close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma Penicillium и Myceliophtora c увеличенной гидролитической активностью.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЧЕКУШИНА АННА ВЯЧЕСЛАВОВНА
Целлюлолитические ферментные препараты на основе
грибов Trichoderma, Penicillium и Myceliophtora с
увеличенной гидролитической активностью
03.01.04 Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
МОСКВА – 2013
Работа выполнена в лаборатории биотехнологии ферментов Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха
Российской академии наук
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор
Синицын Аркадий Пантелеймонович
Официальные оппоненты:
Нифантьев Николай Эдуардович
доктор химических наук, профессор,
член-корреспондент РАН
Федеральное государственное бюджетное
учреждения науки Институт органической
химии имени Н.Д. Зелинского Российской
академии наук
заведующий лабораторией
Скомаровский Антон Андреевич
кандидат химических наук
«БиоХимМак Диагностика»
Закрытое акционерное общество
специалист по продукции
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биохимии
и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина Российской академии
наук
Защита состоится «19» декабря 2013 года в 15.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертации на соискание
ученой степени кандидата наук и доктора наук при Федеральном
государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им.
А.Н.Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский
проспект, дом 33, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы
РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.
Автореферат разослан
2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук
Орловский А.Ф.
2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Большие запасы возобновляемой
растительной биомассы (около одного триллиона тонн) делают её привлекательным
сырьём для получения различных полезных продуктов. Широкое разнообразие
ферментов и их характеристик предоставляет большие возможности для эффективной
переработки растительного сырья в сахара. Глюкоза, получаемая ферментативным
путём из целлюлозы, может быть конвертирована с помощью микроорганизмов в
этанол, бутанол, ацетон, органические и аминокислоты, полимеры и многие другие
продукты микробного синтеза. Таким образом, растительная биомасса может служить
(частичной) альтернативой нефти, которая в настоящее время является основным
сырьем при производстве различных продуктов органического синтеза, а также для
получения моторного топлива. К ферментам, осуществляющим конверсию целлюлозосодержащего сырья
(ЦСС), относятся различные эндоглюканазы (ЭГ) и целлобиогидролазы (ЦБГ),
осуществляющие деструкцию нерастворимой целлюлозы, а также ксиланазы,
гидролизующие ксилан (гемицеллюлозу). Однако в последнее время была наглядно
продемонстрировано
существенное
влияние
на
общую
кооперативную
эффективность процессов биоконверсии ЦСС «вспомогательных» ферментов
(реализация т.н. boosting эффекта), осуществляющих гидролиз растворимых
олигосахаридов (например, β-глюкозидаз и β-ксилозидаз), а также ферментов
негидролитической природы (полисахаридмонооксигеназ, ПМО).
Целлюлолитические ферменты и многие другие карбогидразы продуцируются
преимущественно микроскопическими грибами. Мутантные или рекомбинантные
штаммы грибов рода Trichoderma играют ведущую роль среди промышленных
продуцентов целлюлолитических ферментов, что объясняется, во-первых, их высокой
секреторной способностью, а, во-вторых, разнообразием состава продуцируемого
ферментного комплекса. Поэтому неудивительно, что ферментные препараты
целлюлаз и гемицеллюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются в разных
странах ведущими производителями промышленных ферментов, в частности,
Novozymes (Дания), DuPont&Genencor (США) и др. При этом следует подчеркнуть,
что поиск новых продуцентов ферментов, предназначенных для гидролиза ЦСС, попрежнему является актуальной задачей. Грибы рода Penicillium, Myceliоphtora (ранее
Chrysosporium) и др. могут стать достойной альтернативой штаммам рода
Trichoderma, поскольку по наиболее важным биотехнологическим критериям не
уступают, а иногда и превосходят лучшие из известных штаммов Trichoderma.
Выбор для гидролиза ЦСС высокоэффективных целлюлолитических
ферментных препаратов, представляющих собой многокомпонентные ферментные
3 комплексы, зависит от ряда факторов и, в значительной степени, от
сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности его
индивидуальных компонентов. Очевидно, что для осуществления максимально
эффективного гидролиза ЦСС первостепенное значение приобретает решение задачи,
связанной с пониманием оптимального качественного и количественного состава
ферментного комплекса. Поэтому в области ферментативной конверсии ЦСС активно
ведутся фундаментальные исследования и прикладные разработки не только по
поиску и получению новых высокоактивных микроорганизмов-продуцентов, но
также по поиску новых ферментов, как с высокой гидролитической способностью,
так и обладающих «вспомогательной» функцией в процессах гидролиза. Результатом
таких исследований могут быть ферментные препараты, способные осуществлять
высокоэффективную конверсию различных видов ЦСС. Исследования, проведенные в
нашей лаборатории ранее, показали, что ферментные комплексы, секретируемые
грибом Penicillium verruculosum могут стать достойной альтернативой современным
промышленным ферментным препаратам. Поэтому в диссертационной работе мы
проводили исследование по поиску возможностей дальнейшего увеличения
эффективности ферментного комплекса P.verruculosum в процессах биоконверсии
ЦСС.
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось
получение высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов с
увеличенной гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС.
Для этого было необходимо решить следующие задачи:
• Сопоставить гидролитическую активность и компонентный состав новых
промышленных ферментных препаратов, выпускаемых ведущими зарубежными
компаниями, предназначенных для гидролиза ЦСС;
• Определить оптимальный состав ферментного препарата для гидролиза ЦСС;
• Провести сравнительный анализ лучшего промышленного ферментного
препарата и лабораторного препарата на основе гриба рода P.verruculosum по таким
параметрам как компонентный состав и гидролитическая активность по отношению к
различным видам ЦСС;
• Создать новый продуцент P.verruculosum и получить новый целлюлазный
ферментный препарат с увеличенной гидролитической активностью, исследовать его
состав, свойства и возможности применения в процессах биоконцерсии ЦСС.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основании
результатов анализа компонентного состава различных ферментных комплексов,
продуцируемых грибами родов Trichoderma и Myceliophtora, обладющих высокой
гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС, выявлены
общие закономерности их «конструирования»: содержание целлобиогидролаз – от 30
4 до 60%, эндоглюканаз – от 10 до 30%, β-глюкозидаз – от 5 до 20%, ксиланаз – от 5 до
10% от общего содержания белка. Исследовано влияние полисахаридмонооксигеназ
грибов Myceliophtora thermophila, Trichoderma reesei и Thelavia terrestris как нового
компонента целлюлазного комплекса на эффективность гидролиза различных видов
ЦСС под действием ферментных препаратов. Установлено, что полисахаридмонооксигеназы являются важным компонентом целлюлазного комплекса и
оказывают существенное положительное влияние на увеличении эффективности
ферментативной конверсии ЦСС. Впервые на основе рекомбинантного штамма гриба
P.verruculosum получен ферментный препарат, имеющий в своем составе
полисахаридмонооксигеназу из M.thermophila, определен его компонентный состав,
биохимические свойства и показано, что этот препарат значительно эффективнее
гидролизует различные виды ЦСС (в случае микрокристаллической целлюлозы выход
продуктов гидролиза увеличивается на 60%, для различных видов растительного
сырья – на 40%), чем препарат, полученный на основе исходного штамма
P.verruculosum. Ферментный препарат P.verruculosum, содержащий полисахаридмонооксигеназу M.thermophila по своей эффективности гидролиза ЦСС сравним с
лучшими новыми коммерческими целлюлазными ферментными препаратами,
предназначенными для биоконверсии ЦСС. Показано, что совместное применение
целлюлазного ферментного препарата P.verruculosum и β-глюкозидазного
ферментного препарата P.verruculosum приводит к увеличению общей гидролитической активности ферментного комплекса до уровня современных
промышленных препаратов.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены
на международных конференциях и конгрессах: «Биотехнология: экология крупных
городов» (Москва, 2010), «Ломоносов – 2012» (Москва, 2012), «Ломоносов – 2013»
(Москва, 2013), «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск,
2012), «Biocatalysis: fundamentals & applications» (Москва, 2013), «Физико-химия
растительных полимеров» (Архангельск, 2013), «Биомасса: топливо и энергия»
(Москва, 2012), «Биотехнология: состояния и перспективы развития» (Москва, 2013)
и «EU-Russia: cooperation in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries and food»
(Москва, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах,
рекомендуемых ВАК, а также 1 статья и 10 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения,
обзора литературы (главы 1-4), отдельной главы с изложением материалов и методов
исследования (глава 5), результатов и их обсуждение (главы 6-8), выводов и списка
5 литературы, включающего 157 источников. Работа изложена на 98 страницах
печатного текста, содержит 36 рисунков и 14 таблиц.
Продуценты
препаратов
Ферментные
препараты
M.thermophila T.reesei T.reesei
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Состав и свойства промышленных целлюлазных ферментных
препаратов, полученных с помощью различных продуцентов
Важными характеристиками целлюлазных ферментных препаратов являются
их активности по отношению к различным субстратам, компонентный состав
ферментного комплекса, а также гидролитическая способность (активность) в
процессах биоконверсии различных видов ЦСС. В работе были исследованы новые
промышленные ферментные препараты, созданные для ферментативного гидролиза
ЦСС, продуцируемые грибами рода Trichoderma (серии Cellic CTec и Accellerase), а
также грибом M.thermophila (серия С1).
Активность промышленных ферментных препаратов. Одним из важных
критериев для сравнения эффективности ферментных препаратов, предназначенных
для биоконверсии ЦСС, является их удельная активность по ряду специфических
субстратов – растворимых и нерастворимых полисахаридов, таких как
микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ, авицел), карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ),
ксилан, а также олигосахаридов (целлобиозы). Активности исследуемых препаратов
по отношению к этим субстратам были определены нами по начальным скоростям
гидролиза и приведены в табл. 1.
Таблица 1. Удельные активности промышленных ферментных препаратов по
отношению к различным субстратам, (ед./мг белка).
Cellic CTec1
Cellic CTec2
Cellic CTec3
Accellerase 1000
Accellerase DUET
Accellerase TRIO
C1_1
C1_2
C1_3
Авицелазная
400С,
рН 5.0
0,3
0,3
0,5
1,2
0,8
0,7
0,2
0,3
0,3
C1_4
0,4
Активность
КМЦЦеллоби
азная
-азная
0
50 С,
400С,
рН 5.0
рН 5.0
10,9
2,4
15,6
4,0
18,7
13,9
12,3
2,7
7,9
2,2
14,0
10,0
12,6
2,6
43,2
4,5
41,2
4,6
12,2
2,4
Ксиланазная
500С,
рН 5.0
1,5
11,3
12,6
2,4
14,0
20,0
2,9
10,1
10,2
3,5
6 Удельная активность по МКЦ иллюстрирует способность ферментных
препаратов гидролизовать высокоупорядоченные кристаллические зоны целлюлозы
и, в целом, характеризует активность ЦБГ. Препараты серии Accellerase
характеризовались наиболее высокими значениями удельной авицелазной
активности: от 0,7 ед./мг белка (Accellerase TRIO) до 1,2 ед./мг белка (Accellerase
1000). Для остальных ферментных препаратов значения удельной активности по
отношению к МКЦ варьировало от 0,2 ед./мг белка (С1_4) до 0,5 ед./мг белка (Cellic
CТec3).
Удельная активность препаратов по КМЦ демонстрирует их способность
гидролизовать менее упорядоченные, аморфные зоны целлюлозы, и характеризует
активность ЭГ. Исследуемые промышленные ферментные препараты характеризовались значениями удельной активности по КМЦ в пределах 10-20 ед./мг белка,
за исключением препаратов С1_2 и С1_3, которым соответствовали наиболее высокие
значения удельной КМЦ-азной активности (43,2 и 41,2 ед./мг белка, соответственно).
Следует отметить, что наиболее высокие значения удельной активности по
отношению к КМЦ наблюдались в серии препаратов Cellic CTec для Cellic CТec3
(18,7 ед./мг белка), а в серии препаратов Accellerase для Accellerase TRIO (14,0 ед./мг
белка).
Удельная активность препаратов по целлобиозе (β-глюкозидазная активность,
БГЛ) характеризует их способность конвертировать образующиеся в ходе гидролиза
ЦСС целлобиозу и целлоолигосахариды (растворимые промежуточные продукты) в
глюкозу. Значения активностей рассматриваемых препаратов по целлобиозе заметно
отличались друг от друга. Препараты Cellic CТec1, Accellerase 1000, Accellerase
DUET, С1_1 и С1_4 характеризовались низкой удельной активностью по отношению
к целлобиозе (от 2,2 до 2,7 ед./мг белка), удельные активности препаратов Cellic
CТec2, С1_2 и С1_3 были примерно в 2 раза выше (от 4,0 до 4,6 ед./мг белка), а у
препаратов Cellic CТec3 и Accellerase TRIO – примерно в 4 раза выше (13,9 и 10,0
ед./мг белка, соответственно).
Исследованные ферментные препараты продемонстрировали разный уровень
ксиланазной активности: у Cellic CTec1 значение удельной активности (1,5 ед./мг
белка) было самое низкое, ~ в 2 раза меньше, чем у препаратов Accellerase 1000, C1_1
и С1_4 (от 2,4 до 3,5 ед./мг белка), и в ~7-10 раз меньше, чем удельная активность
остальных ферментных препаратов. Следует отметить, что наиболее высокое
значение ксиланазной удельной активности демонстрировал препарат Accellerase
TRIO (20,0 ед./мг белка).
Таким образом, по результатам изучения удельных активностей промышленных ферментных препаратов можно сделать вывод о том, что Cellic CTec3 и
7 Accellerase TRIO значительно превосходят остальные препараты по значениям
удельных активностей по отношению к целлобиозе и ксилану, что позволяет
предположить, что в их составе увеличено содержание БГЛ и ксиланаз. Препараты
С1_2 и С1_3 характеризовались наиболее высокими значениями по отношению к
КМЦ, что говорит о высоком содержании ЭГ. Однако, как уже было отмечено выше,
приведённые активности были определены нами по начальным скоростям гидролиза
соответствующих субстратов, и их сопоставление не всегда является достаточным
для сравнения препаратов, поскольку в ходе длительного гидролиза ЦСС
существенное значение приобретают процессы инактивации ферментов,
ингибирования их лигнином (за счёт непродуктивной адсорбции на нём ферментов),
а также ингибирования ферментов продуктами реакции. Поэтому нами было
проведено сравнение активности исследуемых ферментных препаратов в ходе
длительного процесса гидролиза различных видов ЦСС (МКЦ и различные виды
предобработанного растительного лигнифицированного сырья – измельченной
осиновой древесины, измельченной обессмоленной сосновой древесины и
измельченной багассы).
Эксперимент проводили при дозировке ферментных препаратов 2, 5 и 10 мг
белка на 1 г субстрата, в качестве продуктов гидролиза определяли глюкозу и
восстанавливающие сахара (ВС), отбирая пробы из реакционной смеси через 3, 24 и
48 часов после начала гидролиза. На рис.1 представлены данные, характеризующие
выход ВС и глюкозы через 24 часа гидролиза при дозировке ферментных препаратов
5 мг/г субстрата, так как именно в этих условиях наилучшим образом проявлялось
различие в гидролитической активности разных препаратов.
Гидролитическая активность ферментного препарата Cellic CTec3 была в 2-2,5
раза более высокой по сравнению с ферментным препаратом Cellic CTec1 и на 1020% более высокой по сравнению с Cellic CTec2. В серии препаратов Accellerase
наибольшей гидролитической активностью обладал Accellerase TRIO, препараты
Accellerase1000 и DUET проявляли более низкую (и близкую между собой)
гидролитическую активность. Препараты серии С1 характеризовались близкой
гидролитической активностью по отношению ко всем видам ЦСС, несколько более
высокой гидролитической активностью в этой серии обладал препарат С1_4.
Таким образом, наибольшую гидролитическую активность по отношению к
ЦСС проявляли промышленные ферментные препараты Cellic CTec3, Accellerase
TRIO и С1_4, причём первый из них был наиболее активным. С точки зрения
значений удельных активностей (табл.1) одним из факторов, позволяющих
интерпретировать полученные результаты является достаточно высокая
целлобиазная (БГЛ) активность этих препаратов.
8 А
60
ВС
50
Глюкоза
40
30
20
10
0
Б
60
ВС
50
Глюкоза
40
30
20
10
0
В
60
ВС
50
Глюкоза
40
30
20
10
0
Г
60
ВС
50
Глюкоза
40
30
20
10
4
С
1_
3
С1
_
2
С1
_
1
С
1_
Tr
io
et
Ac
ce
lle
ra
se
Du
0
ce
lle
ra
se
10
0
c3
ra
se
ce
lle
Ac
Ac
C
Тe
ec
2
lic
CТ
Ce
l
lic
Ce
l
Ce
l
lic
CТ
ec
1
0
Рисунок 1. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных видов ЦСС:
А) измельченная багасса; Б) измельченная и обессмоленная сосна; В) измельченная
осина; Г) МКЦ. Условия: 50°С, рН 5, [S]= 100 г/л, [E]= 5 мг/г субстрата,
перемешивание – 1000 об/мин.
9 Компонентный состав промышленных ферментных препаратов.
Качественный состав исследуемых ферментных препаратов был определен с
помощью двухстадийного хроматографического фракционирования, с последующим
измерением специфических активностей полученных фракций по отношению к
различным субстратам, электрофоретического разделения фракций, массспектрометрического анализа фрагментов белковых полос полиакриламидного геля и
сопоставления полученной информации с белковыми базами данных
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Количественный состав ферментных препаратов
изучали путем определения содержания индивидуальных ферментов в
хроматографических фракциях. Концентрацию ферментов во фракциях измеряли
спектрофотометрически как отношение поглощения фракции на 280 нм (А280) к
среднему коэффициенту экстинкции белка, который принимали равным 2,0. За
содержание каждого фермента в исследуемом ферментном препарате принимали
массовую долю этого фермента, рассчитанную относительно общего количества
белка в образце и выраженную в процентах.
Используемый нами подход для определения компонентного состава
ферментных препаратов можно проиллюстрировать на примере препарата Cellic
CTec3. Ферментный препарат обессоливали методом гель-проникающей
хроматографии на носителе Bio-Gel P6 и фракционировали методом анионообменной
хроматографии среднего давления (FPLC) на колонке с носителем Source 15Q (объем
1 мл) при рН 7,0 в линейном градиенте соли (1 М NaCl). В результате были получены
несвязавшаяся с носителем фракция (NB) и ряд фракций, элюирущихся в градиенте
NaCl. Электрофореграмма полученных фракций и хроматографический профиль
фракционирования препарата Cellic CTec3 на колонке Source 15Q представлены на
рис.2 и 3, соответственно.
На рис.4 приведен MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата
фрагмента белковой полосы полиакриламиднго геля и результаты идентификации
пептидов на примере БГЛ 120 кДа Aspergillus fumigatus. Анализ результатов MALDITOF масс-спектрометрии проводили с использованием программы Bruker Data
Analysis, а поиск пептидов осуществляли по белковым базам данных с помощью
программы Mascot (http://expasy.org/tools/mascot.html). Подобным образом была
проведена идентификация и других ферментов.
В табл.2 представлены данные о составе (содержание основных компонентов)
ферментных препаратов Cellic CTec3, Accellerase TRIO и C1_4, которые
продемонстрировали наиболее высокую гидролитическую активность по отношению
к различным видам ЦСС.
10 Рисунок 2. Электрофореграмма фракций после анионообменной хроматографии
ферментного препарата Cellic CTec3 на колонке с носителем
Source 15Q (М – маркёры молекулярной массы).
Рисунок 3. Хроматографический профиль при фракционировании ферментного
препарата Cellic CTec3 на колонке с анионообменным носителем (рН 7,0), градиент
соли приведен серым цветом.
11 Основными компонентами этих трех исследуемых являлись ЦБГ: суммарное
содержание ЦБГ в препаратах варьировало в пределах от 30 до 60% от общего пула
белка. Наиболее высоким содержанием ЦБГ характеризовался препарат Cellic CTec3
(до 60%). Для препаратов С1_4 и Accellerase TRIO содержание ЦБГ было примерно
одинаковым (32-35%). Для всех исследуемых препаратов было характерно
преобладание высокомолекулярной формы ЦБГ (содержащей как каталитический, так
и целлюлозосвязывающий модули), над низкомолекулярной (лишенной
целлюлозосвязывающего модуля).
Intens.
x10 8
1485.8
VSQMTLAEKV
TNVAATWDKT
VLFAETIKGI
LWPFADAVRA
AALAGLDMSM
RIPPNFSSWT
PLTGKEVKVG
VISNGGNVFA
GEAVIDTVVS
VNPSAKTPFT
HGLSYTTFGY
YPWLNSTDLE
TITNTGNVAG
EAQDWVITKY
6
1204.7
4
2
Q
NLTTGTGWEM
LAYLRGKAMG
QDAGVIATAK
GVGAVMCSYN
PGDISFDDGL
RDEYGWEHSA
VLGEDAGSNP
VTDNGALSQM
HCNNTIVVIH
WGKTRESYGA
SHLRVQALNS
DSSDDPNYGW
YEVPQLYVSL
PKKVHVGSSS
VFDNSHGNNQ
DRCVGQTGSV
EEFNDKGVDI
HYILNEQEHF
QINNSYGCQN
SFWGTNLTVS
VSEGAWTKVN
WGANGCPDRG
ADVASQSSVS
SVGPVLIDRW
PLLTEPNNGN
SSSAYVPTSG
EDSEYIPEGA
GGPNEPRVVL
RKLPLRAPLP
1875.1
1952.0
1090.7
840.6 1003.7
0
1000
1473.9
1500
1849.0
1799.1
ELAFSPPFYP
PRLGINWGLC
LLGPAAGPLG
RQVGEAQGYG
SQTLNKLLKA
VLNGTVPAWR
DFVNVQRSHS
CDNGTLAMAW
LVFVNADSGE
YDNPNVTAII
GAPQDDFNEG
ETKPAPTYGE
RDGSPQPLLK
RKFDRIFLAP
RVY
SPWADGQGEW
GQDSPLGIRF
KYPDGGRIWE
YNITETISSN
ELGFQGFVMS
VDDMAVRIMT
QIIREIGAAS
GSGTANFPYL
GFISVDGNEG
WAGLPGQESG
VFIDYRHFDK
IGSAADYLYP
AGGAPGGNPT
GEQKVWTTTL
ADAHRRAVEI
SDLNSAFPAG
GFSPDPALTG
VDDKTMHELY
DWSAHHSGVG
AYYKVGRDRL
TVLLKNTGAL
VTPEQAIQRE
DRKNLTLWKN
NSLVDVLYGR
RNETPIYEFG
EGLKRITKFI
LYQDLVRVSA
NRRDLANWDV
2892.7
2112.2
2000
2415.5
2500
3000
3500
4000
m/z
Рисунок 4. MALDI-TOF масс-спектр трипсинового гидролизата фрагмента белковой
полосы, соответствующей β-глюкозидазе A.fumigatus (входящей в состав ферментного
препарата Cellic CTec3) и ее аминокислотная последовательность. Пептиды,
идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, подчеркнуты.
Общее содержание ЭГ составляло от 13 до 33% от общего пула белка, причем
содержание ЭГ в препарате С1_4 в 1,5 и 2 раза превосходило таковое в препаратах
Accellerase TRIO (21%) и Cellic CTec3 (13-16%).
Содержание БГЛ варьировало от 7% до 23%, причем содержание БГЛ в
препарате С1_4 было ниже в 3 раза содержания БГЛ в препаратах Accellerase TRIO
(22%) и Cellic CTec3 (14-23%). Следует отметить, что препараты Accellerase TRIO и
Cellic CTec3 имели в своём составе как гомологичные, так и гетерологичные БГЛ,
причем, содержание гетерологичных БГЛ превышало содержание гомологичной БГЛ
T.reesei. Препарат Cellic CTec3 включал одну гомологичную и две гетерологичные
БГЛ – БГЛ A.fumigatus и БГЛ A.oryzae, а препарат Accellerase TRIO – одну
гомологичную и одну гетерологичную БГЛ A.nidulans.
12 Суммарное содержание ксиланаз варьировало от 3% до 10%, наиболее высоким
содержанием ксиланаз характеризовался препарат Accellerase TRIO, а наиболее
низким – С1_4.
В препаратах Cellic CTec3 и С1_4 был обнаружен фермент, который согласно
масс-спектрометрическим данным, относится к классу ПМО M.thermophila.
Проведённые нами исследования состава ферментных препаратов, обдающих
наибольшей гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС –
Cellic CТec3 и Accellerase TRIO на основе гриба рода T.reesei и С1_4 гриба
M.thermophila – позволили выявить общие закономерности «конструирования» их
ферментных комплексов (табл.2). Суммарное содержание ЦБГ в этих ферментных
препаратах варьировало в пределах от 30 до 60% от общего пула белка, суммарное
содержание ЭГ – от 10 до 30%, ксиланаз – 3 до 10%, β-глюкозидаз – от 5 до 20%.
Обнаружено, что в состав препаратов Accellerase TRIO и Cellic CTec3 входят
гетерологичные β-глюкозидазы из различных видов грибов Aspergillus, и их
содержание в 5-7 раза превышает содержание гомологичной β-глюкозидазы. Кроме
того, в составе ферментных препаратов Cellic CTec3 и C1_4 были обнаружены
ферменты, относящиеся к классу ПМО.
Таблица 2. Компонентный состав промышленных ферментных препаратов,
обладающих наибольшей гидролитической активностью, % от общего содержания
белка.
Ферментный препарат
Ферменты
Accellerase
С1_4
Cellic CTec3
TRIO
Целлобиогидролазы
35
32
40-60
Эндоглюканазы
33
21
13-16
β-Глюкозидаза гомологичная
7
3
2-4
β-Глюкозидаза гетерологичная
19
12-19
(Aspergillus sp.)
Ксиланазы
3
10
4-8
Полисахаридмонооксигеназа
+
+
2. Сравнение свойств лучших промышленных ферментных препаратов со
свойствами лабораторного препарата P.verruculosum В221-151
Как отмечалось выше, исследования, проведенные в нашей лаборатории,
показали, что ферментный комплекс гриба P.verruculosum обладает высокой
гидролитической активностью по отношению к ЦСС и может стать достойной
альтернативой современным промышленным ферментным препаратам. Мы провели
сравнительный анализ активности и компонентного состава промышленного
ферментного препарата, проявившего наибольшую гидролитическую активность по
13 отношению к ЦСС (Cellic CTec3) и лабораторного ферментного препарата В221-151,
полученного с помощью гриба P. verruculosum.
Сравнение активностей и компонентного состава ферментных препаратов
Cellic CTec3 и P.verruculosum В221-151. Удельные активности препаратов B221-151
и Cellic CТec3 по отношению к МКЦ им КМЦ являлись величинами одного порядка и
были примерно одинаковыми (ср. табл.1 и 3). Удельная ксиланазная активность
препарата B221-151 превышала таковую препарата Cellic CТec3 примерно в три раза.
По уровню удельной целлобиазной активности препарат B221-151 заметно уступал
Cellic CТec3 (что может говорить о более низком содержании БГЛ в В221-151).
Таблица 3. Удельные активности ферментного препарата P.verruculosum В221-151,
по отношению к различным субстратам, ед./мг белка.
Активность
Ферментный
препарат
Авицелазная
400С,
рН 5.0
КМЦазная
500С,
рН 5.0
Целлоби
-азная
400С,
рН 5.0
Ксиланазная
500С,
рН 5.0
0,7
18,3
0,7
30,3
P. verruculosum
В221-151
Компонентный состав ферментного препарата В221-151 определяли с
помощью методов, описанных в предыдущем разделе, Данные, характеризующие
компонентный состав препарата В221-151 приведёны в табл.4.
Препарат В221-151 характеризовался более высоким суммарным содержанием
ЦБГ (69% от общего пула белка), чем препарат Cellic CTec3 (40-60%, табл.2), что
объясняет более высокое значение удельной активности по МКЦ для препарата В221151 по сравнению с Cellic CTec3 (ср. табл.3 и 1), поскольку именно авицелазная
активность характеризует активность ЦБГ.
Таблица 4. Компонентный состав ферментного препарата P.verruculosum В221-151,
% от общего содержания белка.
Ферментный препарат
Ферменты
В221-151
Целлобиогидролазы
69
Эндоглюканазы
17
β-Глюкозидаза гомологичная
4
β-Глюкозидаза гетерологичная (Aspergillus sp.)
Ксиланазы
4
14 Суммарное содержание ЭГ как в препарате В221-151, так и в Cellic CTec3,
оказалось примерно одинаковым (14-16%, ср. табл.2 и 4), что соответствует близким
удельным активностям этих препаратов по КМЦ (ср. табл.3 и 1).
Препарат В221-151 характеризовался значительно более низким содержанием
гомологичной БГЛ (4%) по сравнению с общим содержанием БГЛ в препарате Cellic
CTec3 (порядка 20%), которые были представлены как гомологичными, так и
гетерологичными (БГЛ из A.fumigatus и A.oryzae) ферментами (ср. табл.2 и 4). Низкое
содержание БГЛ в препарате P.verruculosum В221-151 объясняет соответствовавшие
ему невысокие значения удельной активности по целлобиозе (табл.3).
Исследуемые ферментные препараты характеризовались примерно в 2 раза
отличающимся суммарным содержанием ксиланаз (4% и 8% для В221-151 и Cellic
CTec3, соответственно, ср. табл.2 и 4). При этом удельная активность препарата
В221-151 по ксилану превышала активность препарата Cellic CTec3 по этому
субстрату примерно в три раза (ср. табл.3 и 1), что, видимо, обусловлено большей
удельной активностью ксиланаз P.verruculosum В221-151.
Отметим, что, в отличие от ферментного препарата Cellic CTec3, в состав В221151 не входит ПМО.
Таким образом, ферментный препарат P.verruculosum В221-151 и Cellic CTec3
обладали примерно одинаковыми удельными активностями по отношению к МКЦ и
КМЦ, удельная целлобиазная активность В221-151 была ниже, а ксиланазная
активность – выше, чем у Cellic CTec3, Оба ферментных препарата обладали
примерно одинаковым компонентным составом с точки зрения содержания ЦБГ и ЭГ,
однако В221-151 имел по сравнению с Cellic CTec3 пониженное содержание БГЛ и не
имел в своём составе ПМО.
3. Получение и свойства ферментных препаратов P.verruculosum с
увеличенной гидролитической активностью
Гидролитическая активность целлюлазного комплекса P.verruculosum может
быть увеличена за счет введения в состав комплекса вспомогательных белков, таких
как ПМО, а также за счет увеличения содержания БГЛ. В нашей лаборатории уже
проводились работы по увеличению содержания БГЛ в составе ферментных
препаратов на основе P.verruculosum, в результате был получен штамм P.verruculosum
F10, продуцент БГЛ A.niger (её содержание в препарате F10 составило 80% от общего
пула белка). Было установлено, что препарат F10 может быть использован как
эффективная добавка к препарату В221-151 при гидролизе различных видов ЦСС,
приводящая к увеличению выхода продуктов гидролиза. Поэтому наше внимание
было сконцентрировано на возможности получения ферментных препаратов
15 P.verruculosum, имеющих в своем составе ПМО, способных при добавлении к
целлюлазному комплексу существенно увеличить выходы продуктов гидролиза ЦСС.
Сравнение свойств полисахаридмонооксигеназ грибов рода T.reesei,
M.thermophila и T.terrestris. В нашей лаборатории были выделены в гомогенном виде
три фермента, относящиеся к ПМО, а именно ПМО из T.reesei, M.thermophila и
T.terrestris. Нами были проведены исследования по сравнению каталитической
активности выделенных ПМО при их использовании в качестве добавок к
ферментному препарату P.verruculosum В221-151 для гидролиза МКЦ и
измельченной осиновой древесины (в качестве контроля использовали ферментный
препарат В221-151). Дозировка В221-151 составила 2 мг/г субстрата, ПМО – 1 мг/г.
На рис.5 представлены данные, характеризующие выходы ВС и глюкозы через 24
часа гидролиза нерастворимых субстратов. А
30
ВС
Глюкоза
20
10
0
30
ВС
Глюкоза
20
Б
10
T.
re
B
es
22
ei
115
1+
T.
re
es
ei
T.
te
B
rr
22
es
1tri
15
s
1+
T.
te
rr
es
tri
s
M
.th
B
er
22
m
1op
15
hi
1+
la
M
.th
er
m
op
hi
la
В
22
115
1
0
Рисунок 5. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных видов ЦСС:
А) МКЦ; Б) измельченная осина. Условия: 50°С, рН 5, [S]= 100 г/л, [В221-151]= 2
мг/г субстрата, [ПМО]= 1 мг/г субстрата, перемешивание – 1000 об/мин.
Добавление ПМО T.terrestris в реакционную смесь не повлияло на
гидролитическую активность ферментного препарата В221-151. Добавление ПМО
M.thermophila увеличило выход ВС и глюкозы по сравнению с контролем примерно в
2 раза, а добавление ПМО T.reesei – примерно в 1,5 раза по сравнению с ферментным
препаратом В221-151.
16 Отметим, что в отсутствии препарата В221-151 гомогенные ПМО
M.thermophila, T.reesei и T.terrestris практически не приводили к образованию ВС и
глюкозы при гидролизе МКЦ и измельченной осиновой древесины. Состав и свойства нового ферментного препарата, полученного с помощью
гриба рода P.verruculosum В1_MT. На основании полученных выше данных был
сделан вывод о необходимости создания штамма P.verruculosum, который, наряду с
комплексом собственных целлюлолитических ферментов, будет продуцировать ПМО
M.thermophila. С помощью индуцибельной системы экспрессии под контролем
промотора гена cbh1, кодирующего мажорный белок P.verruculosum ЦБГ I, такой
рекомбинантный штамм-продуцент был создан, на его основе получен ферментный
препарат P.verruculosum В1_MT (представлявший собой лиофильно высушенную
культуральную жидкость, полученную в 1-л ферментере с помощью штаммапродуцента P.verruculosum В1_MT). Целью наших дальнейших исследований
являлось изучение свойств полученного нового ферментного препарата.
Электрофореграмма препаратов В1_МТ и В221-151 представлена на рис.6.
Доказательством наличия экспрессии ПМО M.thermophila, являлись результаты
идентификации трипсинового гидролизата фрагмента соответствующей белковой
полосы полиакриаламидного геля, полученные с помощью MALDI-TOF массспектрометрии.
В1_МТ М В221-151 116
90 50 ПМО M.thermophila 36 27 20 Рисунок 6. Электрофореграмма ферментных препаратов B1_MT и В221-151
(М – маркёры молекулярной массы).
Удельные авицелазная, КМЦ-азная и ксиланазная активности ферментного
препарата B1_MT (табл.5) по сравнению с аналогичными активностями препарата
В221-151 (табл.3) несколько уменьшились, а удельная целлобиазная активность у
обоих препаратов была близка. Уменьшение удельных активностей по отношению к
соответствующим субстратам может свидетельствовать о некотором уменьшении
17 содержания в общем пуле секреторного белка таких ферментов как ЦБГ, ЭГ и
ксиланазы за счет появления в составе препарата фермента ПМО M.thermophila (не
обладающего активностью по отношению к этим субстратам).
Качественный и количественный состав ферментного препарата В1_МТ
определяли с помощью методов, описанных в предыдущих разделах. Полученные
данные представлены в табл.6. Препарат B1_MT характеризовался меньшим
суммарным содержанием ЦБГ, чем препарат В221-151 (ср. табл.4 и 6), что
соответствует различию удельных активностей препаратов по МКЦ (ср. табл.3 и 5).
Общее содержание ЭГ в препарате B1_MT оказалось меньше примерно на 40%, что
соответствует уменьшению удельной активности препарата по КМЦ. Общее
содержание ксиланаз и БГЛ в препарате B1_MT уменьшилось по сравнению с В221151 незначительно. Содержание ПМО M.thermophila в препарате B1_MT составило
25% от общего пула белка.
Таблица 5. Удельные активности ферментного препарата P.verruculosum В1_МТ, по
отношению к различным субстратам, ед./мг белка.
Активность
Ферментный
препарат
Авицелазная
400С,
рН 5.0
КМЦазная
500С,
рН 5.0
Целлоби
-азная
400С,
рН 5.0
Ксиланазная
500С,
рН 5.0
0,3
6,4
0,6
17,5
P. verruculosum
В1_МТ
Таблица 6. Компонентный состав ферментного препарата P.verruculosum В1_МТ, %
от общего содержания белка.
Ферментный препарат
Фермент
В1_МТ
Целлобиогидролазы
54
Эндоглюканазы
10
β-Глюкозидаза гомологичная
3
β-Глюкозидаза гетерологичная (Aspergillus sp.)
Ксиланазы
3
Полисахаридмонооксигеназа
25
Сравнивали гидролитическую активность ферментного препарата B1_MT по
отношению к ЦСС с таковой для контрольного препарата В221-151, для смеси
ферментных препаратов В221-151 и целлобиазного препарата F10, а также лучшего
18 промышленного препарата Cellic CTec3. В качестве ЦСС использовали измельченные
осиновую и сосновую древесину, багассу, а также МКЦ. За критерий
гидролитической активности принимали выходы глюкозы и ВС после 24 часов
гидролиза (загрузка ферментных препаратов составляла 5 мг белка на 1 г субстрата).
Препарат B1_MT, имеющий в своем составе, помимо гидролитических ферментов
целлюлазного комплекса, ПМО M.thermophila, гидролизовал различные виды ЦСС
более эффективно по сравнению с препаратом В221-151. Выходы ВС и глюкозы в
случае препарата B1_MT были выше на 60% и 40% при гидролизе МКЦ и различных
видов ЦСС, соответственно (рис.7). По гидролитической активности препарат B1_MT
практически не уступал промышленному ферментному препарату Cellic CTec3.
Интересно отметить, что добавление целлобиазного препарата F10 к целлюлазному
препарату В221-151 приводило к увеличению его гидролитической способности до
уровня, примерно сопоставимого с таковой для препарата B1_MT.
Таким образом, сформулированные выше на основании сравнительного
анализа компонентного состава наиболее активных современных промышленных
ферментных препаратов и препарата P.verruculosum В221-151 требования к
изменению его состава, заключающиеся в необходимости его дополнительного
обогащения ПМО (и БГЛ) оказались справедливыми и подтвердились
экспериментальными данными. Следует отметить, что введение в состав ферментного
препарата P.verruculosum B1_MT 25% ПМО (от общего пула белка) позволило
сохранить необходимое для эффективного гидролиза ЦСС содержание других
целлюлолитических ферментов (ЦБГ и ЭГ).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ферментные препараты на
основе новых штаммов-продуцентов P.verruculosum, являются конкурентоспособными
для применения в процессах биоконверсии возобновляемого растительного сырья по
сравнению с новыми современными промышленными ферментными препаратами,
полученными с помощью штаммов-продуцентов Trichoderma и Myceliophtora sp.,
выпускаемых ведущими биотехнологическими компаниями.
19 60
А
50
40
ВС
Глюкоза
30
20
10
0
60
Б
50
40
ВС
Глюкоза
30
20
10
3
0
60
50
В
40
ВС
Глюкоза
30
20
10
0
60
50
Г
40
ВС
Глюкоза
30
20
10
В2
21
-1
51
+F
10
C
Тe
c3
C
el
lic
B1
_M
T
B2
21
-1
51
0
Рисунок 7. Выход ВС и глюкозы (г/л) за 24 часа гидролиза различных видов ЦСС:
А) измельченная МКЦ; Б) измельченная и обессмоленная сосна; В) измельченная
осина; Г) измельченная багасса. Условия: 50°С, рН 5, [S]= 100 г/л, [E]= 5 мг/г
субстрата, перемешивание – 1000 об/мин.
20 ВЫВОДЫ
1.
Определён компонентный состав новых промышленных ферментных
препаратов серий Cellic CТec (Novozymes), Accellerase (DuPont&Genencor) на основе
гриба рода Trichoderma reesei и Myceliophtora thermophila C1 (Dyadic International,
Inc) для эффективного гидролиза целлюлозосодержащего сырья (ЦСС). Установлено,
что содержание целлобиогидролаз (ЦБГ) варьировало в пределах от 30% до 60% от
общего количества белка, эндоглюканаз (ЭГ) – от 10 до 30%, β-глюкозидаз – от 5 до
20%, ксиланаз - от 1-2% (Accellerase 1000 и С1_1) до 5-10% (Accellerase DUET и
TRIO, Cellic CTec2, Cellic CTec3, С1_2, С1_3 и С1_4), а содержание β-ксилозидаз
составляло 1-2%. Обнаружено, что в состав препаратов Accellerase TRIO и Cellic CTec
входят гетерологичные β-глюкозидазы из различных видов грибов Aspergillus, и их
содержание в 5-7 раза превышает содержание гомологичной β-глюкозидазы. Кроме
того, в состав препаратов Cellic CTec2, Cellic CTec3 и M.thermophila C1 были
обнаружены ферменты, относящиеся к классу полисахаридмонооксигенз (ПМО).
2.
Проведен
сравнительный
анализ
компонентного
состава
и
гидролитической активности наиболее активного промышленного ферментного
препарата Cellic CTec3 и лабораторного препарата на основе Penicillium verruculosum
В221-151 (ИНБИ РАН). Установлено, что содержание ЦБГ (69%), ЭГ (17%) и
ксиланаз (4%) в препарате В221-151 сравнимо с их содержанием в препарате Cellic
CTec3, однако В221-151 отличался более низким содержанием β-глюкозидазы (~ 4%),
и не содержал ПМО.
3.
Исследовано влияние трёх гомогенных ПМО, выделенных из грибов
T.reesei, M.thermophila и Thelavia terrestris, на гидролитическую активность
ферментного препарата В221-151 по отношению к различным видам ЦСС и показано,
что ПМО T.reesei и M.thermophila приводят к 1,5-2-кратному увеличению
гидролитической активности препарата В221-151.
4.
Создан ферментный препарат на основе нового штамма-продуцента
P.verruculosum B1_MT, содержащий помимо собственного целлюлазного комплекса
ПМО M.thermophila; исследованы свойства нового препарата и установлено, что его
гидролитическая активность возрастает в 1,5-2 раза по сравнению с исходным
ферментным препаратом B221-151, а также достигает уровня препарата Cellic CTec3.
Установлено, что в состав препарата P.verruculosum B1_MT входит 25% ПМО, 54%
ЦБГ, 10% ЭГ, 3% β-глюкозидазы и 3% ксиланаз.
5.
Показано, что совместное применение ферментного препарата
P.verruculosum B221-151 и β-глюкозидазного ферментного препарата P.verruculosum
F10 приводит к увеличению общей гидролитической активности ферментного
комплекса до уровня препарата Cellic CTec3.
21 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:
1. Доценко Г.С., Чекушина А.В., Кондратьева Е.Г., Правильников А.Г., Андрианов
Р.М., Осипов Д.О., Синицына О.А., Короткова О.Г., Степанов В.И., Новожилов Е.В.,
Ачильдиев
Е.Р.,
Синицын
А.П.
Реакционная
способность
различных
целлюлозосодержащих материалов при ферментативном гидролизе. Вестник
Московского государственного университета леса – Лесной вестник, 2012, №8, 129135.
2. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Синицын А.П. Сравнение эффективности процессов
биоконверсии растительного сырья биокатализаторами на основе ферментных
препаратов Trichoderma и Penicillium verruculosum. Катализ в промышленности, 2012,
№6, 68-76.
3. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Компонентный
состав коммерческих ферментных препаратов, полученных с помощью грибов рода
Trichoderma и предназначенных для биоконверсии растительного сырья.
Биотехнология, 2013, №3, 58-68.
4. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Ферментные
препараты Penicillium verruculosum для биоконверсии растительного сырья –
альтернатива коммерческим препаратам, полученных с помощью грибов рода
Trichoderma. Биотехнология, 2013, №3, 69-80.
Тезисы докладов и статьи:
1.
Gusakov A.V., Shulga T.N., Chekushina A.V., Sinitsyn A.P. Comparison of three
protein assays for purified cellulases and hemicellulases from fungi. Open Journal of
Analytical Chemistry Research, 2013, №1 (1), 1-4.
2.
Андрианов Р.М., Чекушина А.В., Зоров И.Н., Синицын А.П. Разработка
методик изучения адсорбционных свойств ферментных препаратов на
лигноцеллюлозных субстратах. Московская международная научно-практическая
конференция «Биотехнология: экология крупных городов», 15-17 марта, 2010,
Москва.
3.
Денисенко Ю.А., Чекушина А.В. Исследование свойств ферментных
препаратов на основе новых штаммов Penicillium verruculosum. Международная
научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 9-13
апреля, 2012, Москва.
4.
Чекушина А.В., Синицын А.П. Сравнительный анализ гидролитической
способности ферментных препаратов Penicillium и Trichoderma. Международный
конгресс «Биомасса: топливо и энергия», 17-18 апреля, 2012, Москва.
22 5.
Sinitsyn A. P., Rozhkova A.M., Sinitsyna O.A., Chekushina A.V., Bushina E.V.,
Volkov P.V., Proskurina O.V., Satrutdinov A.D. Production platform for industral enzymes
based on a Penicillium host-vector system. VII International Symposium «EU-Russia:
Cooperation in Biotechnology, Agriculture, Forestry, Fisheries and Food», 31 may-1 june,
2012, Moscow.
6.
Чекушина А.В., Синицын А.П. Сравнение эффективности применения
ферментных препаратов, полученных с использованием грибов рода Penicillium и
Trichoderma для гидролиза различных видов целлюлозосодержащего сырья.
Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития
биотехнологии», 3-5 октября, 2012, Саранск.
7.
Чекушина А.В., Синицын А.П. Изучение компонентного состава ферментных
препаратов, применяемых для эффективного гидролиза различных видов
целлюлозосодержащего сырья. Международная научная конференция «Достижения и
перспективы развития биотехнологии», 3-5 октября, 2012, Саранск.
8.
Чекушина А.В., Синицын А.П. Сравнительный анализ биоконверсии
растительного сырья ферментативными препаратами различных грибных
продуцентов. Международный конгресс «Биотехнология: состояния и перспективы
развития», 19-22 марта, 2013, Москва.
9.
Булахов А.Г., Чекушина А.В. Сравнение эффективности процессов
биоконверсии растительного сырья ферментными препаратами продуцентов
Trichoderma и Penicillium. Международная научная конференция студентов,
аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 8-13 апреля, 2013, Москва.
10.
Chekushina A.V., Bulakhov A.G., Sinitsyn A.V. The main components of
multienzyme complex from Trichoderma for effective hydrolysis of plant raw materials.
International Conference «Biocatalysis: Fundamentals & Applications», 2-5 july, 2013,
Moscow.
11.
Чекушина А.В., Синицын А.П. Анализ компонентного состава ферментных
препаратов для эффективного гидролиза лигноцеллюлозных материалов.
Международная конференция «Физикохимия растительных полимеров», 8-11 июля,
2013, Архангельск.
23 
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа