close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Новые подходы фармакологической коррекции морфофункциональных нарушений сердечно-сосудистой системы при экспериментальном гестозе

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Гуреев Владимир Владимирович
Новые подходы фармакологической коррекции
морфофункциональных нарушений сердечно-сосудистой
системы при экспериментальном гестозе
14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
доктора медицинских наук
Белгород - 2016
Работа
выполнена
в
федеральном
государственном
автономном
образовательном
учреждении
высшего
образования
«Белгородский
государственный национальный исследовательский университет»
Научный консультант:
Покровский Михаил Владимирович, доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Тюренков Иван Николаевич, член-корреспондент РАН, доктор медицинских
наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего образования «Волгоградский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской
Федерации, заведующий кафедрой фармакологии и биофармации ФУВ
Хохлов Александр Леонидович, доктор медицинских наук, профессор,
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего
образования
«Ярославский
государственный
медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
заведующий кафедрой клинической фармакологии с курсом ИПДО
Макляков Юрий Степанович, доктор медицинских наук, профессор,
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего
образования
«Ростовский
государственный
медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
заведующий кафедрой фармакологии и клинической фармакологии
Ведущая организация:
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится 17 февраля 2017 года в 10:00 на заседании объединенного
диссертационного совета Д 999.071.02 на базе ФГАОУ ВО «Белгородский
государственный национальный исследовательский университет», ФГБОУ ВО
«Курский государственный медицинский университет» Минздрава России по
адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВО «Белгородский
государственный национальный исследовательский университет» и на сайте
организации: http://www.bsu.edu.ru/bsu.
Автореферат разослан «_____» _________________ 2016 г.
Ученый секретарь диссертационного
совета, кандидат медицинских наук
Гудырев Олег Сергеевич
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность научного исследования
Гестоз является наиболее часто встречающейся акушерской патологией.
В отдельных регионах нашей страны его частота может достигать более 30 %
среди всех случаев беременности (ВОЗ, 2012; Резникова Л.Б., 2013; Росстат.,
2013, 2014; Шувалова М.П., 2014). В структуре материнской смертности гестоз
занимает одно из первых мест. На его долю приходится до 25% случаев
(Гребенник Т.К., Павлович С.В., 2011). У детей, родившихся у матерей,
перенесших гестоз, перинатальная заболеваемость достигает 30%, а смертность
в 3-4 раза превышает популяционную (Иванова Л.Б., 2012). Кроме этого,
страдает умственное и физическое развитие ребенка, а у женщин повышается
вероятность развития хронической патологии почек и артериальной
гипертензии (Иванова О.Ю., 2011; Jain A., 2012).
Патогенез гестоза еще далек от полного понимания, но все больше
внимания исследователи уделяют дисангиогенезу в плаценте и нарушению
регуляции тонуса мелких артериальных сосудов (Тюренков И.Н., 2012, 2013;
Scioscia M., 2015; Adu-Bonsaffoh K., 2015). При морфологическом исследовании
плаценты многие авторы описывают специфическую гистологическую картину,
которая заключается в диспропорциях развития ее пограничного участка между
материнской и плодными частями (Ducray J.F., 2011; Oppenraaij R.H., 2011;
Sánchez-Aranguren L.C., 2014; Pereira R.D., 2015). Происходит неполная инвазия
цитотрофобласта в спиральные артерии матери, что приводит к ишемическим
явлениям в плаценте и повышению проницаемости фетоплацентарного барьера
(Gilbert J.S., 2008; Ducray J.F., 2011; Oppenraaij R.H., 2011).
Поступление в системный кровоток из ишемизированной плаценты
свободных радикалов, гормонов, факторов роста, провоспалительных
цитокинов, антигенов плода и других гуморальных факторов вызывает
повышение содержания молекул клеточной адгезии и накопление в крови
эндогенных ингибиторов eNOS – метилированных аналогов L-аргинина
асимметричного диметиларгинина (ADMA) и монометиларгинина (L-NMMA).
Конечным финалом сложных патофизиологических механизмов является
нарушение реологических и коагуляционных свойств крови и эндотелиальная
дисфункция, которые служат причиной полиорганной недостаточности.
Cтепень разработанности темы
Развитие плаценты представляет собой сложное сочетание процессов
ангиогенеза и апоптоза регулируемых большим количеством факторов роста
(Forbs K., 2010; Knofler M., 2010). Многочисленные исследования показали их
дисбаланс у женщин с гестозом, а раннее его появление и повышенное
содержание ADMA и его аналогов служат диагностическими критериями этого
грозного заболевания на его доклинической стадии (Солоницын А.Н., 2008;
Крукиер И.И., 2009; Speer P.D., 2008; Herr F., 2009). С учетом того, что в
реализации эффектов многих факторов роста значительную роль играет оксид
азота (NO), ишемия плаценты и эндотелиальная дисфункция являются
взаимосвязанными и взаимообуславливающими звеньями в патогенезе гестоза.
3
Обобщив многочисленные литературные данные, можно сказать, что
эндотелиальная дисфункция не только фактор определяющий тяжесть
клинического протекания заболевания, но и основное звено патогенетических
процессов (Айламазян Э.К., 2009; Тюренков И.Н., 2012; Резникова Л.Б., 2013).
Основные принципы современной фармакологической терапии гестоза
направлены на коррекцию и компенсацию ишемических явлений в плаценте и
борьбу с нарушением функции жизненно важных органов организма женщины.
Они включают в себя улучшение микроциркуляции в тканях, снижение
артериального давления, нормализацию водно-солевого обмена, коррекцию
реологических и коагуляционных свойств крови, увеличение доставки
кислорода к тканям, оптимизацию клеточного метаболизма, антиоксидантную
терапию и др. («Cтандарт специализированной медицинской …» МЗ РФ, 2013).
В свете современных представлений о патогенезе гестоза выявляется, что ее
существенным
недостатком
является
отсутствие
целенаправленного
использования препаратов для коррекции NO-продуцирующей функции
эндотелия и активации естественных противоишемических защитных
механизмов.
В более ранних исследованиях было показано, что препараты,
повышающие содержание субстрата для синтеза NO – L-аргинина,
увеличивают активность NO-синтазы, усиливают образование NO и
предотвращают развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов при
ADMA-подобном L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота. Кроме
этого, эффективными на данной модели оказались активатор eNOS –
резвератрол, антиоксиданты, эритропоэтин и др. Определенное развитие
получили исследования эндотелиопротективной активности на других «eNOS–
ассоциированных»
экспериментальных
моделях:
гипоэстрогениндуцированной, гомоцистеин-индуцированной, метаболического Х синдрома,
при реактивном поствакцинальном васкулите и сепсис-индуцированной
эндотелиальной дисфункции (Покровский М.В. и соавт., 2005-2014).
Еще одним перспективным направлением лечения и профилактики
гестоза может явиться использование фармакологических препаратов, в основе
механизма действия которых лежит активация защитных процессов
наблюдаемых при ишемическом прекондиционировании. Дистантное
ишемическое прекондиционирование, и как его вариант фармакологическое
прекондиционирование, оказывает положительное влияние на различные
звенья патогенеза гестоза, реализуя свое действие через триггеры «1-го окна»
(К+АТФазный механизм) и «2-го окна» (NO-опосредованный механизм)
защиты (Карпова Э.С., 2012; Щербакова Е.С., 2014).
Таким образом, в настоящее время накопилось достаточно большое
количество сведений о влиянии различных факторов на течение гестоза и их
роли в развитии эндотелиальной дисфункции как основного патогенетического
звена этого грозного заболевания и возможности коррекции эндотелиальной
дисфункции фармакологическими агентами различных групп. Однако в
доступной
литературе
не
обнаружено
сведений
об
изучении
эндотелиопротективного действия в условиях ADMA-подобного гестоза
4
тетрагидробиоптерина, селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010,
тадалафила, витамина В6 и фолиевой кислотой, поливитаминно-минеральными
комплексами, эритромицина, азитромицина, рекомбинантного эритропоэтина, а
также эффективности направления, в основе которого лежит дистантное
ишемическое прекондиционирование.
Цель исследования: повышение эффективности фармакологической
коррекции морфофункциональных нарушений сердечно-сосудистой системы
при гестозе с помощью активации eNOS-детерминированного пути и феномена
прекондиционирования.
Задачи исследования:
1. Провести комплексную оценку функциональных, биохимических и
морфологических нарушений при моделировании различных видов патологии
беременных с использованием результатов функциональных проб, данных
ЛДФ-метрии плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и
морфологического исследования плаценты и почек, с целью выбора
экспериментальной модели наиболее приближенной к гестозу.
2. Провести исследование эффективности коррекции экспериментального
гестоза тетрагидробиоптерином с использованием выбранных критериев:
результатов функциональных проб и данных биохимического и
морфологического исследований.
3.
Провести
исследование
эффективности
коррекции
морфофункциональных
нарушений
при
экспериментальном
гестозе
селективным ингибитором аргиназы 2 ZB49-0010 с использованием выбранных
критериев.
4. Изучить эффективность применения ингибитора ФДЭ5 – тадалафила,
обладающего
прекондиционирующим
эффектом,
при
коррекции
экспериментального гестоза.
5. Изучить эффективность коротких эпизодов ишемии-реперфузии при
коррекции экспериментального гестоза. Оценить роль АТФ-зависимых К+
каналов и iNOS в реализации эндотелиопротективного эффекта дистантного
ишемического прекондиционирования.
6.
Исследовать
эффективность
фармакологического
прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином при коррекции
экспериментального гестоза.
7. Оценить степень коррекции морфофункциональных нарушений у
беременных
животных
с
ADMA-подобной
моделью
патологии
антибактериальными препаратами из группы макролидов, обладающими
актиоксидантной и противовоспалительной активностью.
8.
Провести
исследование
эффективности
коррекции
морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMAподобной моделью патологии препаратами из группы витаминно-минеральных
комплексов для беременных и витаминами В6 и фолиевой кислотой,
обладающими различными механизмами действия.
5
Научная новизна исследования
В работе впервые в сравнительном аспекте представлены
морфофункциональные нарушения, возникающие при воспроизведении
ADMA-подобного гестоза и гипоперфузии беременной матки. Показано, что
ADMA-подобная модель патологии у беременных животных в большей
степени характеризуется нарушениями, характерными для клинических
проявлений гестоза второй половины беременности у женщин.
На основании данных проведенных исследований эффективности
тетрагидробиоптерина, селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010 и
«Тадалафила», относящегося к группе ингибиторов фермента фосфодиэстеразы
5 при коррекции морфофункциональных нарушений, возникающих на фоне
ADMA-подобного гестоза, показана эффективность фамакологических агентов
влияющих на путь L-Аргинин – NO - цГМФ.
Использование 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии задних
конечностей оказывает выраженное протективное действие при коррекции
морфофункциональных изменений при моделировании ADMA-подобной
патологии. Значительную роль в реализации положительных эффектов
дистантного
ишемического
прекондиционирования
при
коррекции
морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMAподобной моделью гестоза играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
Введение рекомбинантного эритропоэтина при ADMA-подобной
патологии у животных приводит к коррекции морфофункциональных
нарушений.
Проведенное исследование показало уменьшение морфофункциональных
нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии
при использовании антибактериальных препаратов из группы макролидов:
азитромицина
и
эритромицина,
обладающих
актиоксидантной
и
противовоспалительной активностью.
Впервые показана эффективность использования поливитаминноминеральных комплексов: «Компливит триместрум 2 триместр®» и
«Компливит триместрум 3 триместр®» для коррекции морфофункциональных
нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии.
Теоретическая и практическая значимость работы
В работе обоснована эффективность применения фармакологических
агентов для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных
животных с ADMA-подобной моделью патологии, точками приложения, в
механизмах действия которых являются различные eNOS-обусловленные
патогенетические звенья. Показано, что использование различных препаратов,
улучшающих
NO-продуцирующую
функцию
(тетрагидробиоптерин,
селективный ингибитор аргиназы 2, ингибитор фосфодиэстеразы 5), позволяет
нормализовать плацентарную микроциркуляцию, артериальное давление,
предотвратить альбуминурию, а также изменение соотношений сосудистых
реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид
(эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить снижение показателей
6
биохимических маркеров (Тоtal NO), добиться положительной динамики
морфологических показателей в плацентарной и почечной ткани.
Полученные данные позволяют обосновать новое перспективное
направление для поиска и создания эффективных лекарственных препаратов
для лечения гестоза, в основе реализации механизма действия которых будет
лежать патогенетическое воздействие на различные ADMA-eNOSдетерминированные механизмы развития этой патологии.
На основании результатов проведенной исследовательской работы
разработаны теоретические положения, совокупность которых можно
квалифицировать как крупное научное достижение в развитии перспективных
направлений в фармакологии, клинической фармакологии, состоящее в
экспериментальном обосновании новых патогенетических подходов к лечению
гестоза.
Методология и методы диссертационного исследования
Методология проведенного исследования основана на методических
подходах научных исследований отечественных и зарубежных авторов,
освещенных в литературе.
Расчет дозирования и режимы введения фармакологических агентов
основаны на эффективности в экспериментальных исследованиях,
терапевтических дозах для человека c последующим перерасчетом с помощью
межвидовых коэффициентов или подобраны в ходе проведения эксперимента.
Дизайн проведенного исследования планировался с учетом рекомендаций
по проведению доклинических исследований и одобрен местным этическим
комитетом.
Внедрение результатов научных исследований
На основании данных диссертационного исследования запланировано
проведение
целенаправленных
клинических
исследований
тетрагидробиоптерина, тадалафила, коротких эпизодов ишемии-реперфузии, а
также их комбинаций с препаратами, входящими в стандартную
фармакологическую терапию эндотелий-ассоциированной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов «Компливит триместрум 2 триместр»
производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008560/10) и
«Компливит триместрум 3 триместр» производства ОАО «ФармстандартЛексредства» (РУ № ЛСР-008555/10), включены в состав документов,
поданных на регистрацию в М3 РФ.
Полученные результаты используются в учебных программах кафедры
фармакологии Орловского
государственного
университета, кафедры
фармакологии Белгородского государственного университета и кафедры
фармакологии Воронежской медицинской академии.
Материалы исследования селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010
получены в рамках Госконтракта по программе Минпромторга РФ «ФАРМА
2020» №13411.1008799.13.129 «Доклинические исследования лекарственного
средства на основе низкомолекулярных ингибиторов аргиназы 2 для лечения
артериальной и легочной гипертензии».
7
Положения, выносимые на защиту
1. Введение фармакологических агентов, влияющих на путь L-Аргинин –
NO – цГМФ (тетрагидробиоптерин, селективный ингибитор аргиназы 2 ZB490010 и ингибитор ФДЭ-5 тадалафила), оказывает протективное действие при
коррекции морфофункциональных нарушений сердечно-сосудистой системы
при ADMA-подобной модели гестоза.
2. Использование коротких эпизодов ишемии-реперфузии
и
рекомбинантного
эритропоэтина
как
препарата,
обладающего
прекондиционирующими свойствами, оказывает выраженное протективное
действие на коррекцию морфофункциональных изменений при моделировании
ADMA-подобной патологии. Важную роль в реализации протективных
эффектов играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
3. Введение антибактериальных препаратов из группы макролидов:
азитромицина и эритромицина оказывает выраженный положительный эффект
при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с
ADMA-подобной моделью гестоза.
4. Применение новых поливитаминно-минеральных комплексов
«Компливит триместрум 2 триместр®» и «Компливит триместрум 3 триместр®»
для коррекции морфофункциональных нарушений, возникающих у беременных
животных при ADMA-подобной модели патологии, оказывает выраженный
положительный эффект.
Степень достоверности и апробация результатов
Высокая степень достоверности основана на достаточном количестве
наблюдений в эксперименте с использованием методических подходов,
отвечающих задачам проводимого эксперимента, и оборудования, имеющего
соответствующие сертификаты и прошедшего поверку в метрологической
службе.
Для всех данных была применена описательная статистика: данные
проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся
критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были
подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m).
Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий
Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами в
зависимости от типа распределения. Статистическую значимость различий
между морфологическими изменениями после их ранжирования оценивали с
помощью метода анализа непараметрических данных Манна-Уитни. Все
расчеты выполнены с помощью пакета статистических программ Microsoft
Excel 7.0.
Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и
конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010, 2011, 2012 и
2013 гг., V и ХIV национальных конгрессах «Человек и лекарство», V
конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология»
(Санкт-Петербург, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре
«Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии»
(Волгоград, 2011), X итоговой научно-практической конференции клинических
8
ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и
экспериментальной
медицины»
НИУ
«БелГУ»,
конференции
«Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Франция (Париж,
2012), конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в
медицине», Россия (Сочи, 2013), пятой ежегодной научно-практической
конференции специалистов по работе с лабораторными животными
«Лабораторные животные: наука, фармакология, ветеринария», Россия
(Белгород, 2015), X Международном научном конгрессе «Рациональная
фармакотерапия», (Санкт-Петербург, 2015).
Апробация диссертации проведена 18.06.2015 г. на заседании кафедры
фармакологии
Белгородского
государственного
национального
исследовательского университета.
Номер госрегистрации: АААА-А16-116041310091-5.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 38 печатных работ, из них 17 в
российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень
изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций,
отражающих полностью содержание работы. Издана 1 монография. Получено
14 патентов РФ на изобретения и 1 патент РФ на полезную модель.
Личный вклад автора
Автору принадлежит основная роль при определении направления
исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Автором
проведен анализ отечественных и зарубежных источников по теме
выполняемой диссертации. На основании анализа литературных данных
выдвинуты рабочие гипотезы о возможных путях фармакологической
коррекции экспериментального гестоза с помощью подходов, направленных на
ADMA-eNOS-детерминированные механизмы, и методах, в основе реализации
которых лежат процессы, протекающие при дистантном ишемическом
прекондиционировании. Вклад автора является определяющим и заключается в
непосредственном участии на всех этапах исследования.
В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично
проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены
ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при
моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых
тестируемых
препаратов.
При
непосредственном
участии
автора
осуществлялось выведение животных из эксперимента с регистрацией
физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с
помощью программного комплекса Asqknowledge 3.8.1, забор тканей и органов
для биохимического и морфологического исследований, биохимические и
морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных,
научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и
методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов,
выводов и списка литературы, включающего 362 источников, из них 87
9
отечественных и 275 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 239
страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц, 89 рисунков.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 Материалы и методы исследования
1.1 Моделирование ADMA-подобного гестоза
Эксперимент выполнен на 1030 белых крысах-самках линии Wistar
массой 250–300 г. Для формирования групп беременных животных с
заданными сроками, находящихся на раздельном содержании, к самкам (3
животных) подсаживали самцов (2 животных) на 24 часа. Затем животных
рассаживали и через 10-14 суток в условии эфирного сна пальпаторно
определяли наличие беременности. В наших экспериментах беременность
наступала в 30-40%. ADMA-подобный агент – неселективный блокатор NOсинтазы
N-нитро-L-аргинин-метиловый
эфир
(L-NAME)
вводили
внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут в течение семи дней (14-20 сутки
беременности). По данным литературы, такой умеренно пролонгированный
среднедозовый режим введения L-NAME приводит к блокаде NO-синтазы в
эндотелии плацентарных сосудов, что, в свою очередь, приводит к
деструктивным изменениям в тканях плаценты, артериальной гипертензии и
протеинурии (Барсук А.А., 2011; Полянская О.С., 2013).
1.2 Моделирование редуцированного кровотока в плаценте (reduced
uterine perfusion pressure (RUPP))
Эксперимент выполнен на 60 белых крысах-самках линии Wistar массой
250–300 г. Для формирования групп беременных животных с заданными
сроками, находящихся на раздельном содержании, к самкам (3 животных)
подсаживали самцов (2 животных) на 24 часа. Затем животных рассаживали и
через 14 суток в условии эфирного сна пальпаторно определяли наличие
беременности. В наших экспериментах беременность наступала в 30-40%. На
14 день гестации у 10 животных проводили наложение серебряных клипс
непосредственно выше бифуркации брюшной аорты (0,2 мм) и на обе
яичниковые артерии (0,1 мм). У 10 животных на 14 день гестации проводили
наложение серебряных клипс на правую подвздошную артерии (0,1 мм) и на
правую яичниковою артерию (0,1 мм) (Barbara T. A., 2011; Heltemes A., 2011).
1.3 Оценка степени развития эндотелиальной дисфункции
при моделировании патологии
Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных
оценивали по соотношению показателей эндотелийзависимой вазодилатации и
эндотелийнезависимой вазодилатации с последующим расчетом коэффициента
эндотелиальной дисфункции (КЭД) (Покровский М.В. и др., 2007).
1.4 Определение биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции
Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и
нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски
10
в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в состав
реактива Грисса (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2002).
1.5 Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS)
определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А.,
Гуманова Н.Г., 2002). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной
хемолюминесценции (ECL).
1.6 Оценка плацентарной микроциркуляции
Для получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте на 21
сутки беременности под наркозом в 4 точках измеряли уровень
микроциркуляции на расстоянии 1 мм от края плацентарного диска. Для
получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте использовали
оборудование производства компании Biopacsystems: полиграф MP100 с
модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным
игольчатым датчиком TSD144, который устанавливался непосредственно на
проекцию плацентарного диска. Регистрация и обработка результатов ЛДФ
производилась с помощью программы AcqKnowledge версии 3.8.1., значения
микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕд) (Артюшкова
Е.Б. и др., 2008).
1.7 Исследование протеинурии
Сбор мочи у интактных и опытных групп крыс проводился с
использованием специальных метаболических клеток. Животное помещалось в
клетку на 12 часов с обеспечением свободного доступа к воде. В основе метода
Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера.
1.8 Исследование отечности большого сальника
Для исследования содержания жидкости в большом сальнике,
производили его взвешивание с последующим высушиванием при 370С в
течение 24 часов и повторным взвешиванием (Тюренков И.Н. и др., 2012).
1.9 Морфологические методы оценки изменений в плаценте и почках
при моделировании экспериментального гестоза1
Для морфологического подтверждения развития моделируемых
патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов
проведено гистологическое исследование (во всех сериях эксперимента), почек
и плаценты. Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой
в парафин. Срезы почек производили перпендикулярно основной оси органа
через лоханку. Гистологические срезы плаценты производили в строго
вертикальном направлении через середину плацентарного диска с захватом
всех слоев плаценты и стенки рога матки. Изучение микропрепаратов,
фотопротоколирование и морфометрию проводили на микроскопе Leica
DM4000B с системой видеорегистрации и обработки изображений. При всех
морфологических исследованиях использовали окраску гематоксилином и
эозином. Для возможности сравнительной оценки морфологические изменения
оценивали в рангах. Иммуногистохимическое исследование экспрессии eNOS и
1
Гистологические исследования выполнены под руководством проф. А.А. Должикова и проф. В.С. Барсукова
11
iNOS в плаценте проводили с использованием антител фирмы «Spring
Bioscience».
1.10 Исследование плодов
Плоды извлекали из полости матки, взвешивали, измеряли рост
(краниокаудальный размер) с последующим расчетом росто-весового
коэффициента (Миронов А.Н., 2012) .
1.11 Выбор режимов введения фармакологических агентов
и воспроизведения эпизодов ишемии-реперфузии
В рамках данной работы проведено исследование эндотелиопротективной
активности ряда фармакологических агентов:
Гипотензивный препарат центрального действия - метилдопа (Допегит,
«Эгис») вводился в дозе 0,086 (2 x 0,43) мг/кг/сут внутрь в 2 приема с 14 по 20
сутки беременности.
Исследование активности тетрагидробиоптерина (ВН4) (Sigma Aldrich,
USA) проводилось в дозе 10 мг/кг.
Исследование активности селективного ингибитора аргиназы 2 ZB490010 (5 мг/кг/сут) внутрь однократно в сутки (ЗАО «ИИХР»).
Ингибитор фосфодиэстеразы 5 - тадалафил (Сиалис, ELI LILLY &
Company Limited) вводили в дозе 0,9 мг/кг 1 раз в сутки внутрь с 14 по 20 сутки
беременности.
В эксперименте с воспроизведением 10-минутных эпизодов ишемииреперфузии использовались 2 режима их воспроизведения. В первом случае
эпизод ишемии-реперфузии воспроизводили на 21 день беременности за 90
минут до начала проведения функциональных проб. Второй режим заключался
в ежедневном с 10 по 20 сутки беременности однократном воспроизведении
эпизода ишемии-реперфузии задней конечности.
Рекомбинантный эритропоэтин (Эпокрин, ФГУП ГосНИИ ОЧБ) вводили
подкожно в дозе 50 МЕ/кг однократно в сутки на 7, 10, 13, 16, 19 сутки
беременности.
Антибиотики из группы макролидов: эритромицин (ОАО «Биосинтез») и
азитромицин (Сумамед, Плива Хрватска д.о.о. ) вводились внутрибрюшинно
однократно в сутки в дозе 30 мг/кг с 14 по 20 сутки беременности.
Фолиевую кислоту (ОАО «Валента Фармацевтика») вводили
внутрижелудочно в дозе 0,2 мг/кг/сутки однократно с 14 по 20 сутки
беременности. Витамин В6 (ОАО «Верофарм») вводили внутрибрюшинно в
дозе 2 мг/кг/сутки однократно с 14 по 20 сутки беременности.
Препараты «Компливит триместрум 2 триместр» и «Компливит
триместрум 3 триместр» (ООО «Фармстандарт-УфаВИТА») вводили в дозе
0,084 таб./кг/сутки однократно внутрь с 14 по 20 сутки беременности.
Блокатор АТФ-зависимых К+ каналов – глибенкламид (Манинил, БерлинХеми АГ) вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг с 14 по 20 сутки
беременности.
Селективный ингибитор iNOS – аминогуанидин (Aminoguanidine
hemisulfate sate, Sigma-aldrich chemine GmbH) вводили внутрибрюшинно в дозе
300 мг/кг.
12
При комбинированном применении препаратов использовались те же
дозы, пути введения и та же продолжительность применения.
1.12 Дизайн эксперимента состоит из следующих блоков:
1. Контрольная группа (животные с пероральным введением NaCl в
эквивалентных дозах с 14 по 20 сутки беременности).
2.
Моделирование
ADMA–подобного
гестоза
(животные
с
внутрибрюшинным введением L-NAME в дозе 25 мг/кг однократно в сутки с 14
по 20 сутки беременности) (рисунок 1.1).
3. Моделирование редуцированного кровотока в правом и левом рогах
матки.
4. Моделирование редуцированного кровотока в правом роге матки.
5. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений
при моделировании ADMA–подобного гестоза:
5.1 тетрагидробиоптерином (10 мг/кг).
5.2 селективным ингибитором аргиназы 2 ZB49-0010 (5 мг/кг).
5.3 ингибитором ФДЭ5 – тадалафила (0,9 мг/кг).
5.4 кратковременными эпизодами ишемии-реперфузии.
5.5 кратковременными эпизодами ишемии-реперфузии на фоне
введения аминогуанидина (300 мг/кг).
5.6 кратковременными эпизодами ишемии-реперфузии на фоне
введения глибенкламида (50 мг/кг).
5.7 рекомбинантным эритропоэтином (50 Ме/кг).
5.8 эритромицином (30 мг/кг) и азитромицином (30 мг/кг).
5.9 фолиевой кислотой (0,2 мг/кг), витамином В6 (2 мг/кг),
препаратов «Компливит триместрум 2 триместр» (0,084 таб./кг) и «Компливит
триместрум 3 триместр» (0,084 таб./кг).
сутки
1
2
10
14
20 21
Примечания:
- Спаривание животных
- Пальпаторное определение факта беременности
- Введение L-NAME
- Проведение функциональных проб, забор материала для
биохимического и морфологического исследований
Рисунок 1.1 – Дизайн моделирования ADMA-подобного гестоза.
1.13 Статистическая обработка результатов исследования
Для всех данных была применена описательная статистика: данные
проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся
критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были
подсчитаны среднее значение (M) и стандартная ошибка среднего (m).
Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий
13
Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами, в
зависимости от типа распределения. Статистическую значимость различий
между морфологическими изменениями после их ранжирования оценивали с
помощью метода анализа непараметрических данных Манна-Уитни. Расчеты
выполнены с помощью статистических программ Microsoft Excel 7.0.
2 Результаты исследования
2.1 Сравнительная оценка морфофункциональных нарушений при
моделировании ADMA-подобного гестоза и редуцированного кровотока в
матке
При введении ADMA-подобного агента – L-NAME беременным самкам
(25 мг/кг однократно в сутки с 14 по 20 сутки беременности) на 21-е сутки мы
наблюдали развитие патологии, по своим проявлениям соответствующей
критериям клинических проявлений гестоза. Происходило статистически
значимое повышение систолического и диастолического АД с 134,5±2,3 и
92,0±2,1 до 186,3±7 и 145,0±5,0 мм рт. ст., соответственно и увеличение КЭД с
1,1±0,11 до 3,12±0,17 (p<0,05) (таблица 2.1).
Значение уровня микроциркуляции в плаценте интактных беременных
крыс на 21 сутки составляло 446,3±27,5 ПЕд (перфузионных единиц). При
моделировании ADMA-подобного гестоза, обнаружено ее существенное
снижение до 218,3±13,7 ПЕд. У интактных беременных крыс 12-часовой
диурез составил 5,8±0,3 мл, что соответствовало нормальным показателям
у животных массой 250-300 г при протеинурии, значения которой
соответствовали 0,93±0,06 г/л, т.е. до 1,0 г/л. Введение L-NAME не
оказывало существенного влияния на 12-часовой диурез. При анализе
мочи обнаружено умеренно выраженное увеличение протеинурии со
значениями 2,04±0,22 г/л (p<0,05). Однако нужно отметить, что при
измерении микроциркуляции в почечной ткани статистически достоверной
разницы между группой интактных беременных животных и животных с
моделируемым ADMA-подобным гестозом не наблюдалось.
Исследование NO-продуцирующей функции эндотелия показало, что
моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO приводило к резкому
снижению экспресии eNOS и содержания нитрит-ионов (NOx) соответственно в
1,8 и 1,7 раза (таблица 2.1).
Гистологическая картина почек у интактных беременных крыс (21 сутки
беременности) была следующей: клубочки умеренно полнокровны, базальная
мембрана не утолщена, воспалительные изменения в интерстиции клубочков и
пирамид отсутствуют; спастические и гипертрофические изменения мелких
артерий и артериол не обнаружены (рисунок 2.1).
Плацента крыс на 21 сутки беременности без признаков повреждения
(рисунок 2.2).
14
Рисунок 2.1 – Почка беременной крысы в
норме: мелкая артерия в корковом
веществе без признаков гипертрофии
стенок, её эндотелий не поврежден;
базальная мембрана капилляров
клубочка не утолщена, клеточная
воспалительная реакция отсутствует.
Окраска гематоксилином и эозином.
Микрофото. Х 280.
А
Б
Рисунок 2.2 – Строение интактной плаценты. Структура спонгиозного (ворсинчатого)
слоя (а) и пограничного участка между ворсинами и слоем гигантоклеточного
трофобласта (б) плаценты интактных животных: равномерное кровенаполнение
капилляров ворсин и межкапиллярных пространств, относительно мономорфная
структура трофобласта, непрерывность перехода от ворсинчатого слоя в
трофобластический слой; Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х 200.
У крыс с ADMA-подобным гестозом обнаружено увеличение содержания
жидкости в тканях большого сальника с 49,89±0,82% до 58,09±1,73% (р<0,05).
В почечных клубочках выявлены признаки ишемического повреждения в виде
их малокровия, а также дистрофические изменения базальной мембраны
капилляров клубочков с её утолщением в виде проволочных петель (рисунок
2.3 (б)). Заметной реакции мезангия не отмечалось: среднее количество клеток
на клубочек составило 39,20±2,99 (в норме 40,70±3,80). Описанные изменения
гломерулярного аппарата могут объяснять имеющуюся у крыс данной группы
гиперфильтрацию с выраженной протеинурией. В мелких артериях и
артериолах отмечались спазм и выраженная гипертрофия стенок (рисунок 2.3
(а)).
Морфологическая картина плаценты при ADMA-подобном гестозе
проявлялась в виде ишемии ворсин и интервиллезных пространств и
слущиванием эндотелия в сосудах плаценты (рисунок 2.4). В отдельных
случаях это приводило к появлению очагов некроза децидуальных клеток в
ткани плаценты. На внешней поверхности плаценты наблюдали массивные
отложения фибрина.
15
А
Б
Рисунок 2.3 – Почка беременной крысы с гестозом (21 сутки беременности). а –
спазм и гипертрофия артериолы; б – клубочек малокровен, базальная мембрана
капилляров резко утолщены и имеют вид проволочных петель (мембранозная
гломерулопатия); Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х 280.
А
Б
Рисунок 2.4 – Патологические изменения в плаценте при моделировании
ADMA-подобного гестоза. А – неравномерное кровенаполнение спонгиозного
слоя; Б - вакуольная дистрофия гигантоклеточного трофобласта; очаги некроза
на границе гигантоклеточного трофобласта и децидуальной ткани;
дистрофические изменения, малокровие децидуального слоя. Окр.
гематоксилином и эозином. Микрофото. Х 200.
Наложение серебряных клипс выше бифуркации аорты и на 2 яичниковые
артерии приводило к подъему артериального давления до 155,4±3,6 и 109,3±5,7
мм рт. ст. Коэффициент эндотелиальной дисфункции повышался до 2,02±0,23
(p<0,05). Кроме этого происходило снижение микроциркуляции в
плаценте обоих рогов матки до 229,7±9,9 при 446,3±27,5 ПЕд у интактных
беременных самок. Моделирование снижения кровотока в обоих рогах
матки приводило к статистически значимому по сравнению с интактными
беременными животными повышению протеинурии до 1,34±0,11 г/л
(p<0,05).
Исследование NO-продуцирующей функции эндотелия у животных с
редуцированным кровотоком в обоих рогах матки показало отсутствие
статистически значимой разницы экспрессии eNOS в эндотелии и
16
концентрации конечных метаболитов NO в плазме крови по сравнению с
беременными интактными животными.
При моделировании редуцированного кровотока в обоих рогах матки в
плаценте наблюдались ярко выраженные изменения ишемического генезы
(рисунок 2.5).
Рисунок 2.5 – Патоморфологические изменения плаценты при ишемии. А – общий вид
с обширными некрозами и кровоизлияниями в лабиринтной зоне (ЛЗ), Б – некрозы и
геморрагические озера в ЛЗ, Б – крупный очаг гнойного децидуита, расслоение тканей
на границе плаценты и стенки матки. Окраска гематоксилином и эозином. Микрофото.
Х50 (А), Х200 (Б, В).
Наложение клипс на артерии кровоснабжающие только правый рог матки
приводило к снижению микроциркуляции в плаценте правого рога до
204,4±14,3 и до 309,0±15,8 ПЕд в левом роге матке (p<0,05). Статистически
значимого изменения артериального давления, КЭД, диуреза, протеинурии и
NO – синтезирующей функции эндотелия у этих животных не выявлено.
17
При моделировании редуцированного кровотока в правом роге, в
плацентах правого рога матки возникали изменения ишемического генеза и
морфологическая картина принципиально не отличалась от состояния плацент
у группы животных с моделированием редуцированного кровотока в обоих
рогах матки.
Интегральная
характеристика
балльной
оценки
изменения
морфологических показателей при моделировании ADMA-подобного гестоза и
моделирования редуцированного кровотока в матке представлена в таблице 2.1.
Таблица 2.1 – Значения морфофункциональных показателей у беременных
крыс при моделировании ADMA-подобного гестоза и редуцированного
кровообращения в матке (M±m; n=10).
Группа
Беременные
интактные
Беременные
+
L-NAME
134,5±2,3y
92,0±2,1y
1,10±0,11y
446,3±27,5y
186,3±7*
145,0±5,0*
3,12±0,17*
218,3±13,7*
2,28±0,11y
113,2±5,1y
0-1
1,28±0,08*
68,5±3,3*
5-6*
49,89±0,82y
58,09±1,73
52,86±2,66
1,73±0,06y
1,52±0,06*
1,16±0,04*
Показатель
САД, мм рт. ст.
ДАД, мм рт. ст
КЭД, усл. ед.
Микроциркуляция,
пер. ед.
NOx, мкмоль/дЛ
eNOS, %
Комплексная
оценка патоморфологических изменений, в баллах
Содержание
жидкости в тканях
б. сальника, %
Масса плодов, г
Беременные
Беременные
(редуцированный (редуцированный
кровоток в 2х
кровоток в
рогах матки)
правом роге
матки)
155,4±3,6*
138,8±4,4y
109,3±5,7*
89,8±5,8y
2,02±0,23*
1,29±0,08y
229,7±9,9*
204,4±14,3*R
309,0±15,8*yL
2,12±0,11y
2,15±0,09y
y
104,5±6,6
105,4±3,2 y
5-6*
5-6*P
0-1L
48,78±2,00y
1,13±0,06*R
1,31±0,08*L
y
*
*
Рост плодов, мм
24,59±0,42
22,91±0,34
20,10±0,27
20,89±0,45*R
22,90±0,45*L
y
*
*
Рост/вес, мм/г
14,91±0,28
15,93±0,31
18,25±0,55
19,36±0,76*R
18,63±0,68*L
*
Постимплантаци0
0
36,53±2,86
34,16±3,37*R
онная гибель, %
18,66±5,66*L
Примечание: * - при р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами; y - при р<0,05
в сравнении с беременными крысами с L-NAME, R - микроциркуляция в правом роге матки,
L – микроциркуляция в левом роге матки.
Сравнительная оценка состояния плодов выявила уменьшение массы
плодов при всех моделируемых патологических состояниях по сравнению с
группой интактных беременных животных. В группах животных с
редуцированным маточным кровотоком гипотрофия плодов была более
выраженной по сравнению с группой с ADMA – подобным гестозом. Кроме
18
этого у животных с редуцированным маточным кровоток наблюдалась
постимплантационная гибель плодов (таблица 2.1).
Таким образом, комплексный анализ морфофункциональных изменений
при моделировании различных патологий беременных позволяет сделать вывод
о том, что ADMA-подобная модель наиболее приближена к гестозу второй
половины беременности. В пользу этого свидетельствует повышение
артериального давления, нарушение взаимоотношения вазоконстрикторных и
вазодилатирующих механизмов, снижение микроциркуляции в плаценте,
повышение протеинурии, нарушение NO-синтезирующей функции эндотелия,
комплекс морфологических изменений в почках и плаценте, что послужило
причиной использование ее как базовой модели.
2.2 Исследование эффективности фармакологических агентов, влияющих
на путь L-аргинин – NO – цГМФ, при коррекции ADMA-подобного гестоза
Исследование эффективности фармакологических агентов, влияющих на
путь L-аргинин – NO - цГМФ: тетрагидробиоптерина (BH4), селективного
ингибитора аргиназы 2 (ZB49-0010) и ингибитора ФДЭ-5 тадалафила при
коррекции ADMA-подобного гестоза выявило статистически значимое
снижение артериального давления под влиянием BH4, тадалафила и препарата
входящего в стандартную терапию гестоза метилдопы и улучшение функции
эндотелия (КЭД) под влиянием всех изучаемых фармакологических агентов
влияющих на путь L-аргинин – NO - цГМФ (таблица 2.2).
Таблица 2.2 – Влияние фармакологических агентов, влияющих на путь Lаргинин – NO – цГМФ на артериальное давление, КЭД и микроциркуляцию в
плаценте при коррекции ADMA-подобного гестоза у крыс (M±m; n=10).
Показатель
САД,
ДАД,
КЭД,
МикроцирГруппа
мм рт.ст.
мм рт.ст.
усл. ед.
куляция, ПЕд
Интактные
134,5±2,3y
92,0±2,1y
1,10±0,11y
446,3±27,5y
*
*
*
L-NAME
186,3±7
145,0±5,0
3,12±0,17
218,3±13,7*
L-NAME + метилдопа
135,8±2,9y
103,8±3,8y
3,16±0,33*
248,4±10,7*
(2 x 0,43) мг/кг/сут
L-NAME + тетрагидро157,4±7,9*y
116,7±8,8*y
1,73±0,24*y
402,0±26,2y
биоптерин (10 мг/кг)
L-NAME + ZB49-0010
192,5±8,7*
150,2±6,7*
1,49±0,14y
435,4±27,4y
(5 мг/кг)
L-NAME +
149,7±2,2y
97,6±3,2y
1,85±0,08*y
398,7±24,9y
тадалафил (0,9 мг/кг)
Примечание: * - p<0,05 – в сравнении с интактными; y - р<0,05 – в сравнении с L-NAME.
При исследовании микроциркуляции в плаценте было выявлено ее
улучшение под влиянием тетрагидробиоптерина, селективного ингибитора
аргиназы 2 и тадалафила (таблица 2.2). Кроме этого, под влиянием
фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO – цГМФ и
метилдопы, происходило снижение протеинурии (таблица 2.3).
19
При исследовании влияния тетрагидробиоптерина, ZB49-0010 и
тадалафила на NO-синтезирующую функцию эндотелия при коррекции ADMAподобного гестоза было выявлено ее статистически значимое улучшение
(p<0,05) под влиянием метилдопы, тетрагидробиоптерина и ZB49-0010
(рисунок 2.6). Это касается как содержания конечных метаболитов NO, так и
уровня экспрессии eNOS.
Морфологическое и иммуногистохимическое исследования выявили в
почках и плаценте протективный эффект при применении метилдопы и
фармакологических агентов, влияющих на метаболический путь L-аргинин –
NO – цГМФ, что выразилось в приближении интегральной оценки к группе
интактных беременных животных (таблица 2.4).
Таблица 2.3 – Влияние фармакологических агентов, влияющих на путь Lаргинин – NO – цГМФ, на значения показателей 12-часового диуреза и
протеинурии при коррекции ADMA-подобного гестоза (M±m; n=10).
Показатель
Кол-во 12-часовой
Протеинурия
Группа
мочи (мл)
(г/л)
Интактные беременные
5,8±0,3
0,93±0,06у
L-NAME
5,6±0,3
2,04±0,22*
L-NAME + метилдопа (2 x 0,43) мг/кг/сут
5,4±0,3
1,45±0,14* у
L-NAME + тетрагидробиоптерин (10 мг/кг)
5,6±0,3
1,16±0,09у
L-NAME + ZB49-0010 (5 мг/кг)
5,6±0,3
1,19±0,10 у
L-NAME + тадалафил (0,9 мг/кг)
5,7±0,3
0,99±0,05 у
Примечание: * - p<0,05 – в сравнении с интактными беременными животными; у – р<0,05 –
в сравнении с беременными самками, получавшими L-NAME.
120
2,50
%
100
20
65,5±3,4*
107,7±4y
108,2±4,2y
76,5±6,7*
40
68,5±3,3*
60
1,36±0,10*
1,95±0,06y
1,86±0,07y
1,48±0,08*
0,50
1,28±0,08*
1,00
2,28±0,11
мкмоль/дЛ
80
1,50
113,2±5,1y
2,00
0
0,00
Интактные
L-NAME
Метилдопа
ВН4
ZB49-0010
Интактные
Тадалафил
L-NAME
Метилдопа
ВН4
ZB49-0010
Тадалафил
Примечание: *- при р<0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; Yр<0,05 в сравнении с группой беременных животных, получавших L-NAME.
Рисунок 2.6 – Исследование влияния на концентрацию NOx в плазме крови и
экспрессию eNOS фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO –
цГМФ при коррекции ADMA-подобного гестоза.
20
Таблица 2.4 – Влияние фармакологических агентов, влияющих на путь Lаргинин – NO – цГМФ, на интегральную оценку комплекса
патоморфологических изменений в почках и плаценте и экспрессию eNOS при
коррекции ADMA-подобного гестоза (n=10).
Серия экспериментов
Комплексная
Экспрессия eNOS
оценка в баллах
в плаценте, %
Интактные беременные самки
0-1
5,4±0,21
L-NAME
5-6*
0,04±0,01*
L-NAME + метилдопа (2 x 0,43) мг/кг/сут
3*
2,07±0,16*
L-NAME + тетрагидробиоптерин (10 мг/кг)
2-3*
4,01±0,26
*
L-NAME + ZB49-0010 (5 мг/кг)
2
4,45±0,21
L-NAME + тадалафил (0,9 мг/кг)
3*
5,04±0,26
Примечание. * - p<0,05 в сравнении с интактными беременными самками.
Микроскопическое исследование почек у животных, получавших
лечение, выявило однотипную картину, которая резко отличалась от
контрольной группы беременных крыс. Мелкие артерии коркового вещества
почки с признаками слабо выраженной гипертрофии мышечного слоя.
Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не
утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствовали. Заметной реакции
мезангия не отмечалось. Так среднее количество клеток на клубочек в группе с
использованием тадалафила составляло 39,80±2,31 (в норме 40,70±3,80).
Морфологическая картина плаценты при L-NAME-индуцированном
гестозе, леченном метилдопой и фармакологическими агентами, влияющими на
метаболический путь L-аргинин – NO – цГМФ, приближалась к группе
интактных животных. Отмечалось мономорфная структура слоев плаценты без
очаговых деструктивных изменений, умеренное кровенаполнение спонгиозного
слоя. На внешней поверхности плаценты наблюдались следы отложения
фибрина.
Таким образом, использование тетрагидробиоптерина, селективного
ингибитора аргиназы 2 и тадалафила оказывало выраженное протективное
действие на модели ADMA-подобного гестоза, что выражалось в статистически
достоверном гипотензивном эффекте, снижении коэффициента эндотелиальной
дисфункции (КЭД), предотвращении снижения микроциркуляции в плаценте, а
также в полном предотвращении снижения содержания нитрит-ионов NOx и
экспрессии eNOS под влиянием тадалафила. Одновременно результаты
исследований
мочи
плаценты
выявили
снижение
протеинурии.
Морфологические исследования почек и плаценты в этих группах выявили
максимальное приближение гистологической картины к группе интактных
беременных животных.
Полученные результаты коррекции морфофункциональных нарушений
сердечно-сосудистой системы при ADMA-подобном гестозе свидетельствуют о
перспективности подхода для лечения и профилактики гестоза, направленного
на преодоление ADMA-обусловленного ингибирования eNOS и коррекции
вызванной ею патофизиологических изменений.
21
2.3 Исследование эффективности коротких эпизодов ишемии-реперфузии и
рекомбинантного эритропоэтина при ADMA-подобном гестозе и роли iNOS
и АТФ–зависимых К+ каналов в реализации их положительных эффектов
2.3.1 Исследование эффективности коротких эпизодов ишемии-реперфузии
и рекомбинантного эритропоэтина при коррекции морфофункциональных
нарушений при ADMA-подобном гестозе
Воспроизведение однократного ишемического эпизода за 90 минут до
снятия проб не приводило к какому-либо значимому изменению артериального
давления.
10-кратное воспроизведение ишемического эпизода и введение
рекомбинантного эритропоэтина приводило к статистически значимому
снижению артериального давления: систолического до 141,6±5,5 и 143,5±4,0
мм рт.ст., диастолического до 104,2±5,7 и 98,1±5,9 мм рт.ст. (р<0,05)
соответственно (таблица 2.5).
Таблица 2.5 – Влияние коротких эпизодов ишемии-реперфузии и
рекомбинантного эритропоэтина на артериальное давление, микроцикуляцию в
плаценте и КЭД при коррекции ADMA-подобного гестоза (M±m; n=10).
Показатель
САД,
ДАД,
КЭД,
МикроцирГруппа
мм рт.ст.
мм рт.ст.
усл. ед.
куляция, ПЕд
134,5±2,3y
92,0±2,1y
1,10±0,11y
446,3±27,5y
Интактные
L-NAME
186,3±7*
145,0±5,0*
3,12±0,17*
218,3±13,7*
L-NAME
+
Ишемия177,1±9,8*
124,9±8,4*
1,52±0,09y
327,3±17,2y
реперфузия(1)
L-NAME
+
Ишемия141,6±5,5y
104,2±5,7y
1,56±0,13y
339,6±20,4y
реперфузия(10)
L-NAME + рекомбинантный
143,5±4,0y
98,1±5,9y
1,67±0,15y
296,6±27,1y
эритропоэтин (50 МЕ/кг)
Примечание: САД, ДАД – систолическое и диастолическое артериальное давление; КЭД –
коэффициент эндотелиальной дисфункции; микроциркуляция в плаценте; ПЕд –
перфузионные единицы; * - р<0,05 - в сравнении с группой беременных интактных
животных; y - р<0,05 - в сравнении с группой беременных крыс, получавших
L-NAME.
Воспроизведение как однократного ишемического эпизода за 90 минут до
снятия проб, так и 10-кратного эпизода ишемии-реперфузии с 10 по 20 день
беременности, а также введение рекомбинантного эритропоэтина приводило к
нормализации взаимоотношения вазодилатирующих и вазоконстрикторных
реакций при ADMA-подобном гестозе, о чем свидетельствует снижение КЭД
до 1,52±0,09, 1,56±0,13 и 1,67±0,15 усл. ед., соответственно (таблица 2.5).
Обращает на себя внимание, что однократное воспроизведение эпизода
ишемии-реперфузии снижало КЭД на фоне L-NAME-индуцированной
патологии, не влияя на артериальное давление. Это свидетельствует об
отличительных особенностях механизмов действия однократного и
многократного воспроизведения эпизодов ишемии-реперфузии и их различном
22
влиянии на вовлеченные в патогенетический процесс элементы гуморального и
нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения.
Воспроизведение однократного, 10-кратного эпизода ишемииреперфузии и введение рекомбинантного эритропоэтина вызывало
существенное улучшение микроциркуляции до 327,3±17,2, 339,6±20,4 и
296,6±27,1 усл. ед., соответственно, что было достоверно выше, чем у
беременных самок с гестозом (p<0,05).
Воспроизведение 10-кратных эпизодов ишемии-реперфузии с 10 по 20
сутки и введение рекомбинантного эритропоэтина у беременных животных с
моделированием ADMA-подобного гестоза нормализовало показатели белка в
моче, значения которых не выходили за пределы нормы и составили 1,02±0,04
и 1,01±0,06 г/л соответственно, что статистически различимо (р<0,05) по
сравнению с группой нелеченных беременных животных (таблица 2.6).
Таблица 2.6 – Влияние коротких эпизодов ишемии-реперфузии и
рекомбинантного эритропоэтина на значения показателей 12-часового диуреза
и протеинурии при моделировании ADMA-подобного гестоза (M±m; n=10).
Показатель
Группа
Интактные
Кол-во мочи,
мл
5,8±0,3
Протеинурия,
г/л
0,93±0,06у
5,6±0,3
2,04±0,22*
L-NAME
5,5±0,3
1,02±0,04у
L-NAME+Ишемия-реперфузия (10)
L-NAME+рекомбинантный эритропоэтин (50 МЕ/кг)
5,3±0,2
1,01±0,06у
Примечание: * - p<0,05 – в сравнении с интактными беременными животными; у – р<0,05 –
в сравнении с беременными самками, получавшими L-NAME.
Влияние коротких эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного
эритропоэтина на NO-продуцирующую функцию эндотелия исследовано на
основании данных увеличения экспрессии eNOS и содержания нитрит-ионов
NOx (рисунок 2.7). Обнаружено, что при однократном воспроизведении
эпизода ишемии-реперфузии не происходило увеличения ни экспрессии eNOS,
ни уровня нитрит-ионов в плазме крови. Увеличение показателей экспрессии
eNOS происходило как под влиянием рекомбинантного эритропоэтина, так и
при воспроизведении 10-кратного эпизода ишемии-реперфузии. Увеличение
содержание конечных метаболитов NO в плазме крови происходило только при
10-кратном воспроизведении эпизодов ишемии-реперфузии.
При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен
протективный эффект 10-кратного воспроизведения эпизодов ишемииреперфузии и введения рекомбинантного эритропоэтина. У животных с 10кратным воспроизведением коротких эпизодов ишемии-реперфузии картина
резко отличалась от контрольной группы беременных крыс. Мелкие артерии
коркового вещества почки со слабовыраженными признаками гипертрофии и
спазма мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны,
базальные мембраны не утолщены, симптом «проволочных петель»
23
отсутствует. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество
клеток на клубочек составило 36,80±3,16 (в норме 40,70±3,80).
%
120
2,50
100
20
87,3±6,5*
53,4±2,5*
40
68,5±3,3*
60
113,2±5,1y
1,92±0,18y
1,38±0,12*
0,50
1,11±0,09*
1,28±0,08*
1,00
2,28±0,11y
мкмоль/дЛ
80
1,50
116,5±4,4y
2,00
0
0,00
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(1)
Ишемияреперфузия(10)
Интактные
Эритропоэтин
L-NAME
ИшемияИшемияЭритропоэтин
реперфузия(1) реперфузия(10)
Примечание: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой беременных крыс, получавших L-NAME.
Рисунок 2.7 – Влияние коротких эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного
эритропоэтина на концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS в эндотелии
при коррекции ADMA-подобного гестоза.
Морфологическое исследование плаценты при коррекции L-NAMEиндуцированного гестоза 10-кратным воспроизведением эпизода ишемииреперфузии выявило устранение ишемических повреждений в плацентарной
ткани (рисунок 2.8.). Наблюдалось относительно равномерное кровенаполнение
спонгиозного слоя, отсутствие повреждения слоя гигантоклеточного
трофобласта и децидуальной оболочки. На внешней поверхности плаценты
наблюдались слабые отложения фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических
показателей
и
результаты
иммуногистохимического
исследования
представлены в таблице 2.7, из которой следует, что 10-кратное
воспроизведение кратковременного эпизода ишемии-реперфузии и введение
рекомбинантного эритропоэтина достоверно снижали интегральную оценку в
баллах и восстанавливали экспрессию eNOS в плаценте по сравнению с
ADMA-подобным гестозом.
Таблица 2.7 – Влияние 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии на комплекс
патоморфологических изменений и экспрессию eNOS при моделировании
ADMA-подобного гестоза (n=10).
№
п/п
1
2
3
4
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
0-1
5-6*
2-3*
3*
Экспрессия eNOS
в плаценте, %
5,4±0,21
0,04±0,01*
5,18±0,38
5,18±0,27
Интактные беременные самки
ADMA-подобный гестоз
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10)
L-NAME
+
рекомбинантный
эритропоэтин (50 МЕ/кг)
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками.
24
Б
А
В
Рисунок 2.8 – Плацента у животных с 10-кратным воспроизведением
кратковременных ишемических эпизодов на фоне ADMA-подобного гестоза. А –
децидуальный слой: мономорфная структура, отсутствие дистрофических изменений;
Б – равномерное кровенаполнение спонгиозного слоя; В - отсутствие дистрофических
изменений трофобласта; Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х 200.
2.3.2 Исследование роли iNOS и АТФ-зависимых К+ каналов в реализации
положительных эффектов коротких эпизодов ишемии-реперфузии при
коррекции ADMA-подобного гестоза
Введение аминогуанидина, являющегося селективным ингибитором
iNOS, или глибенкламида, являющегося блокатором АТФ-зависимых К+
каналов, здоровым беременным животным не приводило к статистически
значимому изменению артериального давления, КЭД, микроциркуляции в
плаценте и протеинурии.
Введение аминогуанидина или глибенкламида беременным животным с
экспериментальным гестозом, леченным короткими эпизодами ишемииреперфузии, приводило к полному устранению их гипотензивного эффекта,
ухудшало микроциркуляцию в плаценте (рисунок 2.9) и повышало
протеинурию до уровня нелеченых животных. Только КЭД, несмотря на
статистически достоверное свое повышение, оставался ниже группы нелеченых
животных (p<0,05).
При введении аминогуанидина или глибенкламида беременным
животным принципиально значимого снижения уровня нитрит-ионов в плазме
крови и активности eNOS не происходило. При введении их животным с
ADMA-подобным гестозом, леченным короткими эпизодами ишемииреперфузии, увеличение уровня нитрит-ионов в плазме крови конечных
25
181,3±4,6*
198,5±13,1*
0,5
0
И нтактные
L-NAME
И нтактные
И шемияреперфузия(10)
И шемияИшемияреперфузия(10) реперфузия(10)
+Глибенкламид +Аминогуанидин
2,5
2
0,5
0
0
И нтактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
И шемияИ шемияреперфузия(10) реперфузия(10)
+Глибенкламид +Аминогуанидин
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
1,49±0,06*
256,8±24,6*
1
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
1,61±0,07*
50
233,2±21,6*
100
339,6±20,4y
150
1,5
218,3±13,7*
446,3±27,5y
350
200
L-NAME
г/л
400
250
2,24±0,17y
0
И шемияИ шемияИ шемияреперфузия(10) реперфузия(10) реперфузия(10)
+Глибенкламид +Аминогуанидин
450
300
2,34±0,09y
1
1,56±0,13y
2
1,5
20
ПЕ
3,12±0,17*
2,5
1,02±0,04у
40
3
2,04±0,22*
60
КЭД
1,1±0,11y
80
3,5
ДАД
0,93±0,06у
100
САД
133,5±3,3*
120
139,2 ±8,3*
140
104,2 ±5,7y 141,6±5,5y
160
186,3±7*
180
145,0±5,0*
200
92,0±2,1y 134,5±2,3y
мм рт. ст.
метаболитов NO и экспрессии eNOS под влиянием последних не происходило
(рисунок 2.10).
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
Примечание: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.
Рисунок 2.9 – Влияние аминогуанидина (300 мг/кг) и глибенкламида (50 мг/кг) на
АД, КЭД, микроциркуляцию в плаценте и протеинурию при коррекции ADMAподобного гестоза короткими эпизодами ишемии-реперфузии.
2,50
120
%
0,00
Инт актные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
116,5±4,4y
59,3±3,0*
20
62,6±2,7*
40
68,5±3,3*
1,31±0,06*
60
1,29±0,07*
1,92±0,18y
0,50
1,28±0,08*
1,00
2,28±0,11
мкмоль/дЛ
80
1,50
113,2±5,1y
100
2,00
0
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
Примечание: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.
Рисунок 2.10 – Влияние аминогуанидина (300 мг/кг) и глибенкламида (50 мг/кг) на
концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS при коррекции ADMAподобного гестоза короткими эпизодами ишемии-реперфузии.
Обращает на себя внимание то, что отрицательное влияние
аминогуанидина и глибенкламида на функциональные показатели проявляется
только при попытке коррекции моделируемой патологии, что указывает на
26
важную роль iNOS и АТФ-зависимых К+ каналов в реализации
эндотелиопротективного эффекта короткими эпизодами ишемии-реперфузии.
При морфологическом исследовании почек и плаценты животных,
которым вводился аминогуанидин или глибенкламид, обнаружено отсутствие
какого-либо их влияния на микроскопическую картину в органах, которая
соответствовала группе интактных беременных животных (0-1 в баллах).
При введении аминогуанидина или глибенкламида животным с
экспериментальным гестозом, леченным короткими эпизодами ишемииреперфузии, наблюдалось практически полное устранение положительного
влияния последних как в плацентарной ткани, так и в почках. В почках
наблюдались спазм и гипертрофия мышечного слоя мелких артерий. Эпителий
канальцев уплощен, на значительных участках десквамирован. Заметной
реакции мезангия не отмечено.
Морфологическая картина плаценты проявлялась ишемией ворсин и
интервиллезных пространств и слущиванием эндотелия в сосудах плаценты.
Отмечаются очаги некроза децидуальных клеток в ткани плаценты. На внешней
поверхности плаценты наблюдали массивные отложения фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических
показателей
и
результаты
иммуногистохимического
исследования
представлены в таблице 2.8, из которой следует, что 10-кратное
воспроизведение кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии на фоне
введения аминогуанидина или глибенкламида положительного эффекта на
морфофункциональные нарушения при ADMA–подобном гестозе не оказывало.
Таблица 2.8 – Влияние аминогуанидина и глибенкламина на комплекс
патоморфологических изменений и экспрессию eNOS при коррекции
короткими эпизодами ишемии-реперфузии ADMA-подобного гестоза (n=10).
№
п/п
1
2
3
4
Серия экспериментов
Комплексная
Экспрессия eNOS
оценка в баллах
в плаценте, %
Интактные беременные самки
0-1
5,4±0,21
ADMA-подобный гестоз
5-6*
0,04±0,01*
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10)
2-3*
5,18±0,38
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10) +
5-6*
0,03±0,01*
аминогуанидин (300 мг/кг)
5
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10) +
5-6*
0,04±0,01*
глибенкламид (50 мг/кг)
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками.
Таким образом, однократное и 10-кратное воспроизведение коротких
ишемических эпизодов и введение рекомбинантного эритропоэтина проявило
выраженное эндотелиопротективное действие на модели ADMA-подобного
гестоза, что выражалось в усилении эндотелийзависимого расслабления
сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции КЭД до
уровня интактных животных, а также в уменьшении нарушений
микроциркуляции в плаценте. Кроме этого, 10-кратное воспроизведение
коротких ишемических эпизодов и введение рекомбинантного эритропоэтина
27
приводило к снижению артериального давления, нормализации протеинурии,
восстановлению функции NO-продуцирующей системы. Морфологическое
исследование выявило предотвращение деструктивных явлений ишемического
генеза, вызванных введением L-NAME при воспроизведении 10-кратных
ишемических эпизодов и введении рекомбинантного эритропоэтина. Однако
полной нормализации морфологической картины в почках и плаценте не
наступало.
Следует отметить, что эффекты однократного воспроизведения и 10кратного воспроизведения ишемических эпизодов на NO-синтезирующую
функцию разнонаправленные. Данный факт говорит о различных механизмах
реализации их эндотелиопротективного действия.
В
представленных
экспериментах
показано,
что
введение
аминогуанидина, являющегося ингибитором iNOS, или глибенкламида,
являющегося блокатором АТФ-зависимых К+ каналов, животным с
экспериментальным ADMA-подобным гестозом, леченным воспроизведением
эпизодов
ишемии-реперфузии,
практически
полностью
снимает
положительный эффект последних. Это проявляется в устранении их
гипотезивного эффекта, снижении выраженности положительного влияния на
функцию эндотелия, снижении микроциркуляции в плацентарной ткани и
показателей NO-продуцирующей функции эндотелия до уровня нелеченых
животных, а также в восстановлении деструктивных повреждений в
плацентарной ткани и почках ишемического генеза. Это свидетельствует о
важной роли iNOS и АТФ-зависимых К+ каналов в реализации протективных
эффектов эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции ADMA-подобного
гестоза в эксперименте.
2.4 Исследование эффективности эритромицина
и азитромицина при ADMA-подобном гестозе
Введение азитромицина (30 мг/кг) приводило к статистически значимому
снижению как систолического, так и диастолического давления у животных с
экспериментальным ADMA-подобным гестозом (рисунок 2.11). Введение
эритромицина (30 мг/кг) не оказывало сколь-нибудь существенного влияния на
данные показатели. Оба препарата примерно в равной степени статистически
значимо снижали КЭД до 1,88±0,16 и 1,82±0,09 соответственно (р<0,05), тогда
как в группе нелеченых беременных самок, получавших L-NAME, он составлял
3,12±0,17. Однако целевого уровня снижение КЭД не достигало.
Курсовое введение эритромицина и азитромицина вызывало
существенное улучшение микроциркуляции до 381,9±16,6 и 362,1±16,7
перфузионных единиц соответственно, что было достоверно выше, чем у
беременных самок с гестозом (p<0,05), и статистически не отличалось от
значений микроциркуляции у интактных беременных крыс. Кроме этого,
происходило снижение белка в моче до уровня интактных животных
(рисунок 2.11).
Введение эритромицина и азитромицина вызывало улучшение NOсинтезирующей функции эндотелия, что выразилось в увеличение уровня
28
нитрит-ионов в плазме крови под действием эритромицина и в статистически
достоверном увеличение экспрессии eNOS под действием обоих препаратов
(рисунок 2.12).
150,5±2,3y
2
1,5
1
0,5
20
0
0
Интактные
3,12±0,17*
180,8±11,1*
2,5
L-NAME
Эритромицин
Интактные
Азитромицин
L-NAME
Эритромицин
1,82±0,09y
40
3
1,88±0,16y
60
ДАД
1,1±0,11y
80
3,5
САД
107,7±4,8y
100
132,6±6,7*
120
145,0±5,0*
АД, мм рт. ст.
140
92,0±2,1y
160
134,5±2,3y
180
186,3±7*
КЭД
200
Азитромицин
2,5
450
400
0
0
Интактные
L-NAME
Эритромицин
Интактные
Азитромицин
L-NAME
Эритромицин
0,79±0,11у
0,5
50
0,96±0,06у
1
2,04±0,22*
1,5
0,93±0,06у
100
Протеинурия, г/л
150
362,1±16,7y
200
381,9±16,6y
250
218,3±13,7*
300
2
446,3±27,5y
Микроциркуляция, ПЕд
350
Азитромицин
Примечания: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
- р<0,05 по сравнению с группой беременных животных, получавших L-NAME.
Рисунок 2.11 – Влияние эритромицина (30 мг/кг) и азитромицина (30 мг/кг) на
значения АД, КЭД, микроциркуляцию в плаценте и протеинурию при коррекции
ADMA-подобного гестоза.
Y
2,50
120
40
20
0,00
Интактные
L-NAME
105,4±4,2y
60
68,5±3,3*
80
113,2±5,1y
eNOS, %
1,48±0,10*
1,84±0,17y
0,50
1,28±0,08*
1,00
2,28±0,11y
NOx, мкмоль/дЛ
1,50
117,0±3,6y
100
2,00
Эритромицин
0
Азитромицин
Интактные
L-NAME
Эритромицин
Азитромицин
Примечание: *- р<0,05 в сравнении с интактными крысами; Y- р<0,05 в сравнении с
группой животных, получавших L-NAME.
Рисунок 2.12 – Влияние эритромицина (30 мг/кг) и азитромицина (30 мг/кг)на
концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS в эндотелии при коррекции
ADMA-подобного гестоза.
29
При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен
протективный эффект эритромицина и азитромицина. В сосудах почек у
животных, получавших L-NAME на фоне лечения эритромицином и
азитромицином, картина отличалась от контрольной группы беременных крыс.
Наиболее выраженный положительный эффект от проводимой терапии
наблюдался в группе животных с использованием азитромицина. Мелкие
артерии коркового вещества почки с умеренными признаками гипертрофии
мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные
мембраны незначительно утолщены, симптом «проволочных петель»
отсутствует. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество
клеток на клубочек составило 39,40±2,74 и 39,30±2,55 соответственно (в норме
40,70±3,80).
Морфологическое исследование плаценты при коррекции эритромицином
и азитромицином L-NAME-индуцированного гестоза выявило однотипность
гистологической картины в обеих группах, но более положительные явления
выявлены у животных группы, получавшей азитромицин. Плацента без
патологических изменений, ворсины и интервиллезные пространства
полнокровны. Имеются признаки ишемии плаценты функционального
характера. На внешней поверхности плаценты наблюдались отложения
фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических
показателей
и
результаты
иммуногистохимического
исследования
представлены в таблице 2.9, из которой следует, что эритромицином и
азитромицином достоверно снижали интегральную оценку в баллах (3-4) по
сравнению с ADMA-подобным гестозом и повышали экспрессию eNOS в
эндотелии сосудов плаценты.
Таблица 2.9 – Влияние эритромицина и азитромицина на комплекс
патоморфологических изменений и экспрессию eNOS в плаценте при
моделировании ADMA-подобного гестоза (n=10).
№
Серия экспериментов
Комплексная
Экспрессия eNOS
п/п
оценка в баллах
в плаценте, %
1
Интактные беременные самки
0-1
5,4±0,21
2
L-NAME-индуцированный гестоз
5-6*
0,04±0,01*
3
L-NAME + эритромицин (30 мг/кг)
3-4*
3,77±0,12*
4
L-NAME + азитромицин (30 мг/кг)
3*
4,28±0,21*
Примечание. * - р<0,05 в сравнении с интактными беременными самками.
Таким образом, эритромицин и азитромицин в дозе 30 мг/кг проявляли
отчетливое эндотелиопротективное действие на модели L-NAMEиндуцированного гестоза, что выражалось в снижении коэффициента
эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, улучшении
микроциркуляции в плаценте, а также в уменьшении снижения экспрессии
eNOS на фоне полного предотвращения протеинурии. Кроме этого,
азитромицин проявлял умеренное гипотензивное действие, эритромицин
уменьшал падение стабильных метаболитов NOх в плазме крови.
30
Морфологические исследования обнаружили уменьшение под влиянием
эритромицина и азитромицина в указанных дозах развития нарушений в почках
и ишемических изменений в плаценте, не достигающих повреждения структур.
2.5 Исследование эффективности Витамина B9,
сочетанного применения витаминов B9 и В6, витаминно-минеральных
комплексов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит®
триместрум 3 триместр» при ADMA-подобном гестозе
Введение исследуемых препаратов: фолиевой кислоты, сочетания
фолиевой кислоты и витамина В6, поливитаминно-минеральных комплексов
«Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр»
не оказывало сколь-нибудь значимого влияния на артериальное давление на
фоне моделируемого экспериментального ADMA-подобного гестоза (рисунок
2.13).
КЭД
0,5
0
КТр3Тр
400
100
357,7±37,3y
284,4±10,4y
150
316,4±17,4y
218,3±13,7*
200
389,3±27,3y
446,3±27,5y
350
B6+B9
2,0±0,1y
2,1±0,08y
КТр2Тр
КТр3Тр
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,4
0,2
0
B9
2
0,6
50
L-NAME
1,33±0,06у
450
Интактные
1,41±0,07у
КТр2Тр
1,66±0,11*
B6+B9
1,69±0,15*
B9
2,04±0,22*
L-NAME
Протеинурия, г/л
ПЕд
2,69±0,22*
0
Интактные
250
2,10±0,1y
1
1,1±0,11y
1,5
20
300
3,12±0,17*
182,1±5,1*
180,9±5,0*
170,2±7,2*
2,5
0,93±0,06у
40
3
121,3±5,0*
60
92,0±2,1y
80
3,5
САД
ДАД
2
138,9±6,1*
100
133,2±5,8*
120
137,1±7,6*
140
188,2±7,4*
186,3±7*
160
145,0±5,0*
180
134,5±2,3y
АД мм рт. ст.
200
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
0
Интактные
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
Интактные
®
L-NAME
B9
Примечание: КТр2Тр - «Компливит триместрум 2 триместр»; КТр3Тр - «Компливит®
триместрум 3 триместр»; *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой беременных животных, получавших L-NAME.
Рисунок 2.13 – Влияние витамина B9 (0,2мг/кг), сочетанного применения витаминов B9
(0,2 мг/кг) и В6 (2 мг/кг), препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» (0,084
таб./кг) и «Компливит® триместрум 3 триместр» (0,084 таб./кг) на АД, КЭД,
микроциркуляцию в плаценте и протеинурию при коррекции ADMA-подобного
гестоза.
31
Введение фолиевой кислоты в монотерапии не приводило к коррекции
КЭД. Введение фолиевой кислоты в сочетании с витамином В6, а также обоих
поливитаминно-минеральных комплексов приводило к улучшению функции
эндотелия, что выразилось в статистически значимом снижении КЭД.
Улучшение микроциркуляции в плаценте происходило во всех
исследуемых группах (рисунок 2.13).
Использование витаминно-минеральных комплексов «Компливит®
триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» у
беременных животных с моделированием L-NAME-индуцированного
гестоза статистически достоверно уменьшало количество белка в моче,
доводя его значение в последней группе животных до значения
интактных животных. Использование фолиевой кислоты и сочетания
фолиевой кислоты и витамина В 6 не приводило к статистически
значимому снижению протеинурии на данной модели патологии
(рисунок 2.13).
Исследование влияния витамина B9, сочетанного применения витаминов
B9 и В6, препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит®
триместрум 3 триместр» на NO-синтезирующую функцию эндотелия при
коррекции ADMA-подобного гестоза показало, что использование
поливитаминно-минеральных препаратов «Компливит® триместрум 2
триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» статистически значимо
повышало концентрацию нитрит-ионов (рисунок 2.14). Введение фолиевой
кислоты и сочетания ее с витамином В6 не приводило к статистически
значимому повышению концентрации нитрит-ионов в плазме крови у
животных с ADMA-подобным гестозом.
2,50
eNOS, %
120
2,00
100
84,8±3,5y
82,8±3,7y
63,4±3,5*
60,6±3,3*
40
68,5±3,3*
60
113,2±5,1y
1,69±0,1y
1,61±0,06y
1,40±0,06*
1,38±0,07*
0,50
1,28±0,08*
1,00
2,28±0,11y
NOx, мкмоль/дЛ
80
1,50
20
0
0,00
Интактные
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
Интактные L-NAME
КТр3Тр
B9
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
Примечании: КТр2Тр - «Компливит® триместрум 2 триместр»; КТр3Тр «Компливит® триместрум 3 триместр»; *- р<0,05 в сравнении с интактными
беременными крысами; Y- р<0,05 в сравнении с группой беременных животных,
получавших L-NAME.
Рисунок 2.14 – Влияние витамина B9 (0,2 мг/кг), сочетанного применения витаминов
B9 (0,2 мг/кг) и В6 (2 мг/кг), препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» (0,084
таб./кг) и «Компливит® триместрум 3 триместр» (0,084 таб./кг) на концентрацию NOx
в плазме крови и экспрессию eNOS при коррекции ADMA-подобного гестоза.
32
Динамика показателей экспрессии eNOS при применении описываемых в
этой главе препаратов носила тот же характер, что и концентрация стабильных
метаболитов NO (рисунок 2.14). Отмечалось статистически значимое
увеличение показателей экспрессии еNOS только в группах животных,
получавших поливитаминно-минеральные препараты «Компливит® триместрум
2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр».
При морфологическом исследовании почек и плаценты было выявлено,
что введение фолиевой кислоты и ее комбинации с витамином В6 не приводило
у улучшению гистологической картины в почках и плаценте. При введении
витаминно-минеральных комплексов «Компливит® триместрум 2 триместр» и
«Компливит® триместрум 3 триместр» отмечалась умеренно выраженная
положительная динамика как в почках, так и в плаценте (таблица 2.10). Кроме
этого, происходило повышение экспрессии eNOS в эндотелии сосудов
плаценты.
Таблица 2.10 – Влияние витамина B9, сочетанного применения витаминов B9 и
В6, препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит®
триместрум 3 триместр» на комплекс патоморфологических изменений и
экспрессию eNOS при коррекции ADMA-подобного гестоза (n=10).
№
п/п
1
2
3
4
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
0-1
5-6*
5-6*
5-6*
Экспрессия eNOS
в плаценте, %
5,4±0,21
0,04±0,01*
0,04±0,01*
0,03±0,01*
Интактные беременные самки
L-NAME
L-NAME + B9 (0,2 мг/кг)
L-NAME + B9 (0,2 мг/кг)+
B6 (2 мг/кг)
5
L-NAME +КТр2Тр (0,084 таб./кг)
4*
2,02±0,12*
6
L-NAME +КТр3Тр (0,084 таб./кг)
4*
1,83,±0,21*
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками.
Таким образом, приведенные данные исследования указывают на то, что
минимальные протективные свойства были выявлены при использовании
фолиевой кислоты в монотерапии и при сочетанном ее применении с
витамином В6. Выраженность положительных эффектов от применения
поливитаминно-минеральных препаратов «Компливит® триместрум 2
триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» носила значимый характер
и проявилась в улучшении функции эндотелия, увеличении показателей
микроциркуляции в плаценте и повышении NO-синтезирующей функции
эндотелия,
снижении
протеинурии
и
положительной
динамике
морфологической картины в почках и плаценте.
33
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Итоги выполненного исследования
Анализируя в сравнительном аспекте полученные данные с
использованием
в
качестве
критерия
интегральный
показатель
морфологических изменений, нужно отметить, что наиболее эффективным
оказалось использование фармакологических агентов, влияющих на путь Lаргинин – NO – цГМФ (таблица 3.1). Это можно объяснить непосредственным
воздействием на основные звенья патогенеза (рисунок 3.1). Кроме этого,
особого внимания заслуживают данные, полученные при коррекции
экспериментального гестоза короткими эпизодами ишемии-реперфузии и
рекомбинантного эритропоэтина. В клинической ситуации, где значительно
возрастает роль ишемических явлений в плаценте, их применение будет более
актуальным.
Менее
выраженные
терапевтический
эффект
макролидов
и
поливитаминно-минеральных комплексов объясняется их влиянием на часть
опосредованных звеньев патогенеза. Однако это нисколько не уменьшает
значимости проведенного исследования. Обе эти группы препаратов не могут
рассматриваться как препараты выбора при целенаправленном лечении гестоза,
но наличие у них данного плейотропного эффекта повышает актуальность
сбалансированного витаминного рациона при беременности, а в случае
необходимой антибиотикотерапии для макролидов становится немаловажным
свойством в пользу их выбора.
Таблица 3.1 – Интегральная оценка комплекса патоморфологических
изменений в почках и плаценте при коррекции ADMA-подобного гестоза
(n=10).
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
Интактные беременные самки
0-1
L-NAME
5-6*
L-NAME + тетрагидробиоптерин (10 мг/кг)
2-3*
L-NAME + ZB49-0010 (5 мг/кг)
2*
L-NAME + тадалафил (0,9 мг/кг)
3*
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10)
2-3*
L-NAME + рекомбинантный эритропоэтин (50 МЕ/кг)
3*
L-NAME + эритромицин (30 мг/кг)
3-4*
L-NAME + азитромицин (30 мг/кг)
3*
L-NAME +КТр2Тр (0,084 таб./кг)
4*
L-NAME +КТр3Тр (0,084 таб./кг)
4*
Примечание: * - p<0,05 в сравнении с интактными беременными самками.
В заключение нужно отметить, что результаты проведенной работы дают
экспериментальное обоснование новых подходов профилактики и лечения
гестоза фармакологическими средствами, направленными на преодоление или
компенсацию ADMA-обусловленного ингибирования NO-синтезирующей
34
функции эндотелия, а также активацию биологических процессов, лежащих в
основе
механизма
положительных
эффектов
ишемического
прекондиционирования.
НЕБЛАГОПРИЯТНЫЕ
ВНЕШНИЕ ФАКТОРЫ
ДИСАНГИОГЕНЕЗ
Нарушение синтеза и
функции факторов
роста, усиление
апоптоза
Нарушение инвазии
трофобласта,
незрелость
спиральных артерий
Стресс, авитаминозы,
гиперхолистеринеми
я ожирение,
интоксикации
Повреждение
клеточных структур
ИШЕМИЯ
ТРОФОБЛАСТА
ОКСИДАТИВНЫЙ
СТРЕС
Образование перекисных
радикалов
Макролиды
Ингибирование еNOS,
недостаток NO
Короткие эпизоды
ишемии-реперфузии
Выделение ET-1,
TNF-α
Спазм сосудов
Ингибирование DDAh
Тадалафил
Нарушение
синтеза NO
ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ
ДИСФУНКЦИЯ
Гипергомоцистеинемия
Повышение чувствительности к ренину
ADMA,
DDMA
ZB49-0010
тетрагидробиоптерин
Гиповитаминоз
В9, В12
Рисунок 3.1 – Современные представления о патогенезе гестоза и точки приложения
механизма действия исследуемых подходов его коррекции.
35
Практические рекомендации
С целью повышения здоровья населения целесообразно проведение
доклинических и клинических исследований коррекции морфофункциональных
нарушений при гестозе препаратами, улучшающими функцию эндотелия в
сочетании с препаратами, входящими в стандартную терапию.
Продолжить исследования коррекции морфофункциональных нарушений
при гестозе методами, направленными на активацию биологических процессов,
протекающих при ишемическом прекондиционировании.
Провести клиническое исследование коррекции гестоза эритропоэтином в
неэритропоэтических дозах и провести ретроспективный анализ коррекции
анемии эритропоэтином на фоне гестоза.
Рекомендуется провести клиническое исследование и ретроспективный
анализ случаев терапии инфекционной патологии на фоне гестоза
антибиотиками из группы макролидов.
Рекомендовать
поливитаминно-минеральные
комплексы
всем
беременным женщинам с целью профилактики гестоза и включать их в
комплексную терапию при его лечении.
Использовать полученные результаты для поиска новых лекарственных
препаратов для профилактики и лечения гестоза, в механизме действия которых
будут лежать коррекция функции эндотелия, снижение выделения
провосполительных гуморальных факторов и активация биологических
процессов, протекающих при ишемическом прекондиционировании.
Полученные данные использовать в учебном процессе кафедр
фармакологи, клинической фармакологии и акушерства и гинекологии.
Перспективы дальнейшей разработки темы
Очевидными перспективами дальнейшей разработки темы являются
исследования, посвященные поиску лекарственных препаратов для
профилактики и лечения гестоза, направленных на преодоление ADMAингибирующего влияния на eNOS.
Проведение комплекса исследований коррекции морфофункциональных
нарушений при гестозе фармакологическими агентами активирующими АТФзависимые К+ каналы, такие как, никорондил, эритропоэтин и резвератрол для
расширения спектра лекарственных препаратов для его терапии.
Не менее перспективным направлением является поиск лекарственных
препаратов лечения и профилактики гестоза, направленных на уменьшение
оксидативного стресса и снижение образование молекул адгезии.
36
ВЫВОДЫ
1. Комплексный анализ функциональных, биохимических
и
морфологических показателей при моделировании различных видов патологии
беременных с использованием результатов функциональных проб, данных
ЛДФ-метрии плацентарной микроциркуляции, значений биохимических
маркеров и результатов морфологического исследования плаценты и почек
показало, что наиболее приближенной к гестозу второй половины
беременности является ADMA- подобная модель.
2. Назначение кофактора еNOS тетрогидробиоптерина (10 мг/кг) с 14 по
20 день беременности приводит к выраженной коррекции патологических
изменений при экспериментальном ADMA-подобном гестозе. Наблюдается
восстановление взаимоотношения эндотелийзависимой вазорелаксации,
улучшение микроциркуляции в плаценте, восстановление NO-синтезирующей
функции эндотелия, уменьшении протеинурии, снижение артериального
давления. При морфологическом исследовании гистологическая картина в
почках и плацентарной ткани приближается к таковой в группе интактных
животных.
3. Использование селективного ингибитора аргиназы 2 ZB49-0010 (5
мг/кг) с 14 по 20 день беременности приводит к выраженной коррекции
патологических изменений при экспериментальном ADMA-подобном гестозе,
выражающейся в восстановлении взаимоотношения эндотелийзависимой и
эндотелийнезависимой вазодилятации, улучшении микроциркуляции в
плаценте,
восстановление
NO-синтезирующей
функции
эндотелия,
уменьшении протеинурии, снижении артериального давления и нормализации
гистологической картины в почках и плацентарной ткани.
4. Введение тадалафила (0,9 мг/кг/сут) приводит к статистически
достоверному
гипотензивному
эффекту,
достоверному
улучшению
взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой реакций,
повышению микроциркуляции в плаценте, снижению протеинурии,
устранению выраженных деструктивных явлений ишемического генеза и
уменьшает нарушения функционального характера в плацентарной ткани и
почках.
5. При коррекции ADMA-подобного гестоза воспроизведение
однократного 10-минутного эпизода ишемии-реперфузии на 21 сутки
беременности за 90 минут до проведения функциональных проб приводит к
статистически значимому улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и
эндотелийнезависимой реакций и повышению микроциркуляции в плаценте.
Воспроизведение 10 10-минутных эпизодов ишемии-реперфузии с 10 по 20
сутки беременности приводит к умеренному гипотензивному эффекту,
статистически значимому улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и
эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте,
снижению протеинурии, повышению NO-синтезирующей функции эндотелия,
улучшению гистологической картины в почках и плацентарной ткани.
37
Ингибирование iNOS или блокада АТФ-зависимых К+ каналов снимает эффект
прекондиционирования.
6.
Фармакологическое
прекондиционирование
рекомбинантным
эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг однократно на 7, 10, 13, 16, 19 сутки
беременности на фоне моделирования ADMA-подобного гестоза вызывает
умеренный, статистически достоверный гипотензивный эффект, улучшение
взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой реакций,
повышение микроциркуляции в плаценте, повышение активности eNOS,
снижение протеинурии, улучшение гистологической картины в почках и
плацентарной ткани, которая приближается к группе интактных беременных
животных.
7. Введение эритромицина (30 мг/кг/сут) и азитромицина
(30 мг/кг/сут) с 14 по 20 сутки беременности приводит к статистически
достоверному
улучшению
взаимоотношения
эндотелийзависимой
и
эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте,
снижению протеинурии, статистически достоверному повышению экспрессии
eNOS, устранению выраженных деструктивных явлений ишемического генеза и
некоторому уменьшению нарушений функционального характера. Под
влиянием эритромицина происходит увеличение концентрации конечных
метаболитов в плазме, под влиянием азитромицина наблюдался умеренный
гипотензивный эффект.
8. При использовании поливитаминно-минеральных комплексов
«Компливит® триместрум 2 триместр» (0,084 таб./кг/сут) и «Компливит®
триместрум 3 триместр» (0,084 таб./кг/сут) происходит коррекция
морфофункциональных нарушений в условии ADMA-подобного гестоза. Их
введение приводит к улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и
эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте,
снижению протеинурии, статистически достоверному увеличению показателей
NO-синтезирующей функции эндотелия, уменьшению выраженности
деструктивных явлений ишемического генеза в почках и плаценте.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Моделирование L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / А.А.
Барсук, В.В. Гуреев, М.В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы
фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф.
В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. –
С. 104-105.
2.
Использование L-аргинина в профилактике развития L-NAMEиндуцированного гестоза в эксперименте / В.В. Гуреев, А.А. Барсук,
Е.В. Проскурякова [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации :
сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию
КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. – С. 165.
3.
Комбинированное использование L-аргинина и амлодипина в
коррекции L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / М.В. Покровский, Г.А.
38
Лазарева, А.А. Барсук, В.В. Гуреев [и др.] // Актуальные вопросы
фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф.
В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. –
С. 289-290.
4.
Использование
амлодипина
в
коррекции
L-NAMEиндуцированного гестоза крыс / Е.В. Проскурякова, А.А. Барсук, В.В. Гуреев [и
др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч.
конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. – Курск : Издво КГМУ, 2009. – С. 304-305.
5.
Гуреев, В.В. Коррекция резвератролом ADMA-подобного гестоза в
эксперименте / В.В. Гуреев, В.И. Кочкаров, Е.В. Проскурякова // Научные
ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина.
Фармация. – 2010. – № 22 (93), вып. 12. – С. 53–57.
6.
Фармакологическая
коррекция
L-аргинином
ADMA-eNOSассоциированных мишеней при экспериментальной преэклампсии /
М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Кубанский научный
медицинский вестник. – 2010. – № 1. – С. 85-92.
7.
Реалии и перспективы фармакологической коррекции ADMA-eNOS
- ассоциированных путей при преэклампсии / М.В. Покровский,
Н.Г. Филиппенко, В.В. Гуреев [и др.] // Рациональная фармакотерапия в
кардиологии. – 2010. – № 6 (6). – С. 882-887.
8.
L-NAME–индуцированный гестоз у крыс / А.А. Барсук,
В.В. Гуреев, М.В. Покровский [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и
лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). – М.,
2010. – С. 575-576.
9.
L-аргинин в профилактике развития L-NAME-индуцированного
гестоза у крыс / В.В. Гуреев, А.А. Барсук, Е.В. Проскурякова [и др.] // XVII Рос.
нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва,
12-16 апр. 2010 г.). – М., 2010. – С. 601-602.
10. Cочетанное использование L-аргинина и амлодипина в коррекции
L-NAME-ндуцированного гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, Г.А.
Лазарева, А.А. Барсук, Е.В. Проскурякова, В.В. Гуреев [и др.] // XVII Рос. нац.
конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16
апр. 2010 г.). – М., 2010. – С. 704.
11. Амлодипин в коррекции L-NAME-индуцированного гестоза крыс /
Е. В. Проскурякова, А. А. Барсук, В. В. Гуреев [и др.] // XVII Рос. нац. конгр.
«Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр.
2010 г.). – М., 2010. – С. 707.
12. Коррекция резверотролом ADMA-подобного гестоза у крыс / О.С.
Полянская, В.В. Гуреев, А.А. Барсук [и др.] // Биотехнология и биомедицинская
инженерия : материалы III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. Участием,
посвящ. 75-летию Курск. гос. мед. ун-та. – Курск : Изд-во КГМУ, 2010. – С.
219-220.
39
13. Фармакологическая коррекция ADMA-eNOS-ассоциированных
мишеней при преэклампсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и
др.] // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 2. – С. 16-20.
14. Пути коррекции NO-дефицитного состояния при патологии
беременных в эксперименте / В.В. Гуреев, М.В. Покровский, О.С. Полянская [и
др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер.
Медицина. Фармация. – 2011. – № 4 (99), вып. 13/2. –
С. 40–43.
15. Влияние L-аргинина, витамина В6 и фолиевой кислоты на
показатели эндотелиальной дисфункции и микроциркуляции в плаценте при
моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота /
М.В. Покровский, О.О. Новиков, В.В. Гуреев [и др.] // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – Т. 152, № 7. – С. 77-80.
16. Arginase Inhibitor in the Pharmacological Correction of Endothelial
Dysfunction / M.V. Pokrovskiy, M.V. Korokin, V.V. Gureev [et al.] // International
Journal of Hypertension. – 2011. – Vol. 2011. – Article ID 515047, doi:
10.4061/2011/515047.
17. Коррекция L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте с
помощью L-норвалина / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, И.В. Медведев [и др.] //
Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф.
студентов и молодых ученых с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.).
– Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – С. 291-292.
18. Коррекция микроциркуляции в плаценте с помощью дистантного
прекондиционирования
при
ADMA-подобной
модели
гестоза
/
О.С. Полянская, В.В. Гуреев, И.В. Медведев [и др.] // Молодежная наука и
современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых
ученых с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). – Курск: Изд-во
КГМУ, 2011. – С. 292-293.
19. Гуреев, В.В. Эндотелиальная дисфункция – центральное звено в
патогенезе гестоза / В.В. Гуреев // Научные ведомости Белгородского
государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. – 2012. –
№ 4 (123), вып. 17/1. – С. 5–12.
20. Гуреев, В.В. Роль витаминов в коррекции эндотелиальной
дисфункции при экспериментальном гестозе / В.В. Гуреев // Научные
ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина.
Фармация. – 2012. – № 4 (123), вып. 17/1. – С. 120–123.
21. Коррекция экспериментального гестоза препаратами из группы
макролидов / В.В. Гуреев, М.В. Покровский, А.А. Должиков [и др.] // Научные
ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина.
Фармация. – 2012. – № 4 (123), вып. 17/1. – С. 124–127.
22. Коррекция дистантным ишемическим прекондиционированием
эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобном экспериментальном гестозе
/ В.В. Гуреев, М.В. Покровский, А.А. Должиков [и др.] // Научные ведомости
Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. –
2012. – № 4 (123), вып. 17/1. – С. 128–134.
40
23. Коррекция ADMA-подобного гестоза в эксперименте /
В.В. Гуреев, С.А. Алехин, А.А. Должиков, А.С. Мостовой // Курский научнопрактический вестник «Человек и его здоровье». – 2012. – № 1. – С. 14-19.
24. Использование
L-аргинина
в
коррекции
эндотелиальной
дисфункции при экспериментальной преэклампсии / М.В. Покровский,
Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Экспериментальная и клиническая
фармакология. – 2012. – Т. 75, № 2. – С. 14-16.
25. Гуреев, В.В. Коррекция ADMA-подобного гестоза в эксперименте с
помощью ингибитора аргиназы L-норвалина и препаратов, входящих в
стандартную
схему
лечения
/
В.В.
Гуреев,
О.С.
Полянская,
А.А. Должиков // Курский научно-практический вестник «Человек и его
здоровье». – 2012. – № 2. – С. 14-20.
26. Гуреев, В.В. Роль iNOS в коррекции эндотелиальной дисфункции
при ADMA-подобном гестозе короткими эпизодами ишемии-реперфузии в
эксперименте / В.В. Гуреев // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 8, Ч.
2. – С. 298-301.
27. Гуреев, В.В. Роль АТФ-зависимых К+ каналов в коррекции
эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобном гестозе короткими
эпизодами ишемии-реперфузии в эксперименте / В.В. Гуреев [Электронный
ресурс] // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 5,
http://www.science-education.ru/105-7053.
28. Гуреев, В.В. Исследование роли дистантного ишемического
прекондиционирования в коррекции морфофункциональных нарушений
короткими эпизодами ишемии-реперфузии в условии ADMA-подобного гестоза
/ В.В. Гуреев // Курский научно-практический вестник «Человек и его
здоровье». – 2012. – № 3. – С. 5-9.
29. Полянская, О.С. Перспективы использования дистантного
прекондиционирования в коррекции развития ADMA-подобного гестоза у крыс
/ О.С. Полянская, Т.В. Корогодина, В.В. Гуреев // Молодая фармация –
потенциал будущего : материалы II Всерос. науч. конф. студентов и аспирантов
(Санкт-Петербург, 18-19 апр. 2012 г.). – СПб., 2012. – С. 6-7.
30. Полянская, О.С. Коррекция экспериментального гестоза с помощью
ингибитора
аргиназ
L-норвалина
и
ингибитора
фосфодиэстеразы
5 тадалафила / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, О.Ю. Иванова // Успехи
современного естествознания. – 2012. – № 10. – С. 90-91.
31. Полянская, О.С. Исследование влияния коротких эпизодов ишемииреперфузии на течение ADMA-подобного гестоза / О.С. Полянская, В.В.
Гуреев, О.Ю. Иванова // Успехи современного естествознания. – 2012. – № 10. –
С. 94.
32. Гуреев, В.В. Новые подходы к фармакологической коррекции
гестоза : метод. рекомендации / В.В. Гуреев, О.С. Полянская. – Курск : Изд-во
КГМУ, 2012. – 96 с.; ил.
33. Новые подходы коррекции ADMA-подобного гестоза / Гуреев В.В.,
Ступакова Е.Г., Гуреева Е.Г., Гончарова Д.В. // Научные ведомости
41
Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. –
2014. – № 11 (182), вып. 26/1. – С. 157–160.
34. Гуреев, В.В. ADMA – eNOS – детерминированные пути
фармакологической коррекции гестоза / Гуреев В.В., Покровский М.В.,
Корокин М.В. и др. – Белгород : Изд-во БелГУ, 2014.- 265 с.; ил.
35. Remote Ischemic Preconditioning Correction in ADMA-Like Gestosis
Model / Gureev V.V., Alehin S.A., Pokrovskiy M.V. [et al.] // Research Journal of
Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. – 2014. - №5(5). - P. 1095-1098.
36. Коррекция
эндотелиальной
дисфункции
никорандилом,
тетрагидробиоптерином
и
резвератролом
при
моделировании
экспериментального гестоза / Гуреев В.В., Жилинкова Л.А., Ступакова Е.Г. //
Фундаментальные исследования. – 2015. – № 1. – С. 58-62.
37. Correction of ADMA-Induced Preeclampsia with Use of
Tetrahydrobiopterin and Selective Inhibitor of Arginase II ZB49-0010 / Gureev V.V.,
Pokrovskiy M.V., Korokin M.V. [et al.] // Research Journal of Pharmaceutical,
Biological and Chemical Sciences. – 2015. - №6(5). - P. 1538-1541.
38. Correction of ADMA-induced preeclampsia with the use of
phosphodiesterase 5 and selective inhibitor of arginase II ZB49-0010 / Gureev V.V.,
Martynova O.V., Anciferova O.E. [et al.] // Научный результат. Серия: Медицина
и фармация. - 2015. - Т. 1. № 4(6). - С. 66-68.
Патенты РФ на изобретения и полезные модели
1.
Пат. 2449381 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункции L-норвалином при ADMA-подобной модели
гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.] ; заявитель и
патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию». – № 2010144195/14; опубл. 27.04.2012, Бюл. № 12. – 4 с.
2.
Пат. 2453000 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза / М.В.
Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.] ; заявитель и
патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию». – № 2010144193/14; опубл. 10.06.2012, Бюл. № 16. – 4 с.
3.
Пат. 2432618 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза в
эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.] ;
заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию». – № 2010121673/14; опубл. 27.10.2011, Бюл. № 30. –
4 с.
4.
Пат. 2457548 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте поливитаминно-минеральным комплексом при
ADMA-подобной модели гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, В.В.
42
Гуреев, О.С. Полянская [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО
«Курский государственный медицинский университет Министерства
здравоохранения и социального развития Российской Федерации». – №
2011122318/14; опубл. 27.07.2012, Бюл. № 21. – 4 с.
5.
Пат. 2460149 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункции поливитаминно-минеральным комплексом при
ADMA-подобной модели гестоза в эксперименте / М.В. Покровский,
В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО
«Курский государственный медицинский университет Министерства
здравоохранения и социального развития Российской Федерации». –
№ 2011122328/14; опубл. 27.08.2012, Бюл. № 24. – 4 с.
6.
Пат. 2460148 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза в
эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.];
заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации». – № 2011116372/14; опубл. 27.08.2012, Бюл.
№ 24. – 4 с.
7.
Пат. 2462766 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином при ADMAподобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и
др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации». – № 2011116378/14; опубл. 27.09.2012, Бюл.
№ 27. – 4 с.
8.
Пат. 2462253 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте азитромицином при ADMA-подобной модели
гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.];
заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации». – № 2011116308/15; опубл. 27.09.2012, Бюл.
№ 27. – 4 с.
9.
Пат. 2462765 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункции дистантным прекондиционированием при ADMAподобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и
др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации». – № 2011116380/14; опубл. 27.09.2012, Бюл.
№ 27. – 4 с.
10. Пат. 2466462 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте рекомбинантным эритропоэтином при ADMAподобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и
др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет Министерства здравоохранения и социального
43
развития Российской Федерации». – № 2011116371/14; опубл. 10.11.2012, Бюл.
№ 31. – 4 с.
11. Пат. 2481103 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения
микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза в
эксперименте однократным ишемическим эпизодом / М.В. Покровский, В.В.
Гуреев, О.С. Полянская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО
«Курский государственный медицинский университет Министерства
здравоохранения и социального развития Российской Федерации». – №
2011136310/15; опубл. 10.05.2013, Бюл. № 13. – 4 с.
12. Пат. 2507594 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобной модели гестоза в
эксперименте / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров [и др.];
заявитель и патентообладатель Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Белгородский
государственный
национальный
исследовательский
университет». – 2012108543/14; опубл. 20.02.2014, Бюл. № 5. – 4 с.
13. Пат. 2507595 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункции азитромицином при ADMA-подобной модели
гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.И. Кочкаров [и
др.]; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Белгородский
государственный
национальный
исследовательский
университет». – 2012108545/14; опубл. 20.02.2014, Бюл. № 5. – 4 с.
14. Пат. 2543359 Российская Федерация. Способ коррекции
эндотелиальной дисфункуии фармакологическим прекондиционированием
никорандилом при ADMA-подобной модели гестоза в эксперименте / В.В.
Гуреев, М.В. Покровский, О.В. Молчанова [и др.]; заявитель и
патентообладатель Федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего профессионального образования «Белгородский
государственный
национальный
исследовательский
университет».
–
2014109304/15; опубл. 27.02.2015, Бюл. № 6. – 4 с.
15. Пат. 97615 Российская Федерация. Устройство для дистантного
прекондиционирования / О.О. Новиков, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров [и
др.]; заявитель и патенообладатель ГОУ ВПО «Белгородский государственный
университет». – № 2010110708/22; опубл. 20.09.2010, Бюл. № 27. – 4 с.
44
Список сокращений
АД – артериальное давление
АГ – артериальная гипертензия
АХ – ацетилхолин
ДАД - диастолическое артериальное давление
КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции
САД – систолическое артериальное давление
ЧСС – частота сердечных сокращений
цГМФ – циклический гуанозин - монофосфат
ET-1 - эндотелии-1
ADMA – асимметричный диметиларгинин
еNOS – эндотелиальной синтаза оксида азота
iNOS – индуцибельная синтаза оксида азота
L-NAME – NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир
L-NMMA – монометиларгинин
NO – оксид азота
TNF-α – фактор некроза опухоли
45
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа