate формирует большое количество игловидных или
звездчатых кристаллов в сперматоцитах (Hardy et al., 1984; Palumbo et al.,
1994; Bozzetti et al., 1995).
Растворимая форма белка Stellate, обнаруженная в ядрах сперматоцитов
самцов с делецией повторов Su(Ste), взаимодействует с каталитической αсубъединицей
протеинкиназы
СК2,
СК2α,
и
вызывает
модуляцию
фосфорилирования ряда мишеней СК2 в ядре (Egorova et al., 2009). Кроме
того, белок Stellate подвергается посттрансляционному триметилированию по
остатку лизина K92, структурно мимикрируя триметилирование гистона Н3
по остатку К9 (Egorova et al., 2009). Не исключено, что именно
триметилированная форма Stellate играет ключевую роль в аберрантном
мейотическом процессе за счёт изменения фосфорилирования ядерных
хромодоменных
белков,
участвующих
в
когезии
и/или
расхождении
гомологичных хромосом и сестринских хроматид в мейозе.
Повторы Stellate эволюционно фиксированы и сохраняют высокую
гомогенность в геноме D. melanogaster (Tulin et al., 1997; Kogan et al., 2000).
Гены Stellate представляют собой основную мишень piРНК-сайленсинга в
семенниках D. melanogaster (Aravin et al., 2001; Nagao et al., 2010). Т.о. для
поддержания фертильности самцов и воспроизводства вида необходима
интактная система генов Ste-Su(Ste) и корректная работа piРНК-зависимой
машины сайленсинга.
Остаются неизвестными как эволюционный смысл возникновения SteSu(Ste) системы, так и точный механизм вызываемого гиперэкспрессией
Stellate патогенеза. У других близкородственных видов Drosophila подобной
системы не обнаружено. Возникновение, эволюция и регуляция Ste-Su(Ste)
системы остается предметом интенсивных исследований (Kalmykova et al,
1997; 2002; Usakin et al., 2005; Nishida et al., 2007; Nagao et al., 2010; Kogan et
al., 2012). Однако до настоящего времени о транскрипционной регуляции
экспрессии генов Stellate было известно немного.
В ходе данной работы было проведено функциональное картирование
промотора генов Stellate, в результате которого в составе минимального
промоторного учаска были обнаружены три цис-регуляторных элемента,
известных как Е-боксы (CANNTG). Один и тот же фактор из ядерного
экстракта семенников (dUSF, транскрипционный фактор из семейства bHLH,
basic Helix-Loop-Helix) взаимодействовал со всеми тремя Е-боксами in vitro. С
помощью репортерного анализа была показана необходимость Е-боксов для
семенник-специфической транскрипции с использованием данного промотора
in vivo. Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип
семенник-специфического
промотора,
определяющего
смысловую
транскрипцию не только повторов Ste-Su(Ste), но и другого семейства
семенник-специфичных генов.
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы являлся анализ семенник-специфичного
промотора генов семейства Stellate. Для этого были поставлены следующие
задачи:
картировать цис-регуляторные участки в последовательности промотора
генов Stellate;
идентифицировать
тканеспецифичный
транскрипционный
фактор,
взаимодействующий с цис-регуляторными участками в промоторе генов
Stellate;
доказать функциональную значимость найденных цис-регуляторных
участков для транскрипции in vivo с помощью репортерных конструкций;
провести сравнительный анализ промоторов семейств генов Ste-Su(Ste)
и βNACtes;
сравнить активность репортерных конструкций под промотором генов
Stellate, встроенных в аутосомы и в Х-хромосому.
Научная новизна работы
В работе представлен анализ семенник-специфичного промотора генов
семейства Stellate. Впервые обнаружены в промоторной области три близко
расположенных цис-регуляторных участка, известных как Е-боксы, с
которыми взаимодействует один транскрипционный фактор - dUSF семейства
5
bHLH
(basic
Helix-Loop-Helix).
Для
dUSF
впервые
показана
его
тканеспецифичная экспрессия у D. melanogaster.
С использованием избирательно мутагенизированных репортерных
конструкций показано, что для эффективной семенник-специфической
транскрипции с промотора Stellate in vivo необходимы ненарушенные Ебоксы, причем наиболее важным регуляторным элементом является Е-бокс 2.
Сравнительный анализ последовательностей промоторов генов Stellate, Su(Ste)
и βNACtes позволил установить, какие из Е-боксов являются общими для всех
генных семейств. Был также обнаружен потенциальный сайт связывания
неизвестного транскрипционного фактора в промоторной области двух генов
семейства βNACtes, несущих делецию Е-бокса 2 в промоторе. Поскольку мы
не обнаружили Е-боксов в составе известных семенник-специфичных
промоторов, то промотор Stellate может рассматриваться как новый тип
промотора, ответственный за семенник-специфичную транскрипцию.
С помощью анализа экспрессии репортерных конструкций P{Ste703lacZ} и P{6Stellate-Ste703-lacZ}, встроенных в различные хромосомы, мы
впервые показали, что активность эндогенного промотора семенникспецифичных генов Х-хромосомы определяется контекстом хроматина Xхромосомы в герминальных клетках самцов и является сниженной вдвое по
сравнению с таковой в аутосомах. Это позволяет говорить о двух уровнях
репрессии генов Stellate, один из которых реализуется на уровне хроматина,
приводя к частичному подавлению их транскрипции, а другой основан на
посттранскрипционном
piРНК-сайленсинге,
обеспечивающем
полную
репрессию этих генов.
Практическая значимость
Нарушения слаженного механизма работы генетической системы SteSu(Ste) приводит к значительным дефектам сперматогенеза, воспроизводства
и поддержания вида. И если о посттранскрипционном сайленсинге генов
Stellate с помощью piРНК в настоящий момент известно довольно много, то о
регуляции транскрипции генов Stellate данных чрезвычайно мало. В работе
охарактеризован новый тип тканеспецифичного промотора, выявлены цис-
регуляторные участки и идентифицирован взаимодействующий с ними
фактор. Результаты данной работы расширяют наши знания о механизмах
тканеспецифичной экспрессии генов, о транскрипционной регуляции разных
генных семейств, обладающих одинаковым промотором и о влиянии Ххромосомного
контекста
на
экспрессию
Х-сцепленных
генов
на
премейотических стадиях сперматогенеза.
Апробация работы
Работа апробирована на лабораторном семинаре в Отделе молекулярной
генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН.
Данные, полученные в работе, были представлены на следующих
научных симпозиумах и конференциях: Eighteenth IGB meeting “Epigenetic
Bases of Genome Reprogramming” (Capri, Italy, 8 – 11 October, 2005), 48th
Annual Drosophila Research Conference (Philadelphia, USA, March 7-11, 2007),
Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology
and genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov (Kiev, Ukraine, 20-22
September, 2007), на IV Международной научной конференции «Факторы
экспериментальной
сентября,
2008
г.),
эволюции
на
организмов»
Международный
(Алушта,
научной
Украина,
22-26
конференции
по
биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной
75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 28
сентября - 1 октября, 2009 г.), на XXV Международной зимней молодежной
научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии», посвященной 30-летию Научно-образовательного центра
ИБХ РАН (Москва, Россия, 11-15 февраля, 2013 г).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных
реферируемых
журналах,
статья
в
сборнике
трудов
международной
конференции и глава в серийном издании «Drosophila Melanogaster: Life
Cycle, Genetics and Development».
7
Структура и объем диссертации
Материал диссертации изложен на 147 страницах машинописного
текста, содержит 39 рисунков. Список цитированной литературы состоит из
262 работ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии Drosophila melanogaster
Для
P-элементной
трансформации
использовали
линию
Df(1)w67c23(2)y; в работе обозначена как yw. Линия с делецией большей части
повторов Su(Ste) на Y хромосоме cry1Y ywf/C(1)DX, yf/cry1BSYy+,описана в
работе Palumbo et al., 1994; в работе обозначена как cry1.Были использованы
линии, несущие конструкции P{Ste134-lacZ} (Aravin et al., 2001), P{Ste703lacZ} (Аравин и др., 2000) и P{Ste134mut-lacZ} (Aravin et al, 2004), последняя
обозначена как Ste134-E3M-lacZ. Для ремобилизации конструкции P{Ste134lacZ} (получения трансгенных линий с различными местами встройки в
геном), была использована линия w*; wgSp-1/CyO; ry506 Sb1 P{Δ23}99B/TM6B, Tb1.
Молекулярно-биологические методы
Клонирование,
гетерологичную
экспрессию
в
клетках
E.
coli,
гибридизацию по Саузерну, Вестерн-блот анализ и другие традиционные
манипуляции проводили согласно общепринятым методикам. P-элементную
трансформацию эмбрионов дрозофилы проводили по стандартной методике
(Rubin and Spradling, 1982). Выделение ядерного экстракта из семенников
проводили по методу, описанному в работе Klymenko et al., 2006, с
небольшими модификациями.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Идентификация цис-регуляторных участков в промоторе генов Stellate
Как показано ранее, репортерные конструкции, несущие в качестве
промоторов
проксимальные
5'-участки
(225
п.н.
и
134
п.н.)
гетерохроматиновых генов Stellate (Ste225-lacZ и Ste134-lacZ), достаточны для
высокоуровневой экспрессии β-галактозидазы в семенниках самцов с
делецией локуса crystal (cry1Y) (Aravin et al., 2001). Фрагмент размером 134
п.н., включающий -101 п.н. перед и +33 п.н. после старта транскрипции,
может рассматриваться как минимальный промотор генов Stellate. Известно,
что многие гены, экспрессирующиеся в семенниках, имеют чрезвычайно
короткие промоторы (White-Cooper, 2010).
Рис.1. Схема проксимального промоторного участка гетерохроматиновых генов
Stellate. Старт транскрипции (+1) обозначен стрелкой, последовательность Inr выделена
красной рамкой, последовательность DPE - синей, последовательности Е-боксов —
прямоугольной. Последовательности олигонуклеотидных зондов для гель-шифта (Ste 1,
Ste 2, Ste 3 и Ste 4) подчёркнуты.
Для обнаружения цис-регуляторных участков в минимальном промоторе
генов Stellate был применён EMSA анализ (Electrophoretic Mobility Shift Assay,
или гель-шифт). В качестве зондов был использованы четыре радиоактивно
меченых по 5´-концу двуцепочечных олигонуклеотида размером 27-37 п.н.
(Ste 1, Ste 2, Ste 3 и Ste 4), полностью перекрывающие последовательность
минимального промотора гетерохроматиновых генов Stellate (Рис. 1). Мы
обнаружили формирование специфичных ДНК-белковых комплексов с
одинаковой электрофоретической подвижностью (С1) для зондов Ste 1, Ste 2 и
9
Ste 4 после инкубации их с ядерным экстрактом семенников (Рис. 2). Для
зонда Ste 2 характерно образование двух комплексов, помимо комплекса С1,
формировался комплекс С2, обладающий большей электрофоретической
подвижностью (Рис. 2). Специфичность ДНК-белковых комплексов была
подтверждена с помощью контрольных экспериментов: добавления 50-ти
кратного избытка немеченого двуцепочечного олигонуклеотида с той же
последовательностью было
достаточно для
эффективного подавления
формирования комплексов С1, тогда как добавление такого же избытка
немеченого
двуцепочечного
последовательностью
не
олигонуклеотида
оказывало
влияния
на
со
случайной
связывание
зондов.
Эффективность образования комплекса С1 воспроизводимо уменьшается в
ряду Ste 2 (1) > Ste 4 (0,71)> Ste 1 (0,1) (в скобках приведена относительная
интенсивность сигнала).
Рис. 2. Детекция ДНК-белковых комплексов. Показан результат EMSA с
радиоактивно-мечеными
олигонуклеотидами,
перекрывающими
минимальный
промотор генов Stellate, после инкубации с ядерным экстрактом семенников.
Специфичность комплексов подтверждена конкурентным анализом при добавлении 50ти кратного избытка немеченых специфического (специфический конкурент) или
неспецифического (неспецифический конкурент) олигонуклеотидов.
Одинаковая подвижность в геле всех трех ДНК-белковых комплексов
С1 указывала на то, что один и тот же транскрипционной фактор из ядерного
экстракта семенников может связываться с одинотипными сайтами в
последовательности каждого из трех зондов. Олигонуклеотид Ste 2,
формирующий ДНК-белковый комплекс с наибольшей интенсивностью
сигнала, содержит палиндромную гексануклеотидную последовательность
CACGTG, известную из данных литературы как Е-бокс (E-бокс 2, -47–-42 п.н.)
(Рис. 1). Е-боксы являются регуляторными элементами, распознаваемыми
транскрипционными факторами семейства bHLH и рядом других факторов
(Atchley
and
Fitch,
1997;
Ledent
et
al.,
2002).
Выравнивание
последовательностей зондов Ste 1 и Ste 4 относительно Ste2 позволило также
обнаружить в их составе по одному вырожденному непалиндромному Е-боксу
- CATCTG (E-бокс 1, -87 – -82 п.н.) и CAAGTG (E-бокс 3, +18 – +23 п.н.),
соответственно (Рис. 1 и 3А). Таким образом, были обнаружены три
потенциальных цис-регуляторных участка в минимальном промоторе генов
Stellate.
EMSA с использованием ядерного экстракта из голов мух и
эмбрионального ядерного экстракта выявил формирование ряда других
комплексов с отличной от С1 электрофоретической подвижностью. Поэтому
белковый фактор, взаимодействующий с зондами Ste 1, Ste 2 и Ste 4, повидимому, является тканеспецифичным для семенников.
Мы показали, что семенник-специфический фактор связывается именно
с Е-боксом в последовательности Ste 2, поскольку при использовании в
качестве зонда олигонуклеотида Ste 2mut (в котором последовательность Ебокса 2 CACGTG была заменена на GGCTAT) образование комплекса С1
нарушалось (Рис. 3Б). Образование комплекса зависело также от присутствия
ионов Mg2+ (Рис. 3Б).
Чтобы подтвердить гипотезу о связывании одного фактора со всеми
тремя олигонуклеотидами мы провели EMSA в присутствии 70-ти кратного
молярного избытка немеченых конкурентов Ste 2 или Ste 2mut, а также в их
отсутствии (Рис. 3В). Добавление избытка немеченого Ste 2 эффективно
11
нарушает образование комплекса С1 для всех трех зондов. При этом избыток
немеченого Ste 2mut не влияет на образование комплексов. Поскольку
олигонуклеотид Ste 2 взаимодействует с фактором из экстракта семенников
через Е-бокс (Рис. 3Б), то и с остальными зондами Ste 1 и Ste 4 он
конкурирует благодаря Е-боксу, в отсутствие которого (Ste 2mut) конкуренции
не происходит (Рис. 3В). Следовательно, все три Е-бокса взаимодействуют с
одним и тем же фактором.
Рис. 3. Идентификация цис-регуляторных участков в промоторе генов Stellate. (А)
Олигонуклеотиды Ste 1, Ste 2 и Ste 4 содержат мотивы, известные как Е-боксы (выделены
шрифтом). (Б) Связывание олигонуклеотидного зонда Ste 2 с белком из ядерного экстракта
зависит от присутствия ионов Mg2+ и последовательности Е-бокса. При использовании
зонда Ste 2mut (с нарушенным Е-боксом) образование комплекса С1 не происходит. (В) Все
три олигонуклеотидных зонда, Ste 1, Ste 2 и Ste 4, связываются с одним и тем же фактором
из ядерного экстракта семенников. Представлен результат EMSA в присутствии 70-ти
кратного молярного избытка немеченых конкурентов Ste 2 или Ste 2mut, а также в их
отсутствии. Немеченый Ste 2 конкурирует с меченым за образование комплекса С1.
Немеченый Ste 2mut (с нарушенным Е-боксом) не влияет на образование комплекса С1.
Идентификация фактора, связывающего Е-боксы, в промоторе
гетерохроматиновых генов Stellate
Е-боксы
узнаются
транскрипционными
факторами
обширного
семейства белков basic Helix-Loop-Helix (bHLH), а также некоторыми другими
белками. Транскрипционные факторы bHLH играют важную роль в регуляции
различных клеточных процессов у эукариот. Белки семейства bHLH
связываются с Е-бокс-мотивами как гомо- и гетеродимеры или в составе
сложных мультибелковых транскрипционных комплексов (Atchley and Fitch,
1997; Legent et al., 2002).
Связывание фактора с Е-боксами зависело от ионов Mg2+ (Рис. 3Б).
Более быстро мигрирующий комплекс С2 (Рис. 2 и Рис. 3В) часто
обнаруживался в EMSA с зондом Ste 2. Избыток немеченого специфического
конкурента эффективно предотвращал формирование обоих комплексов, С1 и
С2 (Рис. 2 и Рис. 3В). Такой же избыток неспецифического конкурента не
влиял на комплекс С1, тогда как формирование комплекса С2 заметно
снижалось. Полуспецифический комплекс С2 становился более заметным при
длительном хранении ядерных экстрактов семенников при -70°С, тогда как
относительная интенсивность сигнала С1 при этом уменьшалась. Однако, при
увеличении концентрации DTT в инкубационной смеси с 1 до 5 mM и выше
удавалось достичь воспроизводимого увеличения содержания комплекса С1 и
ослабление
сигнала
от
комплекса
С2
(Рис.
4А).
Формирование
полуспецифичного комплекса С2 может быть объяснено слабым связыванием
мономера транскрипционного фактора семейства bHLH с полусайтом Ебокса,
что,
возможно,
связано
с
внутримолекулярным
окислением
сульфгидрильных групп при длительном хранении экстракта и препятствием
для образования димеров фактора для взаимодействия с целым Е-боксом.
Подобное влияние окислительно-восстановительных условий среды было
ранее описано для фактора USF млекопитающих (Marmillot and Scovell, 1998;
Pognonec et al., 1992), так же как и зависимость от ионов Mg 2+ (Bendall and
Molloy, 1994). Таким образом, по биохимическим свойствам фактор,
13
взаимодействующий с Е-боксами в промоторе Stellate. похож на USF
млекопитающих.
Рис. 4. Идентификация Е-бокс-связывающего фактора ядерного экстракта
семенников. (А) Влияние концентрации дитиотрейтола (ДТТ) на взаимодействие фактора с
зондом Ste 2. (Б) «Супер-шифт» EMSA при добавлении антител в реакционную смесь.
Наблюдается появление нового медленно мигрирующего комплекса S1, при добавлении
анти-dUSF антител, но не анти-Piwi антител.
Продукт гена CG17592 D. melanogaster, dUSF, был предсказан
биоинформатическими методами, но биохимически не исследован (Moore et
al., 2000), однако EST-библиотеки из семенников взрослых мух содержали
клоны dusf мРНК. Для подтверждения гипотезы о взаимодействии dUSF с Ебоксами в составе промоторов генов Stellate мы получили мышиные
поликлональные антитела против укороченной (рекUSF1) и полноразмерной
(рекUSF2) формы рекомбинантного dUSF (Рис. 5) и провели EMSA.
Добавление анти-dUSF антител в реакционную смесь вызывало уменьшение
сигналов комплексов С1 и С2 и появление более медленно мигрирующего
комплекса S1 (т.н. “супер-шифт”) (Рис. 4Б). Добавление антител к другому
ядерному белку, Piwi, не влияло на образование и миграцию в геле
комплексов С1 и С2. Полученные результаты позволяют рассматривать dUSF
как транскрипционный фактор из экстракта семенников, ответственный за
связывание с E-боксами и формирование С1 и С2 комплексов.
Рис. 5. Вестерн-блот анализ рекомбинантных белковых фрагментов
рекUSF1, рекUSF2 и эндогенного dUSF в лизатах различных тканей мух yw с
использованием полученных анти-dUSF антител. Белок с мобильностью около 55-57
кДа детектируется только в лизате семенников. В каркасах наблюдается
неспецифическая полоса большей подвижности (*). Антитела к актину
использованы для контроля закрузки, антитела к Vasa - для маркировки
герминальных тканей.
15
Рис. 6. Иммунофлуоресцентное окрашивание семенников yw (А, Б) и S2 клеток
Drosophila (В) с использованием анти-dUSF антител (зеленый сигнал). Хроматин окрашен
с помощью DAPI (голубой). Ядерные оболочки визуализированы с помощью антител к
ламину (красный). (А) Диффузное внутриядерное и цитоплазматическое окрашивание
dUSF видно в сперматоцитах. (Б) показано увеличенное изображение ядер двух
сперматоцитов, обозначенных в (А) белым квадратом, (В) Никакого сигнала dUSF в S2
клетках Drosophila не наблюдается.
Экспрессия Stellate происходит в первичных сперматоцитах самцов, с
делеций локуса Su(Ste) (Aravin et al., 2004; Bozzetti et al., 1995; Egorova et al.,
2009).
Иммунофлуоресцентное
окрашивание
семенников
показало
присутствие dUSF в ядрах, а также в цитозоле первичных и зрелых
сперматоцитов (Рис. 6А, 6Б), подтверждая предположение о том, что dUSF
требуется для семенник-специфической транскрипции генов Stellate. Сигнал
dUSF в S2 клетках Drosophila не был детектирован (Рис. 6В), в соответствии с
отсутствием в них экспрессии dUSF (Рис. 5).
Функциональность цис-регуляторных элементов в промоторе генов
Stellate
Для подтверждения функциональности Е-боксов в промоторе генов
Stellate in vivo использовали конструкцию Ste134-E123M-lacZ, содержащую
минимальный промотор генов Stellate с тремя нарушенными Е-боксами. С
помощью
Р-элементной
трансформации
эмбрионов
были
получены
трансгенные линии, содержащие конструкцию в различных участках генома.
Для получения сравнимого количества контрольных линий с интактным
промотором была проведена ремобилизация трансгена Ste134-lacZ в ранее
полученной линии
(Aravin et al., 2001). Трансгенные линии содержали
встройку конструкции в аутосоме и были введены в геном самцов с делецией
основной части локуса crystal, cry1Y. Потеря всех трех Е-боксов в составе
промотора Stellate приводила к снижению экспрессии lacZ в семенниках в
среднем до 4%, в сравнении с интактным промотором (Рис. 7 и Рис. 8А).
Активность β-галактозидазы в головах трансгенных мух достоверно не
отличалась от активности фермента в контрольной линии yw (не показано),
что свидетельствует о специфичности экспрессии в семенниках. Полученные
результаты строго свидетельствуют о функциональности Е-боксов в составе
промотора Stellate in vivo.
17
Рис. 7. Гистохимическое окрашивание семенников мух, несущих конструкцию
Ste134–E123M–lacZ, и контрольных линий мух, субстратом ß- галактозидазы X-gal.
При нарушении всех трёх Е-боксов в конструкции Ste134-E123M-lacZ активность
репортёрного гена значительно снижается. Слабый уровень экспрессии наблюдается
только в линии №1, в положительном контроле, линии Ste134-lacZ, детектируется
сильное окрашивание семенника. Никакой активности не наблюдалось в семенниках
мух yw, не несущей трансгенную конструкцию.
Только
Е-бокс
последовательность
2
содержит
CACGTG,
каноническую
известную
как
палиндромную
сайт
узнавания
транскрипционными факторами семейства bHLH групп B и C, остальные два
Е-бокса являются вырожденными (рис. 3А). Потеря центрального Е-бокса 2 c
заменой его на TGCGAT достоверно (p<0.05) приводила к падению
активности β-галактозидазы на 55% (Рис. 8Б), тогда как разрушение Е-бокса
3 в конструкции Ste134-E3M-lacZ не приводило к достоверному уменьшению
активности β-галактозидазы (Рис. 8Б) и (Aravin et al., 2004). Следовательно,
любого из двух Е-боксов, 2-го или 3-го, достаточно для поддержания
транскрипции генов Stellate, хотя для высокоуровневой транскрипции
необходимо присутствие палиндромного Е-бокса 2.
Рис. 8. Анализ активности репортерных конструкций in vivo в семенниках. Слеваобозначения и схемы соответствующих трансгенных конструкций, Е-боксы обозначены
серыми квадратами. Справа - активность β-галактозидазы (см. Методы исследования). (А)
Резкое уменьшение активности β-галактозидазной при нарушении трёх Е-боксов. (Б)
Активность β-галактозидазы при нарушении Е-бокса 2 (конструкция Ste134-E2M-lacZ)
падает вдвое. Нарушение Е-бокса 3 (конструкция Ste134-E3M-lacZ) не сказывается на
активности β-галактозидазы.
Дивергенция в промоторной области генов семейства βNACtes
Обнаружение
в
Х-хромосоме
cеменник-специфичных
дуплицированных генов βNACtes с промоторами, гомологичными промоторам
генов Stellate (Usakin et al., 2005), позволяет рассмотреть вопрос, касающийся
19
изменчивости цис-регуляторных участков в промоторах тканеспецифичных
генов. Гены βNACtes предположительно кодируют белок, гомологичный βсубъединице комплекса белков, связывающихся с растущей полипептидной
цепью (NAC, Nascent polypeptide-Associated Complex). Семейство генов
βNACtes в Х-хромосоме представлено пятью копиями, расположеными в
секции 12Е Х-хромосомы вблизи одного из кластеров генов Stellate (Usakin et
al., 2005) и псевдогеном βNACtes5 расположеным в секции 13Е. Четыре гена
(βNACtes3, βNACtes4 и βNACtes6, βNACtes2) образуют два тандемных повтора
«голова к хвосту» на расстоянии 65 т.п.н. друг от друга (в противоположной
ориентации)
(Рис.
9А).
βNACtes1
и
псевдоген
βNACtes5
являются
одиночными копиями (Usakin et al., 2005).
Ранее показана высокая степень гомологии (до 95%) на протяжении 180
п.н. в промоторных областях генов Stellate и βNACtes (Usakin et al., 2005).
Установлено, что в промоторах генов βNACtes наблюдается низкий уровень
дивергенции и для 5'-копий тандемов (3,3%), и для 3'-копий (1,1%). Однако
уровень различий между 5'- и 3'- копиями достигал 8,3%. Различия
затрагивали последовательности Е-боксов. Е-боксы 1 и 2 оказались
консервативными только в 5'- копиях обоих тандемов и в одиночном гене
βNACtes1, тогда как 3'-копии утратили Е-боксы (Рис. 10, внизу). В промоторах
βNACtes2 и βNACtes4 Е-бокс 1 был разрушен в результате точечной мутации,
а палиндромный Е-бокс 2 полностью исчез в разультате делеции 17 п.н. Мы
тестировали в EMSA с ядерным экстрактом семенников олигонуклеотиды
NAC1 и NAC2, перекрывающие измененные участки. Только зонд NAC2
(соответствующий области с делецией 17 п.н.) образует специфичный ДНКбелковый комплекс С3 в ядерном экстракте семенников (Рис. 9Б). Добавление
100-кратного избытка немеченого олигонуклеотида Ste2 не разрушало
комплекс С3, что свидетельствует о том, что dUSF не взаимодействует с
последовательностью NAC2 (Рис. 9Б). Зонд NAC2 содержит протяженный
участок, богатый нуклеотидами A и T (ТТТТТАААААААААА), появившейся
в результате делеции 17 п.н. в промоторе. Мы предполагаем, что этот элемент
с потенциальной крестообразной структурой может служить сайтом
связывания для белков содержащих AT-hook.
Рисунок
9.
(А)
Геномная организация кластера
генов βNACtes в Х хромосоме.
Кластер состоит из единичного
гена βNACtes1 и двух пар
тандемно
дуплицированных
генов (βNACtes3 и βNACtes4;
βNACtes6
и
расположенных
βNACtes2),
«голова
к
хвосту».
(Б) Результаты EMSA с
использованием
олигонуклеотидных
зондов
NAC1 и NAC2. В ядерном
экстракте
семенников
содержится белковый фактор,
который
специфично
взаимодействует с зондом NAC2 с образованием комплекса С3.
Е-бокс 3 в минимальном промоторе генов Stellate находится за
пределами области гомологии с промоторами генов βNACtes, и в промоторах
генов βNACtes отсутствует (Рис. 10). В целом, из промоторов генов βNACtes2
и βNACtes4 исчезли функционально значимые цис-регуляторные элементы
генов Stellate.
21
Рисунок 10. Сравнительная схема организации промоторных областей генов SteSu(Ste) и βNACtes. Условные обозначения приведены в нижней части схемы. Область
гомологии в промоторах выделена серыми прямоугольниками. Нумерация Е-боксов
соответствует указанной в тексте автореферата. Обозначены положения зондов NAC1
и NAC2, соответствующих точечной мутации в области Е-бокса 1 и небольшой
делеции последовательности, приводящей к потере Е-бокса у генов βNACtes2 и
βNACtes4.
Таким образом, мы показали, что Е-бокс 1 и Е-бокс 2 являются
консервативными только для трёх копий генов семейства βNACtes: βNACtes1,
βNACtes3 и βNACtes6, тогда как другие два члена семейства βNACtes2 и
βNACtes5 свои Е-боксы утратили за счёт точечной замены и небольшой
делеции (Рис. 10). Возможно, что потеря Е-боксов и приобретение нового
цис-регуляторного участка частью промоторов генов βNACtes может быть
результатом положительного отбора, благоприятствующего фиксации этих
изменений.
Репрессия активности трансгенов в X-хромосоме
В соматических клетках Drosophila гены, расположенные в Xхромосоме, подвергаются дозовой компенсации, т.е. в соматических клетках у
самцов активность генов в единственной Х-хромосоме вдвое выше, чем
каждого из генов в X-хромосоме самок. Дозовая компенсация обеспечивается
привлечением к X-хромосоме самца комплекса белков MSL (male-specific
lethal) и ацетилированием гистона H4 по положению K16 (ацетил-H4K16)
(Gelbart and Kuroda, 2009; Avner and Heard, 2001; Lucchesi et al., 2005).
Дозовая компенсация не распространяется на герминальные клетки самцов,
где хроматин X-хромосомы лишен ряда белков комплекса MSL и не обогащен
позитивной модификацией ацетил-H4K16 (Rastelli and Kuroda, 1998;
Meiklejohn et al., 2011).
Мы сравнили активность репортерного гена под контролем промотора
гетерохроматиновых генов Stellate (в конструкциях P{Ste703-lacZ} и
P{6Stellate-Ste703-lacZ}) при встраивании трансгенов в аутосомы и Ххромосому. Было обнаружено, что экспрессия трансгенов в Х-хромосоме,
снижена на 53-63%, по сравнению с экспрессией таких же трансгенов,
локализованных в аутосомах (Рис. 11).
23
Рис. 11. Анализ активности репортерных конструкций P{Ste703-lacZ} и P{6StellateSte703-lacZ} in vivo в семенниках трансгенных самцов. По оси ординат: полученные
значения β-галактозидазной активности, представленные как ОП*. Анализ экспрессии
трансгенов в Х-хромосоме (темно-серые столбики) показал снижение β-галактозидазной
активности, в среднем на 63% (для конструкций P{Ste703-lacZ}) и на 53% (для
конструкций
P{6Stellate-Ste703-lacZ}),
по
сравнению
с
теми
же
трансгенными
конструкциями в аутосомах (светло-серые столбики).
Таким образом, показано, что в трансгенных конструкциях активность
промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы в герминальных
клетках
определяется
контекстом
хроматина
X-хромосомы.
Можно
предположить, что на премейотической стадии сперматогенеза, в первичных
сперматоцитах, наблюдается специфическая перестройка хроматина Xхромосомы, проявляющаяся в подавлении экспрессии генов. Это показывает
существование двух уровней репрессии генов Stellate, один из которых
реализуется на уровне хроматина, приводя к частичному подавлению их
транскрипции, а другой основан на пост-транскрипционном piРНКсайленсинге, обеспечивающем полную репрессию этих генов.
Выводы
1. В составе промоторов семенник-специфичных генов Stellate у
Drosophila
melanogaster
обнаружены
три
консервативных
цис-
регуляторных участка, Е-боксы (CANNTG). Наличие в промоторе генов
Stellate двух Е-боксов из трех необходимо и достаточно для семенникспецифичной экспрессии репортерного гена.
2. Транскрипционный фактор dUSF из семейства bHLH экспрессируется в
сперматоцитах Drosophila melanogaster и специфично взаимодействует
с Е-боксами в составе промотора генов Stellate.
3. Экспрессия трех генов семейства βNACtes в семенниках определяется
Е-бокс-содержащим промотором, гомологичным промотору Stellate.
Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип семенникспецифичного промотора.
4. Выявлена фиксированная потеря Е-боксов в результате делеции и
точечной мутации без изменения остальной последовательности
промотора в отдельных копиях семенник-специфичных генов βNACtes.
5. В герминальных клетках самцов активность промотора семенникспецифичных
генов
Stellate
в
трансгенных
конструкциях,
расположенных на Х-хромосоме, снижена вдвое по сравнению с его
активностью в аутосомах, т.е. определяется контекстом хроматина Xхромосомы в сперматоцитах.
25
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи
1. Olenkina O.M., Egorova K.S., Kibanov M.V., Gervaziev Y.V., Gvozdev
V.A., Olenina L.V. (2012) Promoter contribution to the testis-specific
expression of Stellate gene family in Drosophila melanogaster. Gene,
499(1), 143-153.
2. О.М. Оленкина, К.С. Егорова, А.А. Аравин, Н.М. Наумова, В.А.
Гвоздев, Л.В. Оленина (2012) Картирование цис-регуляторных участков
в промоторе семенник-специфичных генов Stellate у Drosophila
melanogaster. Биохимия (Москва), том 77, вып. 11, с. 1536 – 1545.
3. Ksenia S. Egorova, Oxana M. Olenkina, Ludmila V. Olenina. Significance
of Stellate Genes in Spermatogenesis of Drosophila melanogaster. (Chapter
in «Drosophila Melanogaster: Life Cycle, Genetics and Development», ed.
M. Spindler-Barth, Nova Science publishers, 2012, p.39-61, ISBN: 978-161470-426-3.
4. Oxana M. Olenkina, Ludmila V. Olenina, Sergei A. Lavrov, Mikhail S.
Klenov, Vladimir A. Gvozdev. Analysis of testis-expressed Stellate genes
promoter
region
in
D.
melanogaster.
В
сборнике
трудов
IV
Международной научной конференции «Факторы экспериментальной
эволюции организмов» (Алушта, Украина, 22-26 сентября 2008 г.), стр.
352-357.
Тезисы
1. Olenkina O.M., Olenina L.V., Lavrov S.A. and Gvozdev V.A. The study of
chromatin structure of Stellate repeats in testes of Drosophila melanogaster.
Eighteenth IGB meeting “Epigenetic Bases of Genome Reprogramming”,
Capri, Italy, 8 – 11 October 2005, Abstract volume, p.68.
2. Olenkina O.M., Olenina L.V., Lavrov S.A. and Gvozdev V.A. In vitro search
of the tissue specific trans-acting factor interacting with regulatory
sequences of the testis expessed Stellate genes in Drosophila melanogaster.
48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, USA, March 711 2007, Program and Abstract Volume, p. 365B.
3. Lev Usakin, Oxana Olenkina, Vladimir Gvozdev. Evolutionary analysis of
the D. melanogaster betaNACtes gene family. 48th Annual Drosophila
Research Conference, Philadelphia, USA, March 7-11 2007, Program and
Abstracts Volume, p. 675C.
4. L.V. Olenina, O.M. Olenkina, S.A. Lavrov, V.A. Gvozdev. Detection of
tissue-specific trans-acting factor interacting with regulatory sequences of
Stellate genes of Drosophila melanogaster. Conference for young scientists,
PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to
120th anniversary of N.I. Vavilov, Kiev, Ukraine, 20-22 September 2007,
Abstract book, M-35, p. 83.
5. Оленкина О.М., Егорова К.С., Кибанов М.С., Гвоздев В.А., Оленина
Л.В.
Транскрипционный
фактор
dUSF
взаимодействует
с
регуляторными последовательностями Е-бокс в промоторной области
семенник-специфичных
генов
Stellate
Drosophila
melanogaster.
Международная научная конференция по биоорганической химии,
биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня
рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 28 сентября
— 1 октября 2009 г.), стр.307-309 в сборнике тезисов.
6. О.М.Оленкина,
К.С.Егорова,
М.В.Кибанов,
Л.В.Оленина. Транскрипционная регуляция
Ю.В.Гервазиев,
кластеров семенник-
специфичных генов Stellate у D.melanogaster. XXV Международная
зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления
физико-химической биологии и биотехнологии», посвященная 30летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, Россия, 1115 февраля, 2013 г), том 1, стр. 96.
27
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
1 249 Кб
Теги
геном, кластеров, семенниках, транскрипционные, melanogaster, stellate, drosophyla, специфичных, регуляции
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа