close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Молекулярная эпидемиология и экология вируса клещевого энцефалита в Восточной Сибири

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ВЕРХОЗИНА
Марина Михайловна
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ
ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
В ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ
03.02.02 - вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Иркутск – 2014
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения и рационального
развития Российской Федерации
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор,
академик РАН
Злобин Владимир Игоревич
Официальные оппоненты:
Бутенко Александр Михайлович – член-корр. РАЕН, доктор биологических
наук, профессор, Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
«Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского», заведующий отделом арбовирусов и лаборатории биологии и индикации арбовирусов
Токаревич Николай Константинович – доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», заведующий лабораторией зооантропонозных инфекций
Щелканов Михаил Юрьевич – доктор биологических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра
микробиологии и вирусологии
Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки «Омский
научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора
Защита состоится 19 марта 2015 г. в 12 часов на заседании диссертационного
совета Д 001.035.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и
сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казённый, д. 5А
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «НИИВС
им. И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва, пер. Малый Казённый, д. 5А; www.instmech.ru
Автореферат разослан « »
2014 г.
Ученый секретарьдиссертационного совета
кандидат биологических наук
2
И.В. Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Клещевой энцефалит (КЭ) занимает одно
из ведущих мест среди природно-очаговых трансмиссивных инфекций на территории
Восточной
Сибири.
Данные
по
изучению
экологоэпидемиологической обстановки свидетельствуют о значительных изменениях, произошедших в эпидемиологии КЭ в Восточной Сибири за последние годы. Они выражаются в стремительном росте заболеваемости в последней четверти ХХ века, расширении ареала вируса, увеличении численности клещей в
природе, умножении антропургических очагов, изменении структуры заболеваемости, патоморфозе клиники болезни (Борисов В.А. и др., 2000, 2003; Злобин В.И. и др., 1996, 2002, 2009; Козлова И.В., 2008; Козлова И.В. и др., 2009;
Данчинова Г.А., 1994, 2006; Хазова Т.Г., 2006, 2007; Хазова Т.Г. и др., 2011;
Ястребов В.К., 2003, 2007). КЭ в Восточной Сибири имеет свои региональные
особенности, отличаясь по основным клиническим проявлениям как от дальневосточного, так и от западного вариантов течения заболевания (Борисов
В.А. и др., 2000, 2003). Эти особенности могут быть обусловлены комплексом
разных причин, среди которых немаловажное место могут занимать число и
вид клещей-переносчиков, их зараженность вирусом КЭ, число и виды прокормителей клещей, количество восприимчивого населения, свойства циркулирующего вируса.
Успехи, достигнутые за последние десятилетия в области вирусологии,
внедрение в биологию молекулярно-биологических методов открыли новые
перспективы для исследований, позволили по-новому подойти к работе и дополнить представления о взаимоотношениях и связях в природном очаге. В
результате исследований генетического разнообразия вируса КЭ получена информация о географическом распространении генотипов в различных частях
ареала (Злобин В.И. и др., 1996, 2002, 2009; Погодина В.В., 2006; Погодина
В.В. и др., 2004; Адельшин Р.В. и др., 2006; Леонова Г.Н., 1996, 1998, 2010;
Демина Т.В., 2012; Карань Л.С. и др., 2004; Ткачев Е.С. и др., 2011; Ковалев
С.Ю. и др., 2011). Доказана циркуляция на территории Восточной Сибири вируса КЭ трех основных генотипов – урало-сибирского (генотип 3), дальневосточного (генотип 1) и европейского (генотип 2) и обнаружены штаммы «88684» и «178-79» с уникальной генетической структурой (Злобин В.И. и др.2002;
Демина Т.В. и др., 2012, Козлова И.В., 2000; Козлова И.В. и др., 2008, 2011;
Верхозина М.М., 2000; Верхозина М.М. и др., 2011).
Вместе с тем, требуют решения вопросы о том, какова роль экологических факторов в формировании гетерогенной вирусной популяции; что представляют собой и каковы свойства штаммов, отличающихся от трех основных
генотипов; существует ли связь между генотипическими различиями вируса и
видовыми различиями природного хозяина; какова детальная этиологическая
структура КЭ в Восточной Сибири; существует ли зависимость тяжести клинического течения КЭ от генотипа (субгенотипа) вируса; оказывает ли природная гетерогенность вируса КЭ влияние на эффективность диагностики,
профилактики и лечения заболевания. Данные о генетической структуре и
3
биологических свойствах вируса КЭ имеют большое значение для адекватной
оценки эпидемической ситуации и вопросов, связанных со специфической диагностикой и профилактикой. При организации профилактических и противоэпидемических мероприятий также необходимо учитывать характер ландшафтов и экологические особенности приуроченных к ним биоценозов.
Таким образом, все вышеперечисленное определяет необходимость проведения комплексных исследований, характеризующих природную вариабельность вируса КЭ на территории Восточной Сибири, на основе оценки экологических и генетических особенностей.
Цель исследования - получить комплексную эколого-географическую,
эпидемиологическую, вирусологическую и молекулярно-генетическую характеристику структуры популяции вируса КЭ на территории Восточной Сибири.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Дать характеристику структуры природных очагов КЭ Восточной Сибири (природно-климатические и биоценотические особенности, видовой состав
патогенов сочетанных очагов клещевых инфекций).
2. Провести исследование генетического разнообразия вируса КЭ, циркулирующего на территории Восточной Сибири, с помощью различных молекулярно-генетических методов.
3. Изучить антигенные свойства и фенотипические признаки штаммов вируса КЭ, выделенных на территории Восточной Сибири.
4. Охарактеризовать генетическую структуру популяций вируса КЭ в зависимости от распространения в различных ландшафтных зонах Восточной Сибири.
5. Оценить особенности генетической характеристики штаммов вируса КЭ
в зависимости от источника изоляции (иксодовые клещи, позвоночные животные).
6. Осуществить анализ этиологической структуры КЭ Восточной Сибири и
исследовать взаимосвязь генетической характеристики вируса КЭ и особенностей течения заболевания у жителей Восточной Сибири.
7. Оценить влияние генетической вариабельности вируса КЭ, циркулирующего на территории Восточной Сибири, на эффективность профилактики заболевания. Наметить пути повышения эффективности диагностических и
профилактических препаратов.
Научная новизна работы
Впервые дана комплексная эколого-географическая, эпидемиологическая,
вирусологическая и молекулярно-генетическая характеристика структуры популяции вируса КЭ в Восточно-Сибирском регионе. Получена объективная
информация о современном состоянии природных очагов КЭ, совмещенных с
очагами других клещевых инфекций.
Впервые получена развернутая картина географического распространения
генетических типов вируса КЭ на территории Восточной Сибири и входящих в нее отдельных регионов. Показано, что популяция вируса КЭ представлена всеми описанными в настоящее время генотипами – 1 (дальневосточный), 2 (западный или европейский), 3 (урало-сибирский или сибирский), 4 и 5
4
с доминированием генотипа 3, двумя субгенотипами («Васильченко» и «Заусаев») и «микст-штаммами». «Микст-штаммы», сочетающие в себе последовательности трех (1, 2, 3) и двух генотипов (1 и 3), (2 и 3), изолированы в очагах совместной циркуляции нескольких генотипов вируса КЭ на территории
Республики Бурятия и Иркутской области.
Обнаружена группа из 13 изолятов, имеющих генетическую характеристику, аналогичную штамму 886-84 (генотип 5). Установлена экологическая
связь штаммов генотипа 5 со всеми звеньями трансмиссивной цепи. Получены
генетические доказательства особенностей штаммов, входящих в «группу
886».
Впервые проведена оценка фенотипических характеристик штаммов вируса КЭ в совокупности с анализом различий на молекулярном уровне. Выявлены различия между группами штаммов разных генотипов по фенотипическим маркерам и признакам, связанным с вирулентностью.
Впервые рассмотрены эколого-географические аспекты генетической вариабельности вируса КЭ в Восточной Сибири – ландшафтные особенности
природных очагов и видовые различия природного хозяина. Связь генотипов с
определенными видами ландшафтов и степенью их освоенности человеком не
установлена. Группы штаммов, выделенных от иксодовых клещей и позвоночных животных, различаются по генотипическим и фенотипическим свойствам.
Результаты исследования позволяют предположить, что иксодовые клещи являются амплификаторами генотипа 3, а теплокровные животные – генотипа 1.
Получены новые данные об этиологической структуре КЭ в Восточной
Сибири. Установлено, что в региональной инфекционной патологии принимает участие вирус генотипов 1, 2, 3, а также «микст-штаммы». Показано, что
генотип 3 вируса КЭ может вызывать весь спектр клинических проявлений от
инаппарантной формы до очаговой с летальным исходом. Впервые доказано
участие штаммов генотипа 1 в развитии хронического КЭ на территории Восточной Сибири.
В результате проведенных исследований значительно расширены представления об ареале возбудителей, передаваемых с укусом клеща. Сочетанные
очаги КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ выявлены не только на территории эндемичных
по клещевым инфекциям районов Иркутской области, но и на территории северных районов, которые не включены Роспотребнадзором в список эндемичных. Определены достоверные различия инфицированности доминирующих в
природных очагах Иркутской области клещей возбудителями природноочаговых инфекций. Отмечены более высокие показатели зараженности клещей I. persulcatus возбудителями
ИКБ, ГАЧ и МЭЧ,
клещей рода
Dermacentor – возбудителями КР и вирусом КЭ, Н. concinna – бабезиями.
Теоретическая значимость работы
На основании полученных результатов предложена методология углубленного мониторинга и системной оценки очаговых территорий, которая
включает комплексное изучение ведущих компонентов очагов и экологических особенностей приуроченных к ним биоценозов.
5
Результаты комплексного исследования региональных штаммов вируса
КЭ могут послужить теоретической базой для поиска закономерностей влияния нуклеотидных последовательностей геномов вируса КЭ (и, соответственно, аминокислотных последовательностей белков) на их биологические свойства.
Практическая значимость работы и внедрения
Данные о генетической вариабельности вируса КЭ ставят вопрос об использовании универсальных диагностических и профилактических препаратов, учитывающих все разнообразие генотипов. Изучение по комплексу фенотипических маркеров штаммов «группы 886», проявляющих высокий уровень
гомологии с представителями разных генотипов, позволило предложить в качестве перспективных кандидатов для приготовления универсальных диагностических и вакцинных препаратов три штамма из этой группы (740-84, 71289, 418-90).
Результаты комплексной эколого-географической, эпидемиологической,
вирусологической и молекулярно-генетической характеристики структуры
природных очагов КЭ Восточной Сибири используются для определения современных границ эндемичных по КЭ и другим «клещевым» инфекциям территорий, для оценки эпидемиологической ситуации в отношении инфекций,
передаваемых с укусом клеща, для прогноза и разработки научнообоснованных предупредительных мероприятий в сочетанных природных очагах. С учетом выявленных особенностей природных очагов северных районов
Иркутской области, предложен комплекс противоэпидемических мероприятий против инфекций, передаваемых иксодовыми клещами на исследованных
территориях.
Данные мониторинга сочетанных природных очагов Иркутской области
могут быть использованы для создания кадастра «клещевых» инфекций на основе результатов исследования генетического разнообразия возбудителей инфекций, передаваемых с укусом клеща, видового состава, численности и инфицированности иксодовых клещей различными возбудителями в привязке к
типичным ландшафтам изучаемой территории.
При участии автора созданы базы данных для использования в практической работе и научных исследованиях по совершенствованию методической
оснащенности при решении вопросов правильной оценки эпидемиологической
ситуации, прогноза, а также разработки универсальных диагностических и
профилактических препаратов:
1.«Биологические свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на территории Восточной Сибири» (свидетельство о государственной
регистрации базы данных №2010620667);
2.«Генетические свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на территории Восточной Сибири» (свидетельство о государственной
регистрации базы данных № 2011620063).
В международную электронную базу данных GenBank депонированы
нуклеотидные последовательности геномов двух штаммов (№EF469661 и
№EF469662) и 74 фрагментов геномов 69 штаммов вируса КЭ, изолированных
6
на территории Евразии (AF241772-241774, AF139489, AF224662-224665,
AF229363-229364, 236055, JN936329-936375, EU878281-878283, EU072444EU072453, FJ214154-FJ214157).
В Государственную коллекцию вирусов при НИИ вирусологии им. Д.И.
Ивановского МЗ РФ депонирован 131 штамм вируса КЭ (№№1037-1167).
Материалы диссертационной работы использованы при подготовке
пособия для врачей «Диагностика и профилактика клещевых инфекций в
сочетанных природных очагах Восточной Сибири» / И.В. Козлова, М.М.
Верхозина и др. // - Иркутск: РИО ИГИУВАа, 2009. - 32 с.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Природные очаги КЭ Восточной Сибири, имеют тенденцию к распространению на неэндемичные территории и характеризуются высокой степенью сочетанности как ранее известных (ИКБ, КР), так и «новых» (ГАЧ, МЭЧ, бабезиоз) трансмиссивных клещевых инфекций.
2. Восточная Сибирь является уникальной территорией генетического разнообразия вируса КЭ, обитания всех описанных в настоящее время генотипов,
двух субгенотипов и микст-штаммов в различных сочетаниях. Популяция вируса КЭ, циркулирующего на территории Восточной Сибири, гетерогенна по
фенотипическим свойствам.
3. На очаговых территориях Восточной Сибири с тем или иным набором сочленов биоценоза, участвующих в циркуляции вируса КЭ, формируются вирусные популяции с определенной генетической характеристикой. Наибольшая генетическая вариабельность наблюдается в природных очагах Прибайкалья, где выражено разнообразие ландшафтов, переносчиков вируса КЭ и их
прокормителей.
4. Генотипические различия вируса могут быть связаны с видовыми различиями природного хозяина. Полученные данные позволяют предположить, что
иксодовые клещи являются амплификаторами генотипа 3, а теплокровные животные – генотипа 1.
5. В этиологии КЭ в Восточной Сибири доказано участие трех генотипов вируса (1, 2 и 3), а также политиповых штаммов, формирующих разнообразие
клинической картины этого заболевания. Наиболее перспективными кандидатами для приготовления «универсальных» диагностических и профилактических средств, учитывающих региональные различия генетической структуры
вируса КЭ, могут быть штаммы генотипа 5 («группы 886»).
Апробация работы
Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены: на Научной конференции с международным участием «Инфекции
человека в начале XXI века: эволюция, новые проблемы, перспективы контроля», посвященной 90-летию ИЭМ (Иркутск, 2002); первой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Клещевые боррелиозы» (Ижевск, 2002), VIII съезде Всероссийского научно-практического
общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002);
Второй научной конференции с международным участием «Проблемы инфек7
ционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера»
(Новосибирск, 2002); Научно-практической конференции с международным
участием «Актуальные вопросы инфектологии», посвященной 80-летию организации кафедры инфекционных болезней ИГМУ (2003); Расширенном Пленуме проблемной комиссии РАМН «Клещевой и другие вирусные энцефалиты» (Москва, 2003); Первой Всероссийской конференции по вакцинологии
«Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и
профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005); Всероссийской
научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы
борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке» (Томск, 2006); Научнопрактической конференции по профилактике вирусного клещевого энцефалита
(Пермь, 2007); Всероссийской научной конференции «Современные научные и
прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007); Всероссийской
научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные
эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых
неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); Международной
конференции «Zoonotic infectious diseases and tourism» (Ulaanbaatar, 2009);
Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты
эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природноочаговых болезней» (Иркутск, 2009); X Международном симпозиуме по клещевым инфекциям (Jena, 2009); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о
природной очаговости болезней (Омск, 2009); II Национальной конференции с
международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых
инфекций» (Екатеринбург, 2009); научной конференции с международным
участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (к 90-летию кафедры микробиологии ИГМУ) (Иркутск, 2010 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Современные аспекты природной очаговости болезней», посвященной 90-летию
ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора (Омск, 2011); Международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Листвянка-Иркутск, 2012); XII International Jena Symposium on Tick-borne Diseases (Weimar, Германия, 2013); Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы клещевого энцефалита» (Москва,
2013).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 130 научных работ, в том
числе 23 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 6
монографий и 18 публикаций в зарубежных изданиях.
Личный вклад автора
Автором лично получены основные представленные в работе фактические результаты исследований, проведен анализ данных и сформулированы
8
выводы настоящей работы, проведено большинство лабораторных исследований, включающих изучение зараженности иксодовых клещей возбудителями
КЭ, ИКБ, ГАЧ и МЭЧ. Изучение внутривидовых антигенных различий, генетических признаков, определяемых "in vitro" и признаков, связанных с вирулентностью, генотипирование штаммов вируса КЭ с помощью МГНК было
проведено автором совместно с сотрудниками ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН во время работы в
данном учреждении.
Генотипирование штаммов вируса КЭ методом ПЦР в режиме реального
времени с генотип-специфическими флуоресцентными зондами осуществлялось на базе ЦНИИЭ Роспотребнадзора в сотрудничестве с Л.С. Карань. Секвенирование штаммов было выполнено: на базе ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (г. Москва) в сотрудничестве с Л.С. Карань; в Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск) в сотрудничестве С.Е. Ткачевым; в
Лимнологическом институте СО РАН (г. Иркутск) в сотрудничестве с Р.В.
Адельшиным.
Определение видовой принадлежности и генетических вариантов выявленных боррелий, риккетсий, эрлихий, анаплазм и бабезий проведено совместно с сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск).
Структура и объем диссертационной работы
Диссертационная работа состоит из введения, двух глав обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 369 страницах, иллюстрирована 24 рисунками и 43
таблицами. Библиографический указатель содержит 426 источников, из которых 311 - работы отечественных и 115 - зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы. Вирусы и изоляты РНК. В работе использовано 196
штаммов вируса КЭ из коллекции вирусов ФГБУ «Научный центр проблем
здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН (г. Иркутск), выделенных
на территории Восточной Сибири, три прототипных штамма вируса КЭ:
Софьин (генотип 1), 256 (генотип 2), Васильченко (генотип 3) и два вируса
комплекса КЭ (ККЭ) – КЛБ (киассанурской лесной болезни) и ОГЛ (Омской
геморрагической лихорадки), 9 изолятов РНК. Прототипные штаммы вируса
КЭ и вирусы ККЭ были получены из Государственной коллекции вирусов
(Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН) и Института
полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН. Штаммы
из Восточной Сибири выделены из разных источников (148 - от клещей I.
persulcatus, 3 – от клещей D. nuttalli, 2 – от клещей D. silvarum, 29 - от
грызунов, 1 – от насекомоядного, 9 - от людей, 2 - из молока коров, 2 - от
птиц) в период с 1963 по 2004 гг.
Вирусы
пассировали
путем
интрацеребрального
заражения
двухдневных новорожденных белых мышей и клонировали в перевиваемой
клеточной культуре СПЭВ. Число пассажей штаммов вируса КЭ из Восточной
9
Сибири не превышало 7. Для прототипных штаммов вируса КЭ и вирусов
ККЭ число проведенных пассажей неизвестно.
Изоляты РНК получены из крови людей, находившихся в 2009 г. на
лечении в инфекционных стационарах г. Иркутска и п. Усть-Орды.
В 1996 г. (Злобин В.И. и др.), а затем в 2001 г. (Злобин В.И. и др.) нами
впервые описаны генотипы вируса КЭ, которые
были названы
«дальневосточным» - генотип 1, «западным» - генотип 2 и «урало-сибирским»
- генотип 3. Отличающиеся от них и между собой штаммы 178-79 и 886-84 –
были оценены как предположительно представители генотипов 4 и 5. В
дальнейшем в зарубежной литературе, а затем и в отечественной некоторые
авторы стали именовать три основные генетические группы внутри вируса КЭ
соответственно «дальневосточным», «европейским» и «сибирским» субтипами
либо генотипами. В нашей работе мы используем термины «генотипы 1, 2, 3,
4, 5», подразумевая, что «генотип 1» - это также «дальневосточный
генотип/субтип», «генотип 2» - «западный, европейский генотип/субтип»,
«генотип 3» - «урало-сибирский или сибирский генотип/субтип», «генотип 4» штамм 178-79, «генотип 5» - штамм 886-84 или «группа 886».
Иксодовые клещи были собраны в период с 1993 по 2012 гг. в
природных биотопах 28 районов Иркутской области и двух районов
Республики Бурятия. В ходе работы на наличие антигена вируса КЭ
исследовано 22 343 экземпляров клещей, на наличие РНК вируса КЭ – 2 040
экземпляров клещей. Определение зараженности возбудителем ИКБ
осуществлено у 12 206 переносчиков. Для изучения генетического
разнообразия риккетсий группы КПЛ, циркулирующих на территории
Иркутской области и Республики Бурятия, исследовано 460 экземпляров
клещей. При исследовании территории Иркутской области на наличие очагов
МЭЧ и ГАЧ с помощью ПЦР проведено определение зараженности
возбудителями данных инфекций 2 040 клещей. На наличие ДНК бабезий
было исследовано 302 экземпляра клещей.
Пробы крови и образцы сыворотки крови получены от людей,
обратившихся в Пункт экстренной диагностики и профилактики
трансмиссивных клещевых инфекций г. Иркутска в 2004-2006 гг., в ФБУЗ
«Центр гигиены и эпидемиологии в Иркутской области», а также от людей,
находившихся в 2009 г. на лечении в инфекционных стационарах г. Иркутска
и п. Усть-Орды. Всего исследовано 1 548 проб крови от больных с
различными
диагнозами (клещевой энцефалит, клещевой боррелиоз,
клещевой риккетсиоз, лихорадка неясной этиологии, нейроинфекция). На
наличие антител к вирусу КЭ методом ИФА исследовано 118 образцов
сыворотки крови здорового населения.
Иммунные сыворотки кроликов. Для изучения внутривидовых
антигенных
отличий
штаммов
вируса
КЭ
были
получены
штаммоспецифические сыворотки к штаммам: Айна/1448, Софьин, Лесопарк11, 256 и к вирусу ККЭ - КЛБ.
10
Зонды, используемые в реакции МГНК. Для дифференциации штаммов
в МГНК была использована созданная Т.В. Деминой панель зондов,
включающая 40 дезоксиолигонуклеотидных последовательностей, мишенью
для которых послужили все десять генов вируса КЭ. В состав панели вошли:
видоспецифичный зонд sh5; три субпанели по 12 генотипспецифических
зондов на каждый из трех основных генотипов (по одному зонду на гены М,
С, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b и по два – на гены Е и NS5); один
специфический зонд на генотип 4 (он же штаммоспецифичный для изолята
178-79); два субгеноспецифичных зонда для дифференциации штаммов
генотипа 3 на группы «Васильченко» и «Заусаев».
Статистические данные по заболеваемости. При анализе
эпидемиологической ситуации по клещевым инфекциям использовали данные
статистических отчетных форм ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в
Иркутской области» за 1993-2012 гг. (Ф.№ 1 «Сведения об инфекционных и
паразитарных заболеваний», Ф.№ 2 «Анализ заболеваемости клещевыми
инфекциями в Иркутской области»), статистические отчетные материалы
Управления Роспотребнадзора по Иркутской области (Ф. №85 «Отчет о
движении инфекционных заболеваний») и данные литературы.
Методы. Для достижения цели и решения поставленных задач был использован комплекс вирусологических, бактериологических, серологических,
молекулярно-генетических и статистических методов.
Титрование вирусов КЭ и комплекса КЭ по ЦПД проводили в культуре
клеток СПЭВ в 96-луночных планшетах. Титры вируса определяли по методу
Рида и Менча (1938) и выражали в lgТЦД50/мл. Титрование вирусов по бляшкообразованию и клонирование проводили в культуре клеток СПЭВ, выращенной в пластиковых 24 луночных планшетах фирмы «Sarstedt», под агаровым покрытием.
Терморезистентность (Т50)
штаммов ВКЭ изучали по методу,
описанному Э.А. Овчинниковой и др. (1967) с использованием суточной
культуры клеток СПЭВ, выращенной в 96-луночных планшетах в атмосфере
СО2. Уровень терморезистентности оценивали по индексу инактивации –
разность lg титров прогретого (50°С) в течение 15 мин и непрогретого (4°С)
вируса.
Способность к репродукции при супраоптимальной температуре
(rct 42) определяли по разнице титров вируса, культивироваемого в культуре
клеток СПЭВ при 37˚С и 42˚С. Генетический признак (+) учитывали, если
разница титров вируса составляла ≤2,0 lg; (±) – от 2,1 до 3,0 lg; (-) - ≥ 3,1 lg.
Для оценки нейровирулентности и инвазивных свойств штаммов
вируса КЭ определяли индекс инвазивности (II) – разницу титров вируса при
церебральном (mNic) и подкожном (mNsc) заражении мышей, выраженную в
lg LD50/мл. Заражали беспородных белых мышей массой 5-7 г. в мозг по 0,03
мл, под кожу по 0,25 мл инокулята. Животных, зараженных
интрацеребрально, наблюдали в течение 14 дней, зараженных
экстраневрально – 21 день. Титры вируса определяли по методу Рида и
11
Менча. Генетический признак (+) учитывали, если разница титров вируса
составляла ≤2,0 lg; (±) – от 2,1 до 2,9 lg; (-) - ≥ 3,0 lg. Значение II в пределах 1–
2,5 - высокие инвазивные свойства штамма, значение II ≥ 3 - сниженная
инвазивная активность.
РДПА проводили на основе адсорбции иммунных сывороток
стандартными дозами концентрированных антигенов по методу С.Г. Рубина
(1971).
РН. Для изучения штаммов в РН был применен метод
бляшкообразования, основанный на способности иммунной сыворотки
уменьшать число бляшек, образуемых стандартной дозой вируса в
однослойной культуре клеток СПЭВ под покрытием средой с агаром Difco.
Нейтрализующую активность сыворотки определяли по уменьшению числа
бляшек в сравнении с их числом в той же культуре, куда был введен только
вирус. За титр сыворотки принимали разведение, снижающее число бляшек на
80%. В качестве контроля использовали результаты РН прототипных штаммов
с гомологичными иммунными сыворотками.
ИФА. Для экспресс-индикации антигена вируса КЭ в клещах
использовали ИФА (тест-системы НПО «Микроген», Томск; «Вектор-БЕСТ»,
п. Кольцово) в соответствии с инструкцией производителя. Для обнаружения
IgM и IgG-антител к вирусу КЭ в образцах сыворотки крови человека
применяли тест-системы «Вектор-БЕСТ». Исследование крови на наличие
IgM и IgG-антител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ проводили с помощью тестсистем производства НПО «Омникс» (г. Санкт-Петербург).
Светлопольная микроскопия фиксированных препаратов. Часть
клещей была исследована на наличие боррелий методом прямой
светлопольной микроскопии фиксированных мазков из содержимого
кишечника клеща (Коренберг, 1991).
Выделение РНК и ДНК осуществляли с помощью набора реагентов
«РИБО-преп», обратную транскрипцию проводили с помощью набора
реагентов «РЕВЕРТА-L-100», производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ (г.
Москва). Для выделения РНК использовали суспензии клещей и головного
мозга НБМ, зараженных штаммами вируса КЭ, культуральную жидкость,
образцы крови людей. ДНК боррелий, риккетсий, эрлихий, анаплазм и
бабезий выделяли из суспензии клещей и крови людей.
Детекцию РНК вируса КЭ проводили методом обратной
транскрипции с последующей «nested» полимеразной цепной реакцией
(ОТ-ПЦР) с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «ВектоВКЭ-РНКампли-100» («Вектор-Бест»). Тест-системы для исследования любезно
предоставлены
сотрудником
Института
химической
биологии
и
фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) С.Е. Ткачевым. Для
постановки ПЦР использовали праймеры, полученные на основе
консервативного участка NS3-сегмента РНК вируса КЭ.
Выявление специфической ДНК боррелий осуществляли в
однораундовой или двух-раундовой (при использовании
тест-системы
«ВектоЛаймДНКампли-100») ПЦР, которую проводили с собственными
12
наборами реактивов на основе праймеров к генам 16S rRNA и гена белка
флагеллина, разработанных М.А. Хаснатиновым (2002) или коммерческими
ПЦР-тест-системами
производства
«Хеликс»
(Санкт-Петербург)
и
«ВектоЛайм-ДНК-ампли-100» («Вектор-Бест»).
Для выявления ДНК эрлихий и анаплазм в образцах клещей
использовали «nested» ПЦР с родоспецифичными праймерами из области
гена 16S рРНК (праймеры были любезно предоставлены Рар В.А.) и
однораундовую ПЦР с коммерческой тест-системой «GenePak» («Biokom»,
Россия) (Ehr, Эрлихия общ. Ehrlichia spp.).
Для одновременной детекции нуклеиновых кислот вируса КЭ,
боррелий, анаплазм и эрлихий использовали коммерческую тест-систему
«Amplisens® TBEV, B. burgdorferi sl., А. рhagocytophilum, E. muris/E.
chaffeensis – F1» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора РФ, г. Москва). Амплификацию
проводили в термоциклере RotorGene 6000 (Австралия).
ДНК риккетсий выявляли методом ПЦР с праймерами на основе
гена, кодирующего поверхностный белок rOmpA (190 kDa); методом
двухраундовой ПЦР с праймерами, соответствующими фрагментам генов
цитратсинтазы (gltA) (Ливанова Н.Н. и др., 2005) и поверхностного белка
rOmpA. Праймеры для проведения ПЦР-анализа были любезно предоставлены
Иголкиной Я.П. и Рар В.А.
Кроме того, детекцию ДНК риккетсий
осуществляли с помощью коммерческой ПЦР-тест-системы «GenePak»
(«Biokom», Санкт-Петербург) (Rri, Риккетсия Rickettsia rickettsii).
Для изучения гетерогенности популяции генетического разнообразия
риккетсий использовали ПДРФ-анализ. Первичную структуру фрагмента
гена поверхностного мембранного белка rOmpA определяли с помощью
секвенирования.
ДНК бабезий выявляли методом двухраундовой (ПЦР) в присутствии
родоспецифичных праймеров из области гена 18S рРНК. Праймеры для
исследования были любезно предоставлены Рар В.А. Нуклеотидные
последовательности продуктов ПЦР были определены в Центре
секвенирования ДНК СО РАН, г. Новосибирск.
Генотипирование вируса КЭ выполнялось с помощью трех методов:
МГНК. РНК вируса, накопленного в культуре клеток СПЭВ, и суммарную
клеточную РНК из мозговых суспензий выделяли методом фенольной
экстракции (Херрингтон С., Макги Дж., 1999). Образцы РНК наносили на
нитроцеллюлозные фильтры в количестве 2 мкг/пятно суммарной РНК,
выделенной из мозга мышей, или 1 нг/пятно РНК, выделенной из культуры
клеток. Для тестирования полученных образцов суммарной РНК
дезоксиолигонуклеотидные зонды метили с помощью полинуклеотидкиназы
фага Т4 и [γ-32Р] АТР и использовали в МГНК (Маниатис, 1984) при
температуре 45-47ºС.
ПЦР в режиме реального времени с генотип-специфическими
флуоресцентными зондами осуществляли на базе ЦНИИЭ Роспотребнадзора
в сотрудничестве с Л.С. Карань.
13
Секвенирование.
Определены нуклеотидные последовательности
продуктов ПЦР, соответствующих 1) фрагментам гена Е различной длины,
содержащим маркерные аминокислоты в 206-й и 234-й позициях; 2)
фрагментам генов Е и NS1; 3) фрагментам генов С, М и части Е; 4) полной
последовательности гена Е; 4) полного генома вируса КЭ. Генотипирование 8
изолятов РНК выполняли методом секвенирования участка гена,
кодирующего белок С длиной 70 п.н. Типирование изолята РНК B-09
проведено с помощью секвенирования фрагмента гена, кодирующего белок
оболочки Е.
Компьютерный анализ полученных последовательностей осуществляли
с помощью программы MEGA 5.0 (Dudley J, Nei M & Kumar S, 2007). Для
сравнения использовали последовательности фрагментов генома штаммов
вируса КЭ, относящихся к различным генетическим типам, из базы данных
GenBank. Поиск гомологии полученных нуклеотидных последовательностей с
уже известными последовательностями фрагментов геномов вируса КЭ
проводили с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
Статистическая
обработка
материалов.
Полученные
в
эксперименте материалы подвергались статистической обработке в
соответствии с общепринятыми методами вариационной статистики (расчет
средних арифметических и геометрических значений, стандартной ошибки,
достоверности различий по t – критерию Стьюдента). Коэффициент парной
корреляции вычисляли по формуле Пирсона. Достоверность коэффициента
корреляции устанавливали по таблице критических значений выборочного
коэффициента корреляции (r) (Савилов Е.Д. и др., 1993). Расчеты проведены с
применением прикладной программы Microsoft «Exel» 2007. Оценку
достоверности полученных филогенетических схем осуществляли с
использованием бутстреп-анализа на основе 1000 повторов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Структура природных очагов Восточной Сибири
Восточная Сибирь и территориально, и по природным условиям занимает промежуточное положение в обширной зауральской части страны. Очаги
КЭ в Восточной Сибири встречаются от Красноярского края до Забайкальского края, занимая зону среднетаежных и южно-таежных лесов, ареал их совпадает с ареалом клещей I. persulcatus. Анализ данных литературы позволил установить природно-климатические и биоценотические особенности очагов КЭ
Восточной Сибири. Считается, что северная граница ареала КЭ в Сибири совпадает с изолинией суммы эффективных температур 1200-1400°, а в Забайкалье соответствует северной границе распространения лиственничной тайги оптимального развития (Кореберг Э.И., Ковалевский Ю.В., 1981). Очаги расположены в разных типах ландшафтов от высокогорья до межгорных лесостепных и степных котловин, отличающихся климатическими условиями, составом
растительности и фаунистических группировок. Основное эпидемиологическое значение в природных очагах КЭ имеет клещ I. persulcatus. Меньшую
роль в резервации и передаче вируса КЭ на территории Восточной Сибири иг14
рают клещи D. silvarum, D. nuttalli и H. concinna. Первостепенное значение в
прокормлении личинок и значительной части нимф имеют красно-серая полевка, азиатская мышь, красная полевка, бурозубки. Взрослые клещи прокармливаются главным образом за счет крупных диких млекопитающих.
В настоящее время Восточная Сибирь, наряду с Уралом и Западной Сибирью относится к территориям высокого риска заражения КЭ. Анализ эколого-эпидемиологической ситуации в отношении КЭ, проведенный на примере
Иркутской области и г. Иркутска, показал, что изменения, происходящие на
данной территории за последние 25 лет, сходны с таковыми в других эндемичных регионах России (Борисов В.А., 2002; Волкова Л.И., Образцова Р.Г., 2003;
Злобин В.И., Горин О.З., 1996; Злобин В.И. и др., 2003; 2006; Жукова Н. и др.,
2002; Козлова И.В., 2008; Леонова Г.Н., 1997; Ястребов В.К., 2007, Токаревич
Н.Д. и др., 2008). Среди них исключительно важными являются: рост заболеваемости, которая за последние 25 лет возросла в 3,1 - 6,6 раза; расширение
ареала вируса КЭ - если в 1986 г. КЭ был зарегистрирован на 15 административных территориях области, то в 2012 г. эндемичными признаны 30 из 36
территорий; увеличение количества жителей, пострадавших от клещей не
только в южных и центральных, но и в северных районах Иркутской области.
Современную эпидемиологическую обстановку по КЭ невозможно рассматривать изолированно от стремительно накапливающихся данных о распространении на территории России других инфекций, экологически связанных с иксодовыми клещами. Представления о структурных компонентах природных очагов трансмиссивных инфекций на территории Иркутской области,
несмотря на большое количество исследований, недостаточно полны и требуют дополнительных комплексных исследований. Для того чтобы уточнить
структуру сочетанных природных очагов и современные ареалы клещевых
инфекций в Иркутской области, нами получена характеристика административных районов, включающая сведения: по заболеваемости населения КЭ,
ИКБ и КР; об эндемичности районов по КЭ (отношение количества лет, в которые фиксировалась заболеваемость КЭ, к общему числу анализируемых
лет); о доминирующих видах иксодовых клещей, их численности. Проведен
анализ зараженности вирусом КЭ, возбудителями ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, КР и бабезиоза иксодовых клещей, собранных в природных биотопах 28 районов за период с 1993 по 2012 гг. Административные районы, граничащие между собой,
были объединены в 6 групп в соответствии с районированием по комплексу
природных и физико-географических характеристик (Беркин И.С. и др., 1993):
Северные горнотаежные районы, таежно-плоскогорные районы Приленья и
Приангарья, юго-западные подтаежные лесостепные районы Присаянья, Прибайкалья и районы Усть-Ордынского Бурятского округа (УОБО). В ходе исследований рассмотрены биогеоценотические и географические (ландшафтные) особенности территорий.
Установлено, что сочетанные природные очаги как минимум четырех
инфекций – КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, экологически связанные с иксодовыми клещами, функционируют на территории Иркутской области в пределах всех исследованных групп районов, различающихся по климато-географической,
15
ландшафтной и эколого-эпидемиологической характеристике. Процент вирусофорности клещей на всех изученных территориях, за исключением районов
Приленья и Приангарья, практически не отличался (3,3-3,4%). В двух последних группах районов, входящих в Ангаро-Ленскую таежно-плоскогорную
провинцию, зараженность клещей была ниже (2,3 и 2,5%) (табл.1).
Показатели зараженности иксодовых клещей возбудителями ИКБ изменялись от самых высоких значений в Приленских (15,2±1,1%) и Северных
районах (14,9±1,8%), до средних – в лесостепных и степных районах УОБО
(10,7±0,9%) и южных районах Прибайкалья (9,0±0,6%).
Зараженность клещей возбудителями ГАЧ – A. phagocytophilum - во
всех группах районов, кроме Присаянских, была невысокой (от 0,9±0,4 до
2,5±1,0%). В юго-западных районах Присаянья с оптимальными условиями
для развития иксодовых клещей их инфицированность анаплазмами достигала
6,6±1,0%.
Таблица 1
Результаты исследования иксодовых клещей на наличие возбудителей КЭ,
ИКБ, ГАЧ, МЭЧ и КР в районах Иркутской области
Группы районов
Вирус КЭ
Северные горнотаежные
Приленские таежно-плоскогорные
Приангарские таежно-плоскогорные
Присаянские югозападные подтаежные лесостепные
Лесостепные
и
степные
районы
УОБО
Прибайкальские
горнотаежные, лесостепные и степные
Всего:
535/18
3,4±0,8
1867/43
2,3±0,4
1357/34
2,5±0,4
15252/506
3,3±0,2
1763/58
3,3±0,4
3609/123
3,4±0,3
24383/782
3,2±0,1
Индивидуальная зараженность иксодовых клещей *
Боррелии
Анаплаз- Эрлихии Риккетсии
мы
группы КПЛ
382/57
236/6
236/12
14,9±1,8
2,5±1,0
5,1±1,4
1066/162
400/6
400/62
11/0
15,2±1,1
1,5±1,2
15,5±1,8
511/70
227/2
227/26
4/3
13,7±1,5
0,9±0,6
11,5±2,1
75,0
6537/805
565/36
565/31
70/39
12,3±0,4
6,6±1,0
5,7±0,9
55,7±5,9
1140/122
10,7±0,9
2570/231
9,0±0,6
12206/1447
11,9±0,3
Бабезии
36/0
62/0
111/3
2,7±1,7
525/10
1,9±0,6
525/22
4,2±0,9
269/136
50,6±3,0
83/8
9,6±2,7
459/4
0,9±0,4
459/9
2,0±0,7
106/39
36,8±4,8
-
2412/64
2,7±0,3
2412/162
6,7±0,5
460/216
47,0±2,3
302/12
4,0±3,4
Примечание: * Числитель – абс./количество зараженных клещей, знаменатель
- M ± m, где M - % зараженных клещей, m - ошибка
Самые высокие значения инфицированности клещей возбудителями
МЭЧ – E. muris/E. chaffeensis отмечены в таежных Приленских районах
(15,5±1,8%) и районах Приангарья (11,5±2,1%), самые низкие – в районах
Прибайкалья (2,0±0,7%).
Оценка зараженности клещей риккетсиями группы КПЛ была проведена
на территории тех районов, где встречаются основные переносчики этих возбудителей – клещи рода Dermacentor. Более 50% клещей D. silvarum и D.
nuttalli, собранных с людей, укусы которых отмечены в лесостепных районах
Приангарья, Присаянья и в районах УОБО, содержали ДНК риккетсий группы
16
КПЛ. Показатель зараженности риккетсиями клещей, собранных в природных
очагах и с людей в районах Прибайкалья, был несколько ниже – 36,8±4,8%.
Исследование на наличие очагов бабезиоза, проведенное в шести районах Иркутской области, позволило обнаружить ДНК бабезий в клещах из
Эхирит-Булагатского, Иркутского, Шелеховского районов. В среднем инфицированность клещей бабезиями составила 4,0%. В более северных районах
области – Усть-Кутском, Бодайбинском, Нижнеилимском, клещи, инфицированные бабезиями не выявлены
В результате проведенных исследований значительно расширились представления об ареале возбудителей, передаваемых с укусом клеща, на территории Восточной Сибири. Сочетанные очаги КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ выявлены не
только на территории эндемичных по клещевым инфекциям районов Иркутской области, но и на территории северных районов, которые не включены в
список эндемичных (рис.1).
Рис. 1. Карта-схема выявления возбудителей КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, КР и бабезиоза в иксодовых клещах на территории Иркутской области.
Примечание:
- вирус КЭ; - боррелии; - анаплазмы; - эрлихии;
риккетсии; - бабезии. Районы:1-Катангский, 2-Усть-Илимский; 3-Киренский, 4-МамскоЧуйский, 5-Бодайбинский, 6- Тайшетский, 7-Чунский, 8-Братский, 9-Нижнеилимский, 10-УстьКутский, 11-Казачинско-Ленский, 12-Нижнеудинский, 13-Тулунский, 14-Куйтунский, 15Балаганский, 16-Усть-Удинский, 17-Жигаловский, 18-Качугский, 19-Зиминский, 20-Заларинский, 21-Черемховский, 22-Усольский, 23-Иркутский, 24-Ольхонский, 25-Слюдянский,26Шелеховский, 27-Ангарский, 28-районы УОБО (Баяндаевский, Эхирит-Булагатский, Осинский,
Боханский, Аларский, Нукутский).
17
В природных очагах Киренского района выявлена циркуляция вируса
КЭ, B. garinii, E. muris, B. miyamotoi; в Бодайбинском, Нижне-Илимском и
Казачинско-Ленском районах - вируса КЭ, боррелий, E. muris, A.
phagocytophilum; в Усть-Кутском – вируса КЭ и боррелий. Случаев клещевого
риккетсиоза (КР) на всех вышеуказанных территориях официально не зарегистрировано. Так как основные переносчики КР – клещи рода Dermacentor в
этих районах почти не встречаются, то вопрос о существовании природных
очагов и риска заражения КР требует дальнейшего изучения.
С учетом результатов эколого-эпидемиологического и вирусологомикробиологического мониторинга предложен комплекс противоэпидемических мероприятий против инфекций, передаваемых иксодовыми клещами в
северных районах Иркутской области.
Известно, что инфицированность природных популяций клещей определенным видом возбудителя является суммарным итогом многосторонних
взаимодействий всех компонентов паразитарной системы, формирующих природный очаг инфекции – возбудителей, переносчиков и их прокормителей.
Разные виды возбудителей клещевых инфекций и их отдельные варианты значительно отличаются по тропизму к отдельным видам клещей (Алексеев А.Н.,
1990). Для нас представляло интерес определить роль отдельных видов клещей
в поддержании циркуляции различных клещевых патогенов и их генетических
вариантов на территории Иркутской области.
В результате исследований выявлены средние показатели зараженности
возбудителями КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ и КР доминирующих видов иксодовых
клещей, определяющих удельный вес в эпидемиологии клещевых инфекций.
Установлено, что различные виды клещей отличались между собой по
вирусофорности. Средние показатели инфицированности вирусом КЭ клещей
H. concinna составили 2,5±1,0%, I. persulcatus – 3,1±0,1%, Dermacentor spp. 4,2±0,4%.
Максимальная инфицированность возбудителями ИКБ выявлялась у таежных клещей – 12,9±0,3%. Зараженность клещей D. silvarum составила
6,0±2,6%, D. nuttalli - 3,0±0,4%. В клещах H. concinna боррелии не обнаружены.
Наибольшая зараженность риккетсиями выявлена среди клещей D.
silvarum (63,4±5,1%). В клещах D. nuttalli ДНК риккетсий обнаружена в
41,9±3,1% случаев. Несколько меньше клещей I. persulcatus также содержали
ДНК этих микроорганизмов (37,0±7,1%). В клещах H. concinna возбудителей
КР не обнаружено.
ДНК A. phagocytophilum, E. muris и 16S рРНК E. muris/E. chaffeensis обнаружена не только в клещах I. persulcatus, но впервые детектирована в клещах Dermacentor spp. и H. concinna, обитающих в природных очагах Иркутской области. Инфицированность таежных клещей возбудителями ГАЧ и МЭЧ
оказалась выше, чем других видов клещей и составила 3,5±0,5% и 9,6±0,7%
соответственно. На втором месте по зараженности анаплазмами и эрлихиями
оказались клещи D. silvarum. Их инфицированность этими возбудителями составила 2,1±2,1% и 6,4±3,6%. При исследовании клещей H. concinna в одном
18
экземпляре выявлена ДНК A. phagocytophilum, в трех (3,0±1,7%) - E. muris/E.
chaffeensis. Самое низкое содержание A. phagocytophilum (0,8±0,4%) и E.
muris/E. chaffeensis (0,9±0,4%) обнаружено в клещах D. nuttalli.
Инфицированность клещей I. persulcatus бабезиями составила 2,7%, H.
concinna – 11,1%.
В табл. 2 представлены суммарные результаты исследования иксодовых клещей, собранных в природных очагах Иркутской области, на наличие
возбудителей КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, КР и бабезиоза.
Таблица 2
Результаты исследования иксодовых клещей на наличие
возбудителей КЭ, ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, КР и бабезиоза
Возбудители
Вид клеща
I. persulcatus D. silvarum
D. nuttalli
Н. concinna
Вирус КЭ
21476/3,1±0,1
2667/4,1±0,4*
240/2,5±1,0
Боррелии
9981/12,9±0,3 83/6,0±2,6
1782/3,0±0,4
126/0
Анаплазмы
1631/3,5±0,5
47/2,1±2,1
633/0,8±0,4
101/1,0±1,0
Эрлихии
1631/9,6±0,6
47/6,4±3,6
633/0,9±0,4
101/3,0±1,7
Риккетсии
46/37,0±7,1
142/63,4±5,1
260/41,9±3,1
12/0
группы КПЛ
Бабезии
257/2,7±1,0
45/11,1
Примечание: в числителе – количество исследованных клещей, в знаменателе M ± m, где M - % зараженных клещей, m - ошибка; * - суммарные результаты
исследования D. silvarum и D. nuttalli
Таким образом, установлено, что в сочетанных природных очагах Иркутской области в поддержании циркуляции различных клещевых патогенов и
их генетических вариантов принимают участие все доминирующие виды иксодовых клещей. Выявлены статистически значимые различия в зараженности
разных видов иксодовых клещей в Иркутской области возбудителями ИКБ,
ГАЧ и МЭЧ. В клещах I. рersulcatus боррелии, анаплазмы и эрлихии выявляются достоверно чаще, чем в клещах Dermacentor spp. (t = 5,1; 4,5 и 10,7 при
p<0,05 и К>500). Это подтверждает ведущее значение таежного клеща не
только в эпидемиологии КЭ и ИКБ, но и новых для региона инфекций – ГАЧ
и МЭЧ. Бабезии, которые, обнаружены в клещах I. persulcatus, по всей видимости, могут иметь ветеринарное значение. Судя по показателям зараженности
риккетсиями и вирусофорности, клещи рода Dermacentor также могут играть
существенную роль в эпизоотическом процессе, однако их роль в эпидемиологии ИКБ, ГАЧ и МЭЧ несколько ниже. Клещи Н. concinna являются переносчиками вируса КЭ, эрлихий, анаплазм и бабезий, но, скорее всего, не имеют
существенного значения в эпидемиологии, т.к. этот вид довольно редко
встречается на территории Иркутской области.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в природных очагах
Восточной Сибири в иксодовых клещах выявляются те же патогены, что и на
других территориях РФ. Их спектр представлен такими возбудителями, как
19
вирус КЭ, B. garinii, B. afzelii, B. miyamotoi, E. muris, A. phagocytophilum,
«Candidatus Neoehrlichia mikurensis», R. sibirica, R. raoultii (R.sp. DnS14, R.sp.
DnS28, R.sp. RpA4), «Candidatus R. tarasevichiae», B. crassa, выявлены
различные варианты микст-инфицирования иксодовых клещей патогенами
вирусной и бактериальной природы.
Генетические типы вируса клещевого энцефалита
на территории Восточной Сибири
В настоящее время для оценки генетической вариабельности вирусных
популяций используются фундаментальные данные о структуре вирусных геномов или их фрагментов. Ранее, в результате исследований генетического
разнообразия вируса КЭ на территории Восточной Сибири, нами доказана
циркуляция вируса КЭ трех основных генотипов (1, 2 и 3) и обнаружены
штаммы «886-84» и «178-79» с уникальной генетической структурой (Злобин
В.И. и др., 2002; Демина Т.В. и др., 2012; Козлова И.В., 2000; Козлова И.В. и
др., 2008, 2011; Верхозина М.М., 2000; Верхозина М.М. и др., 2011). Однако
для получения более полной и объемной информации о генетическом разнообразии вируса КЭ было необходимо существенное увеличение выборки изолятов с представительством различных участков ареала Восточной Сибири.
Представлялось также актуальным исследование вариабельности вируса по
различным локусам генома. Решение этих задач осуществлялось нами путем
исследования выборки, включающей 196 штаммов вируса КЭ с использованием комплекса молекулярно-биологических методов (МГНК с «длинной» панелью дезоксиолигонуклеотидных генотипспецифических зондов, секвенирование генома и ОТ-ПЦР).
Генотипирование вируса КЭ с помощью молекулярных зондов. Для
дифференциации штаммов в МГНК была использована панель зондов, включающая 40 дезоксиолигонуклеотидных последовательностей, мишенью для
которых послужили все десять генов вируса КЭ. Результаты исследования не
только подтвердили существование пяти генотипов вируса КЭ в очагах Восточной Сибири, но и позволили обнаружить 9 новых изолятов вируса КЭ, обозначенных нами как «группа 886» или генотип 5 (рис. 2). РНК этих штаммов,
аналогично штамму 886-84, гибридизовалась в 25% случаев с зондами генотипа 1. В дальнейшем результаты секвенирования подтвердили принадлежность этих штаммов к «группе 886».
Образцы РНК пяти штаммов гибридизовались одновременно с большей
частью зондов двух и более генотипов, эти штаммы были выделены нами в отдельную группу (политиповые). Термин «политиповые» или «микст-штаммы»
был введен применительно к вирусу КЭ В.В. Погодиной и Л.С. Карань, которыми выявлены штаммы, содержащие одновременно участки генома сибирского и дальневосточного или сибирского и европейского подтипов. В настоящее время появились сообщения о микст-штаммах, выделенных из пула
клещей, из одного клеща, из мозга умерших больных и крови больных (Карань
Л.С. и др., 2007; Погодина В.В. и др., 2007; Ковалев С.Ю. и др., 2008; Колясникова Н.М., 2008; Безрукова (Гамова) Е.Г. и др., 2009; Герасимов С.Г., 2012).
20
В данной работе штаммы 262-74, 618-87, 763-87, 765-87 отнесены к политиповым, т.к. образцы их РНК реагировали с зондами генотипов 1, 2, и 3, а РНК
штамма Красный Яр-1 – с зондами генотипов 1 и 3. Кроме того, РНК штаммов
618-87 и Красный Яр-1 гибридизовалась с зондом на основе штамма 178-79.
По мнению Т.В. Деминой (2013), «политиповые» штаммы представляют собой
смеси вирусных частиц разных генотипов, а образцы их РНК– смеси геномов,
соответствующие этим генотипам.
Рис.2. Результаты типирования штаммов из Восточной Сибири с помощью панели генотипспецифических зондов
Штамм 178-79 был отнесен к группе монотиповых штаммов, т.к. его
способность гибридизоватся не только со своим зондом, но с зондами генотипа 1, обусловлена своеобразием генетической структуры, проявляющимся в
чередовании аминокислот, характерных для двух генотипов, в пределах одного гена, что было сначала показано при расшифровке последовательностей
фрагмента гена белка Е длиной 160 н.о., а затем - полногеномной последовательности этого штамма.
В отличие от зондов, использованных нами ранее, данная панель позволила провести более точную внутривидовую дифференциацию штаммов и
получить дополнительную информацию о генетической вариабельности
штаммов внутри генотипов. Вариабельность штаммов выражалась: 1) в способности реагировать с разным количеством зондов определенного генотипа
(что, свидетельствует о наличии в структуре изучаемых фрагментов замен
нуклеотидов); 2) реагировать одновременно как с зондами одного, так и с единичными зондами других генотипов; 3) в равной степени гибридизоваться с
зондами всех трех генотипов. По мнению Т.В. Деминой (2013), такая вариабельность может быть объяснена либо наличием в исследуемом образце РНК
делеционных мутантов вируса другого генотипа, либо наличием нуклеотидных замен на участках, соответствующих прореагировавшим зондам.
Как известно, генотип 3 является неоднородным по своей генетической
структуре. Так, в его составе выделяют три субгенотипа, один из которых в
позиции 234 имеет аминокислоту аспарагин, как и штаммы генотипов 1 и 2
(Беликов С.И., 2000; Злобин В.И. и др., 2001). Два других субгенотипа отличаются как от западного и дальневосточного генотипов, так и от других вирусов ККЭ и имеют в данной позиции либо аминокислоту глутамин, либо гистидин. В зависимости от маркерных аминокислот в позициях 175 и 234 белка
21
Е выделяют два топоварианта – азиатский и европейский. Азиатский топовариант также в своем составе имеет 2 группы с прототипными штаммами Васильченко и Заусаев (Карань Л.С. и др., 2007).
Неоднородность генетической структуры штаммов, отнесенных к генотипу 3, была отмечена нами и при анализе данных гибридизации с субгенотипспецифичными зондами (предполагаемые субгенотипы (Васильченко/Айна) и
Заусаев). Штаммы, вошедшие в состав данного генотипа, разделились на три
субкластера: 1) субгенотип 3а (прототипные штаммы Васильченко, Айна/1448)
– 24,4%; 2) субгенотип 3б (прототипный штамм Заусаев – 19,1%; 3) «группа ни
3а, ни 3б» (РНК этих штаммов не взаимодействовала с зондами на основе генетических структур штаммов Заусаев и Васильченко) – 56,5%.
Генотипирование на основе анализа последовательностей нуклеотидов вирусных геномов. Проведено секвенирование фрагментов генома 67
штаммов вируса КЭ. Все полученные структуры были сгруппированы в зависимости от исследованного участка генома и выравнены относительно фрагмента последовательностей прототипных штаммов, опубликованных в
GenBank: Софьин (Х03870), Sofjin-HO (AB062064), Oshima 5-10 (AB062063) –
генотип 1; Neudoerfl (U27495), 263 (TEU27491) – генотип 2; Zausaev
(AF527415), Vasilchenko (AF069066), Ek-328 (DQ486861) – генотип 3. В качестве внешней группы использовали последовательности фрагментов генома
флавивируса OHF (NC005068).
Типирование штаммов вируса КЭ на основе данных секвенирования
фрагмента генов белка Е и NS1 (297 н.о.). Методами ОТ-ПЦР с дальнейшим
секвенированием были определены нуклеотидные последовательности гена
белка Е и NS1 длиной 297 н.о. 46 штаммов вируса КЭ, изолированных в различных участках Восточной Сибири. Полученные последовательности 38
штаммов депонированы в базе данных GenBank (номера JN936329 - JN936365,
JN936369). Расшифрованный фрагмент кодирует участок гена белка Е (12461488 н.о. от начала гена Е) и гена NS1 (позиции 1-54 н.о. от начала гена NS1
вируса КЭ штамма Софьин).
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что
исследованные штаммы разделились на группы, соответствующие пяти генотипам вируса КЭ. Пять изолятов проявляют сходство со штаммами генотипа
1 с высокой степенью гомологии (96-99%) и достоверно отличаются от прототипных штаммов других генотипов (79-89% гомологии). Три образца генотипа 2 проявили высокую степень гомологии со штаммом Neudoerfl – 97%.
Третью группу образовали 28 штаммов, сходство которых с прототипами генотипа 3 (Vasilchenko, Zausaev, Ek-324) составило от 91 до 98%. Полученные
последовательности 21 штамма обладали более высоким уровнем сходства со
штаммом Vasilchenko (96-98%), шести образцов – со штаммом Zausaev (9798% гомологии). Для штамма 241-87, примыкающего к генотипу 3, отличия
от прототипных штаммов были более высокими (3 - 8%).
Девять штаммов вошли в «группу 886» (99-100% гомологии), отличаясь
от представителей остальных генотипов на 10-20%.
22
Результаты типирования вышеперечисленных штаммов в тестах МГНК с
генотипспецифическими зондами и на основе данных секвенирования фрагментов генов белков Е и NS1 (297 н.о.) в целом совпали. Исключение составили штаммы 262-74 и 765-87, 429-82, первые два из которых по результатам
МГНК были отнесены к политиповым, а штамм 429-82– к генотипу 1. При генотипировании на основе анализа последовательностей нуклеотидов изолят
262-74 вошел в группу генотипа 2, 765-87 – генотипа 1, 429-82 – отнесен к
генотипу 3.
Дендрограмма, построенная на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Е и NS1 различных штаммов вируса КЭ (рис. 3А) демонстрирует разделение исследуемых штаммов на кластеры, соответствующие пяти генотипам вируса КЭ.
3А
3Б
Рис. 3. Дендрограммы, построенные на основе: А) нуклеотидных и Б)
аминокислотных последовательностей фрагментов генов Е и NS1 различных
штаммов вируса КЭ методом UPGMA. Примечание: цифры над узлами дендрограммы – индекс поддержки; ▲– прототипные штаммы разных генотипов.
23
Штаммы генотипа 3 образуют два субкластера, один из которых относится к субгенотипу «3а» (прототипный штамм «Vasilchenko»), второй – к
субгенотипу «3б» (прототипный штамм «Zausaev»).
Исследуемый участок гена белка Е и гена NS1 длиной 297 н.о, кодирует
последовательности из 99 аминокислот в позициях 416-496 (ген Е) и 1-18 (ген
NS1). Несмотря на наблюдаемые отличия в нуклеотидных последовательностях фрагментов гена Е и NS1 (гомология последовательностей штаммов одного и того же генотипа от 96-98% и выше), для белковых последовательностей изучаемых штаммов уровень гомологии составил 98-100%.
Наряду со стандартными аминокислотными остатками, для некоторых
штаммов обнаружены нетипичные аминокислоты. Так, например, для штамма
241-87 в позиции 433 валин (V) замещен на лейцин (L), а в позиции 476 метионин (М) – на лейцин (L). Это нашло свое отражение при построении дендрограммы на основе аминокислотных последовательностей (рис. 3Б), где положение исследуемых штаммов в целом сохраняется, прослеживается четкое
разделение штаммов сибирского генотипа на кластеры, соответствующие субгенотипам Vasilchenko и Zausaev, а штаммы 48-76, 29-94, 98-86, 482-79, 44783, 820-90, 241-87, 742-87 образуют отдельные ветви в группе генотипа 3.
Типирование штаммов вируса КЭ на основе данных секвенирования гена
белка Е (1449 н.о.). Нуклеотидные последовательности гена белка Е длиной
1449 н.о. были определены у штаммов 112-79 (FJ214156), 118-71 (FJ214154),
134-71 (FJ214155) и 48-06 (FJ214157) вируса КЭ, изолированных в Иркутской
области. Для построения филогенетического древа в анализ кроме вышеперечисленных прототипных штаммов были включены штаммы генотипа 2 (№265
и Hypr), генотипа 1 (№205) из базы данных GenBank.
Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штаммы 118-71
и 134-71 имеют 100% гомологию между собой и наиболее близки по своей
структуре к штаммам генотипа 2 (№263, Neudoerfl и Hypr), сходство с которыми составило 98,2%, 98,0% и 97,2% соответственно. Штамм 112-79 был отнесен к субгенотипу 3а генотипа 3, проявив максимальное сходство со штаммом Vasilchenko (98,4%). Штамм 48-06 группировался со штаммами генотипа
1 (96,7% гомологии со штаммом Sofjin-HO, 95,5% – Oshima 5-10 и 94,9% – со
штаммом 205) (рис. 4А). При анализе гомологии аминокислотных последовательностей гена белка Е выявлено, что для изученных изолятов сохраняется
высокий уровень сходства с теми же прототипными штаммами. Штамм 48-06,
наряду с аминокислотными остатками, характерными для генотипа 1, имеет
замены в позициях 10 – гистидин (H), 27 – аспарагин (N), 28 – аланин (А), 260
– гистидин (H), 266 – аргинин (R). При построении дендрограммы на основе
аминокислотных последовательностей на филогенетическом древе изменилось
положение штаммов 178-79, 886-84 и 48-06. Как показано на рис. 4Б, штамм
178-79 кластеризуется со штаммом 205 генотипа 1, а штаммы 886-84 и 48-06
примыкают к генотипу 1, образуя самостоятельные ветви.
Типирование штаммов вируса КЭ на основе данных секвенирования
фрагмента гена белка Е (217 н.о.). Путем секвенирования фрагментов гена Е
различной длины, содержащих маркерные аминокислоты в 206-й и 234-й по24
зициях были генотипированы 16 штаммов. Номера депонированных в
GenBank штаммов: AF224662, AF224666, AF224667, AF231806.
4А
4Б
Рис. 4. Дендрограммы, построенные на основе: А) нуклеотидных и Б)
аминокислотных последовательностей гена Е штаммов вируса КЭ методом
UPGMA. Примечание: (здесь и далее) ● – штаммы, последовательности которых получены в данной работе.
Полученные
нуклеотидные последовательности были выравнены относительно фрагмента последовательностей прототипных штаммов длиной
217 н.о. (позиции 501-717 н.о. от начала гена Е штамма Софьин).
По результатам филогенетического анализа 13 исследованных штаммов
были отнесены к генотипу 3 (рис. 5А).
5А
5Б
Рис. 5. Дендрограммы, построенные на основе А) нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е (217 н.о.) и Б) аминокислотных последовательностей фрагмента гена Е (82 а.о.) штаммов вируса КЭ методом UPGMA
25
Штамм 2517-05 вошел в кластер генотипа 1, изолят 272-75 – генотипа 2,
а 418-90 – в состав «группы 886» (генотип 5). Анализ гомологии нуклеотидных оснований штаммов генотипа 3 показал, что одна часть из них проявляла
большее сходство со штаммом Vasilchenko (96,4-97,7% гомологии), тогда как
другие были более схожи со штаммом Zausaev (96,4-98,6%).
При сопоставлении аминокислотных последовательностей исследуемых
штаммов с последовательностями прототипных штаммов (73 а.о. в позиции
167-239 по гену Е) установлено, что изоляты разделились на группы, соответствующие трем генотипам по маркерной аминокислоте в 206 позиции, а
штаммы генотипа 3 – на субгенотипы по маркерной аминокислоте в 234 позиции. Аминокислотные последовательности штаммов 413-04, 352-81 и 418-90
имеют отличия по нескольким позициям. При построении филогенетического
древа эти штаммы расположились на отдельных ветвях (рис. 5Б).
Штамм 496-86, по результатам анализа нуклеотидных последовательностей вошедший в состав субгенотипа 3а, в данном случае переместился в
группу 3б.
Филогенетический анализ штаммов вируса КЭ на основе данных секвенирования полных геномов (10242 н.о.) и фрагмента генома, соответствующего генам С, М и части Е (1650 н.о.). Как было указано выше, при изучении
генетической характеристики штаммов, выделенных на территории Иркутской
области, были обнаружены штаммы со своеобразной картиной гибридизации.
Первоначально эти штаммы были описаны как представители самостоятельных генотипов, так как соответствовали установленным критериям генотипирования – 12% и более генетических отличий от других генотипов. Однако
оказалось, что при анализе гомологии аминокислотных последовательностей
фрагмента гена белка Е длиной 160 н.о., штамм 886-84 примыкает к генотипу
3, а штамм 178-79 к генотипу 1. Так, штамм 178-79 в позиции 206 имел аминокислоту серин, а в 235 – аспарагин, как и другие представители генотипа 1.
Штамм 886-84 в позиции 206 имел лейцин, как и все штаммы генотипа 3, а в
позиции 235 аминокислоту аспарагин, как и генотипы 1 и 2 (Злобин В.И. и др.,
2002).
К настоящему времени полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности геномов (10 758 н.о.) штаммов 886-84, 178-79 (GenBank
№EF469661 и EF469662) (Карань Л.С. и др., 2007) и изолята 617-90 (не депонирован), входящего по результатам проведенного ранее исследования в
«группу 886». В результате сравнительного анализа полногеномных последовательностей штаммов 886-84 и 617-90 нами установлено, что их гомология
составляет 99,7%. Сопоставление полных геномов штаммов 886-84, 617-90 и
178-79 с последовательностями вируса КЭ, имеющимися в GenBank, показало,
что на филогенетических деревьях они образуют две отдельные ветви (886-84
и 617-90 – одна, 178-79 – вторая), не входя в состав кластеров трех основных
генотипов (рис. 6), и по уровню нуклеотидных и аминокислотных замен преодолевают или приближаются к установленной нами ранее условной границе
разделения генотипов вируса КЭ в 12%.
26
Рис. 6. Филогенетическое древо, демонстрирующее уровень генетического
родства 55 штаммов вируса КЭ, полученное на основании расшифровки кодирующей области полипротеина (10242 н.о.)
Состав кластеров: генотип 1 - X07755, AB022703, AB001026, DQ989336,
AY182009, AY217093, JF316707, JF316708, FJ997899, EU816450 – EU816455,
AY169390, FJ906622, GQ228395, FJ402885, FJ402886, DQ862460, GU121642,
HQ201303, HQ901367, HQ901366, HM859894, HM859895, JN003205); генотип
2 – TEU27495, TEU27491, TEU39292, AF091010, EU106868, DQ401140,
GV266392, HM535610, HM535611, HM120875, GU183379 – GU183381,
GU183383; генотип 3 – L40361, AF527415, DQ486861, FJ968751, JN003206 –
JN003209, GU183382, GU183384
Анализ полной аминокислотной последовательности геномов штаммов
«группы 886» подтвердил, что их генетическая структура уникальна, она представляет собой «переплетение» из последовательностей, характерных для генотипов 1, 2 и 3 (Карань Л.С. и др., 2007). Как показано в работе Т.В. Деминой
(2013), в наборе из 22 позиций, однозначно дифференцирующих известные
штаммы ВКЭ на три основных генотипа, для штамма 886-84 обнаружено чередование собственных (или уникальных) аминокислот (аланин (A) в позиции С108, серин (S) – NS2A-127 и глицин (G) – NS3-258) с аминокислотами, характерными для каждого из трех основных генотипов.
В полипротеине штамма 886-84 выявлено 28 уникальных замен. Нам
удалось подтвердить генотипспецифическую принадлежность (уникальность)
для 26 замен из 28 у штаммов 886-84 и 617-90 (табл. 3).
На настоящий момент с помощью МГНК и секвенирования нами выявлена группа из 13 изолятов, имеющих генетическую структуру, аналогичную
штамму 886-84. Для восьми штаммов из этой группы были получены фрагменты геномов длиной 1650 н.о., кодирующие белки С, М и часть белка Е (810
н.о.) (рис. 7). Гомология внутри «группы 886» составила 98,2-99,8%, а уровень
различий между штаммами этой группы и представителями трех основных генотипов варьировал от 13,1% со штаммом Софьин до 16,6% со штаммом Найдорф. Штамм 178-79 является единственным представителем генотипа 4, который по сравнению с остальными известными генотипами по уровню гомологии нуклеотидной и аминокислотной последовательностей близко примыкает к генотипу 1.
27
Таблица 3
Замены в полной последовательности полипротеина ВКЭ
длиной 3414 а.о., уникальные для «группы 886»
Белок
С
M
E
NS1
NS2A
NS2В
NS3
NS4А
NS5
Позиция а.о. по
полипротеину
Позиция а.о.
по белку
Генотип 1
98
108
270
688
735
848
898
1125
1181
1250
1255
1258
1329
1485
1745
1747
2185
2537
2607
2781
2893
2895
3033
3098
3142
3388
98
108
158
408
455
72
122
349
53
122
127
130
201
357
256
258
696
26
96
270
382
384
522
587
631
877
А
V/L/I
V
K
L
A/V
S
M
I
S/G
A
K
I/V
R
Q
V
T
A/S
A
E
I
E
G/E
D
I
Q
Генотип 2
А
I
V
K
L
V
S
M
I/M
G/S
E/D
K
V/I
R
Q
A
T
V
A
E
I
E
K
D
I
P
Генотип 3
Т
T
V
K
L/M
V
S
M
I
G
G
K
I
R
Q
M/V
T
V
A
E
I
E
K
D
I
P
178-79
А
V
V
K
L
A
S
M
I
G
G
K
I
R
Q
V
T
A
A
E
I
E
G
D
I
Q
«Группа 886»
886-84
617-90
V
A
A
R
I
S
A
T
V
Y
S
R
T
K
H
G
A
S
S
D
M
D
R
E
V
H
V
A
A
R
I
S
A
T
V
Y
S
R
T
K
H
G
A
S
S
D
M
D
R
E
V
H
Примечание: генотип 1 представлен транслированными нуклеотидными
последовательностями X07755, AB022703, AB001026, DQ989336, AY182009,
AY217093, JF316707, JF316708, FJ997899, EU816450-EU816455, AY169390,
FJ906622, GQ228395, FJ402885, FJ402886, DQ862460, GU121642, HQ201303,
HQ901367, HQ901366, HM859894, HM859895, JN003205; генотип 2 TEU27495, TEU27491, TEU39292, AF091010, EU106868, DQ401140,
GQ266392, HM535610, HM535611, HM120875, GU183379- GU183381,
GU183383; генотип 3 - L40361, AF527415, DQ486861, FJ968751, JN003206JN003209, GU183382, GU183384
Рис. 7. Филогенетическое дерево (UPGMA), построенное на основе анализа
фрагмента генома вируса КЭ, соответствующего генам С, М и части Е (1650
н.о.)
28
При расшифровке полной аминокислотной последовательности штамма
178-79 обнаружено чередование аминокислот, характерных для двух генотипов (1 и 3) в пределах одного гена (Карань Л.С. и др., 2007).
Генотипирование методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами.
Методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с гибридизационнофлюоресцентной детекцией с генотипспецифическими зондами было изучено
18 штаммов вируса КЭ. В ходе данного скрининга была подтверждена установленная нами с помощью МГНК и секвенирования принадлежность 15
штаммов к трем генотипам и типирован ранее не исследованный штамм 204105. Кроме того, было выявлено два «микст-штамма», один из которых содержал вирус КЭ генотипов 3 и 2 (штамм 3869-03), а другой – генотипов 1 и 3 одновременно (штамм 1392-04). По результатам МГНК с панелью из 40 генотипспецифических зондов и секвенирования фрагментов генома штаммы 3869-03
и 1392-04 были отнесены к генотипу 3. Оба штамма выделены из сыворотки
крови людей с различными формами КЭ. До генотипирования, выявившего
наличие геномов двух подтипов, каждый штамм прошел 4-5 пассажей в культуре клеток СПЭВ и на белых беспородных мышах, что указывает на стабильность двойной инфекции. Штаммы 763-87 и 765-87 вошли по результатам исследования в реакции МГНК в группу политиповых штаммов. По результатам
секвенирования штамм 765-87 был типирован как генотип 1. При исследовании в ОТ-ПЦР в режиме реального времени с генотипспецифическими зондами изолят 765-87 был типирован как генотип 2, а 763-87 – как генотип 1. Такое расхождение в результатах типирования может быть следствием того, что
политиповые штаммы содержат РНК вируса КЭ разных генотипов, но поскольку для исследования в разных реакциях были взяты образцы от разных
пассажей, то соотношение между вирусными частицами трех генотипов могло
меняться вследствие проявления «эффекта бутылочного горлышка» (Цилинский Я.Я., 1988). Кроме того, на результат могли повлиять различия в структурах праймеров и зондов, использованных в разных методах типирования.
Таким образом, исследование, проведенное с помощью молекулярнобиологических методов, подтвердило полученные ранее данные о циркуляции
на территории Восточной Сибири пяти генотипов вируса КЭ и, кроме того, позволило получить новые данные о генетической гетерогенности вирусной популяции.
Установлено, что основу популяции вируса КЭ на территории Восточной Сибири представляет генотип 3 (75,0%). Штаммы генотипа 1 составили
9,7%, генотипа 2 – 3,6%. Обнаружены штаммы с уникальной генетической
характеристикой (178-79 и 886-84). Выявлена группа из 13 штаммов, имеющих генетическую структуру, аналогичную штамму 886-84 (генотип 5). Получены генетические доказательства особенностей штаммов, входящих в
«группу 886». Обнаружены «политиповые» или «микст-штаммы», сочетающие в себе последовательности: а) генотипов 1 и 3, б) генотипов 3 и 2, в) генотипов 1, 2 и 3. Отмечена неоднородность генетической структуры штам29
мов генотипа 3. Штаммы разделились на 2 группы: 3а (Васильченко) –
64,3% и 3б (Заусаев) – 35,7%. Показана неоднородность генетической структуры штаммов внутри генотипов.
В отношении отдельных изолятов вируса КЭ выявлена идентичность исследуемых участков генома. Результаты проведенного анализа показали, что
100% гомологию нуклеотидных последовательностей изученных фрагментов
имеют штаммы: 1) изолированные в разные годы из материала, собранного в
одном природном очаге; 2) выделенные из различных источников, собранных
на территории разных районов. Отмечено, что штаммы, выделенные в географически ограниченной зоне, были более сходны по генетической структуре.
Использование современных молекулярно-биологических методов позволило получить развернутую картину географического распространения
генетических типов вируса КЭ на территории Восточной Сибири и входящих в нее отдельных регионов (табл. 4). Так, при исследовании 14 штаммов,
выделеных из клещей I. persulcatus, собранных в природных очагах югозападной части Забайкальского края, выявлены штаммы генотипов 3 (9 изолятов), 5 (4) и один штамм генотипа 1 вируса КЭ. Суммируя собственные данные
и материалы других исследователей (Андаев Е.И., 2009; Сидорова Е.А. и др.,
2012) по генетическому типированию штаммов, мы пришли к заключению,
что на территории Забайкальского края циркулирует вирус КЭ генотипов 1, 3,
5 и микст-штаммы (или политиповые), сочетающие признаки генотипов 1 и 3.
Таблица 4
Результаты анализа географического распространения генотипов вируса
КЭ на территории Восточной Сибири
Генотип
178-79
886-84
Политиповой
Всего
Место изоляции
штаммов
9/64,3
-
4/28,6
-
14
-
45/69,2
-
9/13,8
4/6,2
65
11/10,9
7/6,9
77/76,2
1/1,0
1/1,0
4/4,0
101
Красноярский край
-
-
12/100,0
-
-
-
12
Республика Хакасия
-
-
4/100,0
-
-
-
4
147/75,0
1/0,5
1
2
3
Забайкальский край
1/7,1
-
Республика Бурятия
7/10,8
Иркутская область
Итого: абс./ %
19/9,7
7/3,6
14/7,1
8/4,1
196
Генотипирование 65 штаммов, изолированных на территории Республики Бурятия, показало, что популяция вируса КЭ в этом регионе представлена
генотипами 3 (69,2%), 5 - «группа 886» (13,8%), 1 (10,8%) и политиповыми
штаммами (6,2%), в состав которых входят вирусные частицы генотипов 1 и 3,
а также, возможно, генотипов 1, 2 и 3.
Наибольшая генетическая вариабельность вируса КЭ выявляется в
Иркутской области. Исследования генетической характеристики 101 штамма
позволили установить, что на данной территории циркулирует вирус КЭ всех
30
генотипов (1, 2, 3, 4 и 5) и политиповые штаммы, содержащие РНК генотипов
1 и 3; 3 и 2; 1, 2 и 3. В Иркутской области так же, как и в других регионах Восточной Сибири, преобладали штаммы генотипа 3 (76,2%). Отмечено, что территория области является восточной границей распространения генотипа 2 вируса КЭ в России.
При типировании штаммов из Красноярского края и Республики
Хакасия было показано, что все они (16) принадлежат генотипу 3.
С помощью МГНК и секвенирования фрагментов генома вируса КЭ установлена субгенотипическая принадлежность 84 штаммов генотипа 3. Все
штаммы генотипа 3 из Забайкальского края вошли в группу 3а (Васильченко).
На территории Республики Бурятия преобладали штаммы группы 3а (86,7%),
и меньшую часть (13,3%) составили штаммы субгенотипа 3б (Заусаев). В Иркутской области генотип 3 представлен приблизительно одинаковыми пропорциями субгенотипов 3а (55,6%) и 3б (44,4%). Особенностью субгенотипического состава на территории Красноярского края и Республики Хакасия было
преобладание штаммов группы 3б (66,7%). Приведенные данные позволяют
сделать заключение о преобладании штаммов субгенотипа 3а на территории
восточных регионов Восточной Сибири и постепенном уменьшении их количества по направлению к западу. Для штаммов генотипа 3б отмечена обратная
тенденция.
Таким образом, можно заключить, что Восточная Сибирь является уникальной территорией генетического разнообразия вируса КЭ, обитания всех
описанных в настоящее время генотипов, двух субгенотипов и микст-штаммов
в различных сочетаниях.
Фенотипические различия штаммов вируса КЭ, выделенных на
территории Восточной Сибири
Наряду с установлением генетической структуры штаммов, выделенных
на территории Восточной Сибири, мы сочли необходимым оценить их фенотипические характеристики, которые являются важной составляющей полноценного представления о природе и свойствах вируса и имеют большое значение для практической вирусологии. Из основных групп признаков, используемых для выявления межштаммовых различий вируса КЭ, были выбраны следующие генетические маркеры: антигенная специфичность, бляшкообразующая активность (S), способность к репродукции при различных температурах
(rct37 и rct42), терморезистентность (Т50), вирулентность штаммов для молодых
белых мышей. Изучение коллекции штаммов из Восточной Сибири по этим
признакам, начатое А.Г. Трухиной и соавторами в 1980-е годы (Трухина А.Г.,
1989; Трухина А.Г. и др., 1992), было впоследствии продолжено нами (Верхозина М.М., 2000). В настоящее время у нас появилась возможность дополнить
эти исследования и оценить полученные результаты в совокупности с анализом различий штаммов на молекулярном уровне.
Данные, полученные в результате антигенной дифференциации штаммов с помощью РДПА и РН, свидетельствуют о циркуляции на территории
Восточной Сибири популяции вируса КЭ с высоким уровнем антигенной вариабельности.
31
Помимо представителей какого-либо одного из трех антигенных подтипов, выявляются штаммы, проявляющие антигенное сходство с двумя (сибирским и западным, западным и дальневосточным, сибирским и дальневосточным) и тремя антигенными подтипами (рис. 8).
4,2%
10,4%
4,2%
4,2%
20,8%
2,1%
ДВ
54,1%
С
З
ДВ+С+З
ДВ+З
С+З
ДВ+С
Рис. 8. Результаты типирования 48 штаммов вируса КЭ с помощью
РДПА. ДВ - дальневосточный антигенный подтип, С - сибирский, З - западный
Результаты типирования в РДПА и РН не всегда совпадают в силу
большей специфичности РДПА с адсорбированными сыворотками. Некоторые штаммы, по-видимому, обладают «богатым» антигенным набором, что
дает основание рассматривать их в качестве перспективных вариантов для
приготовления эффективной вакцины, покрывающей антигенную вариабельность вируса КЭ. При сопоставлении результатов антигенного и генетического анализа выявлено, что установленные в РДПА антигенные варианты в
большой степени соответствуют определенным генетическим типам.
Изучение фенотипических маркеров S, rct37, rct42 и Т50 показало, что
популяция вируса КЭ является неоднородной по этим признакам. У разных
штаммов величина бляшек (S-признак) варьировала от 1 до 5,5 мм в диаметре.
Все штаммы активно размножались в культуре клеток СПЭВ, вызывая разрушение клеточного монослоя на 4-6 сутки. Показатель lg ТЦД50/мл при 37°С у
разных штаммов колебался от 3,25 до 10,67. Результаты определения индекса
инактивации 81 штамма при температуре 50°С (Т50) показали, что штаммы
разделяются на термостабильные (59,3±5,5%), термолабильные (18,5±4,3%) и
занимающие промежуточное положение между термостабильными и термолабильными (22,2±4,6%). Большая часть штаммов (84,0±4,1%) активно размножалась при супраоптимальной температуре 42ºС (rct42+), штаммы с rct42- - признаком составили 6,1±2,7%, с rct42± - признаком - 9,9±3,3%.
Анализ вирулентных свойств 37 штаммов вируса КЭ из Восточной Сибири для молодых белых мышей (в т.ч. с привлечением данных по 13 штаммам, полученных А.Г. Трухиной и соавторами (Трухина А.Г., 1989)) показал,
что большинство из них характеризуется высокой церебральной активностью.
Титры вируса при внутримозговом заражении мышей колебались от 6,16 до
10,9, составив в среднем 8,0 lg LD50/мл. При подкожном заражении активность штаммов варьировала от 3,6 до 9,8 lg LD50/мл, среднее значение ее равнялось 6,1 lg LD50/мл. Показатели индекса инвазивности колебались от 0 до
4,5. Более половины исследованных штаммов (67,6±7,7%) характеризовались
32
высоким уровнем (от 0 до 2,42 lg LD50/мл) периферической активности (II+),
остальные обладали средним (II±) и низким (II-) уровнем периферической активности. Показатели СПЖ мышей после заражения различными штаммами
варьировали от 3,8 до 9,8 дней, процент летальности – от 60 до 100%.
При проведении сравнительного анализа штаммов, отнесенных к разным
генотипам, установлены некоторые различия по фенотипическим свойствам.
Штаммы генотипа 1 образовывали только мелкие бляшки, они активно размножались в культуре СПЭВ (показатель lg ТЦД50/мл при 37°С варьировал от
4,84 до 10,67, составив в среднем 7,2), были менее устойчивы к прогреванию
по сравнению со штаммами других генотипов и хорошо размножались при
42ºС (табл. 5).
Таблица 5
Результаты определения генетических признаков S, Т50 и rct42 штаммов
вируса КЭ разных генотипов (абс./%)
Генетические маркеры
S
Т50
rct42
Выраженность признака
+
±
Выраженность признака
+
±
+
±
-
1
n= 6
0
0
6 /100,0
n=8
3/37,5
2/25,0
3/37,5
7/87,5
1/12,5
0
2
n=4
2 /50,0
0
2/50,0
n=5
4/80,0
0
1/20,0
4/80,0
0
1/20,0
Генотип
3
4
n=31
n=1
10/32,2
0
15/48,4
0
6/19,4
1
n=51
n=1
30/58,8
0
11/21,6
1
10/19,6
0
44/86,3
1
5/9,8
0
2/3,9
0
5
n=3
1/33,3
1/33,3
1/33,3
n=13
9/69,2
3/23,1
1/7,7
10/76,9
2/15,4
1/7,7
П
n=2
0
0
2/100,0
n=2
1
1
0
2
0
0
Примечание: n –количество исследованных штаммов
Среди штаммов генотипа 1 встречались изоляты как с высокой, так и с
низкой периферической активностью. При заражении белых мышей штаммами генотипа 1 отмечена минимальная СПЖ, составившая в среднем 4,6 дней и
более высокий процент летальности (98,4±0,8%) (табл. 6).
Таблица 6
Результаты определения индекса инвазивности (II), СПЖ и летальности
штаммов вируса КЭ разных генотипов
Генетические маркеры
Генотип
4
5
П
выраженность признака
n=1
n=11
0
+
2/100,0
12/66,7 1/100,0
7/63,6
II
±
4/22,2
2/18,2
2/40%
2/11,1
2/18,2
n*=248 n*=122 n*=1353 n*=38 n*=162 n*=77
СПЖ
6,0
5,8
4,6
5,5
4,7
5,6
Летальность (%)
98,4
95,9
93,4
100,0
95,1
98,7
Примечание: n – количество исследованных штаммов; n* - количество зараженных мышей
1
n=5
3/60,0
-
2
n=2
3
n=18
33
Штаммы генотипа 2 были разнородными по S и rct42-признакам, обладали
более низкой способностью размножаться в культуре СПЭВ (lg ТЦД50/мл при
37°С составил в среднем 5,8) и самой высокой устойчивостью к прогреванию,
более низким уровнем периферической активности. По показателям СПЖ и
летальности для белых мышей штаммы генотипа 2 оказались на втором месте
после штаммов генотипа 1. Штаммы генотипа 3 имели более гетерогенный состав по S, Т50, rct42 и II - признакам, хорошо размножались в культуре СПЭВ
(lg ТЦД50/мл при 37°С равнялся 6,0). Для мышей, зараженных штаммами генотипа 3, процент летальности колебался от 60 до 100%, составив в среднем
93,4±0,7%, показатель СПЖ был выше (6,0 дней). Штаммы генотипа 5 по S,
Т50, rct42 и II - маркерам были схожи со штаммами генотипа 3, процент летальности для белых мышей составил (95,1±1,7%), СПЖ – 5,8 дней.
В результате совместных исследований, проведенных на базе Института
химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск), были исследованы закономерные связи между аминокислотными последовательностями, соответствующими структурным белкам C, prM и E и началу неструктурного белка NS1 25 штаммов вируса КЭ и их биологическими
свойствами – нейроинвазивностью, терморезистентностью и способностью
размножаться при супраоптимальной температуре.
Проведенный анализ показал, что в последовательностях исследуемых
белков не было найдено мутаций, оказывающих влияние на терморезистентность. Мутация в белке prM в позиции 125 а.о. полипротеина, вероятно, влияет
на способность размножаться при температуре 42ºС. Мутации в белках prM
(позиции 163,176,246, 248, 251 и 258 а.о.), Е (позиции 300, 347, 348 433 а.о.),
NS1 (позиции 830, 848, 897, 918, 1061, 1065 а.о. полипротеина) могут, возможно, влиять на нейроинвазивность.
На базе Института математики им. С.Л. Соболева СО РАН (г. Новосибирск) была исследована зависимость между тремя изучаемыми целевыми
свойствами 17 штаммов, для каждого из которых были определены нуклеотидные последовательности фрагментов генома и выведены аминокислотные
последовательности, соответствующие вышеперечисленным белкам.
Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что терморезистентность и способность штаммов размножаться при супраоптимальной температуре связаны между собой довольно сильной обратной зависимостью.
Различная термоустойчивость вирусов является генетическим признаком, коррелирующим с вирулентностью возбудителя.
Эколого-географические аспекты генетической вариабельности
вируса КЭ в Восточной Сибири
Выше нами было показано, что популяция вируса КЭ, циркулирующего
в природных очагах Восточной Сибири гетерогенна, однако остаются открытыми вопросы о том, с какими экологическими факторами связана генетическая вариабельность вируса на данной территории. В связи с этим мы провели
анализ некоторых структурных компонентов природных очагов, на территории которых проводились исследования, включая климатическую и ландшафтную характеристику территорий, характерные для них фаунистические
34
комплексы мелких млекопитающих – прокормителей клещей, тип населения
иксодид и их доминирующие виды, степень освоенности очагов человеком,
генетические типы вируса КЭ, циркулирующие в очагах.
Результаты анализа распространения генотипов вируса КЭ в основных
типах ландшафтов приведены в табл. 7. Связь генотипов 1, 3 и политиповых
штаммов с определенным видом ландшафта и степенью их освоенности человеком не установлена. Преобладающее количество штаммов генотипа 5 выделено из материала, собранного в Забайкалье, в ландшафтах горной тайги. Они,
так же, как и штамм генотипа 4, обнаруживаются в очагах, где отмечена совместная циркуляция нескольких генотипов вируса КЭ. Штаммы генотипа 2
выявлены в ландшафтах тайги равнин и плато и островных степей и лесостепей южной части Предбайкалья. Кроме того, обнаружение РНК вируса КЭ генотипа 2 в составе политиповых штаммов 763-87 и 765-87, выделенных в пойменных и лесостепных ландшафтах Баргузинской котловины, не исключает
вероятность циркуляции генотипа 2 в очагах Забайкалья.
Таблица 7
Распространение штаммов вируса КЭ различных генотипов в основных типах
ландшафтов (абс./%)
Основные ландшафты
Генотипы
1
2
3
4
П
5
Всего
Горная тайга и таежноерниковые котловины
7/10,0
-
48/68,5
-
13/18,6
2/2,9 70
Тайга равнин и плато
3/10,7
1/3,6
22/78,5
-
1/3,6
1/3,6 28
Лесостепь 8/9,1
6/6,8
69/78,4
1/1,1 -
4/4,6 88
Степь
-
-
4/100
-
-
-
4
Пойма рек
-
-
4/80
-
-
1/20
5
Всего
18
7
147
1
14
8
195
Лесостепные и
степные межгорные котловины
Наибольшая генетическая вариабельность отмечена в районах, располагающихся вдоль оз. Байкал, а также в юго-восточной части Забайкалья. В
Предбайкалье - это территория Иркутской области с благоприятными климатическими условиями, расположенная в южной части, между 52º32' 52º54'с.ш. и 104º47' - 105º29' в.д., включающая участки сбора материала в Иркутском и Эхирит-Булагатском районах. Здесь сочетаются ландшафты островных степей и лесостепей, значительно нарушенных хозяйственной деятельностью человека, переходящие в ландшафты тайги равнин и плато. В Забайкалье
это 1) северо-восточные районы с более суровым климатом, приуроченные к
Баргузинской котловине, где представлены горнотаежные, лесостепные и
пойменные ландшафты; 2) районы с более мягким климатом, непосредственно
примыкающие к средней и южной части оз. Байкал; 3) юго-западные районы,
где таежные среднегорья сочетаются с элементами лесостепи. В районах, расположенных западнее вышеперечисленных территорий (Зиминский район Ир35
кутской области, Красноярский край и Республика Хакасия), популяция вируса КЭ более однородна и представлена штаммами генотипа 3, несмотря на то,
что разнообразие ландшафтов, и, следовательно, переносчиков вируса КЭ и
их прокормителей выражено также широко.
Возможно, разнообразие вируса КЭ в Прибайкалье связано с его особым
географическим положением в центре азиатского континента и историей формирования территории. Байкальская рифтовая зона, представляющая систему
горных хребтов и межгорных впадин – один из важнейших зоогеографических
рубежей Палеарктики. Здесь проходят границы ареалов большого числа видов
флоры и фауны западного и восточного происхождения, представляющих, в
целом, сложное генетически разнородное образование. Если экстраполировать
концепцию происхождения современного видового разнообразия представителей флоры и фауны на территории Прибайкалья на вирусные популяции, то
становится понятным обнаружение в данном регионе вируса генотипа 2, циркулирующего преимущественно на западных территориях и генотипа 1 – доминирование которого отмечается в регионах, расположенных восточнее.
Так как основу формирования популяции вируса КЭ составляют иксодовые клещи и их прокормители – позвоночные животные, то чрезвычайно важно, по нашему мнению, получить генетическую характеристику штаммов вируса, выделенных из различных источников на территории Восточной Сибири.
Полученные данные, основанные на результатах сравнительного изучения штаммов, выделенных в природе или от больных людей на протяжении
многих лет, показали, что генетическое разнообразие вируса КЭ не выходит за
пределы пяти генотипов. Циркуляция генотипов 1, 2, 3, 5 и политиповых
штаммов на территории Восточной Сибири поддерживается как основными
переносчиками (клещами I. persulcatus), так и их прокормителями (мелкими и
крупными млекопитающими, птицами).
Распределение генотипов в группах штаммов от иксодовых клещей и позвоночных животных различалось. Так, в первой группе преобладали изоляты
генотипа 3 (85,5%), из которых 29,6% составили штаммы субгенотипа 3а (Васильченко), 25,6% - субгенотипа 3б (Заусаев) (табл. 8). Генотипы 1 и 2 были
представлены единичными изолятами (3,3% и 1,3% соответственно).
Таблица 8
Результаты генотипирования штаммов вируса КЭ, выделенных из различных биологических объектов на территории Восточной Сибири
Вид
Иксодовые клещи
Теплокровные животные
Генотип (абс./%)
1
2
3
5/3,3
2/1,3
130/85,5
12/35,3
4/11,8
12/35,3
4
5
1/0,7 11/7,2
-
3/8,8
П
Всего
3/2,0
152
3/8,8
34
Среди штаммов, изолированных от теплокровных хозяев, доля генотипа 1
увеличивается до 35,3%, генотипа 2 – до 11,8%, а доля генотипа 3 - значительно
уменьшается (35,3%). Более половины штаммов генотипа 3 (58,3%) отнесены к
36
субгенотипу 3а, штаммов субгенотипа 3б не выявлено. Процентное соотношение изолятов генотипа 5 в этих группах почти не отличалось. Полученные данные позволяют предположить, что иксодовые клещи являются амплификаторами генотипа 3, а теплокровные животные – генотипа 1. Данные наших исследований подтверждают предположение (Романова Л.Ю. и др., 2004; Карганова
Г.Г., 2009) о том, что вирус КЭ может существовать в виде гетерогенной популяции, содержащей варианты, соотношение которых в популяции меняется при
чередовании хозяев в процессе циркуляции.
При сравнительном анализе генетических маркеров штаммов, изолированных от теплокровных и клещей, также выявлены определенные различия,
однако в данном случае они не являются статистически значимыми (p˃0,05).
С помощью РДПА установлено, что от теплокровных чаще выделяются промежуточные варианты антигенных подтипов вируса КЭ, тогда как штаммы,
изолированные от клещей, более однородны по своей антигенной характеристике. Штаммы, выделенные от теплокровных, были более гетерогенны по Sпризнаку, проявляли несколько большую устойчивость к прогреванию при одновременном снижении репродукции вируса при температуре 42°С (табл. 9).
Таблица 9
Сравнительная характеристика штаммов, выделенных от иксодовых клещей и
от теплокровных по генетическим маркерам Т50, rct42
Генетический
признак
+
Т50
±
+
rct42
±
-
Соотношение штаммов, выделенных из разных источников (абс./%±m)
Клещи (n=53)
Теплокровные (n=32)
30/56,6±6,8
20/62,5±8,6
12/22,6±5,7
7/21,9±7,3
11/20,8±4,3
5/15,6±6,4
46/86,8±4,6
26/81,3±6,9
6/11,3±4,3
2/6,3±4,3
1/1,9±1,9
4/12,5±5,9
Штаммы, изолированные от теплокровных, обладали более высокими
нейровирулентными и нейроинвазивными свойствами, несколько более высокой способностью вызывать летальность и низкие показатели СПЖ для лабораторных мышей по сравнению со штаммами, выделенными от клещей (табл.
10).
Таблица 10
Сравнительная характеристика штаммов, выделенных от теплокровных и от
иксодовых клещей, по индексу инвазивности, СПЖ и летальности
Генетический признак
II
+
(абс./%±m) ±
СПЖ (дни)
Летальность (%±m)
Соотношение штаммов, выделенных из разных источников
Теплокровные (n=14)
12/85,7±10,1
2/14,3±9,3
Теплокровные (n=47)
5,4
96,5±0,7
Клещи (n=23)
14/60,9±10,2
5/21,7±8,6
4/17,4±7,9
Клещи (n=136)
6,0
93,5±0,7
37
Этиология КЭ в Восточной Сибири и вопросы повышения эффективности диагностики и профилактики в свете данных о высокой
вариабельности возбудителя
Данные об этиологической структуре КЭ в разных частях ареала исключительно важны для правильной оценки эпидемиологической ситуации, прогноза, а также применения адекватной стратегии и тактики лечебных и профилактических мер. Учитывая значительную гетерогенность природной популяции вируса КЭ, для нас представляло интерес уточнить, какое участие в инфекционной патологии человека на территории Восточной Сибири принимает
вирус КЭ различных генотипов. Для этого проведен анализ генетической характеристики штаммов и изолятов РНК вируса КЭ, выделенных от больных
людей в Иркутской области и Республике Бурятия в 1963-2009 гг. (табл. 11).
Результаты исследования показали, что в этиологии КЭ в Восточной Сибири
принимают участие три генотипа вируса (1, 2 и 3), а также политиповые
штаммы, формируя разнообразие клинической картины этого заболевания.
Таблица 11
Генетическое типирование штаммов вируса КЭ и изолятов РНК, выделенных от больных людей на территории Прибайкалья
Изоляты РНК
Штаммы
Исследуемый
материал
Источник
изоляции
Айна/1448
215-79
210-79
1Г-98
3869-03
413-04
Ликвор
2517-05
1392-04
560-86
А-09
J-09
G-09
H-09
Ku-09
L-09
S-09
Ko-09
B-09
Кровь
Кровь
Секц. материал
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Ликвор
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Кровь
Год
1963
1979
1979
1998
2003
2004
2005
2004
1986
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
2009
Диагноз, форма заболевания
Хронический КЭ, прогредиентная форма
Острый КЭ, менинго-энцефалитическая форма
Неизвестна
КЭ, лихорадочная форма, средней тяжести
Инаппарантная форма
КЭ, менингеальная форма, двухволновое
течение
Хронический КЭ, прогредиентная форма
КЭ, лихорадочная форма
Хронический КЭ, энцефалитическая форма
Хронический КЭ, прогредиентная форма
КЭ, лихорадочная форма
КЭ, лихорадочная форма; гепатит А
КЭ, лихорадочная форма, средней тяжести
КЭ, лихорадочная форма, средней тяжести
Клещевой риккетсиоз
КЭ, менингеальная форма, тяжелое течение
ИКБ, безэритемная форма
КЭ, лихорадочная форма, средней тяжести
Генотип
3а*
3а*
3а
2
П(2/3б)
3а
1
П(1/3а)
3
1
3
1
1
1
1
1
1
3
Примечание: * - для анализа использованы данные секвенирования, опубликованные в базе данных GenBank. П – политиповой штамм.
Вирус КЭ генотипа 1 способен вызывать заболевания, имеющие широкий спектр клинических проявлений: лихорадочная форма, менингеальная,
38
очаговые формы (тяжелое течение) и хронический КЭ, прогредиентное течение. Вирус КЭ генотипа 3 вызывал как острый КЭ (менингеальная, менингоэнцефалитическая и лихорадочная формы), так и хронический КЭ. С генотипом 2 связано развитие лихорадочной формы КЭ. Политиповые штаммы вызывали инаппарантную и лихорадочную формы КЭ. В исследованной выборке
штаммов и изолятов РНК от больных людей не было обнаружено вируса КЭ
генотипа 5, однако описанный в литературе летальный случай менингоэнцефалита в Монголии, вызванный штаммом, гомологичным штамму 886-84, свидетельствует в пользу возможного участия данного варианта вируса КЭ в инфекционной патологии человека (Хаснатинов М.А., 2010).
Исследование иммуноструктуры больных КЭ людей подтвердило участие генотипов 3, 1 и 2 вируса КЭ, а также штамма 178-79 в инфекционной
патологии человека на территории Иркутской области и сопредельных регионов (рис. 9). У больных, образцы сывороток крови которых преимущественно
реагировали со штаммом какого-либо одного подтипа, не отмечено связи с определенными клиническими формами и тяжестью течения заболевания.
3,4%
5,6%
2,3%
4,6%
1,1% 2,3%
6,8%
36,4%
4,6%
4,6%
7,9%
А
С+256+178
А+256
С
А+178
256+178
3,4% 1,1%
256
А+С+256
С+178
15,9%
178-79
А+256+178
А+С+256+178
А+С
А+С+178
Рис. 9. Результаты исследования в РН иммуноструктуры больных КЭ людей из Иркутской области и сопредельных территорий. А- сыворотки, нейтрализующие антиген на основе штамма Айна/1448 (генотип 3), С – Софьин (генотип 1), 256 - 256 (генотип 2), 178 - 178-79 (генотип 4)
В свете полученных данных о высокой генетической вариабельности вируса КЭ, циркулирующего на территории Восточной Сибири, становится актуальным вопрос об эффективности профилактических и диагностических препаратов, применяемых в регионе. В настоящее время в России используются
вакцины, приготовленные из дальневосточных, либо европейских штаммов
вируса КЭ, в то время как наиболее широкое распространение имеет сибирский подтип (генотип 3). Варианты опытов, методов и тестов, использованных
разными авторами, не дают однозначного ответа относительно протективных
свойств существующих вакцин.
Нами проведено изучение нейтрализующей активности вирусспецифических антител по отношению к прототипным штаммам генотипов 1 (Софьин),
39
2 (256), 3 (Айна/1448) и 4 (178-79) в двух группах (по 15 человек) вакцинированных лиц. Первую группу составили лица, привитые вакциной «ФСМЕИММУН Инжект» на основе штамма Neudoerfl (генотип 2), вторую группу –
привитые вакцинами отечественного производства на основе штаммов генотипа 1. Показано, что сыворотки крови людей из первой и второй групп обладали вируснейтрализующей активностью в отношении всех изучаемых штаммов,
однако более высокая нейтрализующая активность антител отмечена в отношении гомологичных штаммов (рис. 10).
56
60
49
50
40
30
39
34
39
34
26
28
Антиген Софьин
20
Антиген 256
10
0
Антиген Айна/1448
Вакцина на основе
штамма вируса КЭ
генотипа 2
Вакцина на основе
штаммов вируса КЭ
генотипа 1
Антиген 178 -79
Рис. 10. Нейтрализующая активность вирусспецифических антител
(СГТА) у лиц, привитых вакцинами на основе штаммов генотипов 1 и 2, по
отношению к прототипным штаммам трех генотипов и 178-79.
Нейтрализующая способность антител по отношению к гетерологичным
штаммам была в 1,5-2 раза ниже. Полученные результаты согласуются с данными других авторов, свидетельствующих о том, что нейтрализующая активность вирусспецифических антител у лиц, привитых вакцинами на основе
штаммов генотипов 1 и 2, по отношению к разным генотипам может различаться. Титры нейтрализующих антител, индуцируемых разными вакцинами
против гетерологичных изолятов вируса КЭ, ниже, чем титры против гомологичных изолятов. Не исключено, что для приготовления в будущем вакцин,
обладающих наиболее высоким уровнем защиты в пределах всего нозоареала,
понадобится использовать препарат, состоящий из штаммов, индуцирующих
образование высоких уровней антител с более широким спектром нейтрализующей активности.
Мы предположили, что в плане приготовления как диагностических, так
и вакцинных препаратов перспективными могут оказаться штаммы генотипа 5,
аналогичные уникальному изоляту 886-84, проявляющие высокий уровень гомологии с представителями разных генотипов и выраженную антигенную
связь с разными серотипами вируса КЭ. Одиннадцать штаммов вируса КЭ генотипа 5 были изучены нами по комплексу маркеров, характеризующих генотип вируса и особенности белка оболочки Е: нейровирулентность при внутримозговом введении (mNic), нейровирулентность при экстраневральном введении (mNsc), индекс инвазивности (II), терморезистентность (Т50) (табл. 12). В
40
результате исследования установлено, что по этим признакам, входящим в перечень критериев, предъявляемых к диагностическим и вакцинным препаратам (Верета Л.А., Воробьева М.С., 1990), в качестве кандидатов могут рассматриваться 3 штамма из этой группы (740-84, 712-89, 418-90).
Таблица 12
Изучение штаммов генотипа 5 по комплексу критериев, используемых
при отборе вакцинных и диагностических препаратов
№
Штамма
886-84*
617-90
636-90
608-90
606-90
691-90
287-83
711-84
740-84*
712-89
418-90
Диапазон показателей
для отбора
mNic (lgLD50/мл)
8,58
6,64
7,06
7,9
7,02
7,02
7,92
6,75
10,2
10,9
9¸72
9,0-10,8
Показатели
mNsc (lgLD50/мл)
7,16
3,8
4,35
4,86
4,02
5,1
5,98
4,6
9,4
9,8
7,8
7,0-9,7
II
1,6
2,84
2,71
3,04
3,0
1,92
1,94
2,15
0,8
1,1
1,52
0,42-1,6
Т50
0,18
4,33
1,78
2,5
1,77
1,41
2,83
1,2
2,4
1,77
1,78
1,4-2,8
Примечание: Жирным шрифтом выделены значения исследованных показателей, входящие в диапазон для отбора. *- штаммы, исследованные по представленным критериям А.Г. Трухиной (Трухина А.Г., 1989)
Таким образом, в результате выполнения всех этапов исследования получена эколого-географическая, эпидемиологическая, вирусологическая и молекулярно-генетическая характеристика структуры популяции вируса КЭ на
территории Восточной Сибири. На основании полученных результатов предложена методология углубленного мониторинга и системной оценки очаговых территорий, которая включает комплексное изучение ведущих компонентов очагов и экологических особенностей приуроченных к ним биоценозов
Такой подход обоснован необходимостью кардинального улучшения мониторинга сочетанных природных и антропургических очагов «клещевых»
инфекций для оценки их распространения и активности; для создания кадастра «клещевых» инфекций на основе результатов исследования генетического разнообразия возбудителей инфекций, передаваемых с укусом клеща,
видового состава, численности и инфицированности клещей различными возбудителями в привязке к типичным ландшафтам изучаемой территории; для
разработки научно-обоснованных планов комплексных профилактических мероприятий в отношении всего спектра инфекций, которыми можно заразиться
от клеща на конкретной территории; для анализа и прогнозирования эпидемиологической ситуации на конкретной территории на основе дополнительной
информации о биологической характеристике циркулирующих штаммов; для
41
создания эффективных профилактических и диагностических препаратов, с
учетом генетического разнообразия вируса КЭ.
ВЫВОДЫ
1. Природные очаги КЭ в Восточной Сибири отличаются чрезвычайным
разнообразием ландшафтно-климатических характеристик. Структурные компоненты природных очагов представлены популяцией вируса КЭ, включающей все разнообразие выявленных на данный момент генотипов, основными
переносчиками вируса - клещами I. persulcatus, D. silvarum, D. nuttalli, Н.
concinna, их прокормителями - мелкими и крупными млекопитающими таежных, лесостепных, степных, пойменных и околоводных группировок.
2. Природные очаги КЭ на территории Восточной Сибири являются сочетанными с очагами ИКБ, ГАЧ, МЭЧ, КР и бабезиоза. Спектр патогенов сочетанных очагов клещевых инфекций представлен вирусом КЭ, боррелиями
(B. garinii, B. afzelii, B. miyamotoi), эрлихиями (E. muris, «Candidatus
Neoehrlichia mikurensis»), анаплазмами (A. phagocytophilum), риккетсиями (R.
sibirica, R. raoultii (R.sp. DnS14, R.sp. DnS28, R.sp. RpA4), «Candidatus R.
tarasevichiae»), бабезиями (B. crassa).
3. Наиболее значимым резервуаром и вектором микроорганизмов вирусной, бактериальной и протозойной природы является клещ I. persulcatus. Инфицированность клещей рода Dermacentor возбудителями ИКБ, ГАЧ и МЭЧ
более низкая, по сравнению с таежными клещами (p<0,05). В клещах Н.
concinna выявляется вирус КЭ, эрлихии, анаплазмы и бабезии. Установлены
различные варианты микст-инфицирования иксодовых клещей.
4. В природных очагах Восточной Сибири циркулирует вирус КЭ генотипов 1, 2, 3, 4 и 5, при общем доминировании генотипа 3, обнаружены «политиповые» или «микст-штаммы», сочетающие в себе последовательности: а)
генотипов 1 и 3, б) генотипов 3 и 2, в) генотипов 1, 2 и 3. Штаммы генотипа
3 представлены субгенотипами азиатской группы «Васильченко» и «Заусаев».
5. Популяция вируса КЭ Восточной Сибири характеризуется высоким
уровнем вариабельности антигенных свойств, генетических признаков, связанных с вирулентностью и фенотипических свойств, определяемых с помощью генетических маркеров S, rct37, rct42, T50. Штаммы, относящиеся к дальневосточному, западному и сибирскому антигенным подтипам, как правило, соответствуют генотипам 1, 2 и 3 вируса КЭ.
6. Связь частоты встречаемости генотипов вируса КЭ на территории
Восточной Сибири с определенным видом ландшафта не установлена. Наибольшая генетическая гетерогенность отмечена в природных очагах, располагающихся вдоль оз. Байкал и в юго-восточной части Забайкалья, где выражено
разнообразие ландшафтных формаций, переносчиков вируса КЭ и их прокормителей.
7. Установлено, что циркуляция генотипов 1, 2, 3, 5 и «политиповых»
штаммов на территории Восточной Сибири поддерживается как основными
42
переносчиками (клещами I. persulcatus), так и их прокормителями. Штаммы
генотипа 1 и 2 достоверно чаще выделялись от грызунов, генотипа 3 - от иксодовых клещей (p˂0,05).
8. В региональной инфекционной патологии принимает участие вирус
КЭ генотипов 1, 2, 3, а также «микст-штаммы». Генотип 3 вируса КЭ, также,
как и генотип 1, может вызывать весь спектр клинических проявлений от
инаппарантной формы до очаговой с летальным исходом. Доказано участие
штаммов генотипа 1 в развитии хронического КЭ на территории Восточной
Сибири.
9. Штаммы вируса КЭ генотипа 5 (740-84, 712-89, 418-90), проявляющие
высокий уровень гомологии геномов с представителями разных генотипов и
выраженную антигенную связь с разными серотипами вируса КЭ, могут быть
использованы в качестве кандидатов для усовершенствования специфических
диагностических и профилактических средств.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Монографии
1. Злобин, В.И. Клещевой энцефалит в Восточной Сибири / В.И. Злобин., В.А.
Борисов, М.М. Верхозина, Г.Н. Холмогорова // Иркутск: РИО ВСНЦ СО
РАМН, 2002. - 184 с.
2. Tick-Borne Encephalitis / V.I. Zlobin, N.V. Ryazantseva, V.V. Novitsky, N.G.
Zhukova, M.M. Verkhozina, A.V. Lepehin and S.L. Mikheev // in: «Encephalitis
Research» edited by Ryan A. Ebert. Nova Scaence Publishers, Inc. - New York,
2006. - P. 31-57.
3. Козлова, И.В. Экспресс-диагностика и экстренная профилактика иксодовых
клещевых инфекций / И.В. Козлова, В.И. Злобин, М.С. Воробьева, М.М.
Верхозина // М.: ООО «Компания БОРГЕС», 2009. – 216 с.
4. Genetic studies of tick-borne encephalitis virus strains from Western and Eastern
Siberia / S.E. Tkachev, T.V. Demina, Yu.P. Dzhioev, I.V. Kozlova, M.M.
Verkhozina, E.K. Doroshchenko, O.V. Lisak, V.N. Bakhvalova, A.I. Paramonov,
V.I. Zlobin // in: «Flavivirus encephalitis» edited by Daniel Ruzek. – 2011. - P.
235-254.
5. Молекулярно-эпидемиологическая и эколого-географическая характеристика вируса клещевого энцефалита в Восточной Сибири / М.М. Верхозина, И.В.
Козлова, Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев, Е.К. Дорощенко, О.В. Лисак, Л.С. Карань, Н.М. Колясникова, С.Е. Ткачев, В.И. Злобин // в коллективной монографии «Инфекции, передаваемые клещами в Сибирском регионе» под ред. В.В.
Власова, В.Е. Репина. «Новосибирск», 2011. – С. 84-108.
6. The genetic and biological properties of tick-borne encephalitis virus unique
group from Eastern Siberia / I.V. Kozlova, M.M. Verkhozina, T.V. Demina, Yu.P.
Dzhioev, S.E. Tkachev, L.S. Karan, E.K. Doroshchenko, O.V. Lisak, O.V.
Suntsova, A.I. Paramonov, O.O. Chernoivanova, A.O. Revizor, V.I. Zlobin // in:
«Encephalitis» edited by Sergey Tkachev. Publisher: InTech, Croatia, 2013. - P.
95-112.
43
В изданиях, рекомендованных ВАК
1. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка Е / В.И. Злобин, Т.В. Демина, Л.В. Мамаев, Т.В. Бутина, С.И. Беликов, О.З. Горин, Ю.П. Джиоев,
М.М. Верхозина, И.В. Козлова, И.В. Воронко, Р.В. Адельшин, М.А. Грачев //
Вопросы вирусологии. - 2001. - №1. - С. 12-16.
2. Молекулярные зонды для генетического типирования вируса клещевого
энцефалита / В.И. Злобин, М.Х. Газо, С.И. Беликов, Ю.П. Джиоев, Т.В. Демина, М.М. Верхозина, И.В. Козлова, Р.В. Адельшин, Е.К. Дорощенко // Вопросы вирусологии. - 2001. - №4.- С. 43-47.
3. Новая концепция природной генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита / В.И. Злобин, С.И. Беликов, Ю.П. Джиоев, Т.В. Демина, И.В.
Козлова, М.М. Верхозина, Г.А. Данчинова, Р.В. Адельшин, Е.К. Дорощенко,
Н.В. Кулакова // Тихоокеанский медицинский журнал. – Владивосток, 2001.
- №2. (7). - С. 75-78.
4. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика региональной популяции
вируса клещевого энцефалита Восточной Сибири / М.М. Верхозина, И.В.
Козлова, Т.В. Демина, М. Газо, С.И. Беликов, В.И. Злобин // Тихоокеанский
медицинский журнал. – Владивосток, 2001. - №2. (7). – С. 118.
5. Специфическое определение флавивирусов методом молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолигонуклеотидными зондами / В.И. Злобин, В.В. Погодина, Д.А. Дрокин, М.Х. Газо, Н.Г. Бочкова, Ю.П. Джиоев, Т.В.
Демина, С.И. Беликов, И.В. Козлова, М.М. Верхозина // Вопросы вирусологии. - №3. – 2003. – С. 23-27.
6. Верхозина, М.М. Экология вируса клещевого энцефалита в Восточной
Сибири / М.М. Верхозина, В.И. Злобин // Бюллетень Сибирской медицины. –
Томск. – 2006. – Т. 5. – Прил. 1. – С. 28-35.
7. Иксодовые клещи юга Восточной Сибири и Монголии и их спонтанная
зараженность возбудителями природно-очаговых трансмиссивных инфекций /
Г.А. Данчинова, М.А. Хаснатинов, В.И. Злобин, И.В. Козлова, М.М.
Верхозина, О.В. Сунцова, С.С. Шулунов, Д. Абмэд, Ж. Батаа, Д. Бат-Очир, Н.
Цэнд, Л.Б. Бадуева, О.В. Лисак, М.О. Горина // Бюллетень Сибирской
медицины. – 2006. – Т. 5. – Прил. 1. – С.137-143.
8. Козлова, И.В. Дифференциальная экспресс-диагностика и экстренная специфическая профилактика трансмиссивных клещевых инфекций в г. Иркутске
/ И.В. Козлова, В.И. Злобин, М.М. Верхозина, М.А. Хаснатинов // Бюллетень
Сибирской медицины. – 2006. – Т. 5. – Прил. 1. – С.154-160.
9. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита в европейской части
России и некоторых странах Балтии, Восточной и Юго-Восточной Европы /
Р.В. Адельшин, В.И. Злобин, С.И. Беликов, Ю.П. Джиоев, Т.В. Демина, М.Х.
Газо, И.В. Козлова, М.М. Верхозина, В.И. Вотяков, Л.П. Титов, Т.И. Самойлова, Г.А. Данчинова, М.А. Хаснатинов, И.В. Воронко, С. Голубович, М. Тешанович, Л.С. Приймяги, В.А. Василенко // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2006. - №2 (27). – С. 27-34.
44
10. Современные подходы к экстренной специфической профилактике клещевого энцефалита / И.В. Козлова, В.И. Злобин, М.М. Верхозина, Т.В. Демина,
Ю.П. Джиоев, О.В. Лисак, Е.К. Дорощенко, Г.А. Данчинова, М.А. Хаснатинов
// Вопросы вирусологии. - 2007. - №6. – С.25-30.
11. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита / В.И. Злобин, М.М.
Верхозина, Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев, Р.В. Адельшин, И.В. Козлова, С.И.
Беликов, М.А. Хаснатинов, Г.А. Данчинова, Е.И. Исаева, А.Е. Гришечкин //
Вопросы вирусологии. - 2007. - №6. – С. 4-13.
12. Эпидемиологическая ситуация в отношении моноцитарного эрлихиоза и
гранулоцитарного анаплазмоза человека в Прибайкалье (результаты рекогносцировочных исследований / И.В. Козлова, В.И. Злобин, М.М. Верхозина, В.А.
Рар, О.В. Лисак, Е.К. Дорощенко, С.С. Шулунов, О.Л. Богомазова, А.М. Антонова // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2007. - №5 (36). – С. 42-46.
13. Клещевой риккетсиоз в Прибайкалье: современная эпидемиологическая
ситуация и генетическая вариабельность возбудителя / И.В. Козлова, В.И. Злобин, М.М. Верхозина, С.Э. Дигас // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.
– 2007. – №6. – С. 16–22.
14. Применение молекулярно-генетических методов для изучения структуры
штаммов вируса клещевого энцефалита / Л.С. Карань, Г.В. Маленко, Н.Г. Бочкова, Л.С. Левина, Г.П. Пиванова, Н.М. Колясникова, Е.Г. Гамова, А.Г. Трухина, В.И. Злобин, М.М. Верхозина, И.В. Козлова, Ю.П. Джиоев, Т.В. Демина,
В.В. Погодина // Бюллетень СО РАМН, 2007. - №4 (126). – С. 34-40.
15. Эколого-генетический анализ региональной популяции вируса клещевого
энцефалита в Восточной Сибири / М.М. Верхозина, В.И. Злобин, И.В. Козлова, Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев, С.И. Беликов, В.А. Борисов, Г.А. Данчинова,
Е.В. Арбатская, О.В. Лисак, Е.К. Дорощенко, Е.Г. Протасова // Бюллетень СО
РАМН, 2007. - №4 (126). – С. 53-60.
16. Эколого-эпидемиологический и молекулярно-генетический анализ популяции вируса клещевого энцефалита на территории Иркутской области / М.М.
Верхозина, В.И. Злобин, И.В. Козлова, Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев, О.В. Лисак, Е.Е. Дорощенко, Е.Г. Протасова // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2008. - №8. – С. 12-18.
17. Современная эпидемиологическая ситуация и профилактика иксодовых
клещевых инфекций в северных районах Иркутской области / О.Л. Богомазова,
И.В. Безгодов, В.Б. Успенский, А.М. Антонова, О.Л. Данилова, Т.Н. Осипова,
О.К. Нефедьева, И.Г. Чумаченко, Л.А. Логиновская, И.В. Козлова, М.М. Верхозина, О.В. Сунцова // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2009. - №3
(46). - С. 23-26.
18. Исследование генетической вариабельности и генотипирование вируса
клещевого энцефалита с помощью дезоксиолигонуклеотидных зондов / Т.В.
Демина, Ю.П. Джиоев, М.М. Верхозина, И.В. Козлова, С.Е.Ткачев, Е.К. Дорощенко, О.В.Лисак, В.И. Злобин // Вопросы вирусологии, 2009. – №3 (54).
– С. 33-42.
19. Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита: географическая вариабельность, определяемая методом молекулярной гибридизации /
45
Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев, М.М. Верхозина, И.В. Козлова, С.Е.Ткачев, Е.К.
Дорощенко, О.В.Лисак, В.И. Злобин // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2009. – №3 (46). – С. 27-39.
20. Сочетанные очаги трансмиссивных клещевых инфекций на территории
Прибайкалья / И.В. Козлова, М.М. Верхозина, Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев,
Е.К. Дорощенко, О.В. Лисак, Л.С. Карань, Н.М. Колясникова, В.А. Рар, Н.В.
Фоменко, С.Е. Ткачев, О.Л. Богомазова, В.А. Борисов, В.И. Злобин //
Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2010. - №4 (53). - С. 40-46.
21. Genetic variability research and genotyping of tick-borne encephalitis virus by
means of desoxyoligonucleotide probes / T.V. Demina, Yu.P. Dzhioev, M.M.
Verkhozina, I.V. Kozlova, S.E. Tkachev, A.Z. Plusnin, E.K. Doroshenko, O.V.
Lisak, V.I. Zlobin // J. of Medical Virology. - 2010. - №82. - P. 965-976.
22. Генетические и биологические свойства оригинальной группы штаммов
вируса клещевого энцефалита, циркулирующей в Восточной Сибири / И.В.
Козлова, М.М. Верхозина, Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев, С.Е. Ткачев, Л.С. Карань, Е.К. Дорощенко, О.В. Лисак, О.В. Сунцова, А.А. Парамонов, О.О. Черноиванова, А.О. Ревизор, В.И. Злобин // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2012. - №64. – С. 14-25.
23. Генотипы 4 и 5 вируса клещевого энцефалита: особенности структуры геномов и возможный сценарий их формирования / Т.В. Демина, Ю.П. Джиоев,
И.В. Козлова, М.М. Верхозина, С.Е. Ткачев, Е.К. Дорощенко, О.В. Лисак,
А.И. Парамонов, В.И. Злобин // Вопросы вирусологии. - 2012. - №4. - С. 1219.
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
а.о.
- аминокислотный остаток
ГАЧ
- гранулоцитарный анаплазмоз человека
ДНК
- дезоксирибонуклеиновая кислота
ИКБ
- иксодовые клещевые боррелиозы
ИФА
- иммуноферментный анализ
ККЭ
- комплекс клещевого энцефалита
КЛБ
- киассанурская лесная болезнь (KFD)
КПЛ
- клещевая пятнистая лихорадка
КР
- клещевой риккетсиоз
КЭ
- клещевой энцефалит (TBE)
МГНК - молекулярная гибридизации нуклеиновых кислот
МЭЧ
- моноцитарный эрлихиоз человека
НБМ
- нелинейные белые мыши
н.о.
- нуклеотидный остаток
ОГЛ
- омская геморрагическая лихорадка (OHF)
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция
ПЦР
- полимеразная цепная реакция
РДПА - реакция диффузионной преципитации в агаре
РН
- реакция нейтрализации
РНК
- рибонуклеиновая кислота
СГТА
- средняя геометрическая титров антител
СПЭВ - культура клеток почки эмбриона свиньи
СПЖ
- средняя продолжительность жизни
УОБО - Усть-Ордынский Бурятский округ
46
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
23
Размер файла
1 939 Кб
Теги
молекулярная, экологии, восточной, вирус, эпидемиология, энцефалита, клещевого, сибири
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа