close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Фотоиндуцированная цитотоксическая активность нетканых материалов на основе хитоза-на содержащих фотосенсибилизатор «ФОТОСЕНС»

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
СЕВЕРЮХИНА АЛЕКСАНДРА НИКОЛАЕВНА
ФОТОИНДУЦИРОВАННАЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
НЕТКАНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА,
СОДЕРЖАЩИХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР «ФОТОСЕНС»
03.01.02 — Биофизика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата
физико-математических наук
Саратов — 2017
Работа выполнена на базе Образовательно-научного института наноструктур
и биосистем ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский
государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»
Научный руководитель:
доктор химических наук, доцент Горин Дмитрий Александрович
Официальные оппоненты:
Директор Физико-технического института ФГБОУ ВО «Саратовский
государственный технический университет имени Гагарина Ю.А.», д.х.н.,
профессор Гороховский Александр Владиленович
Ведущий научный сотрудник лаборатории нанобиотехнологии ФГБУН
ИБФРМ РАН, д.б.н., доцент Богатырев Владимир Александрович
Ведущая организация: ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского»
Защита диссертации состоится «3» апреля 2017 года в 17 часов 30 минут на
заседании диссертационного совета Д 212.243.05 на базе ФГБОУ ВО
«Саратовский
национальный
исследовательский
государственный
университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012 г. Саратов, ул.
Астраханская, д. 83, корпус III, аудитория 34.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени
В.А. Артисевич ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский
государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» и на сайте
http://www.sgu.ru/sites/default/files/dissertation/2016/12/12/2016_12_06_thesis_
severyukhina.pdf
Автореферат разослан « » ________ 2017 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д. ф.-м. н., доцент
Симоненко Георгий Валентинович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы
Передовое направление регенеративной медицины — тканевая
инженерия представляет собой современную инновационную технологию,
целью которой является применение фундаментальных знаний биологии,
медицины и материаловедения для восстановления функций поврежденных
тканей и органов [1]. В ее основе лежит принцип ориентированного
заселения функционально активных клеток на матрицу-носитель (скаффолд),
представляющую собой синтетическую или биологическую систему,
имитирующую функции и свойства внеклеточного матрикса (ВКМ) [Л1].
Нетоксичность, биодеградируемость, механическая прочность, обеспечение
пролиферации и дифференцировки нанесенных клеток являются основными
требованиями, предъявляемыми к таким носителям.
В ряде случаев при создании скаффолдов для тканевой инженерии
возникает необходимость в обеспечении пространственного контроля над
ростом клеток [1–3]. Материалы с такой возможностью могут быть полезны,
например, при стентировании сосудов. Как правило, при создании таких
материалов в качестве модификатора используют антипролиферативные
вещества [4], которые характеризуются неспецифичностью действия и могут
оказывать влияние не только на клетки-мишени, но и на прилежащие
клеточные структуры. Таким образом, для улучшения пространственного
контроля над ростом клеток важно добиться повышения избирательности
действия данных материалов.
Другой важной задачей тканевой инженерии является разработка
раневых покрытий для эффективной антибактериальной терапии.
Существующие материалы представляют собой полимерные матрицы,
содержащие металлические (серебряные, медные, цинковые и др.)
наночастицы или антибиотики. Однако, в связи с резистентностью многих
микроорганизмов к антибиотикам и металлам, а также высокой
токсичностью последних ведется активный поиск альтернативных подходов
к созданию антибактериальных материалов [5,6].
Эффективным способом решения вышеупомянутых проблем является
применение фотодинамического эффекта, в основе которого лежит
цитотоксическое действие синглетного кислорода и других высокоактивных
радикалов, образующихся при поглощении света определенной длины волны
и мощности молекулами фотосенсибилизатора. В биологических системах
синглетный кислород характеризуется чрезвычайно коротким периодом
полураспада (< 0,4 мкс) и радиусом действия (~ 0,1 мкм), что обуславливает
локализованность его цитотоксического действия. Кроме того, синглетный
кислород и другие АФК взаимодействуют с клетками неселективно и,
следовательно, не способствуют развитию резистентности бактерий. В связи
с этим метод успешно применяется не только при лечении целого ряда
онкологических заболеваний, атеросклероза, неоваскуляризации роговицы в
3
офтальмологии, но также является перспективным методом борьбы с
антибиотикорезистентностью микроорганизмов.
Благодаря уникальному набору свойств полимерные нановолокна,
полученные методом электроформования, отлично зарекомендовали себя в
качестве скаффолдов для тканевой инженерии и раневых покрытий, а также
многих других отраслей биомедицины. Электроформование представляет
собой наиболее производительный и эффективный способ получения
волокон диаметром от нескольких десятков нанометров до нескольких
микрон из полимерных растворов под действием поля высокой
электрической напряженности. Волокнистые материалы, полученные
методом
электроформования,
характеризуются
высокой
удельной
поверхностью и пористостью с субмикронным диаметром пор, а также
хорошей паропроницаемостью. Кроме того, возможно получение волокон из
широкого
спектра
полимеров
(включая
биосовмеcтимые
и
биодеградируемые), а также модификация, функционализация и создание
волокон, чувствительных к внешним стимулам, путем включения различных
добавок (наночастиц металлов или их оксидов, фотосенсибилизаторов и др.)
На основании вышеизложенного, создание волокнистого материала с
добавлением фотосенсибилизатора методом электроформования может
решить проблему дистанционного пространственного контроля над ростом
клеток. Такой скаффолд может одновременно выполнять две функции: 1)
поддерживать адгезию и пролиферацию клеточных культур; 2) обеспечивать
дистанционно управляемый и локализованный цитотоксический эффект под
действием света определенной длины волны и мощности. Данный материал
также может найти применение в качестве раневого покрытия с
фотоиндуцированной антибактериальной активностью для терапии
длительно незаживающих ран. При этом модификация поверхности
нетканого материала плазмонно-резонансными наночастицами позволит
проводить мониторинг биохимических процессов, протекающих при
заселении клетками ВКМ или регенерации ран, в режиме реального времени
посредством спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния света.
Цель работы и задачи исследования
Цель
диссертационной
работы
состояла
в
реализации
индуцированного световым воздействием цитотоксического эффекта с
управляемой пространственной локализацией с помощью нетканых
материалов, содержащих в своем составе фотосенсибилизатор «Фотосенс»
(ФС).
Для достижения данной цели решались следующие задачи:
1. Получение нетканых материалов на основе хитозана с различным
содержанием фотосенсибилизатора.
2. Изучение кинетики высвобождения фотосенсибилизатора из нановолокон
хитозана.
3. Исследование биосовместимости нетканых материалов на основе хитозана
с различным содержанием фотосенсибилизатора в отсутствие светового
4
воздействия на примере нормальных (остеобласты мыши MC3T3-E1) и
раковых (клетки рака молочной железы T-47D) клеточных линий.
4. Оценка индуцированной световым воздействием цитотоксичности
нетканых
материалов
на
основе
хитозана
с
содержанием
фотосенсибилизатора на примере нормальных (остеобласты мыши
MC3T3-E1) и раковых (клетки рака молочной железы T-47D) клеточных
линий.
5. Демонстрация возможности дистанционного пространственного контроля
над ростом нормальных (остеобласты мыши MC3T3-E1) и раковых (клетки
рака молочной железы T-47D) клеточных линий.
6. Подтверждение фотоиндуцированной антибактериальной активности
нетканых
материалов
на
основе
хитозана
с
содержанием
фотосенсибилизатора на примере бактериального штамма Staphylococcus
aureus.
7. Получение нетканого материала на основе хитозана с поверхностью,
модифицированной
плазмонно-резонансными
наночастицами,
для
применения в качестве платформы гигантского комбинационного
рассеяния света.
Научная новизна исследования
1. Показана возможность создания методом электроформования нетканых
материалов с различным содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс»
(1%, 2.5%, 5% в сух. веществе).
2. Изучен механизм высвобождения фотосенсибилизатора «Фотосенс» из
нановолокон хитозана в дистиллированной воде и фосфатно-солевом
буфере (pH=7,4).
3. Подтверждена цитотоксичность нетканых материалов с содержанием
фотосенсибилизатора на примере различных клеточных культур (MC3T3E1 – остеобласты мыши, T-47D – клетки рака молочной железы) под
действием светового излучения.
4. Показана возможность дистанционного пространственного контроля над
ростом клеток (MC3T3-E1 – остеобласты мыши, T-47D – клетки рака
молочной железы) под действием светового излучения.
5. Показана фотоиндуцированная антибактериальная активность полученных
нетканых материалов на примере бактериальном штамме Staphylococcus
aureus.
6. Разработана методика получения нетканых материалов на основе хитозана
с
поверхностью,
модифицированной
плазмонно-резонансными
наночастицами, для применения в качестве платформ гигантского
комбинационного рассеяния света.
Практическая значимость работы
В настоящей работе показана возможность получения методом
электроформования чувствительных к световому воздействию нетканых
5
материалов
на
основе
хитозана
с
различным
содержанием
фотосенсибилизатора «Фотосенс». Такие материалы сочетают в себе
преимущества фотодинамической терапии, а также волокнистых раневых
покрытий и скаффолдов для тканевой инженерии и могут одновременно
выполнять две функции: 1) поддерживать адгезию и пролиферацию
клеточных культур; 2) обеспечивать дистанционно управляемый и
локализованный цитотоксический эффект под действием света определенной
длины волны и мощности. Кроме того, описан способ получения платформ
гигантского комбинационного рассеяния света на основе нетканых
материалов с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными
наночастицами.
Достоверность полученных результатов
Достоверность полученных результатов подтверждается применением
научного оборудования, которое верифицируется в соответствии с
международными стандартами обеспечения единства измерений и
единообразием средств измерений, воспроизводимостью экспериментальных
данных, а также использованием математико-статистических методов
обработки результатов.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Высвобождение фотосенсибилизатора «Фотосенс» из нетканого материала
на основе хитозана проходит в два этапа: первый этап характеризуется
аномально-диффузным поведением и длится в течение 9-10 часов в
фосфатно-солевом буфере и 20 часов в дистиллированной воде,
последующий выход красителя обусловлен кинетическими процессами,
подчиняющимися законам Фика.
2. Фотоиндуцированная цитотоксическая активность нетканого материала на
основе хитозана, содержащего препарат «Фотосенс», подтверждена в
отношении штамма Staphylococcus aureus посредством дискодиффузионного метода. Показано, что средний диаметр зоны задержки
роста бактерий (с учетом диаметра самого диска нетканого материала)
составил около 50 % от диаметра области облучения светодиодным
источником (λ=660±15 нм, 48 мВт, 4 Дж/см2) и 35 % от диаметра области
высвобождения фотосенсибилизатора в агар.
3. Показана реализация дистанционного и локализованного контроля над
ростом клеток (остеобластов мыши MC3T3-E1, клеток рака молочной
железы T-47D), инкубированных совместно с образцами нетканого
материала на основе хитозана, содержащего препарат «Фотосенс», под
действием светодиодного излучения (λ=660±15 нм, 70 мВт, 2кДж/см2),
попадающего в полосу поглощения фотосенсибилизатора.
6
Апробация работы
Основные результаты диссертационного исследования были
представлены на Ежегодной Всероссийской научной школе-семинаре
«Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2011» в
программе «У.М.Н.И.К.» (Саратов, 2011, устный доклад, победитель
конкурса); в ходе работы II международного семинара «Smart nanocomposite
scaffold for tissue engineering» (Саратов, 2012, устный доклад); на Ежегодной
Всероссийской
научной
школе-семинаре
«Методы
компьютерной
диагностики в биологии и медицине-2013» (Саратов, 2013, устный доклад);
на IV международном семинаре «Nanoparticles, nanostructured coatings and
microcontainers: technology, properties, applications» (Берлин, 2013, устный
доклад);
в
ходе
работы
III
Международной
конференции
«Супрамолекулярные системы на поверхности раздела» - «Супраз-2013»
(Туапсе, 2013, диплом III степени за устный доклад); на Международной
конференции «Saratov Fall Meeting-2013», 1st International Symposium on
Optics and Biophotonics: Optical Technologies in Biophysics & Medicine XV
(Саратов, 2013, постер); на V международном семинаре «Nanoparticles,
nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications»
(Гент, 2014, устный доклад, постер, победитель постерной секции); на VIII
международном симпозиуме «Molecular Order and Mobility in Polymer
Systems» (Санкт-Петербург, 2014, устный доклад), на VI международном
семинаре «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers:
technology, properties, applications» (Саратов, 2015, устный доклад, диплом III
степени за устный доклад), а также на семинарах научной группы и кафедры
Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского в
течение всего периода обучения в аспирантуре.
Конкурсная поддержка работы
Финансовая поддержка работы, представленной в диссертации,
осуществлялась при помощи следующих проектов: «Разработка технологии
создания функциональных раневых покрытий из полимерных нановолокон»
в рамках программы «У.М.Н.И.К.» (НИОКР № 9928р/14246 от 11.01.2012);
«Дистанционно
управляемые
наноструктурированные
материалы,
включающие биосенсоры и инкапсулированные биоактивные вещества»
(грант
РФФИ
№
12-03-33088);
«Дистанционно
управляемые
наноструктурированные системы для адресной доставки и диагностики»
(грант Правительства Российской Федерации № 2013-220-04-014);
«Комплексное
математическое
моделирование
бескапиллярного
электроформования нановолокон и экспериментальное исследование
процесса создания нановолокнистых материалов» (грант РФФИ в рамках
научного проекта № 12-01-31349-мол_а_2012); «Исследование переноса
заряда и спектров поглощения и фотолюминесценции в упорядоченных
системах «наночастицы в органической матрице» и разработка физикотехнологических основ для создания элементной базы молекулярной
электроники» (гранта Российского научного фонда №14-12-00275);
7
«DINaMIT» по программе Marie Curie International Research Staff Exchange
Scheme (FP7-PEOPLE-2013-IRSES), в рамках которого осуществлялись
научные стажировки в университетской клиникой «Charité» (г. Берлин), а
также при поддержке гранта Правительства Российской Федерации
«Дистанционно управляемые наноструктурированные системы для адресной
доставки и диагностики» (договор №14.Z50.31.0004 от 4 марта 2014).
Личный вклад диссертанта заключается в самостоятельном выполнении
представленных в диссертационной работе экспериментальных исследований
и расчетов, включая получение нетканых материалов, а также проведение
экспериментов по характеризации образцов, экспериментов in vitro и анализа
литературы по соответствующей тематике. Постановка задач исследования и
обсуждение результатов проведены под руководством профессора
Д. А. Горина. При использовании результатов, полученных в соавторстве,
приведены ссылки на соответствующие источники.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи –
в рецензируемых научных изданиях, 5 статей – в трудах российских и
международных конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и списка
цитируемой литературы, состоящего из 175 наименований. Материалы
работы изложены на 105 страницах машинописного текста и включают 23
рисунка, 4 таблицы и 22 формулы.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении кратко описана актуальность темы исследования,
раскрыта научная новизна работы, ее научно-практическая значимость, а
также определены основные цели и задачи.
В первой главе представлен аналитический обзор литературы,
посвященный технологии электроформования и истории ее развития,
основным стадиям процесса и его теоретическим основам. Рассмотрены
влияние технологических параметров процесса электроформования на
характеристики нетканых материалов, а также методы управления их
свойствами. Описаны биомедицинские приложения нетканых материалов,
полученных методом электроформования, а также возможность их
применения в качестве платформ гигантского комбинационного рассеяния
света. Подробно рассмотрены особенности создания нетканых материалов на
основе хитозана – одного из самых распространённых полимеров
биомедицинского назначения. Также описаны физико-химические
механизмы и принцип фотодинамической терапии. Рассмотрено применение
фотодинамического эффекта как альтернативного подхода для борьбы с
антибиотикорезистентностью микроорганизмов. Особое внимание уделено
8
описанию нетканых материалов, содержащих в своем составе
фотосенсибилизаторы. В завершении рассмотрены подходы к описанию
кинетики высвобождения биологически активных веществ из полимерных
матриц.
Во второй главе описаны использованные материалы, методы
получения и исследования нетканых материалов, характеристики
оборудования, приведены математические методы обработки данных и
статистические оценки.
Третья глава посвящена исследованию морфологических и
оптических характеристик образцов нетканых материалов на основе хитозана
с различным содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс» (0%, 1%, 2.5% и
5%, далее для краткости – ФС 0%, ФС 1%, ФС 2.5%, ФС 5%), полученных
методом электроформования; исследованию процесса высвобождения
фотосенсибилизатора из нановолокон хитозана и степени их набухания;
описанию процедуры получения и характеризации образцов нетканых
материалов на основе хитозана с поверхностью, модифицированной
плазмонно-резонансными наночастицами.
Исследование морфологических и оптических характеристик
нетканых материалов, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс»
Образцы нетканого материала, содержащие фотосенсибилизатор,
имеют голубой цвет, характерный для «Фотосенса». При этом интенсивность
цвета увеличивается с повышением содержания фотосенсибилизатора в
формовочных растворах, используемых для получения нетканых материалов
(рисунок 1а-г).
Добавление фотосенсибилизатора не влияет на динамическую вязкость
формовочных
растворов
и,
следовательно,
на
сам
процесс
электроформования. Полученные образцы характеризуются четкой
волокнистой структурой (рисунок 1д, е). Установлено, что различие среднего
диаметра
волокна
у
образцов
с
различным
содержанием
фотосенсибилизатора (0%, 1%, 2.5% и 5%) является статистически
незначимым (p ≥ 0,05) (рисунок 2а). Таким образом, включение
фотосенсибилизатора (до 5% в сух. веществе) в состав нетканых материалов
не оказывает существенного влияния на их структуру и морфологию. Однако
растворы, содержащие более 5 % фотосенсибилизатора в сух. веществе,
характеризуются плохой волокнообразующей способностью, что объясняется
агрегацией молекул «Фотосенса» в водных и органических растворителях,
обусловленной межмолекулярным π-π взаимодействием [7].
Флуоресцентный сигнал, полученный посредством конфокальной
лазерной сканирующей микроскопии на длине волны возбуждения 633 нм,
находящейся в области возбуждения флуоресценции «Фотосенса», с
применением 650 нм длинноволнового пропускающего фильтра,
детектируется только от волокон. Таким образом, подтверждается наличие
фотосенсибилизатора в составе/на поверхности нетканых материалов
(рисунок 1е).
9
Рис. 1. Фотографии нетканых материалов на основе хитозана.
(а-г) Цифровые фотографии нетканых материалов на основе хитозана с различным
содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс»: 0%, 1%, 2.5% и 5%, соответственно;
(д) СЭМ-изображение нетканого материала ФС 5%;
(е) Флуоресцентное изображение нетканого материала ФС 5%, полученное с помощью
конфокальной лазерной микроскопии на длине волны возбуждения 633 нм с применением
650 нм длинноволнового пропускающего фильтра (суперпозиция флуоресцентного и
просвечивающего режимов) [Л2]
Рис. 2. (a) Средние диаметры волокон с различным содержанием фотосенсибилизатора,
полученные по СЭМ-изображениям; (б) Спектры диффузионного отражения нетканых
материалов на основе хитозана: 1) ФС 0%; 2) ФС 1%; 3) ФС 2.5%; 4) ФС 5% [Л2]
В водном растворе «Фотосенс» имеет характерный спектр поглощения,
который включает небольшой максимум на 608±2 нм и узкий интенсивный
пик с максимумом на 676±2 нм. По результатам спектроскопии
диффузионного рассеяния для образцов, содержащих фотосенсибилизатор,
наблюдается существенное снижение показателя отражения, начиная с
10
длины волны 720 нм, и достигает минимума в районе 680 нм, второй
минимум приходится на длину волны 605 нм (рисунок 2б). При этом глубина
минимумом увеличивается с повышением содержания фотосенсибилизатора
в формовочных растворах, используемых для получения нетканых
материалов. В спектре образца волокон хитозана в отсутствие
фотосенсибилизатора таких минимумов не наблюдается. Таким образом,
минимумы на спектрах диффузного отражения могут быть ассоциированы с
наличием «Фотосенса» в составе волокна.
Рис. 3. (a) Спектры КРС порошка «Фотосенса» (синяя линия), образца ФС 0% (зеленая
линия) и образца ФС 5% (красная линия). Фокусировка лазерного луча на образце
осуществлялась с помощью 50x объектива микроскопа при длине волны возбуждения
785 нм (0,05 мВт), время накопления сигнала составляло 10 секунд; (б) Спектральное
изображение КРС поверхности нетканого материала ФС 5%. Относительная высота пика
по отношению к фону в области 1312-1360 см-1 показана синим цветом. Изображение
получено при мощности лазера 0,3 мВт и длине волны 785нм в линейном режиме
сканирования (30 секунд на линию) [Л3]
Хитозан демонстрирует характерный спектр комбинационного
рассеяния света (КРС) с несколькими пиками в области между 1000 см-1 и
1200 см-1, которые ассоциированы с колебаниями растяжения C-OH связей
(рисунок 3a). Спектр КРС «Фотосенса» отличен от спектра хитозана и
включает два характерных максимума, расположенных на 764 см-1 и 1348
см-1. Первый пик соответствует колебаниям связей C-N-C и Al-N, второй пик
обусловлен совместными колебаниями, включающими изгиб валентных
углов между связями C-N-C и N-C-N, растяжением связи C-C во внешних
бензольных кольцах, а также растяжением связи Al-N [8]. Относительная
равномерность распределения фотосенсибилизатора в нетканом материале
была показана методом картирования КРС по интенсивности второго
характерного пика фотосенсибилизатора.
Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора из нановолокон
хитозана
На данном этапе исследования оценивался выход фотосенсибилизатора
из нановолокон хитозана в фосфатно-солевом буфере (PBS) со значением рН
11
7,4 и дистиллированной воде в течение 96 часов при помощи
спектрофотометра (U-2800, Shimadzu).
Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора описана с помощью
уравнения Ritger-Peppas:
Q = kt n ,
(1)
где Q – суммарный выход вещества, n – константа, характеризующая
механизм
высвобождения,
k –
константа
пропорциональности,
характеризующая геометрическую форму содержащей вещество полимерной
матрицы.
Результаты
аппроксимации
экспериментальных
данных
представлены в Таблице 1.
Таблица 1.
CФС,
%
Среда
1
PBS
2,5
PBS
5
PBS
5
H2O
Время,
ч
0-3
24 - 96
0-3
24 - 96
0-3
24 - 96
0-3
24 - 96
Константы
уравнения
(1)
k
n
0,3
0,68
0,08
1,1
1,2
0,73
5,1
0,04
1,4
0,84
7,7
0,07
0,04 0,34
0,07 0,15
R2
0,97
0,87
0,98
0,88
0,99
0,98
0,99
0,92
Точка
пересечения,
ч
10
9
10
20
В ходе аппроксимации экспериментальных данных было показано, что
высвобождение фотосенсибилизатора из нетканых материалов проходит в
два этапа: первый этап характеризуется аномально-диффузным поведением и
длится в течение 9-10 часов в фосфатно-солевом буфере и 20 часов в
дистиллированной воде, последующий выход красителя обусловлен
кинетическими процессами, подчиняющимися законам Фика.
Предполагается, что быстрое высвобождение фотосенсибилизатора
происходит вследствие набухания полимера. В связи с этим на данном этапе
исследования оценивалась степень набухания S нетканого материла на
основе хитозана в фосфатно-солевом буфере со значением рН 7,4 и
дистиллированной воде:
S = 100 × (mw − md ) / md ,
(2)
где S – степень набухания, md – исходная масса нетканого материала, mw –
масса нетканого материала после набухания. Материал демонстрирует резкое
набухание с достижением равновесного состояния в течение первых 60
минут.
Таким образом, на первом этапе происходит быстрое высвобождение
несвязанного фотосенсибилизатора в процессе набухания волокон хитозана.
12
Рис. 4. (а) Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора из нановолокон хитозана с
различным содержанием «Фотосенса» в фосфатно-солевом буфере в течение 96 часов (на
вставке показаны кривые высвобождения «Фотосенса» в течение первых 3 часов); (б)
Спектры поглощения надосадочной жидкости после 96-часового высвобождения
«Фотосенса» из нетканого материала ФС 5% в дистиллированной воде и фосфатносолевом буфере; (в) Степень набухания нетканого материала на основе хитозана ФС 0% в
фосфатно-солевом буфере с течением времени [Л2]
Последующая стадия соответствует высвобождению «Фотосенса» из
полиэлектролитного комплекса с хитозаном. При этом интенсивность
высвобождения фотосенсибилизатора в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4)
значительно выше, чем в дистиллированной воде, что объясняется
изменением физико-химических свойств скаффолда [9].
Получение и характеризация нетканых материалов с поверхностью,
модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами
Для получения нетканых материалов на основе хитозана с
поверхностью, модифицированной золотыми наночастицами, использовали
двухэтапную процедуру [10]. На первом этапе образец нетканого материала
размером 1x1 см2 помещали в водный раствор тетрахлороаурата(III)
водорода HAuCl4. На этой стадии ионы золота взаимодействуют с
карбоксильными группами в структуре хитозана (рисунок 5). На втором
этапе образцы помещались в воду с последующим добавлением водного
раствора цитрата натрия для образования золотых наночастиц в структуре
нановолокон [Л4].
Образцы приобретали темно-красный цвет (вставки на рисунке 6).
Изменение поверхности модифицированного нетканого материала видны
более отчетливо на СЭМ-изображениях, полученных в режиме отраженных
электронов (Рисунок 6).
13
Рис. 5. (a) Схема получения нетканых материалов на основе хитозана с поверхностью,
модифицированной золотыми наночастицами. Слева представлено СЭМ-изображение
свежесформованного нетканого материала на основе хитозана,
справа – СЭМ-изображение того же образца после модификации золотыми
наночастицами; (б) ПЭМ-изображение нетканого материала на основе хитозана с
поверхностью, модифицированной золотыми наночастицами [Л4]
Установлено, что частицы формировались не только на поверхности,
но также и внутри волокон. Характерный размер наночастиц составлял
порядка 4 нм и 20 нм, (рисунок 5б). Поверхностная плотность и
распределение золотых наночастиц варьировалось посредством изменения
молярной концентрации тетрахлороаурата(III) водорода.
Рис.6.СЭМ-изображения нетканых
материалов на основе хитозана c плазмоннорезонансными наночастицами,
полученными при использовании различных
концентраций HAuCl4 (a) 0,5 мМ (б), 1 мМ
(в), 5 мM (г), 10 мM (д), и 25 мM (е) и
обработанных 1% раствором цитрата
натрия. СЭМ - изображения получены в
режиме отраженных электронов. На
вставках представлены изображения
нетканых материалов [Л4]
Возможность применения полученных материалов в качестве ГКРплатформ показана на примере Родамина 6G и D-глюкозы – основного
биомаркера сахарного диабета [Л4].
Четвертая
глава
описывает
результаты
эксперимента,
подтверждающего фотоиндуцированную антибактериальную активность
нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор.
Антибактериальная активность предложенного материла оценивалась
диско-диффузионным методом на примере штамма Staphylococcus aureus.
Бактериальный штамм был получен из Саратовского научноисследовательского института травматологии и ортопедии. Дизайн
14
эксперимента проиллюстрирован на рисунке 7. Для каждой чашки Петри
использовали заранее простерилизованные диски диаметром 10 мм,
вырезанные из материала на основе хитозана ФС 0% (2 штуки), а также ФС
5% (2 штуки). Образцы помещали на поверхность агара в чашке Петри,
предварительно инокулированного Staphylococcus aureus. В течение 2 часов
образцы инкубировались при температуре 37 оС. За это время происходила
частичная диффузия фотосенсибилизатора в агар, о чем свидетельствует
голубоватый ореол вокруг образцов, содержащих «Фотосенс», диаметром
Rrl=20±2 мм (рисунок 8-1, 8-3). Далее, один из образцов ФС 0% (контроль
для исключения влияния теплового эффекта), а также один образец ФС 5%
подвергались световому воздействию посредством фототерапевтического
излучателя АФС («Полироник») на длине волны 660 нм при плотности
мощности излучения 2,5 мВт/см2 в течение 10 минут (рисунок 8-1, 8-2).
Образцы, не подвергавшиеся световому воздействию, рассматривались как
контроль на «темновую» токсичность (рисунок 8-3, 8-4). После облучения
чашки Петри были инкубированы в течение 24 часов при температуре 37 оС.
Для оценивания подавления роста бактерий измеряли диаметр зоны задержки
роста (Rinb). Для каждого эксперимента использовали пять чашек Петри.
Всего было проведено три таких эксперимента.
Рис.7. Дизайн эксперимента, подтверждающего фотоиндуцированную антибактериальную
активность нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор
[Л3]
Как видно из рисуека 8 зона задержки роста имела место только для
образца, содержащего «Фотосенс» и подвергнувшемуся световому
воздействию. Средний диаметр зоны задержки роста составлял 15±2 мм. При
этом у контрольных образцов подавление роста не наблюдалось, а их
поверхность была полностью покрыта бактериальным штаммом. Следует
отметить, что область облучения (Rirr=30±2 мм) была значительно больше
зоны задержки роста (Rinb) и области диффузии фотосенсибилизатора в агар
(Rrl). При этом мощность излучения, пришедшая на зону задержки роста
бактерий, составила около 70 % (48 мВт) от интегральной мощности
светодиодного источника (70 мВт), а доза около – 4 Дж/см2.
15
Рис. 8. Диско-диффузионный метод
оценивания фотоиндуцированной
антибактериальной активности нетканых
материалов на основе хитозана: 1) ФС 5% и
2) ФС 0%, подвергшиеся световому
воздействию, 3) ФС 5% и 4) ФС 0% –
контроль на «темновую» токсичность.
Rrl – область диффузии
фотосенсибилизатора в агар, Rinb – зона
задержки роста и Rirr – область облучения
[Л3]
Таким образом, было установлено, что образец, содержащий
фотосенсибилизатор и подвергшийся световому воздействию, обладает
достаточной токсичностью для угнетения роста бактерий на поверхности
диска, а также в некоторой области вокруг, при этом предполагается, что
наблюдаемый эффект обусловлен фотодинамическим действием, а не
антибактериальной активностью хитозана или нагревом.
В пятой главе приводятся результаты исследований, подтверждающие
биосовместимость нетканых материалов на основе хитозана с различным
содержанием «Фотосенса» в отсутствие светового воздействия, их
фототоксическое действие, а также показана возможность дистанционного
пространственного контроля над ростом клеток.
Определение биосовместимости нетканых материалов на основе
хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс», in vitro
В качестве тестовых клеточных культур были использованы раковые
клетки T-47D (клетки рака молочной железы) и нормальные клетки MC3T3E1 (остеобласты мыши).
Адгезию, распластывание и последующую пролиферацию клеток на
нетканых материалах на основе хитозана с различным содержанием
«Фотосенса» оценивали посредством конфокального сканирующего
лазерного микроскопа (Zeiss LSM 510 Meta). Флуоресцентные изображения
получали по истечении 6 дней культивирования (рисунок 9). Образцы
предварительно фиксировали 4-х% раствором формальдегида, затем
окрашивали флуоресцентными красителями. Для окрашивания актиновых
нитей цитоскелета клеток MC3T3-E1 (зелёный цвет) использовали краситель
Alexa Flour 488 (1:20, Invitrogen, США), ядра клеток (красный цвет) были
окрашены раствором пропидий йодида (1:300, Invitrogen, США).
Клетки
характеризовались
нормальной
морфологией
и
демонстрировали хорошую адгезивную способность. При этом визуальных
различий в структуре и морфологии клеток, культивированных на
16
скаффолдах с различным содержанием фотосенсибилизатора, замечено не
было.
Рис. 9. Флуоресцентные
изображения клеток T-47D
(а-г) и MC3T3-E1(д-з),
культивированных на
нетканом материале с
различным содержанием
«Фотосенса»: a, д – ФС 0%;
б, е – ФС 5 %; в, ж – ФС
2,5 %; г, з – ФС 1 % [Л2]
Для количественного
определения токсичности полученных
материалов посредством MTT-теста оценивали метаболическую активность
клеток, культивированных совместно с образцами с различным содержанием
фотосенсибилизатора (0%, 1%, 2.5% и 5%), в течение 24, 48 и 72 часов
(рисунок 10а,б). Показано, что метаболическая активность клеток
увеличивается в течение всего периода культивирования. Однако клетки,
культивированные совместно с образцами нетканых материалов,
характеризуются более низкой метаболической активностью по сравнению с
контролем (клетки в отсутствие материала). При этом у раковых клеток T47D, культивированных совместно с образцами ФС 2,5% и ФС 5%,
наблюдается значительное снижение метаболической активности по
сравнению с контролем и образцами ФС 0% и ФС 1% (рисунок 10а).
Указанный эффект может быть обусловлен «темновой» токсичностью
фталоцианина алюминия, зависящей от его концентрации [11,12]. Следует
также отметить, что для данного класса фотосенсибилизаторов минимальная
концентрация, обладающая «темновой» токсичностью, до сих пор точно не
определена [11-13]. Кроме того, некоторый фототоксический эффект может
наблюдаться под действием фонового освещения [14]. В отличие от раковых
клеток T-47D метаболическая активность нормальных клеток MC3T3-E1 не
зависит от количества фотосенсибилизатора в материале (рисунок 10б).
Рис. 10. Зависимость
метаболической активности
раковых T-47D (а) и
нормальных MC3T3-E1 (б)
клеток, культивированных с
образцами нетканых
материалов ФС 0%, ФС 1%,
ФС 2.5% и ФС 5% с течением
времени [Л2]
17
Определение фототоксичности нетканых материалов на основе
хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс», in vitro
На данном этапе исследования посредством MTT-теста оценивалось
влияние излучения на клетки, культивированные совместно с образцами ФС
0% и ФС 5%.
Для постановки эксперимента клетки T-47D и MC3T3-E1 рассеивали в
концентрации 5 х 104 клеток/мл в 200 мкл полной среды RPMI-1640 в 96луночные плоскодонные планшеты, которые помещали в инкубатор при
температуре 37 ˚C и 5% СО2. По истечение 24 часов в каждую лунку
добавляли заранее подготовленные образцы размером 0,5х0,5см и
инкубировали с клетками в течение еще 24 часов. Для каждого вида
материала (ФС 0% и ФС 5%) и контроля использовали по 6 лунок на
планшет, 3 из которых подвергались световому воздействию посредством
фототерапевтического излучателя АФС («Полироник») на длине волны 660
нм при плотности мощности излучения 2,5 мВт/см2 в течение 15 минут.
Рис. 11. Влияние
светового воздействия на
метаболическую
активность раковых
T-47D (а) и нормальных
MC3T3-E1 (б) клеток,
культивированных с
образцами нетканых
материалов ФС 0% и ФС
5%), по истечении 24
часов после облучения
[Л2]
Для оценки способности раковых клеток к восстановлению
метаболической активности по истечении 48, 72, и 96 часов после облучения
были проведены дополнительные эксперименты.
Рис. 12. Метаболическая
активность раковых
T-47D,
культивированных с
образцами ФС 5%, по
истечении 24,48,72 и 96
часов после светового
воздействия [Л2]
В течение 96 часов культивирования после светового воздействия
клетки оставались метаболически неактивны (рисунок 12). При этом
метаболическая активность клеток, культивированных с образцами ФС 0% и
подвергшихся облучению, также как контроля и «темнового контроля»
18
увеличивалась в течение всего периода культивирования. Таким образом,
предполагается, что угнетение метаболической активности клеток
обусловлено действием фотодинамического эффекта, а не нагревом или
какими-либо другими факторами.
Пространственный контроль над ростом клеток
На данном этапе исследования была показана возможность
пространственного контроля над ростом клеток T-47D и MC3T3-E1 (5 х 104
клеток/мл в 200 мкл полной среды), культивированных совместно с
образцами нетканого материала ФС 5%, под действием излучения (1,75
Вт/см2, 15 минут). Для фокусировки светового пучка диода в пятно с
диаметром ∼2 мм использовали собирающую линзу (рисунок 13а). Для
визуализации разницы между живыми и мертвыми клетками их
предварительно окрашивали флуорогенными красителями DHR-123
(обеспечивает флуоресценцию зеленого цвета у метаболически активных
клеток) и пропидий йодидом (обеспечивает флуоресценцию красного цвета у
мертвых клеток), результаты эксперимента оценивали посредством
конфокальной лазерной сканирующей электронной микроскопии (рисунок 13
б-г).
В ходе эксперимента показано, что мертвые клетки были локализованы
в области, подвергшейся световому воздействию (рисунок 13б, в). При этом
клетки вокруг этой области оставались метаболически активны, о чем
свидетельствует зарегистрированная от них флуоресценция зеленого цвета.
Подвергшиеся световому воздействию клетки, культивированные совместно
с образцом нетканого материала ФС 0%, также оставались метаболически
активны (рисунок 13г). Следует отметить, что раковые клетки были более
подвержены фототоксическому эффекту по сравнению с нормальными
клетками.
Рис. 13. Пространственный контроль
над ростом клеток, культивированных
совместно с образцом нетканого
материала ФС 5%, под действием
светового излучения: (a) Дизайн
эксперимента; (б) Флуоресцентное
изображение клеток T47-D; (в)
Флуоресцентное изображение клеток
MC3T3-E1; (г) Флуоресцентное
изображение клеток MC3T3-E1,
выращенных на пластике и
подвергшихся световому воздействию
(черная линия демонстрирует границу
между облученной (слева) и
необлученной (справа) областями) [Л2]
Локализованность фототоксического эффекта обусловлена действием
синглетного кислорода, ключевого агента фотодинамической терапии,
19
характеризующегося коротким периодом полураспада в физиологических
жидкостях (<0,4 µс) и коротким радиусом действия (∼0,1 µм) [14].
В заключении сформулированы основные результаты и выводы,
полученные в ходе выполнения диссертационной работы.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Различие среднего диаметра волокна у образцов с различным
содержанием фотосенсибилизатора (0%, 1%, 2.5% и 5%) является
статистически незначимым (p ≥ 0,05). Таким образом, включение
фотосенсибилизатора (до 5% в сух. веществе) в состав нетканых
материалов не оказывает существенного влияния на их структуру и
морфологию.
Материал демонстрирует быстрое набухание в фосфатно-солевом
буфере (pH=7,4) и дистиллированной воде с достижением
равновесного состояния в течение первых 60 минут.
Интенсивность высвобождения фотосенсибилизатора в фосфатносолевом буфере (рН=7,4) значительно выше, чем в дистиллированной
воде, что объясняется изменением физико-химических свойств
скаффолда.
Образцы, содержащие в своем составе фотосенсибилизатор и не
подвергшиеся световому воздействию, а также контрольные образцы,
не
содержащие
фотосенсибилизатор,
не
демонстрируют
антибактериальной активности, что свидетельствует об угнетении
роста бактерий, происходящем вследствие фотодинамического
эффекта, а не нагрева или антибактериальной активности хитозана.
В ходе исследований на биосовместимость установлено, что
предложенные нетканые материалы не являются цитотоксичными и
могут быть использованы в качестве скаффолдов для выращивания
клеточных культур in vitro.
После облучения клеток, культивированных совместно с нетканым
материалом, содержащем в своем составе фотосенсибилизатор,
наблюдалось значительное снижение (>90%) метаболической
активности раковых клеток, при этом нормальные клетки
демонстрировали
относительную
резистентность
к
фотодинамическому эффекту.
Разработана простая методика получения нетканых материалов на
основе хитозана, модифицированных плазмонно-резонансными
наночастицами, для применения в качестве платформ гигантского
комбинационного рассеяния света.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Л1.
Статьи в реферируемых изданиях и журналах:
О. А. Иноземцева, Ю. Е. Сальковский, А. Н. Северюхина, И. В.
Видяшева, Н. В. Петрова, Х. А. Метвалли, И. Ю. Стецюра, Д. А. Горин
20
Л2.
Л3.
Л4.
Л5.
Л6.
Л7.
Л8.
Л9.
«Электроформование функциональных материалов для биомедицины и
тканевой инженерии» // Успехи химии, 2015, 84(3), 251–274.
A. N. Severyukhina, N. V. Petrova, K. Smuda, G. S. Terentyuk, B. N.
Klebtsov R. Georgievac, H. Bäumler, D. A. Gorin «Photosensitizer-loaded
electrospun chitosan-based scaffolds for photodynamic therapy and tissue
engineering» // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2016, 144, 57–64.
A. N. Severyukhina, N. V. Petrova, A. M. Yashchenok, D. N. Bratashov, K.
Smuda, I. A. Mamonova, N. A. Yurasov, D. M. Puchinyan, R. Georgieva, H.
Bäumler, A. Lapanje and D. A. Gorin «Light-induced antibacterial activity
of electrospun chitosan-based material containing photosensitizer» //
Materials Science & Engineering: C. 2017. 70(1), 311–316.
A. N. Severyukhina, B. V. Parakhonskiy, E. S. Prikhozhdenko, D. A.
Gorin, G. B. Sukhorukov, H. Möhwald, A. M. Yashchenok «Nanoplasmonic
chitosan nanofibers as effective SERS substrate for detection of small
molecules»// ACS Appl. Mater. Interfaces. 2015, 7(28), 15466–15473.
Тезисы конференций
A. N. Severyukhina, N. V. Petrova, I. A. Mamonova, I. V. Vidyasheva, A.
M. Zakharevich, A. A. Skaptsov, N. A. Yurasov, G. S. Terentyuk, D. M.
Puchinyan, B. N. Klebtsov, K. Smuda, R. Georgieva, H. Baumler, D. A.
Gorin «Polymer/photosensitizer fibrous materials with light-triggered
antibacterial activity»// Book of abstracts 8th International Symposium
«Molecular Order and Mobility in Polymer Systems», Russia, SaintPetersburg, p. O-69.
И. В. Видяшева, А. Н. Северюхина «Тестирование биоинженерной
конструкции с включением фотосенсибилизатора «фотосенс» с
помощью
низкоинтенсивного
излучения»//
Сборник
статей
Международной
научно-практической
конференции
«Фундаментальные проблемы науки», Россия, Уфа, 2013, С. 27–28.
И. В. Видяшева, А. Н. Северюхина «Апробация нетканого материала
из нановолокон хитозана с включением фотосенсибилизатора
«Фотосенс» в условиях in vitro» // Сборник материалов Всероссийской
молодежной научной конференции «Актуальные проблемы разработки
и применения новых материалов и технологий», Россия, Саратов, 2013,
С. 166–169.
А. Н. Северюхина, И. В. Видяшева, А. А. Савонин, Д. А. Горин, Ю. Е.
Сальковский «Апробация материала на основе нановолокон хитозана с
включением
фотосенсибилизатора для последующей терапии
злокачественных новообразований кожи» // Сборник материалов
Ежегодной Всероссийской научной школы «Методы компьютерной
диагностики в биологии и медицине – 2013», Саратов, 2013, С. 105–
107.
А. Н. Северюхина, И. В. Видяшева, Н. В. Петрова, Е. А. Лукьянец, Д.
А. Горин, Ю. Е. Сальковский «Создание нетканого материала из
нановолокон хитозана с включением фотосенсибилизатора «фотосенс»
21
и тестирование в условиях in vitro» // Сборник тезисов III
Международной конференции «Супрамолекулярные системы на
поверхности раздела» - «Супраз-2013», Россия, Туапсе, 2013, С. 49.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ:
1. Dvir T. et al. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues //
Nature nanotechnology. 2011. № 6. P. 13–22.
2. Gabriel D., Dvir T., Kohane D. S. Delivering bioactive molecules as instructive
cues to engineered tissues // Expert Opin. Drug Delivery. 2012. Vol. 9, P. 473–
492.
3. Hollister S. J. Porous scaffold design for tissue engineering // Nat. Mater. 2005.
Vol. 4. P. 518–524.
4. Innocente F. et al. Paclitaxel-eluting biodegradable synthetic vascular
prostheses: a step towards reduction of neointima formation? // Circulation.
2009. № 120. P. S37–45.
5. Andersson D.I., Hughes D. Antibiotic resistance and its cost: is it possible to
reverse resistance? // Nat. Rev. Microbiol. 2010. № 8. P. 260–271.
6. Silver S. Bacterial resistances to toxic metal ions-a review // Gene. 1996. Vol.
179, № 1. P. 9–19.
7. Zelina J. P. et al. Influence of surfactant-based microheterogeneous fluids on
aggregation of copper phthalocyanine tetrasulfonate // J. Porph. Phthalo. 1999.
Vol. 3, № 3. P. 188–195.
8. Basova T.V. Orientation and morphology of chloroaluminum phthalocyanine
films grown by vapor deposition: Electrical field-induced molecular alignment //
Chemical Physics. 2011. Vol. 380, № 1. P. 40–47.
9. Filion D., Lavertu M., Buschmann M.D. Ionization and solubility of chitosan
solutions related to thermosensitive chitosan/glycerol-phosphate systems //
Biomacromolecules. 2007. Vol. 8, № 10. P. 3224–3234.
10. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in
monodisperse gold suspensions // Nature Physical Science. 1973. Vol. 241.
P. 20–22.
11. Matei C. Photodynamic properties of aluminium sulphonated
phthalocyanines in human dysplazic oral keratinocytes experimental model //
Digest J. Nanomater. Biostruct. 2012. Vol. 7, № 4. P. 1535–1547.
12. Glassberg E. et al. Laser-induced photodynamic therapy with aluminum
phthalocyanine tetrasulfonate as the photosensitizer: differential phototoxicity in
normal and malignant human cells in vitro // J. Invest. Dermatol. 1990. Vol. 94,
№5. P. 604–610.
13. Chan W.S. et al. Cell uptake, distribution and response to aluminium
chlorosulphonated phthalocyanine, a potential anti-tumour photosensitizer // Br.
J. Cancer. 1986. Vol. 53, №2. P. 255–263.
14. Moan J., Berg K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to
estimate the lifetime of singlet oxygen // Photochem. Photobiol. 1991. Vol. 53.
P. 549–553.
22
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа