close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

«Некоторые CC- и CXC-хемокины и их рецепторы у больных бронхиальной астмой».

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
КОВАЛИНСКАЯ
Анна Андреевна
Некоторые CC- и CXC-хемокины и их рецепторы у
больных бронхиальной астмой
14.01.04. - Внутренние болезни
14.03.09. - Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ, 2014
Работа выполнена на кафедре госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого ГБОУ
ВПО « Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.
акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ
Научные руководители:
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Василий Иванович Трофимов
доктор медицинских наук, член-корреспондент
РАМН, профессор Арег Артемович Тотолян
доктор медицинских наук, профессор 1 кафедры
терапии (усовершенствования врачей) ФГКВОУ
ВПО Военно-медицинской академии имени С.М.
Кирова
Министерства
обороны
Российской
Федерации, заместитель главного пульмонолога
Министерства здравоохранения РФ
Харитонов Михаил Анатольевич
главный научный сотрудник отдела лабораторной
диагностики ВЦЭРМ МЧС России, доктор
медицинских наук, профессор
Наталия Михайловна Калинина
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И.
Мечникова» Министерства здравоохранения РФ
Защита
состоится
«___»____________2014
г.
в____часов
на
заседании
Диссертационного совета Д.208.090.01 в Первом Санкт-Петербургском государственном
медицинском университете имени академика И.П. Павлова по адресу: 197022, г. СанктПетербург, ул. Л. Толстого, д. 6-8.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Первого СанктПетербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова
(197022, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 6-8).
Автореферат разослан «___»___________2014 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д.м.н., профессор
Марченко В.Н.
3
Введение
Актуальность темы
Бронхиальная астма (БА) относится к числу широко распространенных заболеваний.
Считается, что приблизительно 300 миллионов человек во всем мире страдают БА.
Предполагается, что эта цифра возрастет еще на 100 миллионов к 2025 году
(www.ginasthma.com/Guidelineitem.asp.). Кроме того, обращает на себя внимание
увеличение распространенности БА в России, увеличение тяжести течения заболевания
и связанный с этим рост летальности (Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., Петрова М.А.,
2011).
Повышение эффективности лечения и профилактики БА связывается с необходимостью глубокого знания патогенетических особенностей заболевания. В настоящее время
известно около 50 хемокинов и 20 типов поверхностных рецепторов к ним (Федосеев
Г.Б., Трофимов В.И., 2006). Хемокины относятся к классу цитокинов, которые являются
центральным регулятором лейкоцитарной миграции, а также способствуют активации
этих клеток, в частности участвуют в высвобождении гранул с биологически активными
веществами (Tian L.et al., 2011). В иммунопатогенезе БА известны хемокины, которые
участвуют как в аллергическом, так и в клеточно-опосредованном иммунном
воспалении. Среди них наиболее хорошо изученными являются хемокины группы
эотаксинов – медиаторов аллергического воспаления при БА, которые взаимодействуют
с рецептором CCR3 (Tian L. et al., 2011). Хемокинами, характеризующие и
аллергическое и клеточно-опосредованное воспаление, являются CCL3/MIP-1α и
CCL5/RANTES, которые взаимодействуют с рецепторами: CCR1, CCR3, CCR5. К
хемокинам,
характеризующим
клеточно-опосредованное
воспаление,
относятся
CCL4/MIP-1β и CXCL8/IL-8, которые взаимодействуют с рецепторами: CCR5 и CXCR1,
CXCR2 соответственно.
Исследование экспрессии мРНК провоспалительных хемокинов CCL3/MIP-1α,
CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CCL11/эотаксина, CCL24/эотаксина-2 и их
рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2), характеризующих иммунное воспаление в слизистой верхних дыхательных путей, в частности носоглотке, у больных БА
до настоящего времени не изучалось. Взаимосвязи между содержанием этих же хемокинов в сыворотке крови и клинико-лабораторными данными у больных БА освещены не
достаточно полно, что обуславливает актуальность настоящего исследования.
4
Цель работы
Изучить
участие
некоторых
хемокинов
(CCL3/MIP-1α,
CCL4/MIP-1β,
CCL5/RANTES, CCL11/эотаксина, CCL24/эотаксина-2, CXCL8/IL-8) и их рецепторов
(CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в иммунопатогенезе БА и оценить возможность
их использования в качестве новых диагностических биомаркеров этого заболевания.
Задачи исследования
1. Определить экспрессию мРНК некоторых СС (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β,
CCL5/RANTES, CCL11/эотаксин, CCL24/эотаксин-2) и CXC (CXCL8/IL-8) хемокинов, а также их рецепторов (CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в слизистой оболочке носоглотки больных БА в фазе обострения, в зависимости от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести заболевания, наличия инфекции в носоглотке,
фактора табакокурения и у практически здоровых лиц.
2. Определить содержание некоторых СС (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES,
CCL11/эотаксин, CCL24/эотаксин-2) и CXC (CXCL8/IL-8) хемокинов в сыворотке
крови у больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов, степени
тяжести, наличия инфекции в носоглотке, фактора табакокурения и у практически
здоровых лиц.
3. Изучить взаимосвязи показателей системы хемокинов с клиническими, общелабораторными и функциональными показателями больных БА.
4. Провести анализ изменений изученных хемокинов и их рецепторов у больных БА и
оценить их в иммунопатогенезе заболевания.
5. Изучить возможность оценки хемокинов с точки зрения биомаркеров бронхиальной
астмы.
Научная новизна
1. У больных БА по сравнению с практически здоровыми лицами выявлена повышенная
экспрессия мРНК CCL11/эотаксина, CCL24/эотаксина-2, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β
и рецептора CXCR1 в слизистой оболочке носоглотки.
2. Впервые установлено, что у больных БА по сравнению с практически здоровыми лицами в сыворотке крови было выявлено повышенное содержание CCL5/RANTES,
CXCL8/IL-8, CCL24/эотаксина-2 и сниженное содержание CCL11/эотаксина, причем
повышенное содержание CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови не зависело от кли-
5
нико-патогенетических вариантов БА, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения.
3. Впервые показано формирование у практически здоровых курильщиков дефекта синтеза и продукции CXCL8/IL-8, что проявлялось сниженной экспрессией мРНК в слизистой оболочке носоглотки и сниженным содержанием этого хемокина в сыворотке
крови.
4. Показаны взаимосвязи у больных БА показателей системы хемокинов с общелабораторными показателями (положительные корреляции между экспрессией мРНК
CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES с эозинофилами и нейтрофилами мокроты) и показателями бронхиальной обструкции (отрицательные корреляции CCL11/эотаксина с индексом Тиффно и CCL5/RANTES с ОФВ1).
Практическая ценность работы
1. Комплексная оценка экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки и содержания в сыворотке крови у больных БА позволяют определить преимущественный характер иммунного воспаления: гуморальное (В-клеточное)
или клеточно-опосредованное (Т-клеточное).
2. Повышенное содержание CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови у больных БА в фазе
обострения независимо от клинико-патогенетических вариантов, степени тяжести
заболевания, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения позволяет
рекомендовать соответствующий хемокин в качестве биомаркера БА.
Положения выносимые на защиту
1. В отличие от инфекционно-зависимой БА, для которой характерно сниженная экспрессия
мРНК
CCL24/эотаксина-2,
повышенное
системное
содержание
CCL5/RANTES и CCL24/эотаксина-2, атопическая БА характеризуется сниженным
системным
содержанием
CCL11/эотаксина,
повышенным
содержанием
CCL5/RANTES, CCL24/эотаксина-2 и повышенным местным синтезом CCL3/MIP-1α,
CCL4/MIP-1β и CCL24/эотаксина-2.
2. У практически здоровых курильщиков в зависимости от длительности табакокурения
развиваются дефекты местного синтеза и системной продукции CXCL8/IL-8.
3. У всех больных БА в фазе обострения не зависимо от клинико-патогенетических
вариантов, степени тяжести заболевания, наличия инфекции в носоглотке, фактора
6
табакокурения
устойчиво
повышено
содержание
в
сыворотке
крови
CCL24/эотаксина-2, что позволяет его отнести к биомаркерам БА.
Личное участие автора
Подбор больных БА и группы практически здоровых лиц для исследования, анализ
литературных данных, взятие браш-биоптата слизистой носоглотки и выполнение
полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения инфекционных агентов, мРНК
хемокинов и их рецепторов в лаборатории ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова,
статистическая обработка выполнялось автором диссертационной работы лично.
Личной участие автора в получении научных результатов подтверждено научными
руководителями, заключением членов проблемной комиссии, ознакомившейся с
первичной документацией проведенных исследований.
Реализация и апробация работы
Материалы докладывались на XIII всероссийском научном форуме с международным
участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»
(Санкт-Петербург, 2009), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы
экспериментальной и клинической медицины ˗ 2009» (Санкт-Петербург, 2009), на региональной научно-практической конференции «Осложнения гриппа и ОРЗ в практике терапевта» (Санкт-Петербург, 2011), на научной конференции, посвященной 110-летию
кафедры госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого СПБГМУ им. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2011).
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работы в отечественных изданиях, 4 из
которых оригинальные статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объём и структура диссертации
Диссертация имеет традиционную структуру и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, собственных данных, заключения и практических рекомендаций. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и
состоит из введения и 7 глав, из которых первая глава – обзор литературы, 6 глав – собственные исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего (24 на русском и 111 на иностранном языках). Диссертация иллюстрирована 36 таблицами и 2 рисунками.
7
Материалы и методы
Клиническая характеристика групп обследованных
Клиническое и лабораторное обследование больных осуществлялось на базе клиники госпитальной терапии имени академика М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО
ПСПБГМУ им. акад. И.П. Павлова Минздрава РФ. Диагноз БА устанавливали в
соответствии с классификацией и критериями международного консенсуса по вопросам
диагностики и лечения БА (GINA, 2011).
Контрольную группу составили 37 практически здоровых лиц: 20 женщин (54%) и
17 мужчин (46%). Средний возраст женщин составил 24±3 лет, а средний возраст мужчин - 26±3 лет. Для отбора контрольной группы учитывались следующие факторы: отсутствие хронических заболеваний, отсутствие признаков острого заболевания в течение
последнего месяца, неотягощенная по БА и другим аллергическим бронхолегочным заболеваниям наследственность, отсутствие в анамнезе заболеваний крови, отсутствие аллергических заболеваний (БА, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, отек
Квинке и др.). Учитывался фактор хронической интоксикации – табакокурение (из 37
добровольцев: 16 (43%) были курильщиками и 21 (57%) - некурильщиками). Стаж курения составлял 3-5 лет, где индекс курящего человека (пачка/лет) составил от 1,5 до 5.
В исследование было включено 70 пациентов, из них 39 (56%) женщин и 31 (44%)
мужчина. Возраст обследованных больных БА находился в пределах от 17 до 68 лет у
женщин (в среднем – 42,5±25,5 лет), а у мужчин – в пределах от 19 до 67 лет (в среднем
- 43±24 лет). Длительность заболевания у больных БА колебалась от 0,3 до 55 лет.
По степени тяжести заболевания больные БА распределялись следующим образом:
14 (20%) больных БА были с легкой степенью тяжести (контролируемая БА) и 56 (80%)
больных БА - со средней степенью тяжести (частично контролируемая БА).
До поступления в стационар большинство пациентов 66 (94%) со средней степенью
тяжести БА самостоятельно использовали ингаляционные глюкокортикостероиды
(ИГКС) в сочетании с β2-агонистами короткого или пролонгированного действия или
комбинацией ИГКС и β2-агонистов пролонгированного действия; и только 4 (6%) пациента с легкой степенью тяжести БА - монотерапию бронхолитиками. По клиникопатогенетическим вариантам больные БА, согласно классификации Г.Б. Федосеева, О.В.
Коровиной, Н.Г. Тенегиной (1977), распределились следующим образом:
8
˗ атопический вариант был у 23 (33%) пациентов, из которых у 14 (17%) больных
БА: с легкой степенью тяжести и у 9 (83%) больных БА – со средней степенью тяжести
заболевания;
˗ сочетание атопического и инфекционно-зависимого вариантов - у 40 (57%) больных БА со средней степенью тяжести заболевания;
˗ инфекционно-зависимый вариант - у 7 (10%) больных БА со средней степенью тяжести заболевания.
В период обследования больные БА были осмотрены ЛОР-врачом. У 46 (66%) из 70
больных БА имели в анамнезе, подтвержденные при осмотре, заболевания ЛОР-органов.
Преобладающими заболеваниями ЛОР-органов у обследованных больных были: аллергический ринит интермиттирующая форма у 23 (50%) и аллергический ринит персистирующая форма у 5 (11%), а также полипозная риносинусопатия у 5 (11 %). Другие заболевания встречались значительно реже.
Методы исследования
Клиническое и лабораторное обследование больных БА осуществлялось на базе клиники госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого ГБОУ ВПО ПСПБГМУ им.
акад. И.П.Павлова Минздрав России.
У всех пациентов был собран анамнез заболевания БА, в том числе аллергологический, проводилось анкетирование, большинство пациентов консультировалось узкими
специалистами: аллергологом, ЛОР-врачом; также проводили стандартное клинико-лабораторное исследование, включающее клинический анализ крови, цитологический
анализ мокроты, оценку состояния функции внешнего дыхания.
Показатели ФВД определяли методом спирографии с регистрацией петли «поток-объем». Регистрация проводилась на приборе SPIROSIFT 3000 фирмы Fukuda
Denshi (Япония). У всех больных БА регистрация показателей функции внешнего дыхания проводилась до и после стандартной пробы с β2-адреномиметиком (фенотеролом
или сальбутамолом) во время госпитализации. Исследованные параметры оценивались
как в абсолютных значениях, так и в процентах к должным величинам по Клементу Р.Ф.
и соавт. (1986).
У 70 больных БА и 17 практически здоровых лиц получали браш-биоптат слизистой оболочки носоглотки для определения мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-
9
1β, CCL5/RANTES, CCL11/эотаксин, CCL24/эотаксин-2 и CXCL8/IL-8,) и их рецепторов: CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР). ПЦР выполняли на амплификаторах: iCycler Bio-Rad (США) и Терцик (Россия).
Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в 1,5% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, при УФ освещении на трансиллюминаторе «Волна» (Россия). Полуколичественную оценку проводили с помощью программы Gel-Pro, принимая
за 100% интенсивность флюоресценции β-актина.
У всех больных и у практически здоровых лиц хемокины (CCL3/MIP-1α,
CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL11/эотаксин, CCL24/эотаксин-2, CXCL8/IL-8,) определяли в сыворотке крови количественным методом мультиплексного хемилюминисцентного анализа с использованием магнитных частиц на приборе MagPix (Luminex,
США). Для количественного определения хемокинов использовались наборы серии
Milliplex mag. (Millipore,США) номер по каталогу HCYTOMAG-62K-PX23. Анализировали согласно инструкции фирмы производителя.
Всем больным БА в осенне-зимне-весенний период дополнительно выполнялся
браш-биоптат слизистой оболочки носоглотки на наличие инфекционных агентов (вируса парагриппа, РС-вируса, аденовируса, M. pneumoniae, Ch. Psitaci). ПЦР выполняли
на амплификаторах: iCycler Bio-Rad (США) – пробирки 0,2 мл и Терцик ( Россия) – пробирки 0,6 мл. Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в 1,5% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, при УФ освещении на трансиллюминаторе
«Волна» (Россия).
Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью стандартного
пакета прикладного статистического анализа SPSS for Windows (Statistical Package for
Social Science, версия 16.0).
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе исследования было показано, что в слизистой оболочке носоглотки у
контрольной группы экспрессируются все гены хемокинов и их рецепторов, включенные в исследование. При анализе экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов в
слизистой оболочке носоглотки практически здоровых лиц в зависимости от фактора
табакокурения, оказалось, что в подгруппе курящих лиц достоверно снижались уровни
экспрессии мРНК CXCL8/IL-8 в 29 раз и CCL5/RANTES в 30 раз по сравнению с
подгруппой некурящих лиц как представлено на рисунке 1.
10
В сыворотке крови содержание CXCL8/IL-8 было достоверно снижено у курящих
практически здоровых лиц в 2,2 раза по сравнению с некурящими лицами.
140
100
80
Некурящие лица
60
Курящие лица
40
CXCR2
CXCR1
CCR5
CCR3
CCR1
CCL24/эотакс…
CCL11/эотаксин
CCL4/MIP-1β
CCL3/MIP-1α
0
CXCL8/IL-8
*
*
20
CCL5/RANTES
% отношения к β-актину
120
*- статистически значимо при р<0,05
Рисунок 1. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов у контрольной группы в
зависимости от фактора табакокурения
Отрицательные
взаимосвязи
были
обнаружены
между
мРНК
CXCL8/IL-8,
CCL5/RANTES слизистой оболочки носоглотки и табакокурением как представлено на
рисунке 2. У группы курящих практически здоровых лиц высчитывался индекс
курящего человека (пачка/лет), который составлял от 1,5 до 5. При проведении
корреляционного анализа отрицательные взаимосвязи оказались между экпрессией
мРНК CXCL8/IL-8 носоглотки и индексом курящего человека (пачка/лет).
r=-0,6; p=0,0007
r=-0,6; p=0,0007
мРНК
CXCL8/IL-8
носоглотки
ТАБАКОКУРЕНИЕ
мРНК
CCL5/RANTES
носоглотки
Рисунок 2. Корреляционные связи между экспрессией мРНК CXCL8/IL-8,
CCL5/RANTES слизистой оболочки носоглотки и табакокурением у практически
здоровых лиц
11
Обратной взаимосвязь была между содержанием CXCL8/IL-8 в сыворотке крови и
индексом курящего человека (пачка/лет), что показано на рисунке 3. Таким образом, чем
длительней курение, тем меньше будет содержание CXCL8/IL-8 в сыворотке крови и
экспрессия мРНК в слизистой оболочке носоглотки.
r=-0,6;p=0,003
r=-0,8;p=0,0001
ИНДЕКС
КУРЯЩЕГО
ЧЕЛОВЕКА
(ПАЧКА/ЛЕТ)
мРНК
CXCL8/IL-8
носоглотки
CXCL8/IL-8
сыворотки
Рисунок 3. Корреляционные связи между экспрессией мРНК CXCL8/IL-8
носоглотки, содержанием CXCL8/IL-8 в сыворотке и индексом курящего человека
(пачка/лет) у практически здоровых лиц
Можно предположить, что табакокурение вызывает либо "дефект синтеза", либо
"истощение функционального резерва" CXCL8/IL-8. При наличии "дефекта синтеза",
CXCL8/IL-8 воспроизводится в сниженном количестве и табакокурение рассматривается в качестве "блокатора "его синтеза, а при "истощении функционального резерва" на
ранних сроках табакокурения, возможно, имела место компенсаторная реакция в виде
увеличения уровня CXCL8/IL-8, затем как проявление декомпенсации – снижение его
синтеза. Несмотря на это, и в том и в другом случаях имел место дефицит экспрессии
мРНК CXCL8/IL-8.
При сравнении показателей группы больных БА с контрольной группой была выявлена достоверно повышенная экспрессия мРНК CCL11/эотаксина, CCL24/эотаксина-2,
CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β и рецептора к CXCL8/IL-8 CXCR1в слизистой оболочке
носоглотки как показано на рисунке 4.
Достоверно были повышенными в сыворотке крови у больных БА: CCL5/RANTES в
3 раза, CXCL8/IL-8 в 5 раз и CCL24/эотаксин-2 в 7 раз по сравнению с контрольной
группой, что представлено в таблице 1.
Как видно из полученных данных в слизистой оболочке носоглотки и в сыворотке
крови повышалось содержание хемокинов, участвующих и в гуморальном и в клеточноопосредованном иммунных ответах.
12
140
% отношения к β-актину
120
100
*
80
60
Контрольная группа
40
20
Больные БА
*
*
0
*
*
*- статистически значимо при р<0,05
Рисунок 4. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов у больных БА
Это совпадает с данными ряда авторов Zietkowski Z. et al. (2010), Chae S.C. et al.
(2004) о том, что при БА хемокины группы эотаксинов имеют тенденцию к повышению.
Группа
эотаксинов
(CCL11/эотаксин,
CCL24/эотаксин-2)
входят
в
группу
провоспалительных хемокинов, участвующие в гуморальном иммунном ответе.
Таблица 1. Содержание хемокинов в сыворотке крови больных БА по сравнению с
практически здоровыми лицами (Ме (Q1-Q2)
Хемокины (пкг/мл)
Контрольная группа
Больные БА
CCL3/MIP-1α
0 (0-0)
9(0-88)
CCL4/MIP-1β
81,6(80,1-89,8)
93(0-193)
CCL5/RANTES
91515,4
(75783-116310,1)
269099(0-698849)*
CCL11/эотаксин
193,6(190-206,4)
145(24-284)*
CCL24/эотаксин-2
172,8(165,3-180,9)
1265(141-3381)*
CXCL8/IL-8
12,4(8,4-17,7)
56(2-423)*
*-статистически значимо при р<0,05
13
Что же касается повышенной экспрессии мРНК CCL3/MIP-1α и CCL4/MIP-1β в
слизистой оболочке носоглотки и повышения содержания CCL5/RANTES в сыворотке,
то они показывают активность как гуморального, так и клеточно-опосредованного
иммунного воспаления у больных БА и в системе органов дыхания, и в сыворотке
крови. Это подтверждается данными ряда авторов Saad-El-Din Bessa S. (2012), Louise N.
(2003), Chvatchko Y. (2003). Так, например, по данным Saad-El-Din Bessa S. et al. (2012)
CCL5/RANTES можно использовать в качестве неинвазивного маркера сыворотки крови
для мониторинга тяжести БА. А Louise N. et al. (2003) показали, что CCL3/MIP-1α и
CCL5/RANTES почти всегда связаны с вирусными инфекциями.
У 48 из 70 больных БА ввиду наличия мокроты удалось изучить клеточный состав
мокроты, в котором присутствовали эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты,
моноциты и эпителий бронхов. В ходе статистического анализа были получены положительные корреляционные связи между экспрессией мРНК хемокинов слизистой оболочки носоглотки и клетками мокроты (мРНК CCL3/MIP-1β и эозинофилами, эпителием
бронхов, нейтрофилами, лимфоцитами, моноцитами; мРНК CCL5/RANTES и эозинофилами, нейтрофилами, моноцитами, макрофагами; мРНК CCL11/эотаксина и моноцитами
мокроты). Полученные данные позволяют утверждать, что по выраженности экспрессии
мРНК хемокинов слизистой оболочки носоглотки можно судить о клеточном составе
мокроты. Полученные данные также демонстрируют, что в очаг активного воспаления
эозинофилы и нейтрофилы привлекаются одними и теми же хемокинами: CCL3/MIP-1β
и CCL5/RANTES как показано на рисунке 5. Это подтверждается данными Волковой
Л.И. и соавт., (2000) о эозинофильно-нейтрофильном воспалении в бронхах у больных
БА.
r=0,3;p=0,005
r=0,3;p=0,01
r=0,4;p=0,02
r=0,3;p=0,01
Эозинофилы
мокроты
мРНК CCL3/MIP-1β и
CCL5/RANTES
носоглотки
Нейтрофилы
мокроты
Рисунок 5. Корреляционные связи между экспрессией мРНК CCL3/MIP-1β,
CCL5/RANTES и клетками мокроты
14
При проведении корреляционного анализа была установлена зависимость показателей выраженности бронхиальной обструкции от содержания хемокинов в сыворотке
крови больных БА. Достоверная обратная корреляция была между содержанием
CCL5/RANTES в сыворотке крови и ОФВ1 после проведения пробы с β2-агонистом как
показано на рисунке 6. Обратной корреляционной взаимосвязь была между содержанием CCL11/эотаксина сыворотки и индексом Тиффно. Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии CCL5/RANTES и CCL11/эотаксина на бронхиальную
проходимость у всех больных БА (n=70).
r=-0,3;p=0,03
ОФВ1 после
проведения пробы
с β2-агонистом
CCL5/RANTES
сыворотки
r=-0,3;p=0,04
CCL11/эотаксин
сыворотки
Индекс Тиффно
Рисунок 6. Корреляционные связи между содержанием CCL5/RANTES,
CCL11/эотаксина в сыворотке и показателями бронхиальной обструкции
В нашем исследовании оценивалась экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов у
больных БА, разделенных на подгруппы в зависимости от клинико-патогенетических
вариантов БА.
В подгруппе больных с атопической БА были выявлены достоверно повышенная экспрессия мРНК CCL24/эотаксина-2 по сравнению с подгруппой больных с инфекционнозависимым
вариантом,
а
также
достоверно
повышенная
экспрессия
мРНК
CCL24/эотаксина-2, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CXCR1 и сниженная экспрессия
мРНК CCR1, по сравнению с контрольной группой.
В сыворотке крови этой подгруппы достоверно сниженным было содержание
CCL11/эотаксина и повышенным – CCL24/эотаксина-2, CCL5/RANTES по сравнению с
контрольной группой. Также для этой группы больных БА характерно достоверное
снижение содержания эотаксина при повышенном содержании эотаксина-2 в сыворотке
крови.
15
В подгруппе, где сочетались атопический и инфекционно-зависимый варианты БА
наблюдалась достоверно повышенная экспрессия мРНК CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β и
мРНК CXCR1 по сравнению с контрольной группой. В сыворотке крови этой подгруппы
достоверно пониженным было содержание CCL11/эотаксина и повышенным CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL24/эотаксина-2 по сравнению с контрольной группой. Кроме того, содержание CCL4/MIP-1β было достоверно повышенным по сравнению с подгруппой больных БА с инфекционно-зависимым вариантом.
В подгруппе с инфекционно-зависимой БА достоверно сниженной была только экспрессия мРНК CCL24/эотаксина-2 по сравнению с контрольной группой. Вероятно, это
связано с перераспределением CCL24/эотаксина-2 в очаг активного воспаления, то есть
нижние дыхательные пути или же недостаточной его экспрессией. В сыворотке крови
этой подгруппы
достоверно повышенным было содержание CCL24/эотаксина-2 и
CCL5/RANTES по сравнению с контрольной группой.
Все больные БА (n=70) были обследованы на наличие внутриклеточной инфекции
(вирусы парагриппа, РС-вирусы, аденовирусы, M. pneumoniae, Ch. Psitaci) в слизистой
оболочке носоглотки методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР). У больных БА с
обострением заболевания вследствие перенесенного ОРЗ браш-биопсия слизистой
оболочки носоглотки выполнялась на 3-4 неделе, соответственно выявленные
инфекционные агенты встречались не так часто. Первую подгруппу больных БА с
выявленной инфекцией составили 16 (23%) пациентов.
Наиболее часто встречаемыми были возбудители: M. Pneumoniae у 5 пациентов, Ch.
Psitaci – у 4; реже встречались: вирус парагриппа - у 1, РС-вирус – у 1, аденовирус – у 1;
так же встречались сочетания: M. Pneumoniaе и Ch. Psitaci – у 2, сочетание Ch. Psitaci и
аденовируса – у 1, сочетание M. Pneumoniaе и РС-вируса – у 1 как показано на рисунке
7. В этой подгруппе достоверно повышенной была экспрессия мРНК CCL3/MIP-1α и
CXCR1 и сниженной - мРНК CCR1 по сравнению с контрольной группой, в отличие от
подгруппы больных БА с не выявленной инфекцией, где достоверных изменений экспрессии мРНК хемокинов не выявлялось. В сыворотке крови этой подгруппы достоверно сниженным было содержание CCL11/эотаксина и повышенным - CCL3/MIP-1α,
CCL5/RANTES, CCL24/эотаксин-2 по сравнению с контрольной группой. Повышение
содержания CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови у больных БА с выявленной инфекцией в нашем исследовании совпадало с данными Federica S. et al., (2000) о том, что
16
внутриклеточная инфекция может стимулировать экспрессию мРНК хемокинов, участвующие в аллергическом воспалении. Очень характерно повышение содержание в сыворотке крови CCL3/MIP-1α и CCL5/RANTES в подгруппе с выявленной инфекцией. По
данным Federica S. et al., (2000) содержание CCL3/MIP-1α и CCL5/RANTES всегда повышается в ответ на внутриклеточную инфекцию, в особенности на аденовирусную и
РС-вирусную.
сочетание M.
сочетание Ch.
Pneumoniaе
и РСPsitaci и
вируса -1
аденовируса
(6%).
1-(6%).
сочетание M.
Pneumoniaе и Ch.
Psitaci
2-(13%).
аденовирус
1-(6%).
РС-вирус 1(6%).
вирус парагриппа
1(6%).
M. Pneumoniae 5(32%).
Ch. Psitaci 4(25%).
Рисунок 7. Выявленная инфекция у больных БА в браш-биоптате слизистой
носоглотки
Во вторую подгруппу входили 54 (77%) с не выявленной инфекцией. При сравнении
экспрессии мРНК хемокинов и их рецепторов с контрольной группой достоверных отличий выявлено не было.
В сыворотке крови этой подгруппы достоверно сниженным было содержание
CCL11/ эотаксина и повышенным - CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES, CCL24/эотаксин-2 по
сравнению с контрольной группой.
Все обследованные больные БА в зависимости от фактора табакокурения были
разделены на подгруппы: курящих (n=18) и некурящих лиц (n=52). В подгруппе некурящих больных БА достоверно сниженной была экспрессия мРНК CXCL8/IL-8,
CCL5/RANTES, CCR1 и повышенной CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CXCR1 по сравнению с контрольной группой некурящих лиц. В сыворотке крови у подгруппы некурящих
больных БА достоверно повышенным было содержание CCL11/эотаксина, CCL3/MIP1α, CCL5/RANTES, CCL24/эотаксин-2 по сравнению с подгруппой некурящих лиц контрольной группы.
В подгруппе курящих больных БА достоверно сниженной была экспрессия мРНК
CCR1 и повышенной – мРНК CCL11/эотаксина, CCL4/MIP-1β по сравнению с кон-
17
трольной группой курящих лиц. В сыворотке же курящих больных БА достоверно повышенным было содержание CXCL8/IL-8, CCL5/RANTES, CCL24/эотаксина-2 по сравнению с группой курящих практически здоровых лиц, что свидетельствует об усиленной активности гуморального иммунного воспаления на фоне табакокурения.
Из обследованных нами больных БА с легкой степенью тяжести было 14 (20%) пациентов и 56 (80%) - со средней степенью тяжести заболевания. В соответствии с этим
больные БА подразделялись на подгруппы.
В подгруппе больных БА с легкой степенью тяжести заболевания достоверно сниженной была экспрессия мРНК CCR1 по сравнению с контрольной группой. В этой же
подгруппе достоверно повышенной была экспрессия мРНК CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP1β, CCL24/эотаксина-2, CXCR1 по сравнению с контрольной группой. В подгруппе
больных БА с легкой степенью тяжести заболевания было достоверно повышено в сыворотке крови содержание CCL3/MIP-1α, CCL24/эотаксин-2, CXCL8/IL-8 по сравнению
с контрольной группой.
В подгруппе, которую составили больные БА со средней степенью тяжести, достоверно сниженной была экспрессия мРНК рецепторов CCR1, CCR3 по сравнению с контрольной группой. Достоверно повышенной экспрессией в этой же подгруппе была
мРНК CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL11/эотаксина, CXCR1 по сравнению с контрольной группой. В подгруппе больных БА, где заболевание со средней степенью тяжести было достоверно повышенным в сыворотке крови содержание CCL3/MIP-1α,
CCL5/RANTES, CCL24/эотаксин-2 по сравнению с контрольной группой.
Резюмируя полученные данные, следует отметить, что достоверное повышение содержания CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови наблюдалось во всех подгруппах больных БА независимо от клинико-патогенетических вариантов БА, степени тяжести, наличия инфекции в носоглотке и фактора табакокурения, как показано в таблице 2. По
данным Chae S.C. et al. (2004) содержание CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови
положительно коррелирует с эозинофилами периферической крови. С учетом этих
данных CCL24/эотаксин-2 может являться биомаркером иммунного воспаления при БА.
Как показано в таблице 2, наряду с CCL24/эотаксином-2, повышенное содержание
CCL5/RANTES в сыворотке крови также было достоверным во всех подгруппах независимо от клинико-патогенетических вариантов, наличия инфекции в носоглотке, фактора
табакокурения, кроме подгрупп больных БА с легкой степенью тяжести заболевания.
18
Таким образом, повышенное содержание в сыворотке крови CCL5/RANTES характеризовало усиление иммунного воспаления у больных БА.
Таблица 2 Содержание хемокинов в сыворотке крови и экспрессия мРНК в
носоглотке у больных БА в зависимости от клинико-патогенетических вариантов БА,
фактора табакокурения, наличия инфекции в носоглотке и степени тяжести заболевания
Клиникопатогенетические
Хемокины
варианты
А
А+ИЗ
CCL3/
конц
MIP-1α
мРНК
CCL4/
конц
MIP-1β
мРНК
↑
↑↑
CCL5/
конц
↑
↑
RANTE
S
конц
н
-2
нет
↑
↑↑
↑
↓
мРНК
↑
IL-8
мРНК
носоглотке
Степень тяжести БА
нет
да
легкая
средняя
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑↑
↑
↑
↑
↑
↑↑
↑
↑
↑
↑↑
↓
↓
↑
↓
↓
↑
↑↑
конц
инфекции в
↓
конц
CXCL8/
да
Наличие
↑
мРНК
CCL24/э
отаксин
рение
↑↑
мРНК
CCL11/
эотакси
↑
ИЗ
Табакоку-
↑↑
↑
↑↑
↑↑
↑
↑↑
↓
↑↑
↑↑
↑↑
↑
↑
↑
↓
Примечание: ↑- статистически значимо при р<0,05; ↑↑- статистически значимо р<0,005
Исходя
из
полученных
данных,
хемокины
(CCL3/MIP-1α,
CCL4/MIP-1β,
CCL5/RANTES, CCL11/эотаксин, CCL24/эотаксин-2, CXCL8/IL-8) и их рецепторы
(CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2) в комплексе могут достоверно характеризовать
иммунное воспаление как в сыворотке крови, так и в системе органов дыхания у больных БА. Хемокин CCL24/эотаксин-2 может быть использован в качестве биомаркера
при БА.
19
Выводы
1. При атопической БА повышенная экспрессия мРНК СС-хемокинов (CCL3/MIP-1α,
CCL4/MIP-1β, CCL24/эотаксин-2) в слизистой носоглотки сочетается с повышенным
содержанием CCL5/RANTES и CCL24/эотаксин-2 и сниженным содержанием
CCL11/эотаксина в сыворотке крови, что характеризует преобладание Th-2 типа иммунного воспаления.
2. При инфекционно-зависимой БА выявлены минимальные отклонения системы ССхемокинов: сниженный уровень мРНК CCL24/эотаксин-2 в слизистой носоглотки и
повышенное содержание CCL5/RANTES и CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови.
Полученные данные подтверждают наличие Th-2 типа иммунного ответа в сыворотке
крови у больных инфекционно-зависимой БА.
3. При смешанном варианте БА (А+ИЗ) выявлены максимальные отклонения системы
СС-хемокинов: повышенный уровень мРНК CCL3/MIP-1α и CCL4/MIP-1β в слизистой носоглотки, и значительно повышенное содержание CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP1β, CCL5/RANTES и CCL24/эотаксина-2 в сочетании со сниженным содержанием
CCL11/эотаксина в сыворотке крови.
4. У практически здоровых курильщиков сниженная экспрессия мРНК CCL5/RANTES и
CXCL8/IL-8 в слизистой носоглотки сочетается со сниженным содержанием
CXCL8/IL-8 в сыворотке крови, что может свидетельствовать о повышенной чувствительности слизистой носоглотки к инфекции.
5. У курящих больных БА повышенная экспрессия мРНК CCL11/эотаксина, CCL4/MIP1β и сниженная экспрессия мРНК CCR1 сочетаются с повышенным содержанием
CXCL8/IL-8, CCL5/RANTES и CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови. Вероятнее
всего, табакокурение усиливает аллергическое воспаление у больных БА.
6. Установлена положительная корреляция между экспрессией мРНК CCL4/MIP-1β,
CCL5/RANTES слизистой носоглотки и количеством эозинофилов и нейтрофилов в
мокроте, что обуславливает эозинофильно-нейтрофильное воспаление дыхательных
путей при БА.
7. Установлены отрицательные корреляции между содержанием CCL11/эотаксина,
CCL5/RANTES сыворотки крови и основными показателям бронхиальной обструкции (индексом Тиффно и ОФВ1) соответственно. Полученные данные свидетельствуют о негативном влиянии CCL11/эотаксина и CCL5/RANTES сыворотки крови на
20
основные показатели бронхиальной обструкции (индекс Тиффно и ОФВ1) у больных
БА
Практические рекомендации
1. Повышенное содержание CCL24/эотаксина-2 в сыворотке крови рекомендуется использовать в качестве биомаркера бронхиальной астмы.
2.
Повышенное
содержание
CCL24/эотаксина-2
и
сниженное
содержание
CCL11/эотаксина в сыворотке крови больных БА может быть использовано для диагностики атопической бронхиальной астмы.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Бибкова (Ковалинская) А.А. Экспрессия мРНК некоторых хемокинов и их
рецепторов в слизистой оболочке носоглотки у практически здоровых лиц / Сысоев К.А., Семенов А.В., Любимова Н.Е., Арсентьева Н.В., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. // Медицинская иммунология. -2011. - Т 13. - №6. - С.617.
2. Бибкова (Ковалинская) А.А Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых
рецепторов в слизистой носоглотки больных бронхиальной астмой в зависимости от внутриклеточной инфекции/ Халиль А.М., Сысоев К.А., Трофимов В.И.,
Тотолян Арег А. // Ученые записки. - 2011. - Том XVIII. - № 3. - С. 34.
3. Бибкова (Ковалинская) А.А. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в слизистой оболочке носоглотки у больных бронхиальной астмой на фоне проводимой базисной терапии / Сысоев К.А., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. // Особенности течения и лечения заболеваний у жителей блокадного Ленинграда и их потомков. - 2011. Выпуск VII. - С. 315.
4. Бибкова (Ковалинская) А.А. Значимость определения некоторых хемокинов и
их рецепторов у больных бронхиальной астмой / Сысоев К.А., Семенов А.В., Любимова Н.Е., Арсентьева Н.В., Трофимов В.И., Тотолян Арег А. // Медицинская
иммунология. - 2012. - Том 14. - №1-2. - С.109.
5. Халиль А.М. Особенности течения хронической обструктивной болезни легких и
в сочетании с гастроэзофагальной рефлюксной болезнью / Трофимов В.И., Бибкова (Ковалинская) А.А. // Ученые записки.- СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 2012. - Том 19. - №1. - С. 78.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
6
Размер файла
481 Кб
Теги
бронхиальной, астмой, больных, некоторые, cxc, рецепторов, хемокины
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа