close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Подвижность разорванных концов протоонкогенов в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ГЛУХОВ Сергей Игоревич
ПОДВИЖНОСТЬ РАЗОРВАННЫХ КОНЦОВ ПРОТООНКОГЕНОВ В
УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ ДНК ТОПОИЗОМЕРАЗЫ II
03.01.03 – Молекулярная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
профессионального образования «Московский государственный университет имени
М.В.Ломоносова» и в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом
Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена
РАН
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор
Разин Сергей Владимирович
кандидат биологических наук
Рубцов Михаил Александрович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Николаев Лев Григорьевич, доктор биологических наук, Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков
М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук, лаборатория структуры и
функций генов человека, старший научный сотрудник
Кибанов Михаил Викторович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук,
лаборатория биохимической генетики животных, младший научный сотрудник
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им.
Н.К. Кольцова Российской академии наук
Защита диссертации состоится 20 декабря 2013 года в ____ на заседании диссертационного
совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном
государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального
образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу:
119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр. 12, биологический факультет, ауд. 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова
(Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций)
Автореферат разослан "___" _ноября_ 2013 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
И.А.Крашенинников
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Борьба с онкологическими заболеваниями представляет одну из наиболее
важных
задач
современной
медицины.
Высокоэффективными
химиотерапевтическими агентами, используемыми для борьбы с широким
спектром онкологических заболеваний, являются яды ДНК топоизомеразы II
(Nitiss J.L., 2009, Pommeir Y., et al., 2010).
Фермент ДНК топоизомераза II у высших эукариот отвечает за разделение
дочерних молекул ДНК в процессе репликации, а также за снятие позитивной
суперспирализации ДНК. В процессе работы фермент связывается с молекулой
ДНК, вносит двунитевой разрыв, осуществляет транспорт другого участка ДНК
через разрыв и затем восстанавливает целостность разрезанной молекулы (Nitiss
J.L., 2009). Известно, что накопление двунитевых разрывов ДНК в клетке в
конечном итоге приводит к ее гибели. Яды ДНК топоизомеразы II препятствуют
религированию двунитевых разрывов, либо способствуют внесению новых
разрывов ДНК топоизомеразой II. Высокая токсичность таких веществ по
отношению к раковым клеткам основана на свойстве этих клеток активно
делиться, что невозможно без высокого уровня репликативной активности и
работы ДНК топоизомеразы II.
Несмотря на высокую эффективность ядов ДНК топоизомеразы II в
качестве агентов, подавляющих рост опухолевых клеток, применение этих
веществ может приводить к развитию так называемых вторичных
онкологических заболеваний, как правило, лейкемий. Для лейкемий,
развившихся после курса химиотерапии ядами ДНК топоизомеразы II,
характерно наличие хромосомных перестроек (Felix C.A., 1998; McClendon A.K.,
Osheroff N., 2007). При возникновении таких перестроек происходит
объединение фрагментов двух протоонкогенов, с образованием функционально
активного слитого гена. Продукты слитых в результате образования перестроек
генов способствуют процессу перерождения здоровых клеток в раковые.
Считается, что перестройки образуются при ошибках репарации двунитевых
разрывов, возникающих, в частности, при ингибировании активности ДНК
топоизомеразы II. В клетках высших эукариот основной механизм репарации
двунитевых разрывов – негомологичное соединение концов (Chapman J.R.,
2012). Негомологичное соединение концов позволяет соединять концы
разорванных молекул ДНК безотносительно их гомологии, принадлежности к
той или иной хромосоме. Точность восстановления двунитевых разрывов
обусловлена
высокой
скоростью
данного
механизма
и
сложной
3
пространственной организацией ядра высших эукариот, препятствующей
свободной диффузии концов разрыва.
В ядрах клеток высших эукариот в интерфазе хромосомы занимают
компактные, непересекающиеся области – хромосомные территории. Помимо
хромосомных территорий, образованных хроматином одной хромосомы, в ядре
выделяют ряд компартментов, где в непосредственной близости оказываются
участки разных хромосом. Так, в образовании ядрышек принимают участие
ядрышкообразующие центры, которые в геноме человека расположены на пяти
различных хромосомах. Недавно было показано, что в околоядрышковой
области располагаются многочисленные локусы всех хромосом (Nemeth A,
Langst G, 2011). Другими компартментами, где в пространстве ядра могут
встречаться фрагменты разных хромосом, являются транскрипционные фабрики
– области, содержащие активно транскрибирующие РНК полимеразы и
необходимые для транскрипции белковые факторы (Davidson S., et al., 2012).
В настоящее время механизм образования хромосомных перестроек
активно исследуется с учетом пространственной организации ядра. Для
образования хромосомных перестроек необходим физический контакт геновпартнеров. Было выдвинуто две гипотезы. Согласно первой, хромосомные
перестройки возникают в ходе репарации двунитевых разрывов при ошибочном
объединении изначально расположенных рядом друг с другом фрагментов
негомологичных хромосом. Такая модель образования хромосомных перестроек
известна как «гипотеза первенства контакта» (Savage J.R., 2000; Nikiforova M.N.,
et al., 2000). Альтернативой выступает «гипотеза первенства разрыва». Согласно
данной гипотезе, в роли инициатора формирования перестройки выступает
двунитевой разрыв ДНК. Далее концы разрыва перемещаются в пространстве
ядра для поиска партнеров по репарации. Перестройки возникают при встрече и
лигировании концов порванных негомологичных хромосом (Aten et al., 2004).
В ходе работы мы анализировали перемещения концов разорванного гена
MLL, наиболее часто перестраивающегося гена при развитии вторичных
лейкемий, опосредованных применением ядов ДНК топоизомеразы II.
Двунитевые разрывы ДНК индуцировали этопозидом, широко применяемым при
терапии онкологических заболеваний ядом ДНК топоизомеразы II. Расшифровка
молекулярного механизма формирования онкогенных хромосомных перестроек
в клетках, обработанных этопозидом, может показать пути снижения риска
возникновения таких перестроек, а, стало быть, и риска возникновения
вторичных лейкозов. Именно это и определяет актуальность данной работы.
4
Цель работы и экспериментальные задачи
Цель работы – проанализировать перемещения района локуса 11q23,
содержащего протоонкоген MLL, в ядрах лимфоидных клеток при
ингибировании ДНК ядом ДНК топоизомеразы II этопозидом.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие
экспериментальные задачи:
1. Подобрать условия ингибирования ДНК топоизомеразы II, при которых
детектируются разрывы внутри гена MLL.
2. Охарактеризовать радиальные распределения нормальных и разорванных
аллелей гена MLL при индукции двунитевых разрывов этопозидом.
3. Оценить частоту колокализации генов-партнеров по хромосомным
перестройкам MLL и AF9, AML1 и ETO при индукции двунитевых
разрывов этопозидом.
4. Оценить частоту колокализации генов MLL, AML1, AF9, ETO и ядрышек
при индукции двунитевых разрывов этопозидом.
5. Выяснить, могут ли аллели гена MLL полностью или частично выходить за
пределы собственной хромосомной территории при индукции двунитевых
разрывов ДНК этопозидом.
Научная новизна работы
В ходе работы впервые определена доля аллелей MLL, разорванных в
области BCR непосредственно в результате обработки клеток топоизомеразным
ядом этопозидом. Впервые продемонстрировано, что инкубация обработанных
этопозидом клеток в течение одного часа в среде без этопозида приводит к
возрастанию количества визуально детектируемых разорванных аллелей MLL.
Впервые продемонстрировано, что концы разорванных аллелей гена MLL
приобретают повышенную подвижность внутри ядра, что выражается в
изменении их радиальных позиций по сравнению с неповрежденными аллелями
MLL и в частом расположении разорванных аллелей MLL за пределами
собственной хромосомной территории. Продемонстрировано удвоение числа
колокализаций генов MLL и AF9, а также AML1 и ETO при ингибировании ДНК
топоизомеразы II.
5
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на 4-ой
международной конференции «The EMBO Meeting» (2012, Ницца, Франция), на
4-ой и 5-ой международных конференциях «Early events in Human Pathologies»
(2011, Ереван, Армения; 2012, Литвянка, Байкал, Россия), на 37-ом
международном конгрессе FEBS «From single molecules to Systems Biology»
(2012, Севилья, Испания), на 19-ой международной конференции студентов,
аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (2012, Москва, Россия), на
конгрессе гематологов России (2012, Москва, Россия).
Публикации по теме работы
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в
рецензируемых научных изданиях и 6 сообщений международных и российских
конференций.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Цели
и задачи», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Список
цитированных источников». Работа изложена на 90 страницах, содержит 12
рисунков, 5 таблиц, в работе процитировано 120 источников.
6
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
Культура клеток. В работе использовали перевиваемую культуру клеток Тлимфоцитов человека Jurkat. Клетки культивировали при 37°С в присутствии 5%
CO2 в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка.
Ингибирование ДНК топоизомеразы II. Клетки инкубировали в среде с
этопозидом (100 мкг/мл) в течение полутора часов, после чего либо сразу
использовали для приготовления препаратов, либо перед приготовлением
препаратов переносили на один час в среду без этопозида (далее по тексту –
«стадия репарации»). Для приготовления контрольных препаратов брали
необработанные этопозидом клетки.
Приготовление препаратов. Клетки фиксировали в гипотоническом
растворе, благодаря чему архитектура организации ядра сохранялась близкой
архитектуре живых клеток. Модифицированным в нашей лаборатории методом
трехмерной флуоресцентной in situ ДНК-ДНК гибридизации (3D FISH) выявляли
гены MLL, AF9, AML1, ETO, CCND1, а также территорию хромосомы 11.
Использовали коммерчески доступные флуоресцентные зонды, условия
гибридизации были оптимизированы в зависимости от набора зондов.
Тотальную ДНК окрашивали неспецифичным интеркалирующим красителем
DAPI. Ядрышки окрашивали двухслойным каскадом антител (первичные
мышиные моноклональные антитела против ядрышкого белка нуклеофосмина,
вторичные куриные антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем
Alexa 647).
Микроскопия препаратов и анализ изображений образцов. Для получения
изображений объемных препаратов использовали конфокальную лазерную
сканирующую микроскопию. В результате конфокальной микроскопии были
получены изображения серий оптических срезов образцов. Последующую
обработку изображений и анализ многослойных изображений проводили с
использованием программного обеспечения ImageJ, Imaris, Nemo. Для анализа
взаимного расположения генов MLL, CCND1 и территории хромосомы 11
нашими коллегами была разработана специальная компьютерная программа.
Статистический анализ данных проводили с применением программного
обеспечения Microsoft Excel.
7
Результаты и обсуждение
Индукция двунитевых разрывов ДНК этопозидом
Область, внутри которой чаще всего происходят разрывы гена MLL при
образовании онкогенных хромосомных перестроек, занимает примерно 9%
длины гена (кластер точек разрыва или breakpoint cluster region – BCR). Для того,
чтобы обнаружить первичные разрывы гена MLL внутри данной области в
клетках, обработанных этопозидом, мы проводили флуоресцентную
гибридизацию in situ с коммерчески доступным двуцветным зондом. Зонд
покрывал геномный локус больший, чем занимает ген MLL. Участок локуса,
содержавший фрагмент гена MLL от 5' конца до области BCR, гибридизовался с
половиной зонда, меченой зеленым флуорофором; участок локуса, содержавший
фрагмент гена MLL от BCR до 3' конца, - с половиной зонда, меченой красным
флуорофором (рис. 1).
Рисунок 1. Генетическая карта фрагмента локуса q23 хромосомы 11, содержащего ген MLL.
Район гена обозначен черной линией, район BCR гена MLL обозначен жирной оранжевой
чертой. На карте показаны первый и последний экзоны гена MLL, а также экзоны,
фланкирующие область BCR. Красный и зеленый прямоугольники отображают цвет зонда,
использованного для гибридизации в данной области генома. Длины гена MLL, красного и
зеленого участков гибридизационного зонда приведены в тысячах пар оснований (т.п.о.).
Целая аллель гена MLL окрашивалась красным и зеленым цветами одновременно
и на изображении представлена желтым сигналом (рис. 2А). При наличии
разрыва в области BCR аллель гена была представлена на фотографии
отдельными красным и зеленым сигналами (рис. 2Б).
В ходе первой части работы клетки обрабатывали этопозидом и, либо
готовили препараты сразу после обработки, либо после стадии обработки
инкубировали клетки в течение часа в среде без этопозида. В результате было
обнаружено, что непосредственно после обработки клеток этопозидом
обнаруживаются двунитевые разрывы ДНК внутри области BCR гена MLL (рис.
2Б). После инкубации обработанных этопозидом клеток в среде без этопозида
было обнаружено увеличение числа детектируемых разрывов в области BCR
8
гена MLL примерно в два раза (рис. 2Б). Увеличение числа детектированных
разрывов, возможно, является следствием начала репарации ДНК после
удаления этопозида. Так, протеолиз заблокированной этопозидом ДНК
топоизомеразы II, освобождает концы разрыва, последующая миграция концов
разрывов приводит к увеличению числа удаленных друг от друга красных и
зеленых сигналов.
Рисунок 2. Результаты in situ гибридизации с двухцветным зондом против гена MLL. 5' конец
гена MLL окрашен зеленым цветом, 3' конец – красным. А) аллели гена MLL не повреждены
(целые аллели помечены головкой стрелки), Б) двунитевой разрыв внутри области BCR гена
MLL (концы порванной аллели гена помечены стрелками), В, Г) двунитевой разрыв
представлен одним цветным пятном (помечен стрелками). Гистограммы показывают долю
клеток (% от выборки), имеющих один из четырех типов окрашивания гена MLL, черный
столбик – контроль, белый столбик – этопозид 1,5 часа, серый столбик – этопозид 1,5 часа,
стадия репарации 1 час. Каждая из трех выборок содержала 310-320 клеток. Планки
погрешностей показывают стандартную ошибку. На рисунке представлены конфокальные
срезы. Количественный анализ проводился на трехмерных моделях, построенных на
основании серий конфокальных срезов.
9
Рисунок 3. Схемы
возникновения
дополнительного одноцветного
гибридизационного сигнала.
Помимо клеток, где двунитевые разрывы внутри гена MLL были
представлены разделенными в пространстве красным и зеленым сигналами,
были обнаружены клетки, где разрыв был представлен одним (либо красным,
либо зеленым) сигналом в непосредственной близости от желтого сигнала (рис.
2В, Г). Возможно, в таких клетках произошло образование разрыва внутри
геномной области, покрытой зондом, но вне района, где зонд меняет цвет и
происходят разрывы, в норме свойственные онкогенным хромосомным
перестройкам (рис. 3А). С другой стороны, такая картина может соответствовать
двунитевым разрывам ДНК в области BCR гена MLL одной из сестринских
хроматид, сцепленных между собой когезиновыми кольцами, концы разрыва
свободные от когезиновых сшивок могут быть видны как одноцветные, красные
либо зеленые пятна (рис. 3Б).
Анализ радиальных распределений гена MLL
На втором этапе работы были проанализированы радиальные позиции
целых аллелей и концов порванных аллелей гена MLL. За радиальную позицию
принимали расстояние между центром сигнала либо целой аллели, либо конца
разрыва и центром ядра. Чтобы оценить изменения радиальных позиций аллелей
были построены их распределения (Cremer M., et al., 2003). Для этого объем ядра
был разбит на пять концентрических равных объемов (рис. 4А). Далее
подсчитывали количество сигналов аллелей внутри каждого из объемов. Было
обнаружено, что радиальные распределения целых аллелей (двуцветные
сигналы) идентичны для клеток контрольной и двух экспериментальных
10
выборок (рис. 4Б, В, Г). В то же время концы двунитевых разрывов гена MLL
смещаются к периферии ядра сразу после обработки клеток этопозидом (рис. 4Д)
После инкубации обработанных этопозидом клеток в среде без этопозида
распределение радиальных позиций концов разрыва гена MLL становится
практически идентичным распределению неповрежденных аллелей (рис. 4Е). В
настоящее время трудно судить о том, является ли кратковременное
перемещение разорванных концов MLL направленным процессом или простым
следствием понижения упорядоченности пространственной организации
интерфазных хромосом после индукции разрывов в ДНК. В этой связи не
следует забывать о том, что в условиях ингибирования ДНК топоизомеразы II
разрывы вносятся не только в ген MLL, являющийся объектом нашего
исследования, но и в другие участки генома.
Рисунок 4. Радиальные распределения гена MLL. А) схематическое разбиение ядра на пять
равных концентрических объемов. Границы ядерных слоев лежат на расстоянии в 58, 73, 84,
94 и 100% ядерного радиуса. Б - Е) Подсчет количества поврежденных и целых аллелей гена
MLL в каждом из пяти ядерных слоев. Б) контроль, неповрежденные аллели, В, Г)
неповрежденные аллели (двухцветные гибридизационные сигналы) В) этопозид 1,5 часа, Г)
этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1 час, Д, Е) концы порванных аллелей (одноцветные
гибридизационные сигналы), Д) этопозид 1,5 часа, Е) этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1
11
час. Планки погрешностей на всех графиках показывают стандартную ошибку. Двухцветные
сигналы подсчитывали в выборках ~300 клеток, одноцветные сигналы ~50 клеток.
Анализ частоты колокализации генов MLL, AF9, AML1, ETO между собой
Как было показано выше, через час после инкубации обработанных
этопозидом клеток в среде без этопозида наблюдается увеличение числа
двунитевых разрывов гена MLL, регистрируемых с помощью двухцветной
гибридизационной пробы, т.е. наблюдается возрастание числа разорванных и
разошедшихся в пространстве ядра 5'- и 3'-фрагментов аллелей гена MLL. С
точки зрения центральной задачи настоящей работы наиболее важным
представляется вопрос о том, сопровождается ли этот процесс повышением
частоты колокализаций партнеров по хромосомным транслокациям.
На третьем этапе работы мы проанализировали взаимное расположение
гена MLL и его партнера по хромосомным перестройкам гена AF9 друг
относительно друга в условиях, при которых мы наблюдали наибольший
уровень двунитевых разрывов гена MLL. Помимо пары генов MLL/AF9 мы
проанализировали взаимное расположение генов AML1 и ETO, которые также
являются партнерами по перестройкам, ассоциированными с вторичными
лейкозами. В данной серии экспериментов каждый из генов гибридизовали с
зондом красного или зеленого цвета. Было обнаружено, что частота
колокализации сигналов для каждой пары генов-партнеров по перестройкам
возрастает примерно в два раза (табл. 1).
Таблица 1. Частота колокализации пар генов MLL/AF9, AML1/ETO в контрольных клетках и
клетках, обработанных этопозидом.
Пара
объектов
Необработанные клетки
Обработанные клетки
N
клеток
%
колокализации
сигналов
N
клеток
MLL/AF9
~200
0,70%
~200
1,81%
2,57
AML/ETO
~100
1,12%
~100
2,06%
1,83
%
колокализации
сигналов
Экспериментальное
значение/
контрольное значение
12
Анализ частоты колокализации генов MLL, AF9, AML1, ETO и ядрышек
Известно, что ядрышки формируются с участием ядрышкообразующих
центров, которые в геноме человека расположены на пяти различных
хромосомах. Согласно последним исследованиям, участки всех хромосом
человека находятся в непосредственном контакте с ядрышком (Nemeth A, Langst
G, 2011). Это позволяет предположить, что именно в околоядрышковом
пространстве могут происходить встречи партнеров по транслокациям. Если это
действительно так, то процесс незаконной рекомбинации между разными
хромосомами мог бы стимулироваться нуклеолином (одним из ядрышковых
белков), который, как было показано (Kobayashi J, et al., 2012), играет важную
роль в репарации двунитевых разрывов ДНК.
Для проверки предположения о том, что околоядрышковое пространство
может способствовать встрече партнеров по хромосомным перестройкам, был
проведен подсчет колокализации генов MLL, AF9, AML1, ETO и ядрышек после
обработки клеток этопозидом и часовой инкубации в среде без этопозида.
Полученные результаты не подтвердили нашего предположения. Было
продемонстрировано, что в клетках, обработанных этопозидом, возрастает лишь
уровень колокализации с ядрышком гена MLL (табл. 2).
Таблица 2. Частота колокализации генов MLL, AF9, AML, ETO и ядрышек в контрольных
клетках и клетках, обработанных этопозидом.
Пара объектов
Необработанные клетки
Обработанные клетки
N
клеток
%
колокализации
сигналов
N
клеток
%
колокализации
сигналов
Экспериментальное
значение/
контрольное
значение
MLL/Ядрышко
~200
6,87%
~200
12,85%
1,87
AF9/Ядрышко
~200
16,84%
~200
14,29%
0,85
AML/Ядрышко
~100
27,42%
~100
22,46%
0,82
ETO/Ядрышко
~100
8,82%
~100
7,92%
0,89
13
Анализ взаимного расположения гена MLL и территории хромосомы 11
В течение интерфазы хромосомы высших эукариот занимают в ядре
компактные, практически не пересекающиеся области – хромосомные
территории. Эта организация создает очевидные препятствия для возникновения
хромосомных перестроек. Действительно, для того, чтобы быть сшитыми
системами репарации двунитевых разрывов ДНК, разорванные куски разных
хромосом должны встретиться в пространстве ядра. Физический контакт между
партнерами по перестройкам может произойти при условии выхода участка хотя
бы одного из них за пределы территории своей хромосомы. В этой связи весьма
важным представляется вопрос о том, приобретают ли концы разорванных ДНК
топоизомеразой II генов повышенную подвижность.
С целью получения ответа на данный вопрос мы проанализировали
расположение 3'-конца гена MLL по отношению к территории хромосомы 11 в
контрольных клетках и клетках, обработанных этопозидом. Аллели гена MLL
гибридизовали с двухцветным зондом (рис. 1), территорию хромосомы 11
гибридизовали с набором одноцветных зондов зеленого цвета (коммерческая
проба на хромосому 11 человека). Было обнаружено, что после инкубации
клеток с этопозидом и последующего одночасового культивирования в обычных
условиях 3'-фрагмент гена MLL часто выходит за пределы территории 11
хромосомы (рис. 5В, Г и таблица 3).
Рисунок 5. Выход 3' конца гена MLL за пределы территории 11 хромосомы. Зеленым окрашена
территория хромосомы 11, красным – 3' конец гена MLL. А) контроль, Б) этопозид 1,5 часа, В,
Г) этопозид 1,5 часа, стадия репарации 1 час. Головка стрелки указывает на 3' конец гена MLL
вышедшего за пределы территории хромосомы 11.
Аллели гена MLL обнаруживаются за пределами территории 11 хромосомы
в два раза чаще, чем в необработанных клетках уже сразу после инкубации
клеток с этопозидом (p=0,04, точный критерий Фишера). После инкубации
обработанных клеток в среде без этопозида процент выхода аллелей гена MLL
существенно возрастает (таблица 3), превосходя таковой в контрольных клетках
14
практически в пятнадцать раз (p=0,0001, точный критерий Фишера).
В качестве дополнительного контроля мы проанализировали частоту
выхода за пределы хромосомной территории гена CCND1. Ген CCND1 также
лежит на хромосоме 11, но не участвует в перестройках, происходящих в ответ
на обработку клеток топоизомеразными ядами и приводящих к развитию
вторичных лейкемий. В тех условиях обработки клеток (инкубация с этопозидом
и последующее кратковременное культивирование в среде без этопозида) когда
ген MLL демонстрирует максимальную частоту выхода за пределы хромосомной
территории, ген CCND1 не демонстрирует выход за пределы хромосомной
территории (p=0,28, точный критерий Фишера). Частоты выхода генов сведены в
таблице 3.
Таблица 3. Выход генов MLL и CCND1 за пределы территории 11 хромосомы.
Ген
Обработка
клеток
этопозидом /
стадия
репарации
-/CCND1
1,5 часа /
1 час
-/1,5 часа / MLL
1,5 часа /
1 час
Число
сигналов
3’-концов
генов в
анализе
~1000
Выход 3'конца гена за
пределы
территории 11
хромосомы
18 (1.7%)
Выход 3'-конца
гена за пределы
территории 11
хромосомы, ±SE
1.5%±0.8%
Достоверность
различий
(контроль/опыт),
точный критерий
Фишера
-
~1200
27 (2.1%)
2.7%±1.6%
0,28
~2000
~1200
8 (0.4%)
11 (0.9%)
0.5%±0.2%
0.9%±0.5%
0,04
~1400
121 (8.8%)
7.2%±3.0%
<0.0001
15
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе было показано, что при ингибировании ДНК топоизомеразы II
гены-партнеры по хромосомным перестройкам MLL и AF9, AML1 и ETO
колокализуются в два раза чаще, чем в норме. Продемонстрировано, что при
обработке клеток Jurkat этопозидом разрывы гена MLL в области BCR с
последующим расхождением разорванных концов являются достаточно частыми
событиями. Было показано, что ген MLL демонстрирует высокий уровень
двунитевых разрывов ДНК внутри области BCR. Наконец, продемонстрировано,
что разорванные в результате ингибирования активности ДНК топоизомеразы II
концы гена MLL приобретают повышенную подвижность внутри клеточного
ядра. Это выражается в изменении их радиальных позиций (по сравнению с
неразорванными аллелями) и предпочтительном выходе за пределы
хромосомной территории.
В совокупности результаты работы свидетельствуют в пользу гипотезы,
постулирующей, что разрыв ДНК является первичным по отношению к
перемещению, необходимому для встречи партнеров по хромосомным
перестройкам (Aten et al., 2004). Данное заключение справедливо, во всяком
случае, для разрывов, возникающих в результате ингибирования ДНК
топоизомеразы II этопозидом. Можно полагать, что выявленная в наших
экспериментах мобильность разорванных концов гена MLL связана с
многоэтапным процессом репарации вызванных топоизомеразой II разрывов,
начальные стадии которого состоят в удалении молекул топоизомеразы,
присоединенных ковалентной связью к 5’-концам цепей ДНК. Согласно ряду
источников, этот процесс осуществляется при участии протеасомной системы
деградации белков и может происходить в определенных функциональных
компартментах внутри клеточного ядра (Salmena L., et al., 2001; Zang A., et al.
2006).
16
ВЫВОДЫ
1. В значительной части популяции клеток линии Jurkat, обработанных ядом
ДНК топоизомеразы II этопозидом, визуализированы двунитевые разрывы гена
MLL в области BCR.
2. В культивируемых клетках Jurkat, обработанных ядом ДНК топоизомеразы II
этопозидом, концы разорванного гена MLL кратковременно смещаются к
периферии ядра.
3. Колокализация партнеров по хромосомным перестройкам MLL и AF9, AML1 и
ETO в ядрах клеток Jurkat повышается примерно в два раза при ингибировании
ДНК топоизомеразы II этопозидом.
4. Среди генов-партнеров по хромосомным перестройкам MLL, AF9, AML1, ETO
только ген MLL демонстрирует повышение колокализации с ядрышком при
ингибировании ДНК топоизомеразы II этопозидом.
5. В клетках Jurkat, обработанных этопозидом, 3’-конец гена MLL с высокой
частотой локализуется вне территории хромосомы 11.
17
СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ:
1.
Glukhov S.I., Rubtsov M.A., Alexeyevsky D.A., Alexeevski A.V., Razin S.V., Iarovaia O.V.
The broken MLL gene is frequently located outside the inherent chromosome territory in human
lymphoid cells treated with DNA topoisomerase II poison etoposide [Электронный журнал] //
PLoS ONE. 2013. V. 8. I. 9. N. e75871. URL:http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%
2F10.1371%2Fjournal.pone.0075871.
2.
Rubtsov M.A., Glukhov S.I., Allinne J., Pichugin A., Vassetzky Y.S., Razin S.V., Iarovaia O.V.
Treatment of lymphoid cells with the topoisomerase II poison etoposide leads to an increased
juxtaposition of AML1 and ETO genes on the surface of nucleoli // Biopolymers and Cell. 2011.
V. 27. I. 5. P. 398-403.
Материалы российских и международных конференций:
1.
Glukhov S.I., Rubtsov M.A., Razin S.V., Iarovaia O.V. Mobility of the MLL containing locus in
the nuclear space upon the etoposide treatment // 4th International Conference “The EMBO
Meeting”. Nice. France. 2012. P. 48.
2.
Rubtsov M.A., Glukhov S.I., Ageeva L.V., Razin S.V., Iarovaia O.V. Genes-partners on tANLL-associated chromosomal translocations exhibit different behavior in response to DNA
topoisomerase II inhibition in lymphoid cells // 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress “From
single molecules to Systems Biology”. Seville. Spain. 2012. P. 308-309.
3.
Rubtsov M.A., Glukhov S.I., Ageeva L.V., Razin S.V., Iarovaia O.V. Genes-partners on tANLL-associated chromosomal translocations exhibit different behavior in response to DNA
topoisomerase II inhibition in lymphoid cells // V International Meeting "Early events in Human
Pathologies". Listvyanka (Baikal) . Russia. 2012. P. 30.
4.
Рубцов М.А., Глухов С.И., Агеева Л.В., Разин С.В., Яровая О.В. Различия в поведении
генов-партнеров по хромосомным транслокациям, ассоциированным с вторичными
лейкозами, в условиях ингибировании ДНК-топоизомеразы II // Конгресс гематологов
России. Москва. Россия. 2012. C. 23.
5.
Агеева Л.В., Глухов С.И., Рубцов М.А. Оценка влияния сверхэкспрессии нуклеолина на
чувствительность клеток HeLa к обработке этопозидом // XIX Международная
конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва. Россия.
2012. С. 183.
6.
Rubtsov M.A., Glukhov S.I., Allinne J., Pichugin A., Vassetzky Y.S., Razin S.V. Iarovaia O.V.
Treatment of lymphoid cells with the topoisomerase II poison etoposide leads to an increased
juxtaposition of AML1 and ETO genes on the surface of nucleoli // IV International Meeting
“Early Events in Human Pathologies”. Yerevan. Armenia. 2011.
18
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
5
Размер файла
879 Кб
Теги
условия, протоонкогенов, концом, подвижности, топоизомеразы, ингибирования, разорванных, днк
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа