close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

КОМПЛЕКСЫ ВОДОРОСЛЕЙ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ГРИБОВ ГОРОДСКИХ ПОЧВ И ИХ РЕАКЦИИ НА ДЕЙСТВИЕ ПОЛЛЮТАНТОВ.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Зыкова Юлия Николаевна
КОМПЛЕКСЫ ВОДОРОСЛЕЙ, ЦИАНОБАКТЕРИЙ И ГРИБОВ ГОРОДСКИХ ПОЧВ
И ИХ РЕАКЦИИ НА ДЕЙСТВИЕ ПОЛЛЮТАНТОВ
03.02.03. – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена на кафедре ботаники, физиологии растений и микробиологии агрономического факультета Вятской государственной сельскохозяйственной академии
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Домрачева Людмила Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, доцент кафедры биологии почв,
факультета почвоведения Московского государственного
университета имени М. В. Ломоносова
Лысак Людмила Вячеславовна
кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии
и иммунологии, факультета почвоведения, агрохимии и экологии
Российского государственного аграрного университета–
МСХА имени К. А. Тимирязева
Ванькова Анна Андреевна
Ведущая организация: Государственное научное учреждение научно-исследовательский
институт сельского хозяйства Северо-Востока
Россельхозакадемии, г. Киров
Защита состоится «21» «мая» 2013 года в ______ на заседании диссертационного совета
Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по
адресу: 119991, Москва, ГСП–1, Ленинские горы, МГУ имени М. В. Ломоносова, д.1, строение 12, факультет почвоведения.
С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского
государственного университета имени М. В. Ломоносова
Автореферат разослан «__» «__________» 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Зенова Галина Михайловна
2
Актуальность темы. Урбанизация – один из прогрессирующих процессов на планете.
С каждым годом стремительно увеличивается площадь урбанизированных территорий, и доля населения, проживающая в городах. Экосистемы городов радикально отличаются от примыкающих к ним природных биоценозов и сельскохозяйственных экосистем. Урбанизация
ландшафтов приводит к существенному изменению рельефа, водного, воздушного, геохимического режимов местности, изменению состава флоры, фауны, микробиоты. Неотъемлемый
компонент структуры наземных экосистем - почва - выполняет множество экологических
функций, обеспечивающих жизнь обитающих в почве и на еѐ поверхности организмов. Экологические функции почвы в своѐм проявлении обусловлены морфологическими, физическими и химическими свойствами почв (Добровольский, 2012; Чернов, 2012). Городские
почвы резко отличаются от зональных по таким признакам как кислотность, содержание загрязняющих веществ, водный и тепловой режимы. Изменение химического режима почвы
сказывается и на функционировании микробных сообществ (Звягинцев, 1987; Кабиров, 1991;
Лысак, Сидоренко, 1998; Добровольская и др., 2001; Артамонова, 2002; Киреева и др., 2005;
Марфенина, 2005; Терехова, 2007; Лысак, 2010 и др.). В частности, происходит усиление роли в педоценозах патогенных и оппортунистических форм бактерий и грибов, резко возрастает численность наноформ бактерий, меняется структура популяций микромицетов, сглаживаются зональные особенности почвенной альгофлоры, обедняется еѐ видовое разнообразие. Однако до настоящего времени недостаточно изучена специфика формирования и функционирования комплексов водорослей, цианобактерий (ЦБ) и грибов городских почв, для
которых показана особая роль в статусе почв сельскохозяйственных, луговых и лесных экосистем (Штина, 1955 – 1997; Штина, Голлербах, 1975; Алексахина, Штина, 1984; Панкратова, 1982, 1989; Дубовик, 1995; Домрачева, 2005; Кузяхметов , 2006).
Целью работы было изучение структуры комплексов водорослей, цианобактерий и
грибов городских почв и выявление их реакций на действие различных поллютантов.
Задачи исследования:
1. Видовая и количественная характеристика внутрипочвенных и наземных фототрофных
микробных группировок.
2. Изучение влияния различных поллютантов на структурные особенности, ход сукцессий
фототрофных микробных сообществ, физиологический отклик отдельных видов ЦБ и
сообщества в целом.
3. Определение сорбционных возможностей отдельных штаммов цианобактерий и цианобактериальных комплексов.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение структуры комплексов почвенных водорослей, цианобактерий (ЦБ) и грибов в зонах г. Кирова с разной техногенной
нагрузкой. Установлено, что максимальное видовое обилие фототрофов характерно для парковой и промышленной зон. Выявлен феномен «цветения» городских почв и субстратов, сообщества которых представляют многовидовые комплексы, с плотностью фототрофных популяций от 18 до 47 млн. кл./см2. Доля эукариотных водорослей в подобных сообществах колеблется от 2 до 12% при абсолютном доминировании ЦБ. Показано, что постоянным значимым компонентом «цветения» почвы являются микромицеты, структура популяций которых служит важным индикационным признаком в биодиагностике.
Впервые выявлены факты и специфические особенности зимней вегетации альгофлоры, включая «цветение» почвы.
Установлено, что под влиянием различных поллютантов изменяется ход сукцессий в
природных биоплѐнках Nostoc commune.
Предложены методы комплексной оценки адаптационных возможностей штаммов ЦБ
Nostoc paludosum, N. muscorum, N. linckia, природных биоплѐнки N. commune и природных
биоплѐнок с доминированием безгетероцистных цианобактерий (БГЦ) на действие таких
3
поллютантов, нефтепродукты (НП), хлорида натрия, ионы меди и никеля, по возрастанию
интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), снижению концентрации
хлорофилла а в клетках, изменению каталазной активности и жизнеспособности клеток, изменению плотности популяций фототрофов и бактерий-спутников.
Доказана высокая сорбционная способность чистых культур ЦБ и природных цианобактериальных биоплѐнок, выделенных из почв г. Кирова, по отношению к ионам меди и никеля.
Практическая значимость. Результаты диссертации дополняют представления о
влиянии поллютантов на видовой состав, численность и структуру комплексов водорослей,
ЦБ и грибов урбанозѐмов. Данные исследования показывают, что для биоиндикации состояния сред, загрязненных ионами тяжѐлых металлов (ТМ) и НП, перспективно использование
биоиндикационного метода по соотношению микромицетов с бесцветным и окрашенным
мицелием; цианобактериального анализа, учитывающего соотношение группировок гетероцистных (ГЦ) и безгетероцистных (БГЦ) форм, а также соотношение эукариотных и прокариотных фототрофов. С целью проведения биотестирования состояния окружающей среды
возможно определение жизнеспособности клеток ЦБ тетразольно-топографическим методом. Выявлены цианобактериальные штаммы, обладающие высокой сорбционной активность по отношению к ТМ и НП, что может служить основой для получения биосорбентов.
Установлены условия, при которых природный комплекс БГЦ ЦБ способен очищать
водные растворы от ионов меди (ІІ) и никеля (ІІ), а также выявлен высокий потенциал в обезвреживании ТМ у природных биоплѐнок Nostoc commune и чистых культур N. paludosum,
N. linckia. На основании полученных данных возможно создание надѐжного и эффективного
биопрепарата для биоремедиации загрязнѐнных природных сред.
Личное участие автора. Автором проведены аналитический обзор литературы, планирование экспериментальной работы, отбор почвенных образцов, получена основная часть
фактических данных, проведена интерпретация полученных результатов.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на научных конференциях: 9-ая научная конференция аспирантов и соискателей «Науке нового века – знания молодых» (Киров, 2009); 4-я областная научно-практическая конференция молодѐжи «Экология
родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2009); 2-ая Всероссийская научнопрактическая конференция «Водоросли: проблемы таксономии, экологии и использование в
мониторинге» (Сыктывкар, 2009); Всероссийская научно-практическая конференция, посвящѐнная 65-летию агрономического факультета «Инновационные технологии – в практику
сельского хозяйства» (Киров, 2009); Всероссийская научно-практическая конференция
«Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009); Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии,
экологии и биотехнологии микроорганизмов», посвящѐнный 125-летию со дня рождения
академика В. Н. Шапошникова и 120-летию со дня рождения профессора Е. Е. Успенского
(Москва, 2009); Всероссийская научно-практическая конференция молодых учѐных, аспирантов и соискателей, посвящѐнная 80-летию Вятской ГСХА «Науке нового века – знания
молодых» (Киров, 2010); Всероссийская научно-практическая конференция молодѐжи «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2010); Международная научнопрактическая конференция, посвящѐнная 100-летию со дня рождения профессора Э. А.
Штиной «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах»
(Киров, 2010); 2-ой Всероссийский симпозиум с международным участием «Автотрофные
микроорганизмы» (Москва, МГУ, 2010); Вторая научно-практическая конференция «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, СОГУ, 2011); Международная научно-практическая конференция молодых ученых, аспирантов и соискателей «Науке нового века – знания молодых» (Киров, ВГСХА, 2011); Всероссийская молодѐжная науч4
но-практическая конференция «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, ВятГГУ, 2011); Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные
основы и инновационные технологии» и Школа молодых учѐных по экологической физиологии растений (Москва МСХА им. Тимирязева, 2011); VІ съезд общества почвоведов им.
В. В. Докучаева Всероссийская с международным участием научная конференция «Почвы
России: современное состояние, перспективы изучения и использования» (Петрозаводск –
Москва, ПГУ, 2012)
Публикации. По результатам исследований опубликовано 26 научных работы, из которых 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4
глав, заключения, выводов, списка литературы включающего 265 наименований, в том числе
73 зарубежных издания. Работа содержит 160 страниц текста, 13 рисунков, 42 таблицы.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь и поддержку научному руководителю д.б.н., профессору Л. И. Домрачевой; к.б.н., доценту Л. В. Кондаковой; к.б.н., доценту А. И. Фокиной; к.б.н., доценту С. Ю.
Огородниковой, всем членам кафедра ботаники, физиологии растений и микробиологиии
им. Э. А. Штиной ВГСХА и сотрудникам лаборатории биомониторинга Института биологии
Коми НЦ УрО РАН и Вятского государственного гуманитарного университета.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты и методы исследования.
В работе использовали образцы почв, отобранные на территории г. Кирова в промышленной, транспортной, селитебной и парковой зонах.
Объектами исследования были природные внутрипочвенные фототрофные комплексы
микроорганизмов, образцы «цветущей» почвы, наземные биоплѐнки и чистые культуры ЦБ.
Численность клеток водорослей и ЦБ, определяли методом прямого счѐта под микроскопом на мазках с одновременным определением их биомассы объемно расчѐтным методом
(Домрачева, 2005). Длину мицелия микромицетов и их биомассу определяли на тех же мазках методом Л.М. Полянской (1996) в нашей модификации.
Видовой состав фототрофов выявляли методом водных и чашечных культур (Голлербах, Штина, 1969). Титр клеток ЦБ в водных культурах определяли с помощью камеры
Горяева (Практикум…, 2005).
Учет эколого-физиологических групп сапротрофных микроорганизмов вели методом
посева на селективные питательные среды (Теппер, 2004).
Жизнеспособность клеток ЦБ определяли по активности дегидрогеназы тетразольнотопографическим методом (Домрачева и др., 2008), основанным на превращении в живых
клетках бесцветного 2,3,5 - трифенилтетразолий хлорида в кристаллы 2,3,5 - трифенилформазана, имеющего красную окраску.
Активность каталазы определялась методом перманганатометрии и газометрически
(Хазиев., 2005).
Количественное определение подвижных и валовых форм ТМ было проведено методами атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС) (Методика выполнения измерений массовых долей токсичных металлов в пробах природных, питьевых и сточных вод атомноабсорбционным методом. ФР.1.31.2007.03683, Москва. 13с.) и инверсионного электрохимического анализа (ИЭА) (Сборник методик измерений массовой концентрации ионов меди,
свинца, кадмия, цинка, висмута, марганца, никеля и кобальта методом вольтамперометрии на
вольтамперометрическом анализаторе «Экотест-ВА». М.: ООО «Эконикс-Эксперт», 2004. 61
с.). Пробоподготовку почвенной вытяжки проводили согласно описанным нормам (Практикум по агрохимии, 2001).
Количественное определение нефтепродуктов проводили на приборе «КН-2М» (Методика измерения массовой доли нефтепродуктов в питьевых, природных и очищенных
сточных водах методом ИК-спектрометрии. Количественный химический анализ почв. ПНД
Ф 14.1:2.4.168-2000. 22 с.).
5
Новые разработки
Пробоподготовка культуральной жидкости ЦБ к определению ТМ
Для определения остаточного содержания ТМ культуру ЦБ отфильтровывают, 2 мл
фильтрата переносят в фарфоровую чашку и проводят «мокрое» озоление двумя миллилитрами концентрированного раствора соляной и азотной кислоты. Сухой остаток растворяют в
5 мл концентрированного фонового раствора для инверсионного электрохимического анализа. Приготовленный раствор можно использовать не только для ИЭА, но и для ААС. Для
ААС можно не проводить специальной пробоподготовки, непосредственно использовать
фильтрат.
Изменение концентрации ионов никеля (II) в растворе в присутствии чистых культур
Nostoc linckia (Roth.) 273 и Nostoc paludosum (Kütz.)18
Культуры ЦБ Nostoc linckia и Nostoc paludosum в контрольном и опытном вариантах
выращивали на жидкой среде Громова № 6 без азота в течение 3-х недель. Перед постановкой опыта культуры гомогенизировали. Рост культур проходил в люминостате при постоянной температуре (+25° С) и освещении 3000 лк. Титр ЦБ при постановке опыта составлял
7·106 клеток/мл. Параллельно в такой же промежуток времени выращивали культуры без
токсиканта. Через 21 сутки в жидкость с чистыми от токсиканта культурами был внесен никель в количестве, аналогичном первому опыту, – 20 мг/л чтобы сравнить, как изменится
концентрация никеля при контакте с гомогенизированной культурой за 21 сутки с изменением концентрации никеля после контакта с «окрепшей», сбившейся в «плѐнки» культурой, но
за 1 сутки.
Изменение концентрации никеля (II), меди (II) и нефтепродуктов в присутствии культуры ЦБ Nostoc linckia
Никель и НП брали в концентрациях 2 и 20 мг/л, а также их смесь. Культуру ЦБ в
контрольном и опытном вариантах выращивали на жидкой среде Громова № 6 без азота в
течение 2-х недель в люминостате при постоянной температуре (+25° С) и круглосуточном
освещении (3000 лк). Титр ЦБ при постановке опыта составлял 7·106 клеток/мл.
Изменение концентрации никеля (II) и меди (II) в водном растворе в присутствии природных биопленок с доминированием безгетероцистных ЦБ
Опыты проведены с ненарушенными и гомогенизированными плѐнками. Гомогенизацию культуры проводили при 11000 об./мин. в течение 1 минуты. Концентрацию токсиканта
определяли после его суточной экспозиции с культурой ЦБ. После определения наиболее оптимальной для контакта формы ЦБ определяли титр микроорганизмов, необходимый для
снижения концентрации токсикантов до уровня ПДК и ниже. После этого устанавливали
время, при котором будет максимальное снижение концентрации ионов металлов в растворе.
Изменение концентрации никеля (II) и меди (II) в водном растворе в присутствии природных биопленок с доминированием Nostoc commune
Никель и медь брали в концентрациях 2 и 20 мг/л, а также их смесь. Сухую, растѐртую в ступке до порошкообразного состояния многовидовую плѐнку Nostoc commune, помещали в растворы с токсикантами. Через сутки определяли остаточное содержание ионов никеля и меди в фильтрате.
Количественное определение физиолого-биохимических параметров ЦБ и культуральной жидкости ЦБ после контакта с поллютантами
Определение жизнеспособности клеток в природных биоплѐнках ЦБ
После контакта ЦБ с токсикантами, полностью отделяли раствор, содержащий поллютант, и культуру заливали 0,075% раствором ТТХ, выдерживали 1 сутки, далее действовали согласно методике определения жизнеспособности клеток.
Определение каталазной активности ЦБ после воздействия токсиканта
После экспозиции культуры ЦБ с токсикантом, отбирали 5 мл суспензии и помещали
еѐ в одно из колен сосуда Ландольта. В другое колено помещали 5 мл 3% раствора пероксида
водорода. Для поддержания рН к ЦБ добавляли 0,01 г карбоната кальция. После смешения
6
раствора пероксида с суспензией микроорганизмов замеряли объѐм кислорода, выделяющегося в течение 5 минут.
Определение перекисного окисления липидов
Интенсивность ПОЛ в культурах ЦБ анализировали по цветной реакции тиобарбитуровой кислоты с малоновым диальдегидом (МДА), образующимся в процессе ПОЛ. За основу была взята методика определения ПОЛ в растительных тканях (Лукаткин, 2002) в нашей
модификации. Для анализа отбирали 1 мл гомогенизированной культуры ЦБ, добавляли
ТРИС-НС1 буфер (рН=7,6) и 0,5% раствор тиобарбитуровой кислоты в 20% трихлоруксусной кислоте. Полученный раствор кипятили на водяной бане в течение 30 минут. Оптическую плотность фильтрата определяли на спектрофотометре Specol-1100 при длине волн 532
нм (Огородникова и др., 2010).
Определение хлорофилла а и феофитина в клетках ЦБ
Содержание хлорофилла а и феофитина определяли по монохроматической методике.
Брали 2,5 мл гомогената ЦБ, добавляли 3 мл ацетона, на кончике шпателя немного соли CaCO3 и растирали в ступке. Растертую массу переносили в пробирку для центрифугирования,
полученный раствор переливали в кюветы толщиной 1 см. Далее измеряли оптическую
плотность раствора, сравнивая с плотностью кюветы с ацетоном, на спектрофотометре Specol-1100 при двух длинах волн 750 нм и 665 нм. Затем добавляли в кюветы с растворами ЦБ
0,2 мл 1% HCl и перемешивали, ждали 2-5 мин и снова измеряли оптическую плотность при
двух длинах волн. Концентрацию рассчитывали по формуле предложенной Лоуренцом (Neelam T., Meenu S., 2009).
Определение морфологических особенностей популяций и отдельных микроорганизмов
Морфологию поверхности цианобактерий определяли методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ). Сканирование вели в режиме атомно-силовой микроскопии на СЗМ
NanoEducator в полуконтактном режиме. Разрешающая способность скана составила 50 нм в
горизонтальной плоскости и 4 нм по вертикали (Миронов, 2005; Неволин, 2005). Образцы
цианобактерий готовили осаждением из культурального раствора на чистое покровное стекло с последующим высушиванием при 20°С.
Статическую обработку данных проводили с применением пакетов прикладных программ Statistica 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Особенности комплексов водорослей, цианобактерий и грибов городских почв
Альфлора городских почв. Альгофлора почв г. Кирова представлена отделами Cyanophyta 36 видов, Bacillariophyta - 8, Xanthophyta - 9, Eustigmatophyta - 6, Chlorophyta - 35. Всего выявлен 91 вид (рис. 1).
91
100
80
61
40
20
55
49
60
36
28
20
8 3
2
21
18
7 2
1
16
35
24
8 9 6
6 6 3
0
Промышленная
Транспортная
Cyanophyta
Eustigmatophyta
Bacillariophyta
Chlorophyta
Парковая
Всего видов
Xanthophyta
Суммарно по зонам
Рис. 1. Таксономический состав почвенных водорослей и ЦБ различных зон Г. Кирова.
7
Наиболее богатая альгофлора цианопрокариот - 28 видов - отмечена в районах размещения промышленных предприятий, что ещѐ раз подтверждает положение об особой устойчивости данной группы фототрофных микроорганизмов (Кондакова, Домрачева, 2007). Доминантами в этих сообществах являются различные виды ЦБ рода Nostoc и Phormidium.
Представители Xanthophyta, которых считают наиболее чувствительными к загрязнению,
наиболее многочисленны в парках (6 видов). Представительство зелѐных водорослей по численности видов практически одинаково во всех исследованных зонах.
Численность водорослей и ЦБ в городских почвах. Учѐт численности клеток водорослей и
ЦБ показал, что городские почвы обильно заселены микрофототрофами. Основную роль в
почвенных альгоценозах по этому показателю, так же как по видовому составу, играют ЦБ
(табл. 1).
Таблица 1
Пределы колебаний численность клеток микрофототрофов в городских почвах
(тыс. клеток/г)
Место отбора проб
Водоросли
Цианобактерии
Всего
Районы промышлен- 200 - 250
1217 - 2983
1467 – 3183
ных предприятий
Транспортная зона
330 - 400
1180 - 2117
1580 – 2417
Парковая зона
320 - 330
1180 - 2743
1510 – 3063
«Цветение» городских почв. Внутрипочвенный пул фототрофов является матричной основой для возникновения «цветения» почв. Максимальное видовое обилие в плѐнках «цветения» характерно для промышленной (29 видов) и парковой (20 видов) зон. При этом основной вклад в видовую структуру наземных фототрофных комплексов вносят ЦБ (рис. 2).
40
30
20
10
29
19
20
15
8
4 3
2
7
8
7
5
1
0
Промышленная
Селитебная
Cyanophyta
Парковая
Bacillariophyta
Транспортная
Chlorophyta
Всего видов
Рис.2. Количество видов фототрофов в плѐнках «цветения» почв г. Кирова.
Определение количественных характеристик наземных сообществ показало, что плотность клеток в плѐнках «цветения» чрезвычайно велика и колеблется в разных зонах города
от 18 до 47 млн./см2 (табл. 2).
Таблица 2
Показатели численности клеток водорослей и цианобактерий
в плѐнках «цветения» в различных зонах города (тыс./см2)
Цианобактерии
Зона
Зелѐные
Диатомовые
Всего
обследования
водоросли
водоросли
БГЦ
ГЦ
Промышленная
1265±40
515±20
5850±150
18600±1000
26300
Селитебная
446±42
2050±57
17978±781
0
20474
Парковая
0
540±30
10660±500
7070±213
18270
Транспортная
200±10
610±20
43360±900
3500±210
46860
Примечание: здесь и далее в таблицах, БГЦ - безгетероцистные цианобактерии, ГЦ - гетероцистные цианобактерии.
Различные группы фототрофов принимают различное участие в формировании структуры наземных разрастаний (табл. 3). Особенно показателен факт доминирования БГЦ ЦБ
8
(от 60 до 100% в структуре популяций ЦБ). Доминирование азотфиксирующих гетероцистных (ГЦ) ЦБ в промышленной зоне (район ТЭЦ), вероятно, обусловлено тем, что «цветение»
в данном случае развивается не на почве, а на безазотистом субстрате из опилок и песка.
Таблица 3
Структура популяций фототрофов в плѐнках «цветения» (%)
Зона обследования
Промышленная
Селитебная
Парковая
Транспортная
Фототрофы
водоросли
цианобактерии
6,8
93,2
12,2
87,8
2,9
97,1
1,7
98,3
Цианобактерии
безгетероцистные гетероцистные
23,9
76,1
98,2
1,8
60,1
39,9
92,5
7,5
Для изучения в динамике состояние поверхностных разрастаний, в одной из наиболее
загрязнѐнных точек города – районе ТЭЦ, пробы грунта (опилки с наносным песком) с поверхностными разрастаниями отбирали в июле 2008-2009 годов. Определение видового состава фототрофов показало, что в формировании наземных разрастаний принимают участие
гетероцистные и безгетероцистные ЦБ, а также водоросли из отделов Bacillariophyta и Chlorophyta. При этом в годы наблюдений видовой состав фототрофов менялся незначительно –
25 видов в 2008 г и 27 видов в 2009. Основной вклад в видовую структуру сообществ вносят
ЦБ (15 видов в 2008 г. и 18 видов в 2009 г.). Доминирующие позиции занимают ГЦ ЦБ из
рода Nostoc (N. paludosum, N. punctiforme, N. linckia f. muscorum).
Результаты количественного учѐта показывают, что численность фототрофов в поверхностных разрастаниях очень велика и составляет 34 млн. клеток/см2 в 2008 г. и 26 млн.
клеток/см2 в 2009 г. (табл.4). Сравнивая показатели плотности популяций по годам, можно
видеть, что снижение этого показателя происходит во всех группах фототрофов. Возможным
объяснением данного явления является разрастание высших растений, затенение и уменьшение свободной поверхности. Поселение растений стало возможным благодаря накоплению
азота вследствие азотфиксирующей деятельности ЦБ. Таким образом, налицо классическая
сукцессия: голый грунт – фотосинтезирующие азотфиксирующие ЦБ – высшие растения.
Таблица 4
Численность фототрофов в поверхностных разрастаниях
(млн. клеток/см2)
Группы фототрофов
Численность клеток
2008 год
2009 год
Зеленые водоросли
2,19±0,90
1,26±0,40
Диатомовые водоросли
1,00±0,03
0,51±0,02
Водоросли (всего)
3,19±0,93
1,77±0,42
БГЦ
8,94±0,50
5,85±1,50
ГЦ
22,82±0,76
18,60±1,00
ЦБ (всего)
31,76±1,26
24,45±2,50
Фототрофы (всего)
33,95±2,19
26,22±2,92
Помимо фототрофов, структурообразующую функцию в биоплѐнках выполняют микромицеты. Результаты показали, во-первых, что за год длина грибного мицелия существенно
снизилась (почти в 5 раз) и, во-вторых, что в оба года наблюдений длина мицелия меланизированных грибов в 2 раза больше по сравнению с неокрашенными формами (табл. 5). Причина снижения длины мицелия в 2009 г. может быть связана с уменьшением численности
фототрофов и, таким образом, с уменьшением доступного органического вещества для минерализационной активности микромицетов.
Таблица 5
2
Длина мицелия микромицетов, м/см .
9
Микромицеты
Длина мицелия
2008 год
2009 год
Окрашенный мицелий
98,16
25,12
Бесцветный мицелий
44,10
11,68
175,6
36,80
Суммарная длина
Анализ структуры комплексов водорослей, цианобактерий и грибов плѐнок «цветения» (табл. 6) показывает, что соотношение фототрофных популяций (водоросли – ЦБ) практически не меняется. В то же время происходит возрастание относительного обилия темноокрашенных (меланизированных) микромицетов, что свидетельствует о возрастании уровня
загрязнения исследуемого грунта.
Таблица 6
Структура популяций альго-микологических комплексов, %.
Годы
Водоросли
Цианобактерии
Грибы
Окрашенный
Бесцветный
мицелий
мицелий
2008
6,25
93,75
55,90
44,10
2009
6,80
93,20
68,30
31,70
Таким образом, погодичное изучение биоплѐнок «цветения» показывает, что высокую
устойчивость к неблагоприятным внешним факторам проявляют цианобактерии, которые
являются главным структурообразующим компонентом поверхностных альгоценозов с
плотностью их клеток более 10 млн./см2. В ходе погодичной сукцессии происходит снижение численности клеток фототрофов в плѐнках «цветения», которое одновременно сопровождается появлением высших растений. Увеличение доли темноокрашенных грибов в структуре популяций микромицетов свидетельствует об усилении уровня загрязнения грунта
вблизи ТЭЦ.
Впервые был отмечен факт зимнего «цветения» почвы, например, в 2009 г. оно продолжалось почти две недели (с 29 ноября до 10 декабря) на дворовой территории в условиях
устойчивого снежного покрова в местах, где проходит теплоцентраль (табл. 7)
Таблица 7
Особенности зимнего «цветения» почвы
Водоросли
Цианобактерии
ДиаПоказатель
Всего
Зеленые
томоБГЦ
ГЦ
вые
Численность
клеток,
1270±200
180±9
3017±130
6020±190 10487±529
2
тыс./см
Структура популяций
фототрофов, %
Структура
популяций
ЦБ, %
Биомасса, мг/см2
0,115
13,8
86,2
0,201
100
33,4
66,6
100
0,238
0,975
1,529
Кроме фототрофов, постоянным значимым компонентом в биоплѐнках являются микромицеты, имеющие формы с бесцветным и окрашенным (меланизированным) мицелием.
Длина мицелия грибов в плѐнках «цветения» и структура их популяций также колеблются в
широких пределах (табл. 8).
Таблица 8
Особенности популяций микромицетов при «цветении» городских почв
10
Структура популяций, %
с
бесцветным с окрашенным мимицелием
целием
Промышленная
14,4±2,1
31,7
68,3
Селитебная
26,6±3,0
57,9
42,1
Парковая
21,8±2,2
44,0
56,0
Транспортная
34,8±1,6
23,6
76,4
На напряжѐнную экологическую ситуацию в местах обследования указывает преобладание микромицетов с меланизированным мицелием. Известно, что синтез меланинов грибами – ответная реакция не только на избыточную инсоляцию, но и адаптация к накоплению
в среде поллютантов. Так, исходя из результатов, приведѐнных в таблице 8, ясно, что достаточно высокий уровень загрязнения характерен для промышленной (68,3% грибов с окрашенным мицелием в структуре популяций) и транспортной зон (76,4% меланизированных
форм микромицетов).
Реакция фототрофов не столь однозначна. Хотя во всех городских экотопах в плѐнках
«цветения» преобладают не водоросли, а ЦБ (в структуре популяций фототрофов их численность колеблется от 87,8 до 98,3%), уровень развития самих ЦБ, их безгетероцистных и гетероцистных форм резко различен в разных местообитаниях. Так, в почвах транспортной и селитебной зон наблюдается абсолютное господство БГЦ ЦБ (92,5 и 100%, соответственно). В
парковой зоне – почти паритетное их представительство (60,1% – безгетероцистные, 39,9% –
гетероцистные ЦБ). Но в промышленной зоне (район ТЭЦ)на искусственном субстрате из
древесных опилок и песка азотфиксирующие ЦБ в структуре популяций составляют 76,1%, а
безгетероцистные – 23,9%. Вероятно, длительное воздействие на почву городских поллютантов, которые с воздухом попадают и в парковые, и в селитебные зоны селектирует популяции ЦБ в сторону преимущественного развития безгетероцистных форм, так как высокая
чувствительность фермента нитрогеназа к загрязнителям у азотфиксирующих ЦБ может
блокировать их размножение. В то же время безазотистый субстрат, который периодически
обновляется у ТЭЦ, не успевает адсорбировать и накапливать поллютанты в количестве,
опасном для их развития.
Сравнительная характеристика структурных особенностей биомассы наземных комплексов водорослей, ЦБ и грибов городских почв показывает, что для данных микробных
комплексов, развивающихся в различных зонах города, характерны следующие особенности:
преобладание в структуре биомассы фототрофного компонента (до 97,2%), а не микромицетов; существенная длина нитей ЦБ и мицелия (до 100 м/см2), скрепляющих частицы почвы и
субстрата (табл. 9).
Таблица 9
Специфика количественных показателей биоплѐнок «цветения» городских почв
Структура
Длина нитей
Биомасса, мг/см2
Зона
популяций, %
ЦБ + мицеобследования
лий, м/см2
фототрофы
грибы
всего фототрофы
грибы
Промышленная
4,165
0,143
4,308
96,7
3,3
110,2
Селитебная
3,749
0,210
3,959
94,7
5,3
80,5
Парковая
2,594
0,085
2,679
96,8
3,2
75,0
Транспортная
4,692
0,136
4,828
97,2
2,8
48,9
В целом, «цветение» почвы или субстратов на урбанизированных территориях можно
рассматривать как положительное явление, так как наземное массовое размножение фототрофов приводит к быстрому обогащению урбаноземов мобильным, доступным для сапротрофов, органическим веществом; присутствие в поверхностных разрастаниях нитчатых ЦБ
и мицелия грибов способствует укреплению субстрата, выполняя противоэрозионные функции.
Адаптационные реакции фототрофных микроорганизмов на стрессовые воздействия
Зона обследования
Длина мицелия, м/см2
11
Изменение хода альгосукцессий биплѐнок Nostoc commune под влиянием городских
поллютантов. Способность микроорганизмов к созданию биоплѐнок является одним из
примеров адаптации к неблагоприятным условиям. Особенно значима роль многовидовых
биоплѐнок, в которых выживание сообщества в целом обусловлено разделением физиологобиохимических функций и метаболической активности различных видов. Таким примером
многовидовых природных биоплѐнок являются плѐнки с доминирванием Nostoc commune. В
наших опытах использованы биоплѐнки N. commune, отобранные вблизи автомобильной дороги, включающие 20 видов фототрофных микроорганизмов, в том числе ГЦ ЦБ – 4; БГЦ ЦБ
– 8; одноклеточных зеленых водорослей – 4; зеленых нитчаток – 3 и 1 вида желтозеленых
водорослей. Плотность фототрофных популяций в данных биоплѐнках превышает 2,5
млрд.кл./г (табл. 10).
Таблица 10
Групповой состав фототрофного комплекса Nostoc commune
у автодороги
Группы фототрофов
Численность, клеток/г воз- Содержание (%)
душно-сухой массы (х109)
Nostoc commune
2,258
83,12
Другие ГЦ цианобактерии
0,213
7,83
БГЦ цианобактерии
0,120
4,42
Одноклеточные зеленые водоросли
0,113
4,16
Нитчатые зеленые водоросли
0,013
0,47
Всего
2,704
100
При этом на долю эдификатора N. commune приходится свыше 80% численности популяций фототрофов. Вклад эукариотных водорослей невелик – 4,63%. Длина грибного мицелия составляет 2 км/г пленки, поэтому можно говорить о существенном вкладе микромицетов в формирование матрикса ностокового ценоза, приобретающего в данном случае
структуру лишайниковоподобной «псевдоткани».
В серии опытов с биопленками N. commune изучали изменение процессов восстановительной сукцессии, связанной с действием поллютантов, наиболее обычных для урбоэкосистем: соли ТМ (СuSO4, Pb(CH3COO)2, Zn(CH3COO)2) и хлорид натрия.
Как показал анализ группового состава биоплѐнок, формирующихся в ходе восстановительной сукцессии, под влиянием применяемых поллютантов происходит соотношения
водорослей и ЦБ, а также перераспределение доли популяций микромицетов с бесцветным и
окрашенным мицелием (табл. 11).
Таблица 11
Изменение структуры поверхностных микробных комплексов биоплѐнок
Nostoc commune в ходе восстановительной сукцессии под влиянием поллютантов (%)
Вариант
Фототрофы
Мицелий микромицетов
водоросли
цианобактерии
бесцветный
окрашенный
Контроль
0,17
99,83
86,8
13,2
Pb2+
5,75
94,25
18,4
81,6
2+
Cu
16,91
83,09
45,4
54,6
Zn2+
100
не обнаружено
0,1
99,1
Под влиянием токсикантов увеличивается вклад эукариотных водорослей в формирование альгоценозов, не существенный при внесении свинца и более ощутимый под влиянием
меди. Можно вычленить особую роль цинка – полное торможение развития ЦБ. Среди наиболее устойчивых видов фототрофов выделены и водоросли, и ЦБ. Среди ЦБ в вариантах с
внесением поллютантов в массе развиваются Phormidium formosum, Ph. boryanum, Ph. uncinatum, Leptolyngbya foveolarum, доминантами среди зелѐных водорослей являются Chlorella
vulgaris, Bractecoccus minor, Sticococcus shodatii.
12
Реакция микромицетов на внесение поллютантов заключается в резком увеличении в
структуре комплексов микромицетов вклада грибов с меланизировнным мицелием, вплоть
до 99,1% (цинк).
Таким образом, установлено, что из единого первоначального пула клеток биоплѐнок
N. commune под влиянием применяемых поллютантов возникают сообщества различающиеся
по плотности популяций фототрофов и интенсивности развития грибного мицелия с бесцветными и окрашенными формами.
Комплексная оценка состояния цианобактерии Nostoc paludosum при воздействии различных поллютантов. В качестве маркерных признаков при изучении состояния
популяции цианобактерии N. paludosum под воздействием различных поллютантов были выбраны следующие показатели: титр клеток, их жизнеспособность, перекисное окисление липидов (ПОЛ) и активность каталазы. Доказана тесная коррелятивная зависимость между интенсивностью ПОЛ и количеством мертвых клеток (рис. 3). Значительное накопление в культуре N. paludosum малонового диальдегида (МДА) свидетельствует о том, что поллютанты
инициируют процессы ПОЛ, вызывают повреждение клеточных мембран и нарушение
функционирования клеток. Данные по интенсивности процессов ПОЛ коррелируют (r=0,61)
с результатами по оценке жизнеспособности клеток методам ТТХ (табл. 12).
120
8,00
100
7,00
6,00
80
5,00
60
4,00
3,00
40
2,00
20
1,00
-
Количество мертвых клеток, %
Содержание МДА, нмоль/мл
9,00
0
контроль
ацетат свинца
МДА
сульфат меди
хлорид натрия
количество мертвых клеток
Рис. 3. Влияние токсикантов на интенсивность процессов ПОЛ и жизнеспособность клеток Nostoc paludosum
Таблица 12
Изменение соотношения живых и мѐртвых клеток в популяции
Nostoc paludosum под влиянием токсикантов
Вариант
Количество клеток, %
Живых
мѐртвых
1. Контроль
99,06±0,32
0,94
2. Pb2+
85,13±3,77
14,87
3. Cu2+
1,0
99,0
4. NaCl
21,7±0,48
78,29
Как видно из таблицы 10, жизнеспособность N. paludosum, развивающегося в контрольном варианте (среда Громова) чрезвычайно велика: 99% клеток проявляют дегидрогеназную активность. Любые вносимые токсиканты снижают жизнеспособность клеток. В
меньшей степени это проявляется при действии ионов свинца, когда погибает около 15%
клеток. Хлорид натрия приводит к гибели около 80% клеток. Полная гибель популяции регистрируется при действии меди, хотя в этом варианте сохраняются морфологические структуры клеток и нитей. По степени токсичности испытуемые поллютанты расположены в ряду:
Сu2+>NaCl>Pb2+.
13
14,00
120
12,00
100
10,00
80
8,00
60
6,00
40
4,00
20
2,00
-
Количество живых клеток, %
Активность каталазы, млО2/мин
Изучение активности каталазы показало, что максимальная величина этого показателя
выявлена в контрольном варианте, а минимальные значения – в вариантах с внесением меди
(рис. 4). Активность каталазы в культуре с внесением поллютантов имела тесную корреляцию с численностью живых клеток (r=0,84).
0
контроль
ацетат свинца сульфат меди хлорид натрия
каталаза
количество живых клеток
Рис. 4. Влияние токсикантов на активность каталазы и жизнеспособность клеток Nostoc paludosum
Результаты определения каталазной активности показывают, что даже после полной
гибели клеток (вариант с медью), сохраняются и проявляют активность ферментные системы. Ряд токсичности соединений, выявленный по каталазе, имеет такой же вид, как и по
жизнеспособности клеток: Cu2+>NaCl> Pb2+.
Таким образом, показано, что при сохранении морфологической структуры клеток и
нитей ЦБ под действием токсикантов может происходить их полная гибель. Доказана тесная
коррелятивная зависимость между интенсивностью ПОЛ и количеством мертвых клеток, а
также между активностью каталазы и количеством живых клеток в популяции N. paludosum.
Данные показатели (ПОЛ, каталазную активность и жизнеспособность клеток) можно использовать в качестве биомаркеров стресса у N. paludosum на поллютанты минерального
происхождения. Наиболее простым, доступным и экспрессным методом определения токсичности соединений для изучаемого штамма ЦБ является метод определения жизнеспособности клеток с помощью ТТХ.
Реакция различных видов цианобактерий рода Nostoс на действие токсикантов.
Выявлено, что после выращивания ЦБ в течение 8 недель при tº=22–25°С и 12-ти часовом
освещении ЦБ достигают экспоненциальной фазы и находятся в наиболее активном состоянии с плотностью клеток в пределах 2,5–3,0*107 в 1 мл. В накопительные культуры ностоков
(Nostoc paludosum, N. linckia, N. muscorum) вносили токсиканты, используемые в опытах с N.
paludosum. Концентрации поллютантов соответствовали 5 ПДК для ТМ, для бензина и хлорида натрия – 5% от объема культуральной среды. Характер их действия определяли через 7
суток. Эффект отдельных токсикантов проявился, в первую очередь, в существенной гибели
клеток. Полную гибель популяций всех трѐх видов ЦБ вызвало действие ионов меди. При
этом микроскопирование показало, что под влиянием ионов меди сохраняются структурные
особенности нитей и клеток, их размеры, форма, не выявляются морфологические патологии, т.е. происходит своеобразная «мумификация» клеток без сохранения ими дегидрогеназной активности. Показано, что для N. muscorum оказался токсичным свинец (летальный исход – 100%). Велика чувствительность к данному ТМ и N. linckia (погибло более 78% клеток). Но в то же время можно отметить высокий уровень резистентности к свинцу N. paludo14
sum, у которого гибель клеток составила всего около 15%. Сильнейший ингибирующий эффект на все 3 вида ЦБ оказал хлорид натрия, под влиянием которого погибает 73–96% клеток
(табл. 13).
Таблица 13
Влияние токсикантов на гибель клеток в популяциях цианобактерий
Вариант
Количество нежизнеспособных клеток, %
N. paludosum
N. linckia
N. muscorum
1. Контроль
0,94
2,96
14,61
2. Pb2+
14,87
78,45
100
2+
3. Cu
100
100
100
4. NaCl
78,29
73,03
96,06
Показателем состояния популяции является не только жизнеспособность клеток, но и
активность ряда физиологических показателей (каталазы и ПОЛ). При определении активности каталазы было доказано, что величина этого показателя колеблется в широких пределах
у разных видов ностока и под воздействием разных поллютантов. Максимальная активность
каталазы характерна для N. paludosum. Для N. linckia при приблизительно таком же количестве жизнеспособных клеток активность каталазы примерно в 3 раза ниже, чем у N. paludosum и примерно такая же, как у N muscorum, хотя у данного вида ЦБ жизнеспособных клеток
намного ниже (в контроле всего 85,4% против 97% у N. linckia и 99% у N. paludosum). Минимальные показатели активности каталазы зафиксированы у ЦБ при действии меди. Установлено, что внесение поллютантов в культуру ностоков приводит к возрастанию интенсивности процессов ПОЛ. Поллютанты разной химической природы оказывали сходное влияние
на интенсивность процессов ПОЛ. Наибольшее накопление продукта ПОЛ – малонового диальдегида – отмечали в варианте с медью. Вычисление коэффициентов корреляции выявило
высокий уровень коррелятивной зависимости между количеством жизнеспособных клеток в
популяциях ЦБ и активностью каталазы (0,84–0,95) и средний уровень коррелятивной зависимости между количеством нежизнеспособных клеток и накоплением продуктов ПОЛ
(табл. 14).
Таблица 14
Коррелятивная зависимость между жизнеспособностью клеток, каталазной активностью и
величиной ПОЛ у разных видов ностока
Вид цианобактерий
Коэффициент корреляции
r1
r2
N. paludosum
0,84
0,61
N. linckia
0,95
0,56
N. muscorum
0,94
0,51
Примечание: r1 - жизнеспособные клетки / активность каталазы; r2 - нежизнеспособные клетки / интенсивность ПОЛ.
В целом, исходя из результатов опыта, можно предположить наличие у разных видов
ностока различных механизмов адаптации как к одному и тому же токсиканту, так и к разным соединениям.
Влияние токсикантов на состояние биоплѐнок с доминированием безгетероцистных
цианобактерий. Культивировали природные биоплѐнки, отобранные с поверхности городской почвы, имеющие следующий состав: Leptolyngbya foveolarum, Plectonema boryanum,
Phormidium ambigum, Ph. boryanum, Nostoc sp. В ходе исследования действие ионов ТМ испытывали на биоплѐнках и их гомогенате (табл. 15). Было выявлено, что ионы никеля и меди
в растворе с концентрацией 20 мг/л по-разному действуют на дегидрогеназную активность
15
комплекса с доминированием БГЦ ЦБ.
Таблица 15
Влияние ионов никеля и меди на жизнеспособность клеток в гомогенате и пленке
Вариант
Доля живых клеток, %
Доля мѐртвых клеток, %
Контроль (гомогенат)
97,14±0,82
2,86±0,82
Контроль (плѐнка)
82,02±4,58
17,98±4,58
Гомогенат + Сu2+
1,1
98,9
2+
Плѐнка + Сu
0,23±0,06
99,77±0,06
2+
Гомогенат + Ni
29,53±5,63
70,47±5,63
Плѐнка + Ni2+
52,78±1,01
47,22±1,01
Ионы никеля и меди оказывают губительное действие как на культуры в виде плѐнки,
так и в гомогенизированном состоянии. Однако действие ТМ на плѐночную культуру выражено в меньшей степени, чем в гомогенате. Вероятно это объясняется тем, что в состояние
плѐнки, клетки, находящиеся в более глубоких слоях, менее подвержены действию токсикантов.
Рис. 5. Влияние продолжительности контакта культуры с токсикантом на каталазную
активность культуры
Изменяется также такой функциональный показатель состояния биоплѐнок, как активность каталазы, которая под влиянием ионов меди со временем возрастает (рис. 5). Под действием ионов никеля максимального значения этот показатель достигает при контакте в течение 24 часов. Смесь токсикантов в первый час вызывает резкое усиление каталазной активности, значение которой превышает уровень при действии токсикантов в индивидуальных растворах. Максимальное значение наблюдается через сутки. По сравнению с контролем, токсиканты стимулируют каталазную активность, что говорит о напряжении в работе
биологических систем культуры. Наибольшее напряжение вызывают ионы меди.
При определении времени влияния токсиканта показано, что кратковременное действие
(1 час) приводит к значительному снижению содержания хлорофилла а в вариантах с ионами
меди (II) и смесью ионов меди (II) и никеля (II) (рис. 6).
16
Рис. 6. Влияние поллютантов (Ni2+, Cu2+, Cu2++Ni2+) на содержание хлорофилла а в культуре
ЦБ при воздействии в течение часа и суток
Через сутки происходит некоторое восстановление культуры, отмечается увеличение
содержания хлорофилла а (рис. 4). Увеличение содержания хлорофилла а и снижение интенсивности процессов ПОЛ в культуре ЦБ через сутки действия поллютантов свидетельствует
об адаптации ЦБ к стрессовым условиям.
Комплексное исследование влияния никеля и НП на цианобактерию N. linckia.
Для опытов использовали жидкую накопительную 2-х недельную культуру N. linckia. Титр
ЦБ при постановке опыта составлял 7•106 кл./мл. Поллютанты брали в количестве 2 и 20
мг/л, а также изучали смесь поллютантов сульфата никеля и НП в равных количествах в тех
же суммарных концентрациях. Выбор данных поллютантов обусловлен тем, что они являются одним из основных компонентов сточных вод машиностроительных предприятий, где есть
гальванические цеха. По окончании опыта определяли жизнеспособность клеток ЦБ; интенсивность роста; численность бактерий-спутников; остаточное содержание токсикантов в
культуральной жидкости; изменение морфологии поверхности клеток ЦБ определяемой методом сканирующей зондовой микроскопии. В результате комплексного исследования выявлено, что высокие концентрации ионов никеля приводят к почти полной гибели популяции
ЦБ, в то же время под влиянием НП происходит значительное увеличение численности клеток ЦБ. При изучении морфологии клеток и поверхности скоплений ЦБ с помощью сканирующей зондовой микроскопии при воздействии токсикантов на сканах образцов цианобактерий без действия поллютантов отчѐтливо различаются как отдельные клетки цианобактерии Nostoc, так и их скопления. После воздействия поллютанта в течение 3-х недель цианобактерии разрушаются, на сканах не удаѐтся обнаружить ни одной целой клетки.
Ионы никеля и НП оказывают действие не только на культуру ЦБ N. linckia, но и на состояние популяции бактерий-спутников. Определение численности бактерий-спутников показало, что, по сравнению с контролем этот показатель выше только в одном варианте - Ni,
20 мг/л. При этом интоксикация питательной среды разными поллютантами характеризуется
сходной реакцией гетеротрофных бактерий: чем выше доза токсиканта, тем больше количественное обилие бактерий. Данный факт можно объяснить по-разному. Одно из объяснений
сводится к тому, что с увеличением концентрации токсиканта повышается процентное содержание мертвых клеток N. linckia, и это создает благоприятную среду для размножения
бактерий-спутников. Возможно и другое объяснение: в процессе возрастания концентрации
токсикантов интенсифицируется селекционный отбор бактерий, устойчивых к применяемым
соединениям. Вычисленные коэффициенты корреляции показывают, что в вариантах с раздельным внесением Ni и НП зависимость между численностью бактерий и дозами токсикантов очень высокая (рис. 7).
17
1
0,9
Коэффициент корреляции
Коэффициент корреляции
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,1
0
0
0
10
2
0
20
10
2
20
Доза внесения НП в культуру ЦБ, мг/л
Доза внесения Ni в культуру ЦБ, мг/л
а
б
0,7
Коэффициент корреляции
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
10
20
Доза внесения (Ni+НП) в культуру ЦБ, мг/л
в
Рис. 7. Зависимость коэффициента корреляции: а - числа бактерий-спутников в ЦБ
N. linckia от дозы внесения Ni; б - числа бактерий-спутников в ЦБ N. linckia от дозы внесения
нефтепродуктов (НП); в - числа бактерий-спутников в ЦБ N. linckia от дозы внесения Ni и
нефтепродуктов.
Сорбционные возможности цианобактериальных плѐнок. Целью данного опыта
было установление условий, при которых концентрация ионов токсикантов в растворе будет
снижаться до значений, ниже ПДК. В опыте использовали природные биоплѐнки с доминированием БГЦ ЦБ. Для этого поставлена серия предварительных опытов, в которых выявлена оптимальная форма нахождения ЦБ: в виде плѐнки или в гомогенезированном виде. Биомасса культуры составила 0,0241 г на 100 мл раствора токсиканта с концентрацией 20 мг/дм3.
Концентрацию токсиканта определяли после его суточной экспозиции с культурой ЦБ. Наиболее оптимальной для контакта формой ЦБ является гомогенат культуры. Для определения
биомассы микроорганизмов, необходимой для снижения концентрации токсикантов до
уровня ПДК и ниже, был проведѐн эксперимент. Для контакта использовали различные биомассы культур, соответствующие титру клеток (17,2 ± 2,70) *10 9, (8,6 ± 1,35)*109, (4,3 ±
0,68)*109, (2,2 ± 0,34)*109 кл/мл (табл. 16).
Таблица 16
Влияние титра клеток цианобактерий на остаточное содержание в растворе меди и
никеля
9
2+
Титр, *10 кл/мл
Ni , мг/дм3
Cu2+, мг/дм3
17,2 ± 2,70
0,02 ± 0,001
0,06 ± 0,003
8,6 ± 1,35
0,97 ± 0,06
0,47 ± 0,07
4,3 ± 0,68
11,32 ± 0,28
3,79 ± 0,05
2,2 ± 0,34
13,96 ± 0,09
4,52 ± 0,02
3
Примечание: первоначальная концентрация ионов металлов 20 мг/дм .
Установлено, что оптимальным титром для уменьшения концентрации ионов никеля
и меди является титр клеток 17,2 ± 2,70*109 кл/мл. Титр 8,6 ± 1,35*109 кл/мл позволяет зна18
чительно (в 20–40 раз) снизить концентрацию ионов, меньшие титры концентрацию снижают существенно, но она остается далѐкой от значений ПДК. максимальное снижение концентрации никеля из раствора сульфата никеля наблюдается через 1 час и через 3 час после контакта, через сутки происходит эмиссия ионов металлов раствор. Максимальное снижение
концентрации меди из раствора сульфата меди происходит через 3 минуты и сохраняется до
1 часа, в дальнейшем происходит значительный переход ионов в раствор. Если говорить о
снижении концентрации меди и никеля из раствора смеси солей, то для никеля приходится
на первый час, а меди на третий час. Оптимальным временем для контакта ионов никеля с
микроорганизмами является 1 час и 3 часа, для ионов меди – 3 минуты и 1 час, в случае если
речь идѐт о растворах индивидуальных веществ указанных ТМ. Если имеется ввиду смесь
ТМ, то оптимальным временем контакта является 1 час, так как через это время наступает
максимальное снижение общей концентрации металлов в растворе, и сутки, так как снижение значительное обоих металлов. К сожалению, снижение концентрации ионов металлов до
уровня ниже ПДК, в рамках изученных условий, происходит только из индивидуальных растворов солей. Поэтому следует продолжать исследования в области поиска оптимальной
биомассы для снижения концентрации из смесей ТМ до уровня ПДК и ниже.
Биосорбционные возможности различных видов цианобактерий рода Nostoc. При
культивировании ЦБ N. linckia в среде, содержащей токсиканты, определение содержания Ni
(II) и НП показало, что в опыте, где время экспозиции N. linckia и токсикантов составляло 2
недели, содержание вредных веществ в культуральной жидкости существенно изменилось
(табл. 17).
Таблица 17
Остаточное содержание и уровень извлечения никеля и нефтепродуктов из культуральной
жидкости Nostoc linckia
Вариант (по дозе вносимого
НП, мг/л
Уровень
Ni2+, мг/л
Уровень
токсиканта), мг/л
извлечеизвлечения, %
ния, %
Время экспозиции 2 недели
Контроль, 0
Не обнаружено
Не обнаружено
Ni2+, 2
1,32±0,60
34,00
НП, 2
0,04±0,01
98,0
Ni2+, 2 + НП, 2
0,14±0,04
93,0
1,38±0,62
31,00
Ni2+, 20
11,75±2,29
41,25
НП, 20
0,15±0,04
99,2
2+
Ni , 20 + НП, 20
0,88±0,22
95,8
11,13±2,67
44,35
Исходя из результатов, приведенных в таблице 17, чѐтко прослеживается определѐнная
тенденция в поведении ЦБ на поглощение Ni и НП из культуральной среды – чем выше первоначальная концентрация токсиканта, тем полнее его извлечение из среды биомассой ЦБ.
Таким образом, уровень биосорбции токсикантов из жидкой среды ЦБ N. linckia может
достигать в варианте с внесением НП 99%, с внесением Ni - 41%.
1.
2.
Выводы
В городских почвах выявлено от 49 до 91 вида внутрипочвенных группировок фототрофов и от 7 до 29 видов в наземных разрастаниях при «цветении» почвы. Установлено,
что во всех зонах города основной вклад в видовое обилие фототрофных комплексов (до
98 % от общего количества видов) вносят цианобактерии.
Комплексы доминатов на нарушенных и ненарушенных почвах состоят из безгетероцистных цианобактерий родов Phormidium и Leptolyngbya. На урбаноземах в промышленной зоне (районы ТЭЦ) лидирующие позиции занимают гетероцистные азотфиксирующие цианобактерии Nostoc muscorum, N. paludosum, Trichromus variabilis.
19
3.
4.
5.
6.
7.
Доказано, что цианофитизация фототрофных комплексов проявляется и на уровне количественных характеристик альгоценозов. При плотности фототрофных популяций при
«цветении» от 18 до 47 млн. клеток/см2 доля цианобактерий колеблется от 87% (в селитебной зоне) до 98% (в транспортной зоне).
Впервые выявлено, что под влиянием испытуемых поллютантов (соли ТМ, хлорид натрия) меняются такие характеристики состояния отдельных видов ЦБ, как активность
перекисного окисления липидов, каталазная активность, содержание хлорофилла а и
жизнеспособность клеток.
Показано, что наиболее чувствительными к действию ТМ является ЦБ Nostoc muscorum,
толерантность к токсикантам проявляют чистые культуры ЦБ Nostoc linckia и Nostoc paludosum, природные многовидовые биоплѐнки с доминированием Nostoc commune, а так
же биоплѐнки с доминированием безгетероцистных цианобактерий.
Доказано, что резистентные к действию поллютантов штаммы ЦБ и природные биоплѐнки с доминированием безгетероцистных цианобактерий обладают высокой адсорбционной активностью, связывая из растворов до 41% ионов никеля.
Полученные результаты доказывают высокий биотехнологический потенциал чистых
культур ЦБ и цианобактриальных биоплѐнок как сорбентов поллютантов в жидкой среде.
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах рекомендованных ВАК
1. Огородникова С. Ю., Зыкова Ю. Н., Березин Г. И., Домрачева Л. И., Калинин А. А.
Комплексная оценка состояния цианобактерии Nostoc paludosum Kütz. при воздействии
различных поллютантов // Теоретическая и прикладная экология. 2010, №3. С. 47-52.
2.
Фокина А. И., Злобин С. С., Березин Г. И., Зыкова Ю. Н., Огородникова С. Ю., Домрачева Л. И., Ковина А. Л., Горностаева Е. А. Состояние цианобактерии Nostoc linckia в
условиях загрязнения среды никелем и нефтепродуктами и перспективы еѐ использования в качестве биосорбента // Теоретическая и прикладная экология, 2011. №1. С. 69-76.
3.
Фокина А.И., Зыкова Ю.Н., Данилов Д.Н., Ашихмина Т.Я., Жмак М.С. Методология
изучения влияния тяжелых металлов на культуры почвенных цианобактерий // Теоретическая и прикладная экология, 2011. №3. С. 16-22.
Монографии
1. Домрачева Л. И., Кондакова Л. В., Зыкова Ю. Н., Ефремова В. А. Альго-цианомикологические комплексы городских почв // Особенности урбоэкосистем подзоны южной тайги Европейского Северо-Востока / Под ред. Т. Я. Ашихминой, Л. И. Домрачевой
/ Т. Я. Ашихмина, Л. И. Домрачева, И. Г. Широких, А. А. Широких, Е. В. Дабах, Л. В.
Кондакова, Е. А. Домнина, С. Ю. Огородникова, Ю. А. Бобров, С. В. Пестов, А. И. Фокина, А. Л. Ковина, Н. Н. Ходырев, Л. Г. Целищева, А. П. Лемешко, Ю. Н. Зыкова, Е. С.
Соловьѐва, Г. И. Березин, С. С. Злобин, В. А. Ефремова. Киров, 2012. (Вятский государственный гуманитарный университет) С. 120–169.
2. Домрачева Л. И., Ковина А. Л., Зыкова Ю. Н. Использование микробов-интродуцентов
при выращивании декоративных культур в городских условиях // Особенности урбоэкосистем подзоны южной тайги Европейского Северо-Востока / Под ред. Т. Я. Ашихминой, Л. И. Домрачевой / Т. Я. Ашихмина, Л. И. Домрачева, И. Г. Широких, А. А. Широких, Е. В. Дабах, Л. В. Кондакова, Е. А. Домнина, С. Ю. Огородникова, Ю. А. Бобров, С.
В. Пестов, А. И. Фокина, А. Л. Ковина, Н. Н. Ходырев, Л. Г. Целищева, А. П. Лемешко,
Ю. Н. Зыкова, Е. С. Соловьѐва, Г. И. Березин, С. С. Злобин, В. А. Ефремова. Киров,
2012. (Вятский государственный гуманитарный университет) С. 169–179.
3. Домрачева Л. И., Фокина А. И., Огородникова С. Ю., Зыкова Ю. Н., Кондакова Л. В.
Адаптационные реакции микроорганизмов на стрессовые воздействия // Особенности
урбоэкосистем подзоны южной тайги Европейского Северо-Востока / Под ред. Т. Я.
Ашихминой, Л. И. Домрачевой / Т. Я. Ашихмина, Л. И. Домрачева, И. Г. Широких, А. А.
20
Широких, Е. В. Дабах, Л. В. Кондакова, Е. А. Домнина, С. Ю. Огородникова, Ю. А. Бобров, С. В. Пестов, А. И. Фокина, А. Л. Ковина, Н. Н. Ходырев, Л. Г. Целищева, А. П. Лемешко, Ю. Н. Зыкова, Е. С. Соловьѐва, Г. И. Березин, С. С. Злобин, В. А. Ефремова.
Киров, 2012. (Вятский государственный гуманитарный университет) С. 180–231.
4. Фокина А. И., Домрачева Л. И., Зыкова Ю. Н., Березин Г. И., Злобин С. С. Микроорганизмы как биосорбенты поллютантов // Особенности урбоэкосистем подзоны южной
тайги Европейского Северо-Востока / Под ред. Т. Я. Ашихминой, Л. И. Домрачевой / Т.
Я. Ашихмина, Л. И. Домрачева, И. Г. Широких, А. А. Широких, Е. В. Дабах, Л. В. Кондакова, Е. А. Домнина, С. Ю. Огородникова, Ю. А. Бобров, С. В. Пестов, А. И. Фокина,
А. Л. Ковина, Н. Н. Ходырев, Л. Г. Целищева, А. П. Лемешко, Ю. Н. Зыкова, Е. С. Соловьѐва, Г. И. Березин, С. С. Злобин, В. А. Ефремова. Киров, 2012. (Вятский государственный гуманитарный университет) С. 232–252.
Статьи и материалы в других изданиях
1. Зыкова Ю. Н., Домрачева Л. И., Елькина Т. С. Использование пшеницы в биотестирвании состояния городских почв. Науке нового века знания молодых // Сб. статей 9-й науч.
конф. аспирантов и соискателей. Ч, 1. Киров, 2009. С. 4348.
2. Елькина Т. С., Зыкова Ю. Н. Сравнительная фитотоксичность почв и снеговой воды на
территории г. Кирова. Экология родного края: проблемы и пути их решения // Матер. 4-й
научно-практич. конф. молодѐжи. Киров, 2009. С. 24-25.
3. Зыкова Ю. Н., Домрачева Л. И. Поллютанты как регуляторы структуры микробных
комплексов, развивающихся из биоплѐнок Nostoc commune // Экология родного края:
проблемы и пути их решения. Матер. 4-й научно-практич. конф. молодѐжи. Киров, 2009.
С. 98-100.
4. Домрачева Л. И., Кондакова Л. В., Попов Л. Б., Зыкова Ю. Н. Биоремедиационные возможности почвенных цианобактерий (обзор) // Теоретическая и прикладная экология.
2009, №1. С. 8-18.
5. Домрачева Л. И,, Зыкова Ю. Н., Кондакова Л. В. Поллютанты, как пусковой механизм
сукцессий альгоценозов (модельные опыты) // Теоретическая и прикладная экология.
2009, №3. С. 20-24.
6. Зыкова Ю.Н., Кондакова Л.В., Домрачева Л.И. Альгологическая и микологическая характеристика грунтов вблизи ТЭЦ-5 г. Кирова. Инновационные технологии – в практику
сельского хозяйства // Сб. статей Всеросс. научно-практич. конф., посвященной 65летию агрономического факультета ВятГСХА. Киров, 2009. С. 148-152.
7. Зыкова Ю.Н., Кондакова Л.В., Домрачева Л.И. Сравнительная характеристика поверхностных разрастаний микроорганизмов промышленной и парковой зон г. Кирова. Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития // Матер. Всеросс. научно-практич. конф. Выпуск VII. Ч 2. Киров, 2009. С. 20-24.
8. Домрачева Л.И., Кондакова Л.В., Зыкова Ю.Н., Попов Л.Б. Почвенные цианобактерии:
мониторинговый и биотехнологический аспекты изучения. Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов // Матер. Всеросс. симпозиума с
междунар. уч. Москва, 2009. С. 56.
9. Домрачева Л. И., Кондакова Л. В., Зыкова Ю. Н., Березин Г. И., Злобин С.С. Роль биоплѐнок Nostoc commune при тестировании загрязнения почвы. Автотрофные микроорганизмы // Матер. Всеросс. симпозиума с междунар. уч. М.: 2010. С. 37.
10. Зыкова Ю. Н., Фокина А. И. Исследование вклада Pb, Cd, Cu и Zn в токсичность урбанозѐмов города Кирова. Водоросли и цанобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах // Матер. междунар. научно-практич. конф., посвящѐнной 100-летию со
дня рождения проф. Э. А. Штиной. Киров, 2010. С. 130-134.
11. .Огородникова С. Ю., Зыкова Ю. Н., Березин Г. И., Домрачева Л. И., Калинин А. А. Реакция различных видов цианобактерий рода Nostoc на действие токсикантов. Водоросли
и цанобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах // Матер. междунар.
21
научно-практич. конф., посвящѐнной 100-летию со дня рождения проф. Э. А. Штиной.
Киров, 2010. С. 216-221.
12. Зыкова Ю.Н., Домрачева Л.И. «Цветение» городских почв (на примере г. Кирова) //
Матер. Всеросс. научно-практич. конф. молодых ученых, аспирантов и соскателей, посвящ. 80-летию ВятГСХА. Киров, 2010. С. 64-68.
13. Зыкова Ю.Н., Злобин С.С., Елькина Т.С., Домрачева Л.И. Сравнительная характеристика методов прямого микроскопического учета и посева на питательную среду при определении численности микроскопических грибов в почве. Экология родного края: проблемы и пути их решения // Матер. Всеросс. научно-практич. конф. молодежи. Киров,
2010. С. 78-80.
14. Зыкова Ю. Н., Злобин С. С., Березин Г. И., Елькина Т. С. Сравнительная чувствительность цианобактерии Nostoc paludosum и высших растений к поллютантам (тестирование
по ТТХ). Инновационные методы и подходы в изучении естественной и антропогенной
динамики окружающей среды // Всеросс. науч. школа молодежи. Киров, 2010. С. 70-73.
15. Фокина А. И., Жмак М. С., Данилов Д. Н., Зыкова Ю. Н. Изменение структурных особенностей цианобактерий и концентрации ионов никеля в растворе, после экспозиции
культуры с ионами токсиканта. Молодые ученые в решении актуальных проблем науки
// Матер. II междунар. научно-практич. конф. Владикавказ, 2011. Ч. 2. С. 19-21.
16. Зыкова Ю. Н., Фокина А. И., Домрачева Л. И. Развитие цианобактерии Nostoc linckia и
бактерий-спутников при действии никеля и нефтепродуктов. Молодые ученые в решении актуальных проблем науки // Матер. II междунар. научно-практич. конф. Владикавказ, 2011. Ч. 2. С. 21-23.
17. Зыкова Ю. Н., Домрачева Л. И., Фокина А. И. Сопряжѐнность развития цианобактерии
Nostoc linckia и бактерий-спутников в условиях химического стресса. Науке нового века
– знания молодых // Матер. междунар. научно-практич. конф. молодых учѐных, аспирантов и соискателей. Киров, 2011. С. 60-69.
18. Зыкова Ю. Н., Горностаева Е. А., Домрачева Л. И. Определение чувствительности двух
видов Nostoc к действию тяжѐлых металлов по их дегидрогеназной активности. Экология родного края: проблемы и пути их решения // Матер. Всеросс. молодѐжной научнопрактич. конф. Киров, 2011. С. 137-139.
19. Жмак М. С., Данилов Д. Н., Фокина А. И., Зыкова Ю. Н., Березин Г. И., Злобин С. С.,
Домрачева Л. И. Исследование изменений поверхности биомассы цианобактерий и концентрации ионов никеля в растворе после экспозиции культуры с токсикантом. Экология
родного края: проблемы и пути их решения // Матер. Всеросс. молодѐжной научнопрактич. конф. Киров, 2011. С. 142-144.
20. Зыкова Ю. Н., Огородникова С. Ю. Физиологические реакции цианобактерий на действие тяжѐлых металлов при разных сроках инкубации. Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии //Матер. Всеросс. симпозиума. М.: Изд-во
Лесная страна, 2011. С. 65.
21. Зыкова Ю. Н. Адаптационные резервы альго-циано-микологических комплексов городских почв. Адаптационные реакции живых систем на стрессовые воздействия // Матер.
Всеросс. молодежной конф. (Доклады. Лекции. Практические занятия). Киров, 2012. С.
42-56.
22. Кондакова Л. В., Домрачева Л. И., Зыкова Ю. Н. «Цветение» городских почв. Почвы
России: современное состояние, перспективы изучения и использования // Матер. Всеросс. с междунар. участием науч. конф. Петрозаводск – Москва, 2012. С. 358-359.
22
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
12
Размер файла
770 Кб
Теги
комплекс, действий, городских, поллютантов, грибов, водоросли, почва, реакций, цианобактерии
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа