close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Оптимизация тест-систем испытаний биологически активных веществ растений против некоторых фитопатогенных грибов из отдела Deuteromycota.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Зайцев Дмитрий Викторович
ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМ ИСПЫТАНИЙ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
РАСТЕНИЙ ПРОТИВ НЕКОТОРЫХ
ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ ИЗ ОТДЕЛА
DEUTEROMYCOTA
Специальность 06.01.07-Защита растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учѐной степени
кандидата биологических наук
Москва – 2013
Диссертационная работа выполнена на кафедре защиты растений Российского
государственного аграрного университета – МСХА имени К. А. Тимирязева
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Смирнов Алексей Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, ведущий научный
сотрудник кафедры микологии и альгологии
биологического факультета Московского
государственного университета
имени М.В. Ломоносова
Лихачѐв Александр Николаевич
кандидат биологических наук,
специалист по семенам цветочным культур
ООО «Сингента»
Троицкая Юлия Сергеевна
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский
институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии.
Защита состоится «17» «декабря» 2013 г. в 1100 часов на заседании
диссертационного совета Д220.043.04 при ФГБОУ ВПО «Российский
государственный аграрный университет – МСХА имени К. А. Тимирязева» по
адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15 (тел./факс 8(499)976-2492).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной
библиотеке Российского государственного аграрного университета – МСХА
имени К. А. Тимирязева.
Автореферат разослан « 15 » ноября 2013 г.
Учѐный секретарь
диссертационного совета
Гриценко В. В.
Общая характеристика работы
Актуальность исследований. Факультативные паразиты из родов
Alternaria, Bipolaris (Helminthosporium), Botrytis и Fusarium являются весьма
опасными
патогенами,
поражающими
большое
количество
сельскохозяйственных и декоративных культур. В годы эпифитотий потери от
этих грибов составляют от 40 до 100% урожая.
Против возбудителей этих болезней необходимо подбирать
эффективные и, по возможности, экологически чистые средства и способы
защиты. Для этого необходимо получать достоверную информацию о
биологических свойствах возбудителей, работая с их чистыми культурами.
Между тем, имеются причины, затрудняющие изучение свойств возбудителей
данных болезней, выделенных в чистую культуру. В работе проводится
систематизация этих причин в лабораторных условиях и оптимизация
имеющихся методик работы с ними.
На этапе скрининга веществ растительного происхождения,
обладающих фунгистатическим действием, усовершенствованы методики
тестирования веществ различной природы, доступных в очень малых
количествах, на активность против грибных факультативных паразитов. Это
имеет принципиальное значение для выявления перспективных средств
биологизированной защиты растений.
Цель исследования – провести комплексные лабораторные
исследования, направленные на оптимизацию методик определения
активности веществ, доступных в очень малых количествах, против Alternaria
alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и
Fusarium oxysporum Schl..
Для выполнения поставленной цели решали следующие задачи:
1. Оптимизация образования и прорастания конидий, а также роста
колоний некоторых, использованных в работе, грибных факультативных
паразитов при различных условиях инкубирования.
2. Оценка агрессивности Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Bipolaris
sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl. в
отношении ряда декоративных растений.
3. Выявление эффекта растительных экстрактов белковой и
органической природы из звездчатки средней (Stellaria media (L.) и ежовника
обыкновенного (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) на Alternaria alternata (Fr.)
Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium
oxysporum Schl.
Научная новизна. Усовершенствованы методики определения
агрессивности грибных факультативных паразитов на растениях-тестерах,
1
позволяющие оценивать интенсивность роста, спороношения и токсичность
данных грибов. Выявлены различные эффекты (от ингибирующего до
стимулирующего) белковых и органических экстрактов, выделенных из
звездчатки средней (Stellaria media (L.) и ежовника обыкновенного
(Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) на развитие Alternaria alternata (Fr.) Keissl.,
Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl.
Практическая ценность работы. Предложенный нами комплексный
подход, объединяющий и оптимизирующий различные методики определения
прорастания конидий и инфекционного потенциала Alternaria alternata (Fr.)
Keissl., Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium
oxysporum Schl. в лабораторных условиях, существенно облегчает проведение
данных исследований и тестирований. Выявлен in vitro существенный
фунгистатический эффект экстракта из звездчатки средней (Stellaria media (L.)
Vill.) на рост и развитие Botrytis cinerea Pers.
Апробация и публикация результатов исследования. Материалы
диссертации доложены на международной научной конференции молодых
учѐных и специалистов РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева (июнь 2011 и
2012 гг.) и всероссийской, с международным участием, конференции
«Научное наследие Н. И. Вавилова и современность» в РГАУ-МСХА имени
К. А. Тимирязева (декабрь 2012 г.).
По материалам работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 –
в журналах списка ВАК.
Структура и объѐм работы. Диссертационная работа изложена на 198
машинописных страницах, состоит из введения, частей «Обзор литературы»,
«Материалы, использованные в работе», «Методики проведения
экспериментов», «Результаты и обсуждение», выводов, библиографического
списка, состоящего из 100 источников, из которых 35 – на иностранном языке.
Работа включает 94 рисунка и 43 таблицы.
2
Содержание диссертации
Введение. Показана актуальность, новизна и практическая ценность
работы. Проведена систематизация трудностей и проблем, возникающих при
работе с фитопатогенными несовершенными грибами.
Глава I. Обзор литературы.
Дана характеристика декоративным растениям и культурам
фитопатогенных грибов, используемым в работе. Проведѐн сбор сведений о
методиках работы с фитопатогенными несовершенными грибами.
Проанализированы методики тестирования веществ различной природы на
активность по отношению к грибным факультативным паразитам.
Глава II. Места проведения опытов, материалы и методы исследований.
Лабораторные и полевые исследования проведены на кафедре защиты
растений (сектор фитопатологии) и в лаборатории защиты растений РГАУМСХА имени К.А. Тимирязева, а также в питомнике ООО «Розовая поляна»
Рузского района Московской области.
В работе использовали: изоляты грибов Alternaria alternata (Fr.) Keissl.,
Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers., Fusarium oxysporum Schl.;
акалифу гаитянскую (Acalypha hispaniolae Urb.) [А], гибискус китайский
(Hibiscus rosa-sinensis L.) [Гиб], пеларгонию щитовидную (Pelargonium
peltatum (L.) L’Her.) [Г], петунию садовую (Petunia х hybrida (Vilm.) Hort. [П],
фикус Бенджамина (Ficus benjamina L.) [Ф], шлюмбергеру Бакли
(Schlumbergera x buckleyi Hunt) [Ш], а также различные сорта розы (Rosa L.):
Dbora (розовая) [Dbp], Kosmos (белая) [Ksб], Barbara (красная) [Brk], Juliette
Child (жѐлтая) [JCж], HBoterro (красная) [HBk], Lions Rose (белая) [LRб],
Sangria (красная) [SAк], La Franse (pозовая) [LFp]; растительные экстракты из
звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.). и ежовника обыкновенного
(Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.).
Фитопатогенные грибы выращивали в чашках Петри на: овсяном
(ОИПС), картофельно-глюкозном (КГА) и картофельно-морковном (КМА)
агарах в течение 10-12 дней при температуре 20-22º С и 26-28º С. Инокуляцию
грибов в органы растения проводили суспензией конидий, инфекционномицелиальными блоками, а также с помощью мелкодисперсного
опрыскивания.
В экспериментах по росту колонии и образованию конидий
исследуемых грибов, а также в работе по изучению влияния минимальной
3
среды на их рост и развитие использовали следующие температурные
условия: -19 – -21° С, 5-7° С, 20-22° С и 26-28° С.
В опытах по прорастанию конидий исследовали следующие
питательные растворы: дистиллированная вода, 3% растворы глюкозы и
сахарозы, 10% картофельный и морковный бульоны, 5% картофельноморковный бульон, 5% аскорбиновую кислоту.
В экспериментах по оценке декоративных растений, розы и петунии, на
возможность заражения их указанными выше фитопатогенными грибами,
использовали варианты с поранением ткани органа растения и без еѐ
предварительного поранения.
В опытах по оценке активности растительных экстрактов из звездчатки
средней и ежовника обыкновенного в отношении указанных выше
фитопатогенных грибов использовали варианты с экспозицией суспензии
конидий с экстрактом в течение 2-3 часов перед инокуляцией в орган растения
и без предварительной экспозиции.
Полученные данные в исследованиях с растениями, а также их
органами, переводили в баллы, на основе которых проводили расчѐт
показателей индекса агрессивности (ИА) и итогового индекса агрессивности
(ИИА) патогена.
Частота инфекции (ЧИ): 1 – заражения нет; 2 – 1 сегмент заражѐн;
3 – 2 сегмента заражено; 4 – 3 сегмента заражено; 5 – 4 сегмента заражено.
Размер хлороза (РХ): 1 – хлороза нет; 2 – хлороз до 10% поверхности;
3 – 10-25% поверхности покрыто хлорозом; 4 – 25-50% поверхности покрыто
хлорозом; 5 – 50-80% поверхности покрыто хлорозом; 6 – хлороз занимает
80-100% поверхности.
Размер некроза (РН): 1 – некрозов нет; 2 – до 10% некротизировано;
3 – 11-30% некротизировано; 4 – 31-60% некротизировано; 5 – 61-90%
некротизированно; 6 – 91-100% некротизированно.
Интенсивность спороношения (ИС): 1 – спороношения нет; 2 – до 10%
покрыто спороношением; 3 – 10,1- 30% покрыто спороношением; 4 –
30,1-60% покрыто спороношением; 5 – 60,1-90% покрыто спороношением; 6 –
более 90% покрыто спороношением.
Инкубационный период 1 (ИП-1) - это период в сутках до появления
первых признаков хлороза.
Инкубационный период 2 (ИП-2) - это период в сутках до появления
некроза.
Латентный период или период споруляции (ЛП) - это период в сутках
до появления спороношения. (ван дер Планк, 1966)
Индекс агрессивности (ИА) рассчитывали по следующей формуле:
ИА = ЧИ * РХ * РН * ИС
4
Итоговый индекс агрессивности (ИИА) рассчитывали по следующей
формуле:
ИИА = (ЧИ * РХ * РН * ИС) / (ИП-1 * ИП-2 * ЛП)
За основу взята методика индекса агрессивности Phytophthora infestans
(Смирнов, Кузнецов, 2006), которая была дополнена показателями РХ и ИП-1,
в связи с тем, что несовершенные грибы медленно заражают растения.
Появляются хлороз и антоцианоз, которые являются частью проявления
агрессивности патогена и отражают уровень вивотоксинов и микотоксинов,
убивающих ткани растения и облегчающих развитие мицелия грибов (Пенкин,
2012).
III. Результаты исследований и их обсуждение.
1. Оптимизация условий прорастания конидий A. alternata, B.
sorokiniana, B. cinerea, F. oxysporum
Прорастание конидий A. alternata в дистиллированной воде на третьи
сутки инкубирования достигало 78,1 и 95% (для российского и иранского
изолята, соответственно); конидий B. sorokiniana – составило 23%; конидий B.
cinerea и F. oxysporum – не превысило 2% и 6%, соответственно. В данной
среде наблюдалось массовое разрушение, как проросших гиф грибов, так и
самих конидий уже при первом учѐте.
Конидии иранского и российского изолятов гриба A. alternata
полностью прорастали во всех из представленных растворов сахаров.
Прорастание конидий B. sorokiniana, B. cinerea и F. oxysporum в 3% растворе
сахарозы было выше, чем в 3% растворе глюкозы в 2 – 4 раза и достигало
приблизительно 93% (для B. sorokiniana) на 3-и сутки инкубирования.
Конидии иранского и российского изолятов гриба A. alternata, а также
конидии B. sorokiniana полностью прорастали во всех видах овощных
бульонов уже на первый день учѐта (рис. 1). Однако в смеси бульонов
прорастание конидии B. sorokiniana опускалось до уровня 80%. Прорастание
конидий B. cinerea в морковном бульоне достигало почти 80% (рис. 1).
Инкубирование конидий данного гриба в картофельном бульоне снижало
процент прорастания почти в два раза (42%), а в смеси этих двух бульонов
прорастание не превышало 32% (табл. 1). Наибольшее прорастание
макроконидий F. oxysporum наблюдалось в смеси картофельного и
морковного бульонов (около 50%). В морковном бульоне этот показатель
снижался до 15%, а в картофельном – не превышал и 5%. В отличие от
макроконидий, микроконидии и хламидоспоры F. oxysporum во всех видах
бульонов прорастали очень слабо, однако наибольший процент наблюдался в
морковном (до 4%). Проросшие гифы хорошо ветвились.
5
Таблица 1. Эффективность применения различных составов
питательных растворов для прорастания конидий B. cinerea, %
Вариант (фактор А/фактор В)
Дистиллированная вода
1-й день
1,1
3-й день
1,8
3%-ный раствор глюкозы
0,0
4,4
3%-ный раствор сахарозы
13,1
16,4
КБ
МБ
КМБ
39,6
70,0
12,2
42,1
78,7
31,6
5%-ный раствор аскорбиновой кислоты
0,0
0,3
где, КБ – картофельный бульон; МБ – морковный бульон; КМБ –
картофельно-морковный бульон
Таблица 1.1. Значения НСР05 по факторам, для взаимодействия
факторов, а также для частных различий
Среднее
по
фактору
А:
Дистиллированная
вода
1,5
Среднее по фактору В:
По фактору А:
0,11 (+; Fф = 64,73)
3-%
раствор
глюкозы
3-%
раствор сахарозы
2,2
КБ
МБ
14,8
40,9
74,4
1-й день
19,4
По фактору В:
Для А и В:
0,06 (+; Fф = 5,29)
0,11 (+; Fф =
2,43)
КМБ
5-%
раствор
аскорбиновой
кислоты
21,9
0,2
3-й день
25,0
Для частных различий: 0,15
В 5% аскорбиновой кислоте прорастание конидий иранского изолята
A. alternata, доходило до 100% на третьи сутки инкубирования. Однако
конидии российского изолята в тех же условиях прорастали достаточно слабо
– 21,5% на третий день. Наблюдался ингибирующий эффект воздействия 5%
раствора аскорбиновой кислоты на конидии B. sorokiniana, B. cinerea и
F. oxysporum. Прорастание их не превышало 0,5% и 1,5% (для B. cinerea и
B. sorokiniana, соответственно) (рис. 2). У F. oxysporum прорастания конидий
вообще не наблюдалось. Проросшие гифы гриба ветвились слабо.
6
Рисунок 1. Проросшие конидии B. cinerea (слева) и B. sorokiniana (справа) в
морковном бульоне на 3-й день инкубирования.
Рисунок 2. Ингибирование прорастания конидии B. cinerea (слева) и B.
sorokiniana (справа) в 5% аскорбиновой кислоте на 3-й день инкубирования.
2. Оптимизация условий роста колонии и образования конидий A.
alternata и B. cinerea, в зависимости от среды выращивания и
температурных условий
Рост колонии иранского и российского изолята гриба A. alternata на
овсяной среде в среднем на 5-10 мм опережал рост на картофельно-морковном
агаре как при температуре 20-22º С, так и при 26-28º С.
При выращивании иранского и российского изолятов гриба A. alternata
при температуре 20-22º С среднее количество образовавшихся конидий было
низким, однако на ОИПС этот показатель со временем незначительно
повышался, в то время как на КМА оставался на одном уровне. При
выращивании гриба A. alternata при температуре 26-28º С на КМА, среднее
количество образовавшихся конидий возрастало ко времени второго учѐта и
далее оставалось неизменным, в то время как на овсяном агаре происходил
резкий рост образования конидий к 8-му дню инкубирования и такой же
резкий спад к 10-му дню. Среднее количество конидий российского изолята
гриба A. alternata несколько превышало среднее количество конидий
иранского изолята в каждом из вариантов опыта.
7
Рост колонии изолятов BMdS/S и PY/HT гриба B. cinerea на
картофельно-морковном агаре в среднем на 20-30 мм опережал рост на
овсяной среде как при температуре 20-22º С, так и при 26-28º С.
При выращивании изолятов BMdS/S и PY/HT гриба B. cinerea при
температуре 20-22º С среднее количество образовавшихся конидий как на
ОИПС, так и на КМА со временем повышалось. При выращивании гриба
B. cinerea при температуре 26-28º С на обеих средах происходил резкий рост
образования конидий к 8-му дню инкубирования и такой же резкий спад к 10му дню. Среднее количество конидий гриба B. cinerea на картофельноморковном агаре превышало среднее количество конидий на овсяной среде в
каждом из вариантов опыта.
3. Оптимизация способности конидий A. alternata к образованию колонии,
в зависимости от температурных условий инкубирования и среды
выращивания
Конидии иранского и российского изолятов A. alternata сохраняли
способность образовывать колонии в каждом из вариантов опыта.
Во всех вариантах рост колоний иранского и российского изолятов
гриба A. alternata на овсяной искусственной питательной среде (ОИПС)
превышал рост колоний на картофельно-морковном агаре (КМА) в среднем на
5-10 мм. Также рост колоний гриба A. alternata каждого из изолятов был
наиболее интенсивным после 9-и дневного инкубирования его конидий во
всех температурных условиях.
Интенсивность роста колонии каждого из изолятов гриба A. alternata
была выше после предварительного инкубирования его конидий при -19 – 21°С (табл. 2) или при 26-28°С, чем после инкубирования их при 5-7°С или
при 18-20°С. Однако после инкубирования конидий гриба при -19 – -21°С,
контаминация растущей колонии была намного ниже (особенно на овсяном
агаре), чем после инкубирования конидий гриба при 26-28°С.
Таблица 2. Средние значения диаметров колоний гриба A. alternata, мм
День учѐта
российский изолят иранский изолят
ОИПС
КМА
ОИПС
КМА
3-й день
14,8
15,3
11,9
11,6
4-й день
32,4
25,1
31,2
21,8
5-й день
64,1
43,8
54,1
38,4
где, КМА – картофельно-морковный агар; ОИПС – овсяный агар.
8
Таблица 2.1. Средние значения и значения НСР05 по факторам, их
взаимодействию, а также для частных различий
НСР05 по фактору А:
4,10 (+; Fф = 13,96)
НСР05 по фактору В:
4,10 (+; Fф = 54,68)
НСР05 по фактору
3-й день
4-й день
5-й день
Среднее по
С: 3,35 (+; Fф =
13,4
27,6
50,1
фактору С:
325,69)
Для В и С:
Для А и В:
Для А и С:
Для частных различий:
4,10 (+; Fф =
3,35 (-; Fф = 0,06)
4,10 (-; Fф = 1,94)
5,80
19,50)
Среднее по
фактору А:
Среднее по
фактору В:
российский изолят 32,6
ОИПС
34,8
иранский изолят
28,2
КМА
26,0
где, фактор А – изолят гриба; фактор В – среда выращивания; фактор С –
день учѐта.
4. Определение влияния минимальной среды («голодного» агара) на рост
и развитие конидий B. cinerea и F. oxysporum
Для изучения прорастания конидий грибов B. cinerea и F. oxysporum, в
аэробных условиях, исследуемые конидии поместили на минимальную среду
(«голодный» агар).
Было установлено, что при температуре 5-7º С инкубируемые на
минимальной среде конидии B. cinerea прорастали крайне слабо даже на 3
сутки инкубирования, а микроконидии F. oxysporum вовсе подверглись
разрушению уже на первый день учѐта (рис. 3). При температуре
инкубирования 20-22º С конидии B. cinerea и микроконидии F. oxysporum на
минимальной среде прорастали длинными хорошо ветвящимися гифами,
наблюдалась некоторая агрегация конидий этих грибов (рис. 4). Также на
проросших гифах микроконидий F. oxysporum фиксировали образование
вздутий, внешне схожих с макроконидиями данного гриба. Инкубируемые
при температуре 26-28º С конидии B. cinerea прорастали слабо. Также
наблюдалась агрегация их в цепочки (рис. 5). Микроконидии F. oxysporum в
данных условиях прорастали длинными слабо ветвящимися гифами, с
небольшими вздутиями, которые к 3 дню учѐта превращались в конидиеносцы
с макроконидиями (рис. 5).
9
Рисунок 3. Конидии B. cinerea (слева), а также полное отсутствие конидий
F. oxysporum (справа), после инкубирования их на минимальной среде
(«голодном» агаре) при температуре 5-7º С в течение 3 и 1 суток,
соответственно.
Рисунок 4. Конидии B. cinerea (слева) и F. oxysporum (справа), после
инкубирования их на минимальной среде («голодном» агаре) при температуре
20-22º С в течение 1 и 3 суток, соответственно.
Рисунок 5. Конидии B. cinerea (слева) и F. oxysporum (справа), после
инкубирования их на минимальной среде («голодном» агаре) при температуре
26-28º С в течение 3 суток.
10
5. Оценка лепестков и листьев различных сортов роз на
возможность заражения их B. cinerea
Проведѐнные исследования показали, что B. cinerea проявлял большую
агрессивность в отношении розово- и белоокращенных лепестков (ИИА равен
27,2 и 32,8 соответственно) и листьев растений, чьи лепестки были данного
цвета (ИИА равен 2,43 и 3,21 соответственно). Напротив, красно- и
жѐлтоокрашенные лепестки (ИИА равен 10, 8 и 7,3 соответственно) и листья
растений, чьи лепестки были данного цвета (ИИА равен 0,04 и 0,64
соответственно), инфицировались B. cinerea гораздо хуже (рис. 6, табл. 3).
Рисунок 6. Развитие фитопатогенного гриба B. cinerea на лепестках роз
жѐлтого, красного, розового и белого цветов.
Таблица 3. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. cinerea Pers. в отношении лепестков розы
Среднее по
фактору
А:
Среднее по
фактору В:
Dbp
3,9
Ksб
3,3
Brk
13,1
К
11,0
Среднее по
фактору
С:
Для А и В:
6,92 (+; Fф = 22,46)
JC
ж
7,3
HBk
13,3
I
9,7
LRб
32,8
II
12,9
б/п
14,4
Для А и С:
3,46 (+; Fф = 4,03)
SAк
10,8
LFp
27,2
III
23,3
с/п
14,7
Для В и С:
4,89 (+; Fф =
36,93)
НСР05 по фактору
А: 3,46 (+; Fф =
48,69)
НСР05 по фактору
В: 4,89 (+; Fф =
37,37)
НСР05 по фактору
С: 6,92 (-; Fф = 2,08)
Для частных различий:
9,79
где, фактор А – сорта розы и окраска их лепестков; фактор В – концентрация
суспензии конидий B. cinerea; фактор С – предварительное поранение
лепестка розы; К – контроль; I – 5000 конидий в 1 мл, II – 50000 конидий в 1
мл, III – 200000 конидий в 1 мл; б/п – без предварительного поранения, с/п – с
предварительным поранением.
Между тем, не было выявлено закономерностей развития B. cinerea,
исходя из концентрации его конидий в суспензии, а также поранения.
Зачастую, размер некроза при заражении суспензией конидий меньшей
концентрации (II – 50000 конидий в 1 мл) был выше, чем при более высоких
еѐ показателях (III – 200000 конидий в 1 мл). Процент развития некрозов на
11
лепестках в контроле, от естественного заражения грибом также был
соизмерим с размерами некрозов от искусственного заражения, а в ряде
вариантов превосходил их (рис. 7). Также при появлении спороношения на
лепестках, наблюдалась контаминация грибами из других родов Fusarium,
Mucor, Penicillium и др. При этом спороношение B. cinerea практически не
наблюдалось.
Рисунок 7. Развитие фитопатогенного гриба B. cinerea на лепестках роз, при
естественном (слева) и искусственном (справа) инфекционных фонах.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о невозможности и
нецелесообразности использования лепестков и листьев роз в качестве
растений-тестеров веществ различной природы.
6. Оценка ряда декоративных растений на возможность заражения их
A. alternata, B. sorokiniana, B. cinerea, F. oxysporum
Максимальную агрессивность гриб A. alternata проявлял на листьях
пеларгонии при инокуляции еѐ инфекционно-мецилиальным блоком и
суспензией конидий (рис. 8) с предварительным поранением ткани листа.
Рисунок 8. Инфицирование пеларгонии инфекционно-мицелиальным блоком
(слева) и суспензией конидий (справа) фитопатогенного гриба A. alternata.
12
Таблица 4. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба A. alternata в отношении ряда декоративных растений
Средние по
П
А
Ф
Ш
Гиб
НСР05 по фактору А:
фактору А:
5,03
3,45
0,38
0,02
1,08
0,80 (+; Fф = 13,5)
Средние по
с/п
б/п
фактору B:
3,73
0,17
Средние по
с/к
и.м.
НСР05 по фактору С:
фактору С:
3,57
2,47
0,26 (+;Fф = 4,6)
НСР05 по фактору В:
0,18 (+; Fф = 11,2)
Для А и В:
Для А и С:
Для В и С:
0,26 (+; Fф = 4,6)
0,80 (+; Fф = 10,3)
0,18 (+; Fф = 1,5)
Для частных различий:
14,3
где, фактор А – растение-тестер; фактор В – предварительное поранение
листа; фактор С – способ инокуляции патогена; с/к – суспензия конидий; и.м.
– инфекционно-мицелиальный блок.
Исходя из полученных данных (табл. 4) видно, что не все растения с
одинаковой интенсивностью поражались фитопатогенным грибом А.alternata.
Наибольшую агрессивность гриб проявлял на листьях пеларгонии (ИИА равен
5,03), а наименьшую – на листьях шлюмбергеры (ИИА равен 0,02). На фикусе
также была отмечена реакция сверхчувствительности (СВЧ).
Рисунок 9. Инфицирование шлюмбергеры без поранения (слева) и фикуса с
предварительным поранением листа (справа) инфекционно-мицельным блоком фитопатогенного гриба A. alternata.
Максимальную агрессивность гриб B. sorokiniana проявлял на листьях
пеларгонии инфицированной суспензией конидий с предварительным
поранением листа (рис. 10).
13
Рисунок 10. Инфицирование пеларгонии суспензией конидий
фитопатогенного гриба B. sorokiniana с поранением.
Таблица 5. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. sorokiniana в отношении ряда декоративных растений
Средние по
П
А
Ф
Ш
Гиб
фактору А:
1,25
0,28
0,0
0,67
0,0
Средние по
с/п
б/п
фактору B:
1,43
0,23
Средние по
с/к
и.м.
фактору С:
1,67
0,63
ля А и В:
0,42 (+; Fф =
21,42)
Для А и С:
0,24 (+; Fф =
29,81)
НСР05 по фактору А:
0,24 (+; Fф = 29,52)
НСР05 по фактору В:
0,42 (+; Fф = 29,25)
НСР05 по фактору С:
0,42 (+; Fф = 21,77)
Для В и С:
0,42 (+; Fф =
10,51)
Для частных различий:
0,60
где, фактор А – растение-тестер; фактор В – предварительное поранение
листа; фактор С – способ инокуляции патогена; с/к – суспензия конидий; и.м.
– инфекционно-мицелиальный блок.
Рисунок 11. Инфицирование фикуса инфекционно-мицелиальным блоком
фитопатогенного гриба B. sorokiniana с поранением.
14
Исходя из полученных данных (табл. 5) видно, что наибольшую
агрессивность гриб B. sorokiniana проявлял на листьях пеларгонии (ИИА
равен 1,25), а наименьшую – на листьях акалифы (ИИА равен 0,28). На
гибискусе, фикусе и шлюмбергере отмечалась реакция сверхчувствительности
(СВЧ) (рис. 11).
Максимальную агрессивность гриб B. cinerea проявлял на листьях
пеларгонии и акалифы при инфицировании их инфекционно-мицелиальным
блоком или суспензией конидий как при поранении, так и без поранения листа
(рис. 12).
Рисунок 12. Инфицирование пеларгонии (слева) и акалифы (справа)
суспензией конидий и инфекционно-мицелиальным блоком B. cinerea с
поранением.
Таблица 6. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. cinerea в отношении ряда декоративных растений
Средние по
П
А
Ф
Ш
Гиб
фактору А:
13,059
180,005
7,500
0,000
0,320
Средние по
с/п
б/п
фактору B:
67,605
62,115
Средние по
с/к
и.м.
фактору С:
3,251
163,986
Для А и В:
17,22 (+; Fф =
709,48)
Для А и С:
9,94 (-; Fф = 0,45)
НСР05 по фактору А:
9,94 (+; Fф = 680,93)
НСР05 по фактору В:
17,22 (+; Fф = 665,21)
НСР05 по фактору С:
17,22 (-; Fф = 0,71)
Для В и С:
17,22 (-; Fф = 0,56)
Для частных различий:
24,36
где, фактор А – растение-тестер; фактор В – предварительное поранение
листа; фактор С – способ инокуляции патогена; с/к – суспензия конидий; и.м.
– инфекционно-мицелиальный блок.
Исходя из полученных данных видно, что наибольшую агрессивность
гриб B. cinerea проявлял на листьях акалифы (ИИА равен 180) и пеларгонии
15
(ИИА равен 13), а наименьшую – на листьях гибискуса (ИИА равен 0,32). На
фикусе и шлюмбергере отмечены распространение гриба сапротрофно по
поверхности листа, а также реакция сверхчувствительности (СВЧ).
Максимальную агрессивность гриб F. oxysporum проявлял на листьях
пеларгонии и шлюмбергеры, как при инфицировании инфекционномицелиальным блоком, так и суспензией конидий с поранением листа (рис.
13).
Рисунок 13. Инфицирование пеларгонии (слева) и шлюмбергеры (справа)
инфекционно-мицелиальным блоком фитопатогенного гриба F. oxysporum с
поранением листа.
Таблица 7. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба F. oxysporum в отношении ряда декоративных растений
Средние по
П
А
Ф
Ш
Гиб
фактору А:
37,6
0,0
0,0
27,8
0,0
Средние по
с/п
б/п
фактору B:
52,6
10,2
Средние по
с/к
и.м.
фактору С:
48,0
27,4
Для А и В:
5,83 (+; Fф =
10,69)
Для А и С:
3,37 (+; Fф =
73,37)
НСР05 по фактору А:
3,37 (+; Fф = 113,80)
НСР05 по фактору В:
5,83 (+; Fф = 25,23)
НСР05 по фактору С:
5,83 (+; Fф = 35,06)
Для В и С:
5,83 (+; Fф = 4,91)
Для частных различий:
8,25
где, фактор А – растение-тестер; фактор В – предварительное поранение
листа; фактор С – способ инокуляции патогена; с/к – суспензия конидий; и.м.
– инфекционно-мицелиальный блок.
Исходя из полученных данных (табл. 7) видно, что наибольшую
агрессивность гриб проявлял на листьях пеларгонии (ИИА равен 37,6) и
шлюмбергеры (ИИА равен 27,8). Во всех остальных вариантах опыта, либо
отмечалась реакция сверхчувствительности (СВЧ), либо гриб F. oxysporum
развивался на поверхности листа сапротрофно (рис. 14).
16
Рисунок 14. Инфицирование фикуса (слева) и шлюмбергеры (справа)
инфекционно-мицелиальным блоком фитопатогенного гриба F. oxysporum с и
без поранения листа.
7. Оценка активности экстрактов растительного происхождения из
звездчатки средней и ежовника обыкновенного в отношении A. alternata,
B. sorokiniana, B. cinerea, F. oxysporum
В проведѐнных нами экспериментах экстракты растительного
происхождения из звездчатки средней и ежовника обыкновенного показали
разнонаправленные эффекты действия.
Экстракт из звездчатки средней оказывал ингибирующий эффект на
развитие A. alternata и B. cinerea (табл. 8). Причѐм, если в отношении A.
alternata ингибирующий эффект был слабо выражен, то в эксперименте с B.
cinerea итоговый индекс агрессивности вариантов опыта в 2-3 раз был ниже,
чем в его контроле.
Таблица 8. Значения итогового индекса агрессивности
фитопатогенного гриба B. cinerea Pers. при обработке экстрактом из
звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.)
Средние по фактору А:
Средние по фактору B:
К
2
1
0,5
0,25
1080 540 540 315
540
2
0
648
558
Для А и В:
33,86 (+; Fф = 36,16)
НСР05 по фактору А:
33,86 (+; Fф = 287,84)
НСР05 по фактору В:
53,53 (+; Fф = 36,16)
Для частных различий:
75,71
где, фактор А – концентрация экстракта, мг/мл; фактор В – экспозиция
экстракта с суспензией конидий гриба, ч; К – контроль; с/эксп – с
экспозицией; б/эксп – без экспозиции.
Был показан стимулирующий эффект действия экстракта из звездчатки
средней на развитие B. sorokiniana (табл. 9) и F. oxysporum (рис. 15). Причѐм,
как в случае с B. sorokiniana, так и в случае с F. oxysporum практически по
17
каждому из вариантов опыта итоговый индекс агрессивности был почти в 10
раз выше контрольного.
Таблица 9. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. sorokiniana Shoem. при обработке экстрактом из звездчатки средней
(Stellaria media (L.) Vill.)
Средние по фактору А:
К
2
1
0,5
0,25
7,84 52,50 76,25 75,00 76,25
Средние по фактору B:
2
0
45,95
52,61
Для А и В:
9,30 (-; Fф = 2,74)
НСР05 по фактору А:
9,30 (+; Fф = 42,41)
НСР05 по фактору В:
16,12 (-; Fф = 2,49)
Для частных различий:
22,79
где, фактор А – концентрация экстракта, мг/мл; фактор В – экспозиция
экстракта с суспензией конидий гриба, ч; К – контроль; с/эксп – с
экспозицией; б/эксп – без экспозиции.
Рисунок 15. Стимулирующий эффект экстракта из звездчатки средней на
фитопатогенный гриб F. oxysporum в концентрации 0,5 мг/мл (слева) без
предварительной его экспозиции с конидиями гриба и контрольный вариант
заражения данным грибом (справа).
Экстракт из ежовника обыкновенного показал разнонаправленный
эффект в зависимости от концентрации. Он ингибировал развитие B. cinerea в
концентрациях 2 и 0,25 мг/мл (рис. 16). Однако в концентрациях 1 и 0,5 мг/мл
этот же экстракт оказывал стимулирующее воздействие на данный гриб (табл.
10).
18
Таблица 10. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. cinerea Pers. при обработке экстрактом из ежовника обыкновенного
(Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.)
Средние по
К
2
1
0,5
0,25
фактору А:
360,0
564,0
195,0
143,8
652,5
Средние по
2
0
фактору B:
396,6
369,5
НСР05 по фактору А:
42,99 (+; Fф = 109,93)
НСР05 по фактору В:
67,97 (-; Fф = 2,03)
Для А и В:
42,99 (+; Fф = 254,92)
Для частных различий:
96,13
где, фактор А – концентрация экстракта, мг/мл; фактор В –
экспозиция экстракта с суспензией конидий гриба, ч; К – контроль; с/эксп – с
экспозицией; б/эксп – без экспозиции.
Рисунок 16. Ингибирующий эффект экстракта из ежовника обыкновенного на
фитопатогенный гриб B. cinerea в концентрации 2 мг/мл (слева) с
предварительной его экспозицией с конидиями гриба и контрольный вариант
заражения данным грибом (справа).
Влияние экстракта из ежовника обыкновенного на развитие
B. sorokiniana было разнонаправленным по каждому из вариантов опыта
(рис. 17). Следовательно, можно сделать вывод об отсутствии какого-либо
эффекта со стороны данного экстракта на этот гриб.
Рисунок 17. Разнонаправленный эффект экстракта из ежовника
обыкновенного на фитопатогенный гриб B. sorokiniana (слева направо:
контроль, 0,5 мг/мл, 1 мг/мл).
19
Экстракт из ежовника обыкновенного оказывал стимулирующий
эффект на развитие A. alternata и F. oxysporum. Причѐм, как в случае с A.
alternata, так и в случае с F. oxysporum по каждому из вариантов опыта
итоговый индекс агрессивности был в 2-20 раз выше контрольного.
Проведѐнные
исследования
показали,
что
агрессивность
фитопатогенных грибов, в большинстве случаев, была ниже при
предварительной экспозиции суспензии конидий с экстрактом, чем без неѐ,
либо оставалась практически на том же уровне.
8. Оценка бутонов петунии садовой на возможность заражения их
B. cinerea
Исходя из полученных данных (табл. 11) видно, что бутоны петунии
хорошо поражались фитопатогенным грибом B. cinerea в каждом варианте
инфицирования. Однако наибольшая агрессивность гриба проявилась в
варианте мелкодисперсного опрыскивания (мдо) (ИИА равен 180).
Таблица 11. Бальные значения основных критериев учѐта
искусственного инфицирования бутонов петунии фитопатогенным грибом
B. cinerea, а также показатель итогового индекса агрессивности
Вариант
опыта
П, б/п, К
П, с/п, К
П, мдо,
В.с.
П, с/к,
В.с.
П, и.м.,
В.с.
НСР05
ЧИ
РХ
РН
ИС
ИП-1
ИП-2
ЛП
ИА
ИИА
5
5
1
1
36
36
5
5
2
4
2
4
4
5
900
900
56,3
11,3
5
1
36
5
1
1
5
900
180
5
1
36
6
3
3
4
1080
30
5
1
36
6
2
2
3
1080
90
#
#
#
#
#
0,88
#
159,5
32,29
где, ЧИ – частота инфекции, РХ – размер хлороза, РН – размер некроза, ИС –
интенсивность спороношения, ИП-1 – инкубационный период 1, ИП-2 –
инкубационный период 2, ЛП – латентный период, ИА – индекс
агрессивности, ИИА – итоговый индекс агрессивности; П – петуния; б/п – без
предварительного поранения, с/п – с предварительным поранением; мдо –
мелкодисперсное опрыскивание, с/к – суспензия конидий, и.м. –
инфекционно-мицелиальный блок.
20
9. Оценка активности экстракта растительного происхождения из
звездчатки средней в отношении фитопатогенного гриба B. cinerea в
испытаниях in vitro и in vivo на петунии садовой
Растительный экстракт из звездчатки средней оказывал ингибирующий
эффект на развитие B. cinerea на петунии in vitro (рис. 18, табл. 12).
Рисунок 18. Ингибирующий эффект экстракта из звездчатки средней на
фитопатогенный гриб B. cinerea в концентрации 0,5 мг/мл (слева) с
предварительной его экспозицией с конидиями гриба и контрольный вариант
заражения данным грибом (справа).
Таблица 12. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. cinerea Pers. при обработке экстрактом из звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.) в опытах на петунии in vitro
Средние по
К
2
1
0,5
0,25
фактору А:
81,3
50,7
45,0
10,0
8,8
Средние по
2
0
фактору B:
41,5
50,8
НСР05 по фактору А:
9,19 (+; Fф = 41,28)
НСР05 по фактору В:
15,92 (+; Fф = 4,95)
Для А и В:
9,19 (+; Fф = 30,78)
Для частных различий:
22,51
где, фактор А – концентрация экстракта мг/мл; фактор В - экспозиция
экстракта с суспензией конидий гриба, ч.
В испытаниях in vivo влияние этого же экстракта на развитие B. cinerea
было разнонаправленным по каждому из вариантов опыта (табл. 13).
Следовательно, можно сделать вывод об отсутствии какого-либо эффекта со
стороны данного экстракта на этот гриб в испытаниях in vivo.
21
Таблица 13. Значения итогового индекса агрессивности фитопатогенного
гриба B. cinerea Pers. при обработке экстрактом из звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.) в опытах на петунии in vivo
Средние по
К
1
0,5
0,25
фактору А:
11,0
14,4
17,2
10,2
Средние по
Р
Ц
фактору B:
11,5
14,9
НСР05 по фактору А:
2,15 (+; Fф = 12,12)
НСР05 по фактору В:
3,04 (+; Fф = 13,50)
Для А и В:
2,15 (+; Fф = 5,61)
Для частных различий:
4,30
где, фактор А – концентрация экстракта мг/мл; фактор В – поражение
всего растения (Р) и его бутонов (Ц).
Выводы
1. Установлено, что изменение температуры, состава питательного
раствора и среды инкубирования существенно влияло на образование и
прорастание конидий грибных факультативных паразитов.
По
результатам
проведѐнных
исследований
количество
образовавшихся конидий A. alternata и B. cinerea было выше при 26-28º С, чем
при 20-22º С. Количество конидий гриба B. cinerea на картофельно-морковном
агаре было выше, чем на овсяной среде. Конидии изолятов A. alternata
сохраняли способность образовывать колонии после инкубирования их
маточной культуры в различных температурных условиях. Причѐм рост
колонии A. alternata был выше после инкубирования его маточной культуры
при -19 – -21° С или при 26-28° С, чем после инкубирования еѐ при 5-7° С или
при 18-20° С. В случае контаминации маточной культуры гриба, после еѐ
инкубирования при -19–-21°С, контаминация растущей колонии существенно
снижалась (особенно на овсяном агаре) по сравнению с инкубированием
маточной культуры при различных положительных температурах.
Помещѐнные на минимальную среду («голодный» агар) конидии B.
cinerea и F. oxysporum хорошо прорастали как при 20-22° С, так и при 26-28°
С. Между тем, конидии B. cinerea, инкубируемые при 5-7°С, прорастали
слабо, а конидии F. oxysporum в данных условиях разрушались. Также при
инкубировании конидий B. cinerea и F. oxysporum при 20-22° С и 26-28° С
наблюдалась агрегация их конидий между собой, а в случае с F. oxysporum
также происходило образование вздутий на проросших гифах, которые затем
преобразовывались в конидиеносцы с макроконидиями данного гриба.
2. Доказано, что из ряда исследованных декоративных растений
грибными факультативными паразитами в большей степени поражалась
пеларгония щитовидная (Pelargonium peltatum (L.) L’Her.), а в случае с
22
B. cinerea и F. oxysporum – акалифа гаитянская (Acalypha hispaniolae Urb.) и
шлюмбергера Бакли (Schlumbergera x buckleyi Hunt) соответственно.
Напротив, фикус Бенджамина (Ficus benjamina L.) и гибискус китайский
(Hibiscus rosa-sinensis L.) не поражались или поражались в незначительной
степени всеми протестированными грибами. Также при инфицировании
данных растений по всем тестируемым патогенам наблюдалась реакция
сверхчувсвительности, а также развитие мицелия грибов сапротрофно по
поверхности листьев. Установлено, что обязательным условием инокуляции
грибными факультативными паразитами растений являлось предварительное
поранение листьев. В большинстве проведѐнных нами опытов инокуляция
патогена суспензией конидий была эффективнее, чем инфекционномицелиальным блоком.
3. Выявлена разнонаправленная активность растительных экстрактов
из звездчатки средней (Stellaria media (L.) Vill.) и ежовника обыкновенного
(Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) по отношению к грибным факультативным
паразитам. Экстракт из звездчатки средней оказывал ингибирующий эффект
на проявление агрессивности A. alternata и B. cinerea, в то время как
стимулировал проявление агрессивности B. sorokiniana и F. oxysporum.
Экстракт из ежовника обыкновенного оказывал стимулирующий эффект на
проявление агрессивности A. alternata и F. oxysporum, а также на B. cinerea в
концентрациях 1 и 0,5 мг/мл. В концентрациях 2 и 0,25 мг/мл этот же экстракт
оказывал на B. cinerea ингибирующий эффект. Воздействие экстракта из
ежовника
обыкновенного
в
отношении
B.
sorokiniana
было
разнонаправленным. Следовательно, его эффективность по отношению к
данному патогену не установлена.
4. Установлено, что в условиях in vitro и in vivo поражение петунии
садовой фитопатогенным грибом B. cinerea достигало 100 % через неделю
после инокуляции. Максимальную агрессивность гриба на цветках петунии
садовой выявляли при инокуляции еѐ мелкодисперсным опрыскиванием
суспензии конидий гриба.
Показан ингибирующий эффект (снижение
итогового индекса агрессивности в 1,5-10 раз по сравнению с контролем)
действия экстракта из звездчатки средней при поражении B. cinerea петунией
садовой (Petunia х hybrida (Vilm.) Hort. in vitro, а также отсутствие какоголибо эффекта данного экстракта в испытаниях in vivo с этим патогеном.
23
Практические рекомендации
Использовать пеларгонию как универсальное тест-растение
для
исследований проявления агрессивности Alternaria alternata (Fr.) Keissl.,
Bipolaris sorokiniana Shoem., Botrytis cinerea Pers. и Fusarium oxysporum Schl. и
выявления стимулирующей или ингибирующей активности веществ
различной природы, доступных в ограниченных количествах, против данных
фитопатогенов.
Список публикационных работ по теме диссертации
1. Рогожин, Е. А. Биологическая активность пептидных экстрактов
лекарственных растений против фитопатогенных грибов и оомицетов /
Е. А. Рогожин, И. И. Тепкеева, Д. В. Зайцев, В. П. Демушкин, А. Н. Смирнов
// Доклады РАСХН. – 2011. – № 4. – С. 34-37.
2. Рогожин, Е. А. Микрометод определения фунгистатической активности
белков растительного происхождения [Сравнительное тестирование
активности 2S-альбуминов одуванчика в отношении ряда фитопатогенных
грибов] / Е. А. Рогожин, Д. В. Зайцев, А. Н. Смирнов // Известия ТСХА. –
2011. – № 5. – С. 79-84.
3. Золфагари, А. Фитофтороз и альтернариоз картофеля и томата при
аномальных погодных условиях в Московской области / А. Золфагари,
В. В. Антоненко, Д. В. Зайцев, А. А. Игнатенкова, А. Г. Мамонов,
Р. В. Пенкин, А. Ю. Поштаренко, А. Н. Смирнов // Защита и карантин
растений. – 2011. – № 12. – С. 40-42.
4. Зайцев, Д. В. Использование микологических технологий для оптимизации
тест-систем испытаний биологически активных веществ / Д. В. Зайцев,
А. Золфагари, Е. А. Рогожин // Междунар. науч. конф. молодых учѐных и
специалистов / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К. А. Тимирязева. – 2012. –
том 1. – С. 31-32.
5. Зайцев, Д. В. Оптимизация способности конидий фитопатогенного гриба
Alternaria alternata к образованию колонии, в зависимости от температурных
условий инкубирования и среды выращивания // Междунар. науч. конф.
молодых учѐных и специалистов, посвящ. 125-летию со дня рождения
академика Н.И. Вавилова / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К. А. Тимирязева.
– 2013. – С. 31-32.
6. Рогожин, Е. А. Методология оценки эффективности действия различных
веществ на грибы - факультативные паразиты - по прорастанию конидий /
Е. А. Рогожин, Д. В. Зайцев, А. Н. Смирнов // Доклады ТСХА / Рос. гос.
аграр. ун-т - МСХА им. К.А. Тимирязева. – 2011. – выпуск 283 часть 1. – С.
243-246.
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа