close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Фармакогностическое изучение некоторых видов рода Geranium L.

код для вставкиСкачать
1
На правах рукописи
РАЗАРЕНОВА КСЕНИЯ НИКОЛАЕВНА
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ
НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА GERANIUM L.
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Санкт-Петербург – 2013
2
Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная
химико-фармацевтическая академия» Минздрава России
Научный руководитель: Жохова Елена Владимировна
кандидат фармацевтических наук, доцент
Официальные оппоненты: Буданцев Андрей Львович
доктор биологических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Ботанический институт им. В. Л. Комарова Российской
академии наук, заведующий лабораторией растительных
ресурсов;
Половинко Андрей Евгеньевич
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры управления
и экономики фармации, фармацевтической технологии,
фармацевтической химии и фармакогнозии ГБОУ ВПО
«Северо-Западный государственный медицинский университет
имени И. И. Мечникова» Минздрава России
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздрава России
Защита состоится «23» апреля 2013 г. в 14.00 на заседании Диссертационного Совета
Д 208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химикофармацевтическая академия» Минздрава России (197376, г. Санкт-Петербург, ул.
Профессора Попова, д. 14)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская
государственная химико-фармацевтическая академия» Минздрава России по адресу: 197227,
г. Санкт-Петербург, пр. Испытателей, д. 14.
Автореферат разослан « 21 » марта 2013 г.
Учёный секретарь
Диссертационного совета Д 208.088.01,
кандидат фармацевтических наук, доцент
Наталья Владимировна Марченко
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
темы.
Одной
из
многочисленных
задач
современной
фармацевтической науки является поиск растительных источников биологически активных
веществ (БАВ) для создания на их основе препаратов различного фармакологического
действия. Многолетний опыт исследования лекарственных растений свидетельствует об их
многостороннем воздействии на организм человека и низкой токсичности по сравнению с
синтетическими лекарственными средствами.
Перспективными источниками для создания фитопрепаратов являются представители
рода герань – Geranium L. Герань пятнистая – G. maculatum L. (трава и корни) включена в
Британскую травяную Фармакопею. Герань каролинская – G. carolinianum L. (трава) и герань
Уилфорда – G. wilfordii Maxim. (трава) входят в Государственную Фармакопею Китайской
Народной Республики, а герань Тунберга – G. thunbergii Siebold et Zucc. (трава) – в Японскую
Фармакопею. Данные виды рекомендованы к использованию в качестве вяжущих,
гемостатических, антимикробных и противовоспалительных средств. Однако, родина
гераней пятнистой и каролинской – Северная Америка, в России они в диком виде не
встречаются. Герани Тунберга и Уилфорда произрастают на Дальнем Востоке. Из видов,
произрастающих на северо-западе Европейской России, лишь герань Роберта – G.
robertianum L. (трава) включена во Французскую Фармакопею.
На северо-западе Европейской России произрастает 12 видов рода Geranium, среди
которых некоторые находят применение в народной медицине при болезнях
пищеварительной системы (диарея, гастриты, колиты, энтероколиты), при воспалительных
заболеваниях ротовой полости, кровотечениях различного генеза, при подагре, ревматизме.
Для видов этого рода характерно наличие комплекса полифенольных соединений в
надземных и подземных органах. Однако, для большинства представителей рода сведения,
касающиеся состава фенольного комплекса и других групп БАВ, фрагментарны.
Вышеприведенные факты указывают на целесообразность подробного исследования
компонентного состава биологически активных соединений и фармакологической
активности представителей рода Geranium с целью введения их в научную медицину.
Диссертационная работа была выполнена на кафедре фармакогнозии СанктПетербургской государственной химико-фармацевтической академии (СПХФА) в
соответствии с планом научно-исследовательских работ СПХФА по теме «Мониторинг
перспективных лекарственных растений флоры России» (номер Государственной
регистрации 01200852355). Фармакологические и микробиологические исследования
проводились на базе лаборатории фармакологических исследований СПХФА и на кафедре
микробиологии СПХФА. Исследования с использованием приборных хроматографических и
спектроскопических методов выполнены в лаборатории аналитических методов НИУ
академии, лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В. Л.
Комарова Российской Академии Наук и лаборатории «ООО Аналит Продактс».
4
Цели и задачи исследования. Целью работы является оценка возможности
использования в качестве источников биологически активных веществ видов рода Geranium,
произрастающих на северо-западе Европейской России, а также комплексное
фармакогностическое изучение наиболее перспективных представителей данного рода.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Провести сравнительное изучение некоторых видов рода Geranium, произрастающих
на северо-западе Европейской России, по содержанию дубильных веществ и
антимикробной активности и выявить наиболее перспективные объекты для дальнейших
исследований;
• Провести сравнительное фитохимическое исследование отобранных на первом этапе
видов рода Geranium;
• Оценить острую токсичность водных извлечений из выявленных перспективных
представителей рода; изучить их антимикробную активность;
• Определить урожайность сырьевой фитомассы перспективных видов рода герань на
конкретных зарослях на территории Ленинградской области;
• Установить макро- и микроскопические признаки наиболее перспективного сырья;
провести товароведческий анализ для установления норм качества лекарственного
растительного сырья; разработать проект нормативного документа (проект
фармакопейной статьи – ФС) на сырье.
Научная новизна. Впервые определены содержание дубильных веществ и
антибактериальная активность 7 дикорастущих видов рода Geranium флоры северо-запада
Европейской России (G. prаtense L., G. sylvaticum L., G. palustre L., G. sanguineum L., G.
sibiricum L., G. robertianum L., G. pusillum L.) и культивируемого вида G. lividum L' Her. С
помощью современных физико-химических методов (ВЭЖХ, ГЖХ, спектрофотометрии)
изучен химический состав основных групп БАВ (флавоноидов, фенольных кислот,
углеводов, аминокислот) надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre.
Изучен компонентный состав, динамика накопления БАВ в сырье указанных видов в разные
фазы развития растений. Методом атомно-абсорбционной спектроскопии определен набор
макро- и микроэлементов надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G.
palustre.
Экспериментально определен уровень острой токсичности водных извлечений из
надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre.
Проведено определение урожайности G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre в
естественных условиях произрастания в Ленинградской области.
Практическая значимость. Разработана методика количественного определения
суммарного содержания флавоноидов в надземной части G. pratense. Определены сроки и
оптимальная фаза вегетации растения для заготовки сырья, а также оптимальный размер
сырьевой части, подлежащей заготовке. Установлены критерии, позволяющие оценить
подлинность и доброкачественность сырья G. pratense. Результаты работы использованы при
5
разработке проектов нормативных документов – ФС – на предлагаемые новые виды
лекарственного сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями».
Экспериментально установлено, что водные извлечения из надземной и подземной части G.
pratense обладают низкой токсичностью; также показана антибактериальная активность
сухих экстрактов растения. Результаты фитохимического и фармакологического
исследований надземной и подземной частей G. pratense могут быть использованы для
введения этих видов сырья в практику научной медицины, а также при целенаправленном
создании новых фитопрепаратов. Методика качественного и количественного определения
флавоноидов и фенольных кислот методом ВЭЖХ в надземной и подземной частях G.
pratense, G. sylvaticum, G. palustre введена в лекционный курс по дисциплине
«Фармакогнозия» для студентов фармацевтического факультета.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Межвузовской
научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета
поколений», посвященная 90-летию СПХФА (Санкт-Петербург, СПХФА 2009); Научнометодической конференции «Гаммермановские чтения – 2011» (Санкт-Петербург, СПХФА,
2011); 66-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011 г.); IIой Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием
«Молодая фармация – потенциал будущего» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2012); II
Международной научно-практической конференции «Современная медицина и
фармацевтика: анализ и перспективы развития» (Москва, 2012); Международной научнометодической конференции «Сандеровские чтения» (Санкт-Петербург, СПХФА, 2012); XVI
Международном съезде «Фитофарм» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием, посвященная 30-летию
фармацевтического факультета ЯГМА «Инновационные процессы в лекарствоведении»
(Ярославль, 2012).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 12 работах, в том числе 4
статьи в рецензируемых научных изданиях.
Основные положения, выносимые на защиту.
• Результаты сравнительного изучения восьми видов рода Geranium по содержанию
дубильных веществ и антимикробной активности;
• Исследование динамики накопления и компонентного состава основных групп БАВ
(флавоноидов, фенольных кислот, дубильных веществ, углеводов, аминокислот), а также
минерального состава надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre;
• Результаты изучения острой токсичности водных извлечений из надземной и
подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre;
•
Критерии оценки качества и подлинности видов сырья «Герани луговой трава» и
«Герани луговой корневища с корнями» по результатам товароведческого анализа и
их стандартизация.
6
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 235 страницах машинописного
текста, иллюстрирована 76 рисунками и 70 таблицами. Диссертация состоит из введения, 6
глав (обзор литературы, материалы и методы и четыре главы, содержащие результаты
экспериментальных исследований), основных результатов и выводов, списка литературы,
включающего 128 источников, из них 52 на иностранных языках и 5 приложений.
В первой главе рассмотрены систематическое положение, химический состав и
биологическая активность некоторых видов рода Geranium. Во второй главе приведены
основные материалы и методы исследований, использованные в экспериментальной работе.
В третьей главе приведены результаты сравнительного изучения восьми видов рода
Geranium по содержанию дубильных веществ и антимикробной активности. В четвертой
главе приведены результаты сравнительного фитохимического и фармакологического
анализа надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre, а также
результаты определения урожайности сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre на
конкретных зарослях на территории Ленинградской области. В пятой главе отражены
результаты исследования антимикробной активности сухих экстрактов, полученных на
основе надземной и подземной части G. pratense. Шестая глава посвящена вопросам
стандартизации сырья «Герани луговой трава» и «Герани луговой корневища с корнями»,
проведению товароведческого анализа, разработке критериев подлинности, нормативов
доброкачественности и определению сроков годности сырья. В разделе «Основные
результаты и выводы» приведены заключительные результаты и выводы по проделанной
работе. Приложение А включает список исследованных образцов видов рода Geranium;
Приложение Б – проект ФС на сырье «Герани луговой трава» и пояснительную записку к
нему; Приложение В – проект ФС на сырье «Герани луговой корневища с корнями» и
пояснительную записку к нему; Приложение Г – фотографии исследованных видов рода
Geranium, сделанные автором во время экспедиций в июне-августе 2009 года; Приложение Д
– Акт о внедрении результатов диссертационной работы.
Автор выражает признательность администрации СПХФА в лице ректора академии
профессора И. А. Наркевича за предоставленную возможность для выполнения
диссертационной работы. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам отдела
гербария БИН РАН Конечной Г. Ю. и Ефимову П. Г. за помощь в заготовке образцов сырья
видов рода Geranium, заведующей лаборатории фармакологических исследований Бурякиной
А. В., доценту кафедры микробиологии Караваевой А. В. и cотруднику лаборатории
аналитических методов Сипкиной Н. Ю. за помощь в проведении химических и
биологических экспериментов.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Материалы и методы исследования
Исследования проводились на 62 образцах сырья 8 видов рода Geranium (G. prаtense,
G. sylvaticum, G. palustre, G. sanguineum, G. sibiricum, G. robertianum, G. pusillum, G. lividum),
заготовленных в Ленинградской, Псковской и Новгородской областях в 2009-2012 годах.
7
Обнаружение основных групп БАВ в исследованных образцах и изучение
компонентного состава флавоноидов, фенольных кислот, углеводов, аминокислот, макро- и
микроэлементов проводили с помощью общепринятых химических реакций, хроматографии
на бумаге (БХ) и современных физико-химических методов: УФ-спектрофотометрии,
атомно-абсорбционной спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГЖХ. Для определения антимикробного
действия использовали водные и водно-спиртовые извлечения из образцов сырья видов рода
Geranium. Исследования острой токсичности для водных извлечений из надземной и
подземной части G. prаtense, G. sylvaticum, G. palustre проводили на белых нелинейных
мышах самцах массой тела 18-23 г.
Определение урожайности сырья на основе надземной и подземной части G. prаtense, G.
sylvaticum, G. palustre проводили в пределах конкретных зарослей, расположенных в
Гатчинском и Всеволожском районах Ленинградской области.
Отбор проб и товароведческий анализ сырья проводили в соответствии с требованиями
ОФС 42-0013-03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора
проб» (2003) и ГФ XI, вып. 1, 2. Составление проекта нормативной документации –
фармакопейной статьи на сырье осуществляли в соответствии с ОСТ 91.500.05.001-00.
«Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» (2000).
2. Результаты исследования
Сравнительное исследование некоторых видов рода Geranium по содержанию
дубильных веществ и антимикробной активности
Объектами исследования служили образцы надземной части 8 видов рода Geranium
(фаза цветения-начала плодоношения): G. prаtense, G. palustre, G. sylvaticum, G. sanguineum,
G. robertianum, G. sibiricum, G. pusillum и G. lividum. Для G. prаtense, G. palustre и G.
sylvaticum исследовали также подземную часть (фаза плодоношения).
Для сравнительной оценки содержания дубильных веществ в указанных видах гераней
использовали перманганатометрический метод Левенталя (ГФ XI), перманганатометрический
метод в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином и спектрофотометрический
метод. При количественном определении дубильных веществ спектрофотометрическим
методом применяли аналитическую длину волны 274±2 нм, так как при данной длине волны
максимумы поглощения водно-спиртового извлечения из надземных и подземных частей
разных видов герани и препарата танина (ГФ X) совпадают.
Результаты количественного определения дубильных веществ тремя методами
представлены в таблице 1.
Для G. sibiricum, G. robertianum, G. pusillum и G. lividum желатиновый метод оказался
непригодным, т.к. при добавлении раствора желатина к водной вытяжке из надземной части
указанных гераней выраженный осадок не образовывался. Спектрофотометрический метод
неприемлем в отношении G. lividum, т.к. спектр поглощения спирто-водного извлечения из
данной герани не имеет выраженного максимума в диапазоне длин волн 200–500 нм.
8
Таким образом, согласно полученным данным среди анализируемых видов рода герань
наибольшее содержание дубильных веществ отмечено для надземной и подземной частей G.
sylvaticum, G. prаtense, G. palustre, а также для надземной части G. sanguineum.
Таблица 1 – Результаты определения содержания дубильных веществ в исследуемых видах
рода Geranium (в % в пересчете на танин в пересчете на воздушно-сухое сырье)
N
п/п
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Вид и его анализируемая часть
G. prаtense, надземная часть
G. prаtense, подземная часть
G. palustre, надземная часть
G. palustre, подземная часть
G. sylvaticum, надземная часть
G. sylvaticum, подземная часть
G. sanguineum, надземная часть
G. sibiricum, надземная часть
G. robertianum, надземная часть
G. pusillum, надземная часть
G. lividum, надземная часть
Методы количественного анализа дубильных веществ
ПерманганаЖелатиновый
Спектрофототометрический
метод
метрический
15,04±0,48
3,60±0,18
9,70±0,48
23,40±0,28
14,32±0,43
13,92±0,36
13,93±0,33
5,62±0,28
7,29±0,33
21,09±0,76
15,51±0,47
4,74±0,15
10,53±0,42
4,34±0,22
6,55±0,29
23,55±0,31
14,96±0,21
8,41±0,43
13,71±0,35
8,08±0,42
7,57±0,28
4,48±0,22
6,97±0,09
–
4,13±0,17
7,32±0,36
–
7,64±0,38
4,22±0,18
–
4,56±0,24
–
–
Антимикробную активность водных и 70%-спиртовых извлечений из 8 видов герани
определяли методом радиальной диффузии в агар согласно методике ГФ XII. Использовали
следующие тест-микроорганизмы: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 209-P, Bacillus cereus ATCC 10702. В качестве
объекта сравнения использовали корневища лапчатки прямостоячей – Potentilla erecta L.
Результаты исследования представлены в таблице 2.
В результате было установлено, что G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre проявили
наиболее выраженную антибактериальную активность среди 8 видов (таблица 2), что
коррелирует с содержанием дубильных веществ.
Таблица 2 – Антимикробная активность водных и водно-спиртовых вытяжек из надземной и
подземной частей различных видов рода Geranium
S. aureus
E. coli B. cereus P. aeruginosa
Образец
диаметр задержки роста микроорганизмов в мм
В
С
В С
В
С
В
С
надземная часть
10
14 14 9 13
9
13
14
G. palustre
подземная часть
11-12
13
9
0
8
13
0
14
надземная часть
9-10
0
0
0 14
0
9
15
G. sylvaticum
подземная часть
9-10
14 14 0 10 12
14
15
надземная часть
0
12
0
0 14
9
0
12
G. prаtense
подземная часть
13-14
12 17 0 10
9
10
9
надземная часть
0
15
0
0
0
0
0
0
G. sanguineum
надземная часть
0
8
0
0
0
0
0
12
G. robertianum
надземная часть
0
8
0
0
0
0
0
0
G. sibiricum
надземная часть
0
0
0
0
0
0
0
12
G. pusillum
надземная часть
0
0
0
0
0
9
0
0
G. lividum
корневища
12
13
0
0
0
9
12
13
Potentilla erecta
Примечание. В – водное извлечение; С – спиртовое извлечение.
9
Для водных и 70%-спиртовых извлечений из надземных и подземных частей трех
названных видов выявлена активность в отношении грамположительных и
грамотрицательных микроорганизмов, в том числе спорообразующих.
С учетом полученных данных по количественному содержанию дубильных веществ и
антимикробной активности для дальнейших исследований выбраны три многолетних
корневищных вида – G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre, которые являются еще и наиболее
часто встречаемыми на северо-западе Европейской России видами среди представителей рода герань.
Сравнительное фитохимическое исследование G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre
На основании проведенного общего фитохимического анализа установлено, что
основными группами БАВ G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre являются полифенольные
соединения, полисахариды, аминокислоты. В надземной и подземной частях исследуемых
видов обнаружены гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества и фенольные
кислоты, в надземной части кроме того показано наличие флавоноидов. Три исследуемых вида
содержат незначительные количества сапонинов и азотсодержащих соединений, не содержат
кардиотонических гликозидов, антраценпроизводных, кумаринов и эфирного масла.
При исследовании динамики накопления экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом
этиловым 40%, установлено, что при увеличении длины побегов G. pratense, G. sylvaticum, G.
palustre содержание экстрактивных веществ уменьшается. В качестве оптимального размера
сырьевой части нами рекомендовано заготавливать побеги длиной до 20-25 см. При
сравнительном изучении содержания экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом
этиловым 40%, отдельно в корневищах и в корнях исследуемых видов получено, что в
корнях их больше, чем в корневищах. Следовательно, в качестве сырья на основе
подземных органов мы рекомендуем использовать корневища с корнями.
Изучение компонентного состава и содержания фенольных кислот и флавоноидов
осуществляли методом ВЭЖХ. В надземной и подземной частях G. pratense и G. sylvaticum, а
также в надземной части G. palustre обнаружены галловая и эллаговая кислоты. В надземной
части G. pratense и G. palustre идентифицирована протокатеховая кислота. В надземной части
G. sylvaticum и G. palustre обнаружена хлорогеновая кислота. Гиперозид был идентифицирован
в надземной части трех исследуемых видов. В надземной части G. pratense кроме того был
обнаружен изокверцитрин. В G. sylvaticum и G. palustre все названные соединения были
идентифицированы впервые. В G. pratense впервые обнаружена протокатеховая кислота.
Примеры хроматограмм спиртовых извлечений из исследуемых видов приведены на
рисунках 1-2. В подземной части G. palustre при проведении ВЭЖХ-исследования названные
соединения не были обнаружены (таблица 3).
Установлено, что среди рассматриваемых объектов максимальное количество
свободной галловой кислоты отмечено в надземной части G. pratense (таблица 3). Этот вид
отличается от G. sylvaticum и G. palustre также максимальным содержанием свободной
эллаговой кислоты в надземной и подземной частях. Однако, по содержанию флавоноидного
гликозида гиперозида надземная часть G. pratense уступает надземной части G. sylvaticum и
G. palustre.
10
I
II III
IV
I
II
Рисунок 1 – Хроматограммы (ВЭЖХ) спиртового извлечения травы G. pratense (I – длина волны
271 нм, III – длина волны 254 нм, IV – длина волны 354 нм) и травы G. palustre (II – длина волны
261 нм): 1 – галловая кислота, 2 – хлорогеновая кислота, 3 – эллаговая кислота, 4 – гиперозид, 5 –
изокверцитрин. Условия хроматографирования: прибор – хроматограф фирмы «Shimadzu»
(Япония), модель LC – 20AB Prominence, колонка Zorbax Eclipse XDB C18, 250x4,6 мм, 5 мкм,
детектор диодно-матричный SPD – M20A, элюент А – раствор кислоты трифторуксусной 0,03%,
элюент В – ацетонитрил, режим градиентного элюирования.
Рисунок 2 – Хроматограммы (ВЭЖХ) спиртового извлечения корневищ с корнями G. sylvaticum
(I – длина волны 271 нм) и G. pratense (II – длина волны 254 нм): 1 – галловая кислота, 2 –
эллаговая кислота
I
III
II
IV
Рисунок 3 – Хроматограммы (ВЭЖХ) гидролизата травы G. pratense (I – длина волны 261 нм, II –
длина волны 365 нм, III – длина волны 254 нм) и корневищ с корнями G. pratense (IV – длина
волны 254 нм): 1 – протокатеховая кислота, 2 – кверцетин, 3 – кемпферол, 4 – эллаговая кислота
11
Таблица 3 – Содержание фенольных соединений в надземной и подземной частях G. pratense,
G. sylvaticum, G. palustre (сбор 2010 года, фаза конца цветения-начала плодоношения)
Название
соединения
Галловая
кислота
Эллаговая
кислота
Протокатеховая кислота
Хлорогеновая кислота
Гиперозид
Изокверцитрин
Содержание обнаруженных фенольных соединений, среднее значение
Время
определения в мг/г абсолютно-сухого сырья
удержиG. pratense G. sylvaticum G. palustre G. pratense G. sylvaticum G. palustre
вания, надземная надземная надземная подземная подземная подземная
мин
часть
часть
часть
часть
часть
часть
–
3,88
3,57
0,17
1,50
0,92
1,38
29,38
5,14
2,29
0,55
8,83
1,76
6,95
0,23
–
0,38
–
–
12,55
–
1,85
2,98
–
–
29,92
1,69
3,02
3,26
–
–
30,39
0,24
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Примечение. Прочерк означает отсутствие компонента на хроматограмме.
С целью установления, какие фенольные соединения трех исследуемых видов находятся в
связанной форме, а какие в свободном состоянии, методом ВЭЖХ было проведено исследование
гидролизатов их сырья. Гидролизаты были получены при кипячении сырья с кислотой
хлористоводородной 2М с последующей обработкой экстракта этилацетатом. Этилацетатную фазу
отделяли, этилацетат отгоняли, полученный сухой остаток растворяли в спирте и исследовали
методом ВЭЖХ.
Хроматограммы гидролизатов G. pratense приведены на рисунке 3. В гидролизатах
надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, а также в гидролизате надземной части
G. palustre были идентифицированы галловая кислота, эллаговая кислота и протокатеховая
кислота. Рассчитанное количество указанных фенольных соединений в гидролизате превышало
их содержание в суммарных извлечениях из сырья, что свидетельствует о присутствии в
исходных образцах галлотаннинов, эллаготаннинов, производных протокатеховой кислоты. В
гидролизатах надземной части G. palustre и G. sylvaticum идентифицирована кофейная кислота,
являющаяся, вероятно, продуктом гидролиза хлорогеновой кислоты, обнаруженной в надземной
части названных видов и не обнаруженной в их гидролизате. В гидролизате надземной части трех
исследуемых видов идентифицированы флавоноловые агликоны кверцетин и кемпферол.
Для оценки количественного содержания флавоноидов в сырье исследуемых видов была
разработана методика дифференциальной спектрофотометрии. Установлены следующие
условия: стандартный образец – рутин; аналитическая длина волны 410 нм,
комплексообразователь – алюминия хлорида спиртовый раствор 1%, экстрагент спирт
этиловый 40%, режим экстракции – трехкратная мацерация на кипящей водяной бане по 30
минут на каждой ступени, соотношение сырья и экстрагента 1:30. Оптимальный размер
частиц сырья – 2 мм. Время взаимодействия алюминия хлорида с флавоноидами – 30 минут.
12
Проведена валидационная оценка методики. Установлено, что предложенная методика
отвечает современным требованиям: она специфична, носит линейный характер, позволяет
получить достоверные результаты, воспроизводима в условиях лаборатории. Относительная
ошибка опыта не превышает 5%. С использованием разработанной методики была
определена динамика накопления суммы флавоноидов в надземной части G. pratense, G.
sylvaticum, G. palustre в разные фазы вегетации (таблица 4).
Таблица 4 – Результаты определения содержания флавоноидов (в % в пересчете на
абсолютно-сухое сырье) в различные фазы вегетации в надземной части G. pratense, G.
sylvaticum, G. palustre
Объект
G. pratense
G. sylvaticum
G. palustre
Содержание флавоноидов (%) по фазам развития растения
Б
Ц
кЦ-нП
П-нС
3,21±0,08
3,65±0,15
2,70±0,14
3,48±0,14
2,22±0,04
2,27±0,11
3,81±0,19
3,42±0,17
1,89±0,09
2,61±0,12
2,93±0,15
2,18±0,09
Примечание. Б – бутонизация, Ц – цветение, кЦ-нП – конец цветения–начало плодоношения, П-нС – плодоношение–
начало осыпания семян (массовое созревание плодов).
Наибольшее количество флавоноидов для G. pratense отмечено в фазу цветенияплодоношения. Для G. sylvaticum, G. palustre максимум содержания флавоноидов определен
в период бутонизации.
Количественное содержание суммы таннидов в сырье определяли в сравнении двумя
методами: перманганатометрическим титрованием по методике ГФ XI (метод 1) и
спектрофотометрически в пересчете на кислоту галловую согласно методике, разработанной
для сырья на основе надземной и подземной частей G. pratense (метод 2).
При разработке спектрофотометрической методики определения суммарного
содержания дубильных веществ длина волны 274 нм была предложена в качестве
аналитической, т.к. максимумы поглощения УФ-спектров водно-спиртовых вытяжек из
надземной и подземной частей трех исследуемых видов совпадают с максимумами
поглощения УФ-спектров раствора кислоты галловой. Кислота галловая была выбрана в
качестве стандартного образца еще и потому, что она была обнаружена ранее методом ВЭЖХ
в свободном виде в трех исследуемых видах.
Установлены технологические параметры методик: а) для травы G. pratense
оптимальная степень измельчения сырья составляет 2 мм; для полноты извлечения
необходима однократная экстракция спиртом этиловым 40% на кипящей водяной бане в
течение 30 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:100; б) для корневищ с корнями G.
pratense наиболее полное извлечение дубильных веществ достигается с использованием
спирта этилового 40%, в образцах сырья со степенью измельченности 2 мм, при нагревании
на кипящей водяной бане в течение 90 мин и соотношении сырья и экстрагента 1:125.
Проведена валидационная оценка разработанных методик. Установлено, что
предложенные методики отвечают современным требованиям.
В результате использования двух методов количественного определения в образцах
сырья трех иследуемых видов выявлена тенденция изменения содержания таннидов по фазам
13
вегетации растений (таблица 5). Для изученных образцов надземной и подземной частей
видов герани результаты метода 1 коррелируют с результатами метода 2. При этом более
высокие значения по содержанию таннидов во всех образцах (за исключением корневищ с
корнями G. palustre) получены методом перманганатометрии, что может быть объяснено
различной избирательностью данных методик в отношении этой группы фенольных
соединений.
Таблица 5 – Количественное содержание дубильных веществ (в % в пересчете на абсолютносухое сырье) в траве и корневищах с корнями G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre
Содержание дубильных веществ, %
Фаза
Вид герани
трава
корневища с корнями
вегетации
метод 1
метод 2
метод 1
метод 2
24,63±1,23
38,82±0,35
10,56±0,19
21,62±1,07
Б
16,04±0,73
32,70±0,85
11,13±0,21
22,62±1,12
Ц
G. pratense
17,15±0,81
34,07±1,53
10,83±0,39
23,90±0,57
кЦ-нП
17,38±0,67
34,39±1,41
8,19±0,22
17,67±0,72
П-нС
13,58±0,64
42,05±1,77
13,22±0,44
28,80±0,71
Б
11,31±0,06
37,98±1,82
9,57±0,21
20,92±0,59
нЦ
G. sylvaticum
13,71±0,54
38,64±1,41
12,54±0,42
26,78±0,86
кЦ-нП
11,57±0,53
28,46±1,17
10,32±0,24
22,11±0,64
П-нС
4,16±0,21
27,29±1,25
19,90±0,84
Б
37,68±1,20
5,27±0,17
28,79±1,35
17,88±0,29
34,27±0,34
Ц
G. palustre
4,23±0,20
28,74±1,52
15,94±0,29
30,58±1,29
кЦ-нП
3,23±0,06
23,71±1,05
14,49±0,21
27,10±1,07
П-нС
Примечание. Обозначение – см. таблицу 4.
Наибольшее содержание дубильных веществ в надземной части G. sylvaticum и G.
palustre, а также в корневищах с корнями G. sylvaticum и G. pratense отмечается в фазу
бутонизации. В надземной части G. pratense максимум накопления таннидов приходится на
период с начала цветения до начала плодоношения. В подземной части G. palustre
максимальное количество дубильных веществ определено в фазу цветения.
Из надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre были выделены
свободные моносахариды (СМС) и полисахаридные комплексы: водорастворимые
полисахариды (ВРПС, или полисахаридная фракция-1, ПФ-1) и полисахаридная фракция-2
(ПФ-2). СМС извлекали спиртом этиловым 82% из сырья, предварительно очищенного от
липофильных веществ, ПФ-1 – водой из шрота, оставшегося после выделения свободных
моносахаридов, ПФ-2 – раствором аммония оксалата и кислоты щавелевой 0,4% (1:1) при
80°С из шрота, оставшегося после выделения полисахаридной фракции-1.
Хроматографическими методами (БХ, ГЖХ триметилсилильных производных) среди
свободных моносахаридов надземной и подземной частей G. pratense, G. sylvaticum и G.
palustre идентифицированы манноза, глюкоза, галактоза, рамноза, арабиноза. В составе СМС
подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre преобладает глюкоза.
Мономерный состав комплексов ПФ-1 (ВРПС) и ПФ-2 определяли методами БХ и
ГЖХ после их гидролиза раствором кислоты трифторуксусной 2% и 20% соответственно.
14
Результаты показали, что комплексы ВРПС из надземной и подземной частей G. pratense, G.
sylvaticum и G. palustre построены из остатков нейтральных моносахаридов: маннозы,
глюкозы, галактозы, рамнозы, арабинозы, ксилозы – и кислоты галактуроновой. В составе
ВРПС из образцов надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre преобладает
манноза и галактуроновая кислота. Основным мономерным звеном комплексов ВРПС
подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre является глюкоза. Для ВРПС
подземной части G. palustre следует отметить кроме того высокое содержание
галактуроновой кислоты.
Установлена динамика содержания СМС и ВРПС в сырье исследуемых видов по фазам
вегетации спектрофотометрическим методом после реакции с фенолом и кислотой серной
концентрированной в пересчете на галактозу (таблица 6).
Максимальное накопление СМС наблюдалось в фазу бутонизации во всех объектах
исследования, за исключением корневищ с корнями G. pratense. В подземной части G. pratense
максимум содержания СМС приходился на фазу конца цветения – начала плодоношения. Для
всех образцов сырья максимальное накопление ВРПС отмечалось в фазу цветения.
Таблица 6 – Содержание свободных моносахаридов (СМС) и водорастворимых
полисахаридов (ВРПС) (в % в пересчете на абсолютно-сухое сырье) в различные фенофазы в
надземной и подземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre
Содержание углеводов, %
Фаза
Вид герани
надземная часть
подземная часть
вегетации
СМС
ВРПС
СМС
ВРПС
6,2±0,2
6,9±0,3
7,5±0,3
10,7±0,5
Б
6,9±0,3
8,3±0,4
8,8±0,4
10,0±0,4
Ц
G. pratense
3,4±0,1
9,3±0,4
5,5±0,2
10,4±0,5
кЦ-нП
5,9±0,1
9,3±0,2
6,8±0,3
7,8±0,3
П-нС
2,9±0,1
9,0±0,3
5,9±0,2
10,5±0,5
Б
6,4±0,3
8,3±0,3
7,5±0,2
9,3±0,4
нЦ
G. sylvaticum
2,6±0,1
8,4±0,4
5,9±0,1
9,8±0,4
кЦ-нП
5,8±0,3
6,1±0,2
5,9±0,2
7,9±0,3
П-нС
Б
5,3±0,2
2,8±0,1
7,1±0,3
2,9±0,1
Ц
3,8±0,2
3,9±0,1
6,8±0,2
5,5±0,2
G. palustre
3,8±0,1
2,2±0,1
2,2±0,1
2,3±0,1
кЦ-нП
П-нС
4,4±0,2
2,7±0,1
2,8±0,1
3,0±0,1
Примечание. Обозначение – см. таблицу 4.
В составе комплексов ПФ-2 всех образцов установлено присутствие нейтральных
(арабиноза, глюкоза, галактоза и рамноза) моносахаров. В составе ПФ-2, выделенных из
образцов надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre, обнаружена также
галактуроновая кислота. Среди мономеров комплексов ПФ-2 образцов надземной части G.
pratense, G. sylvaticum и G. palustre преобладает галактоза. Для ПФ-2, изолированных из
образцов подземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre, основным мономерным
звеном является глюкоза.
15
Изучение аминокислотного состава надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G.
palustre и подземной части G. pratense проводили методами БХ и ВЭЖХ
фенилтиокарбаматных производных.
В надземной части G. pratense выявлено 20 аминокислот, из которых доминируют
аргинин, серин, аспарагин (таблица 7). В надземной части G. sylvaticum обнаружены 19
аминокислот, из них по количественному содержанию преобладают аргинин, пролин,
метионин, аланин. Надземная часть G. palustre в значительном количестве накапливает
аргинин, пролин, метионин, серин, изолейцин среди 19 идентифицированных аминокислот.
Среди обнаруженных свободных аминокислот надземной части G. pratense – 10
незаменимых (гистидин, аргинин, треонин, валин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин,
метионин, триптофан). Все те же незаменимые аминокислоты (за исключением треонина)
идентифицированы в надземной части G. sylvaticum и G. palustre.
Таблица 7 – Содержание свободных аминокислот (мг/г воздушно-сухого сырья) в надземной
части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre и подземной части G. pratense (сбор 2011 года,
фаза конца цветения-начала плодоношения)
подземная часть
надземная часть
Аминокислота
G. pratense
G. pratense
G. sylvaticum
G. palustre
Аспарагин
не обнаружен
1,17±0,14
0,36±0,04
0,050±0,006
Глутамин
0,42±0,05
0,93±0,11
0,58±0,07
0,23±0,02
о-Пролин
0,030±0,003
0,43±0,05
0,09±0,01
0,050±0,005
Серин
0,11±0,01
1,10±0,13
0,21±0,02
2,65±0,31
Глицин
0,20±0,02
0,16±0,02
0,17±0,02
0,22±0,02
Гистидин
не обнаружен
0,08±0,01
0,18±0,02
0,12±0,01
Аргинин
0,34±0,04
1,60±0,19
1,32±0,15
1,84±0,22
Треонин
не обнаружен
0,31±0,03
не обнаружен
не обнаружен
Аланин
1,46±0,17
0,11±0,01
1,21±0,14
0,32±0,03
Пролин
3,37±0,40
0,87±0,10
4,00±0,48
1,40±0,16
Тирозин
0,16±0,02
0,12±0,01
0,22±0,02
0,39±0,04
Валин
0,020±0,002
0,060±0,007
0,36±0,04
0,27±0,03
и-Лейцин
0,57±0,07
0,16±0,01
0,48±0,05
4,15±0,48
Лейцин
0,12±0,01
0,22±0,02
0,070±0,008
0,40±0,04
Фенилаланин
не обнаружен
0,09±0,01
0,08±0,01
0,040±0,005
Лизин
3,02±0,36
0,30±0,03
0,160±0,019
0,040±0,004
Сумма Цистин-Цистеин
0,12±0,01
0,84±0,10
0,160±0,017
0,110±0,013
Метионин
3,15±0,38
0,19±0,02
3,48±0,42
1,15±0,14
Триптофан
0,22±0,02
0,016±0,002
0,037±0,004
0,030±0,003
Суммарное содержание
13,31±1,59
8,76±1,05
13,17±1,58
13,46±1,61
В подземной части G. pratense идентифицировано 16 аминокислот, из которых 7
незаменимых. Установлено, что корневища с корнями G. pratense в значительных
количествах накапливают аланин, пролин, лизин метионин. Эти аминокислоты в подземной
части накапливаются в больших количествах по сравнению с надземной частью G. pratense.
Общее содержание аминокислот составило 8,76, 13,17 и 13,46 мг/г воздушно-сухого
сырья для надземной части G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre соответственно. В
корневищах с корнями G. pratense этот показатель составил 13,31 мг/г воздушно-сухого
сырья, что выше, чем в надземной части.
16
Определение макро- и микроэлементов проводили атомно-абсорбционным методом на
спектрофотометре «Квант-АФА». Полученные результаты представлены в таблицах 8, 9.
Таблица 8 – Содержание макроэлементов (в мг/г в пересчете на воздушно-сухое сырье) в
надземной части и корневищах с корнями G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre (сбор 2011
года, фаза конца цветения-начала плодоношения)
Объект
Ca
Mg
K
надземная часть
20,3±0,7
3,96±0,02
10,8±0,1
G. palustre
подземная часть
47,2±0,9
2,28±0,10
3,70±0,18
надземная
часть
19,3±0,9
2,47±0,01
15,80±0,13
G. pratense
подземная часть
16,3±0,5
2,17±0,01
7,02±0,07
надземная часть
13,5±0,3
2,29±0,06
17,00±0,17
G. sylvaticum
подземная часть
9,8±0,1
1,92±0,02
6,24±0,12
Установлено, что G. palustre и G. pratense аккумулируют Ca и Mg в большем
количестве по сравнению с G. sylvaticum (таблица 8).
Таблица 9 – Содержание микроэлементов (в мкг/г в пересчете на воздушно-сухое сырье) в
надземной части и корневищах с корнями G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre (сбор 2011
года, фаза конца цветения-начала плодоношения)
Объект
Fe
Mn
Zn
Сu
Ni
надземная часть
10,0±0,6 2,53±0,03 21,9±1,0 4,87±0,17 менее 0,1
G. palustre
подземная часть 4,38±0,13 2,55±0,07 95,1±0,9 2,67±0,21 менее 0,1
надземная часть
13,9±0,7
12,1±0,3 23,1±0,6 3,78±0,08 0,49±0,01
G. pratense
подземная часть 4,02±0,11 2,40±0,03 69,9±1,6 3,40±0,03 менее 0,1
надземная часть
17,5±0,1
46,2±1,0 36,0±0,8 3,59±0,13 0,56±0,04
G. sylvaticum
подземная часть
21,7±0,8
32,6±1,0
250±4
3,94±0,03 1,61±0,01
G. sylvaticum характеризуется значительно большим накоплением Fe, Mn и Zn в
надземной части и корневищах с корнями в сравнении с G. palustre и G. pratense (таблица 9).
Сравнительное исследование острой токсичности G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre
В опытах на мышах токсичность определяли с использованием метода Прозоровского
при внутрибрюшинном введении водных извлечений из надземной и подземной частей G.
pratense, G. sylvaticum, G. palustre. Средняя смертельная доза (LD50) составила 2060 мг/кг, 1640
мг/кг и 1910 мг/кг для надземной части G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre соответственно (мг
воздушно-сухого сырья, из которого получали водное извлечение вышеописанным способом
на кг массы тела животного). Для подземной части G. pratense и G. sylvaticum LD50 составила
1410 мг/кг и 971 мг/кг соответственно. Для корневищ с корнями G. palustre величину LD50
определить не удалось, т.к. при внутрибрюшинном введении отвара корневищ с корнями G.
palustre в дозе до 5000 мг/кг (в пересчете на воздушно-сухое сырье) и включительно гибели
мышей и симптомов отравления среди животных не наблюдали. Полученные значения LD50
свидетельствуют о том, что трава G. pratense, G. palustre и G. sylvaticum, корневища с
корнями G. pratense и G. sylvaticum согласно градации Hodge и Sterner относятся к
малотоксичным средствам при внутрибрюшинном введении в форме водного извлечения.
Корневища с корнями G. palustre практически нетоксичны.
17
Урожайность G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre в Ленинградской области
Определение урожайности сырья G. pratense, G. sylvaticum, G. palustre проводили в
пределах конкретных зарослей методом учетных площадок для надземной части и методом
модельных экземпляров для подземной части исследуемых видов. Урожайность воздушносухого сырья составила: для травы G. pratense – 90,4±10,4 г/м2, для травы G. sylvaticum –
49,3±7,4 г/м2, для травы G. palustre – 62,5±6,0 г/м2 . Урожайность воздушно-сухого сырья
корневищ с корнями составила: для G. pratense – 161,6±26,8 г/м2, для G. sylvaticum –
162,8±23,4 г/м2, для G. palustre – 83,2±11,5 г/м2.
Проведенные фитохимические исследования показали, что G. pratense, G. sylvaticum,
G. palustre близки по качественному составу полифенольных соединений, углеводов,
аминокислот, микро- и макроэлементов, но отличаются по количественному содержанию
отдельных компонентов названных групп БАВ. С учетом вышеполученных данных и
результатов исследования острой токсичности и урожайности видов герани, надземная и
подземная части G. pratense представляются наиболее перспективными объектами для
введения в научную медицину.
Изучение антимикробной активности G. pratense
Определение антимикробной активности сухих экстрактов, полученных извлечением
из сырья G. pratense спиртом этиловым 40%, проводили методом серийных разведений.
Микробная нагрузка составила 103 клеток в 1 мл питательной среды. Максимальная
концентрация экстрактов в опыте достигала величины 2 мг/мл питательной среды.
Сухой экстракт травы герани луговой обладал антимикробной активностью в
отношении S. aureus и B. cereus, и не обладал в отношении P. aeruginosa и E. coli в условиях
данного эксперимента (таблица 10). Сухой экстракт корневищ с корнями герани луговой
обладал антимикробной активностью в отношении S. аureus, B. cereus и P. aeruginosa и не
обладал в отношении E. coli в условиях данного эксперимента.
Таблица 10 – Минимальные ингибирующие и бактерицидные концентрации сухих
экстрактов травы и корневищ с корнями G. pratense
Тест-микроорганизм
S. aureus
B. cereus
P. aeruginosa
E. coli
Сухой экстракт травы G. pratense Сухой экстракт корневищ с корнями G. pratense
МИК, мкг/мл
МБК, мкг/мл
МИК, мкг/мл
МБК, мкг/мл
1000
1000
250
500
1000
1000
1000
1000
–
–
2000
–
–
–
–
–
Примечание. МИК – минимальная ингибирующая концентрация; МБК – минимальная бактерицидная концентрация.
Прочерк означает неэффективность экстракта в отношении указанной микробной нагрузки.
18
Разработка показателей подлинности и качества сырья «Герани луговой трава» и
«Герани луговой корневища с корнями»
Для определения оптимальных сроков заготовки сырья G. pratense методом ВЭЖХ
была исследована динамика накопления индивидуальных фенольных соединений в ее
надземной и подземной частях в зависимости от фазы развития (таблицы 11, 12).
Таблица 11 – Содержание фенольных соединений в надземной части G. pratense в
зависимости от фазы развития растения
Содержание идентифицированного фенольного соединения, среднее
Время
Название
значение определения в мг/г абсолютно-сухого сырья G. pratense
удержисоединения
кЦ-нП
П-нС
Б
Ц
вания, мин
Галловая
3,88
1,47
1,60
3,57
0,45
кислота
Эллаговая
29,38
1,22
1,92
5,14
3,46
кислота
Протокатехо6,95
0,30
0,37
0,23
0,18
вая кислота
Гиперозид
29,92
3,47
0,95
1,69
1,16
Изоквер30,39
0,17
–
0,24
–
цитрин
Рутин
29,14
0,54
–
–
–
Примечение. Б – бутонизация, Ц – цветение, кЦ-нП – конец цветения–начало плодоношения, П-нС – плодоношение–
начало осыпания семян. Прочерк означает отсутствие компонента на хроматограмме.
В надземной части G. pratense содержание галловой и эллаговой кислот достигает
максимальной концентрации в фазу цветения – плодоношения и заметно снижается в
остальные фазы. Концентрация протокатеховой кислоты максимальна в фазу цветения.
Содержание гиперозида максимально в фазу бутонизации и заметно снижено в остальные
фазы. Установлено, что рутин определяется только в фазу бутонизации. Изокверцитрин
определяется в достаточном количестве только в фазы бутонизации и цветения – начала
плодоношения (таблица 11).
В подземной части G. pratense содержание галловой кислоты достигает максимума в
фазу бутонизации. Эллаговая кислота определяется только в фазу цветения – плодоношения,
при этом ее содержание достигает значительной величины (таблица 12).
Таблица 12 – Содержание фенольных соединений в подземной части G. pratense в
зависимости от фазы развития растения
Содержание идентифицированного фенольного соединения, среднее
Время
Название
значение определения в мг/г абсолютно-сухого сырья G.pratense
удержисоединения
Б
Ц
кЦ-нП
П-нС
вания, мин
Галловая
3,88
3,74
3,18
0,92
1,99
кислота
Эллаговая
29,38
–
–
8,83
–
кислота
Примечение. Обозначение - см. таблицу 11.
С учетом полученных данных заготовка надземной части G. pratense должна
осуществляться в фазы цветения и цветения – начала плодоношения, т. к. в этот период
отмечено максимальное содержание суммы флавоноидов, дубильных веществ, галловой и
19
эллаговой кислот. Заготовку подземной части G. pratense целесообразно проводить
одновременно с надземной частью, т. е. в период цветения – начала плодоношения.
При изучении микроскопических признаков травы G. pratense, было выявлено, что
препараты с поверхности листьев и чашелистиков имеют сходное строение по типу устьиц
(аномоцитный) и наличию волосков двух типов: простые одноклеточные волоски и
головчатые волоски, имеющие короткую одноклеточную ножку и овальную одноклеточную
головку. Вдоль жилок чашелистиков располагаются головчатые волоски с одноклеточной
головкой и длинной многоклеточной ножкой. В мезофилле листа вдоль жилок и в основании
листовой пластинки присутствуют друзы кальция оксалата. Особенностью анатомического
строения венчика следует считать сосочковидный извилистостенный эпидермис, наличие
головчатых волосков с одноклеточной головкой и короткой многоклеточной ножкой.
Стебель имеет пучковое строение, пучки открытого коллатерального типа. На периферии
центрального
осевого
цилиндра
располагается
склеренхима
перициклического
происхождения, представленная древесными волокнами.
При исследовании анатомических признаков корневищ с корнями G. pratense
установлено, что корневища имеют пучковое строение, пучки открытые коллатеральные,
располагаются в один ряд по кругу. Подавляющее большинство паренхимных клеток коры,
сердцевины и серцевинных лучей заполнено крахмальными зернами, в некоторых клетках
отмечены друзы кальция оксалата. Корни по анатомическому строению отличаются от
корневища наличием двухлучевой первичной ксилемы в центре. Клетки коры и
сердцевинных лучей имеют строение аналогичное паренхиме корневищ, они в большинстве
заполнены крахмальными зернами, однако друзы кальция оксалата в корнях отсутствуют.
Для определения подлинности травы и корневищ с корнями герани луговой
предложена качественная реакция на дубильные вещества (с раствором желатина 1%),
подлинность травы кроме того предложено подтверждать цианидиновой пробой.
Для оценки количественного содержания основной группы БАВ в траве и корневищах
с корнями – дубильных веществ – использовали метод прямой спектрофотометрии.
Содержание дубильных веществ определяли в пересчете на кислоту галловую. Оценку
содержания флавоноидов в траве герани луговой проводили методом дифференциальной
спектрофотометрии в пересчете на рутин. Метрологические характеристики разработанных
методик представлены в таблице 13.
Таблица 13 – Метрологические характеристики методик количественного определения
дубильных веществ в корневищах с корнями герани луговой (А), количественного определения
дубильных веществ в траве герани луговой (Б), флавоноидов в траве герани луговой (В)
2
Методика
x
s
Р, %
t( P, f )
f
Δx
ε,%
s
А
5
16,06
0,1063
0,3261
95
2,57
0,71
4,4
Б
5
11,13
0,00021
0,0143
95
2,57
0,15
1,3
В
5
2,91
0,00017
0,0129
95
2,57
0,12
4,1
20
В результате товароведческого анализа пяти партий сырья герани луговой установлены
следующие числовые показатели, которые были включены в проекты ФС (таблица 14).
Таблица 14 – Числовые показатели – герани луговой травы и герани луговой корневища с
корнями (цельного и измельченного сырья)
Рекомендуемое значение
Рекомендуемое значение
показателя для корневищ с
показателя для травы герани
корнями герани луговой, %
луговой, %
Наименование показателя
Цельное
Измельченное
Цельное
Измельченное
сырье
сырье
сырье
сырье
Суммы флавоноидов в пересчете
Не менее 2,0
Не менее 2,0
–
–
на рутин
Дубильных веществ в пересчете
Не менее 9,5
Не менее 9,5 Не менее 12,5 Не менее 12,5
на кислоту галловую
Потеря в массе при высушивании
Не более 10
Не более 10
Не более 10
Не более 10
Золы общей
Не более 10
Не более 10
Не более 10
Не более 10
Золы, нерастворимой в 10%
растворе кислоты
Не более 0,5
Не более 0,5
Не более 1,0
Не более 1,0
хлористоводородной
Стеблей, в том числе отделенных
Не более 40
–
–
–
при анализе
Старые отмершие корневища
–
–
Не более 5
Не более 5
Частиц, не проходящих сквозь сито
–
Не более 5
–
Не более 5
с отверстиями диаметром 5 мм
Частиц, проходящих сквозь сито с
–
Не более 5
–
Не более 5
отверстиями диаметром 0,5 мм
Частей сырья, изменивших окраску
Не более 5
Не более 5
Не более 10
Не более 10
и поврежденных вредителями
Органической примеси
Не более 1
Не более 1
Не более 1
Не более 1
Минеральной примеси
Не более 0,5
Не более 0,5
Не более 1
Не более 1
Примечание. Прочерк означает, что для данного сырья определение показателя не предусмотрено. Все партии сырья
заготовлены в фазы цветения и цветения-начала плодоношения
Результаты анализа содержания основных групп действующих веществ, а также влажности,
в образцах сырья, заготовленных в 2009-2010 году, показали, что срок годности травы и корневищ
с корнями герани луговой составляет 3 года.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1.
Проведена сравнительная оценка восьми видов рода Geranium по количественному
содержанию дубильных веществ и антимикробной активности. Для дальнейших
исследований были отобраны G. sylvaticum, G. prаtense и G. palustre.
2.
В результате общего фитохимического анализа установлено, что основными группами
биологически активных веществ трех видов герани являются полифенольные соединения,
полисахариды, аминокислоты.
Впервые с помощью методов ВЭЖХ было проведено сравнительное исследование
компонентного состава, содержания отдельных фенольных кислот, флавоноидов и
аминокислот трех исследуемых видов, а также исследована динамика накопления
21
индивидуальных фенольных соединений в надземной и подземной частях G. pratense по
фазам вегетации растения.
3.
Впервые методом ГЖХ изучен компонентный состав свободных моносахаридов и
мономерный состав полисахаридных фракций, выделенных из сырья трех исследуемых
видов. В результате исследования определена динамика накопления свободных
моносахаридов и водорастворимых полисахаридов в сырье изучаемых видов рода Geranium.
Впервые определено содержание трех макро- и пяти микроэлементов в надземной и
подземной частях трех исследуемых видов.
4.
Разработаны спектрофотометрические методики количественного определения
флавоноидов и дубильных веществ в сырье G. pratense. Разработанные методики
использованы для исследования динамики накопления суммы флавоноидов и дубильных
веществ в сырье G. pratense, G. sylvaticum и G. palustre по фазам развития растений, а также
рекомендованы для стандартизации сырья G. pratense.
5.
Определена острая токсичность водных извлечений из надземной и подземной частей
изучаемых представителей рода герань. Для сухих экстрактов из травы и корневищ с
корнями G. pratense определена минимальная бактерицидная концентрация в отношении S.
аureus и B. cereus.
6.
На территории Ленинградской области на конкретных зарослях определена
урожайность сырья G. pratense. G. sylvaticum и G. palustre.
7.
Разработаны проекты фармакопейных статей на новые виды сырья «Герани луговой
трава» и «Герани луговой корневища с корнями», для которых установлены макро- и
микроскопические признаки сырья и нормативы доброкачественности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Разаренова, К. Н. Перспективные виды рода герань — Geranium L. / К. Н. Разаренова,
Е. В. Жохова // Материалы межвузовской научной конференции Санкт-Петербургской
Государственной Химико-Фармацевтической Академии «Фармация в XXI веке: эстафета
поколений». — СПб., 2009. — С. 35.
2. Караваева, А. В. Антимикробные свойства некоторых видов рода герань флоры
Северо-Запада / А. В. Караваева, К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Материалы научнометодической
конференции
Санкт-Петербургской
Государственной
ХимикоФармацевтической Академии «Гаммермановские чтения-2011». — СПб., 2011. — С. 63—66.
3. Разаренова, К. Н. Определение содержания экстрактивных веществ и динамика их
накопления в надземной и подземной частях герани лесной, г. луговой и г. болотной / К. Н.
Разаренова, Е. В. Жохова // Разработка, исследование и маркетинг новой фарм. продукции: сб.
науч. трудов / под ред. М. В. Гаврилина. — Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. — Вып. 66. —
С. 167—171.
4. Разаренова, К. Н. Количественное определение дубильных веществ
спектрофотометрическим методом в траве и корневищах с корнями герани лесной, герани
22
луговой и герани болотной / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова, А. Е. Ирза, К. Д. Коледенкова //
Современная медицина и фармацевтика: анализ и перспективы развития. Материалы II
междунар. научно-практической конф. (28.12.2011). — М., 2012. — C. 144—152.
5. Разаренова, К. Н. Сравнительная оценка содержания дубильных веществ в некоторых
видах рода Geranium L. флоры Северо-Запада / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Химия
растительного сырья. — 2011. — № 4. — С.187—192.
6. Разаренова, К. Н. Разработка числовых показателей герани лесной травы, герани
луговой травы, герани болотной травы / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Материалы
международной научно-методической конференции «Сандеровские чтения», посвященной
памяти Ю. К. Сандера. — СПб.: СПХФА, 2012. — С. 165—170.
7. Разаренова, К. Н. К определению запасов герани луговой, герани лесной, герани
болотной / К. Н. Разаренова, Е. В. Жохова // Тезисы докладов Всероссийской научной конф.
студентов и аспирантов с международным участием Санкт-Петербургской Государственной
Химико-Фармацевтической Академии «Молодая фармация-потенциал будущего». — СПб.,
2012. — С. 10—11.
8. Разаренова, К. Н. Динамика накопления некоторых фенольных соединений в
надземной и подземной частях Geranium pratense L. / К. Н. Разаренова, Н. Ю. Сипкина, Е. В.
Жохова // Бутлеровские сообщения. — 2012. — Т. 31, № 7. — С. 93—97.
9. Разаренова, К. Н. Аминокислотный состав надземной части Geranium pratense L.,
Geranium sylvaticum L., Geranium palustre L. / К. Н. Разаренова, А. М. Захарова, И. Д.
Протасова, Е. В. Жохова // Бутлеровские сообщения. — 2012. — Т. 31, № 8. — С. 73—78.
10. Burakova, M. A. Antibacterial activity of Geranium pratense preparations / M. A.
Burakova, A. V. Karavaeva, I. E Kauhova., K. N. Razaryonova, E. V Zhokhova // 16th International
Congress Phytopharm 2012. — Saint-Petersburg, 2012. — P. 64.
11. Разаренова, К. Н. Разработка методики количественного определения флавоноидов в
траве герани луговой и ее валидация / Разаренова К. Н., Жохова Е. В. // Сборник материалов
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященная
30-летию фармацевтического факультета ЯГМА «Инновационные процессы в
лекарствоведении». – Ярославль, 2012. – С. 270 – 278.
12. Разаренова, К. Н. Минеральный состав некоторых видов рода Geranium / Разаренова
К. Н., Жохова Е. В., Беляева А. И. // Раст. ресурсы. – 2013. – Т.60, вып. 1. – С. 118 –124.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
26
Размер файла
513 Кб
Теги
рода, видов, изучения, некоторые, фармакогностический, geranium
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа