close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Структура и функция комплекса цитохрома c с кардиолипином.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
АЛЕКСЕЕВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ КОМПЛЕКСА ЦИТОХРОМА С
С КАРДИОЛИПИНОМ
03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Государственном учебно-научном учреждении Факультет
фундаментальной медицины Московского государственного университета
имени М.В.Ломоносова.
Научный руководитель:
кандидат химических наук, доцент
Проскурнина Елена Васильевна
Официальные оппоненты:
Красновский Александр Александрович – доктор биологических наук,
профессор, ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, заведующий
лабораторией биохимии синглетного кислорода.
Добрецов Геннадий Евгеньевич – доктор физико-математических наук,
профессор, член-корреспондент РАМН, ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России,
заведующий лабораторией биофизических методов диагностики.
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
химической физики им. Н.Н. Семенова РАН.
Защита состоится «
»
2013 года в
часов
на
заседании
диссертационного совета Д 208.057.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении науки ―Научно-исследовательский институт физикохимической медицины Федерального медико-биологического агентства‖ по
адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ
ФМБА России.
Автореферат разослан «__»____________2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук
Мурина М.А.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Программируемая смерть клеток (апоптоз) играет важную роль в
морфогенезе и в развитии патологических состояний. Центральным событием в
развитии апоптоза, как правило, является выход цитохрома с из митохондрий с
последующим запуском каскада апоптотических реакций в клетке. Выход
цитохрома с (Цит) становится возможным благодаря повреждению внутренней
мембраны в результате перекисного окисления липидов (Kagan et al., 2005),
при этом пусковым механизмом служит превращение цитохрома в пероксидазу
при его взаимодействии с кардиолипином (КЛ). К сожалению, как структура
комплекса цитохрома c c кардиолипином, так и механизм его пероксидазного
действия на органические молекулы, в том числе на липиды, пока мало
изучены. В данной работе проведено исследование структуры и состава
комплекса цитохрома с с кардиолипином, изучена пероксидазная функция
этого комплекса в разных условиях. Показано, что этот комплекс обладает
способностью разлагать липогидропероксиды с образованием пероксильных
радикалов
и
липопероксидазным
действием.
Исследовано
влияние
антиоксидантов на реакции, катализируемые комплексом Цит-КЛ. Полученные
результаты помогут в будущем разработать методы управления апоптозом, что
имеет большое значение для лечения ряда важнейших патологий.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса
Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и
липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных
данных и разработки новых аналитических методик. Для достижения этой цели
были поставлены следующие задачи:
1.
Определить состав и структуру комплекса цитохрома с с
кардиолипином.
2.
Изучить пероксидазную функцию комплекса цитохрома с с
кардиолипином и жирными кислотами.
3
3.
Исследовать взаимодействие цитохрома с и его комплекса с
кардиолипином с жирными кислотами, а так же влияние пероксида водорода на
данное взаимодействие.
4.
Исследовать влияние антиоксидантов на пероксидазную активность
комплекса Цит-КЛ и на взаимодействие цитохрома с и его комплекса с
кардиолипином с жирными кислотами.
Научная новизна исследования
В данной работе было показано, что цитохром с образует с
кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде.
Было определено молярное соотношение КЛ:Цит в комплексах, полученных
при различных значениях рН, и показано, что могут формироваться два
устойчивых комплекса, один в нейтральной, в другой – в кислой среде (при рН
меньше 5,5). Оценено значение растворимости. Показана возможность
перехода этого комплекса в гидрофобную среду и определен состав комплекса
в гидрофобной среде.
Впервые была изучена структура осадка комплекса Цит-КЛ при
различных рН среды методами малоуглового рентгеновского рассеяния.
Полученные данные подтвердили вывод о существовании двух типов
комплексов, имеющих разное соотношение КЛ:Цит и соответственно разный
диаметр наносфер, которые в водном растворе образуют микрокристаллы с
различными расстояниями между отражающими плоскостями. Определена
пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ при различных рН среды.
Впервые
методом
активированной
хемилюминесценции
показана
способность комплекса цитохрома с с липидами разлагать липогидропероксиды
с
образованием
свободных
липопероксильных
радикалов.
Показана
способность комплекса окислять жирную кислоту пероксидом водорода с
образованием липопероксильного радикала (липопероксидазная функция
комплекса).
Изучено влияние водорастворимых антиоксидантов на пероксидазную
активность комплекса цитохрома с с кардиолипином и на образование
4
липопероксильных радикалов при разложении гидропероксидов липидов
комплексом цитохрома с с линолевой кислотой (Цит-ЛК).
Практическое значение работы
Основным результатом работы является углубление фундаментальных
знаний о начальной стадии программируемой смерти клетки.
Данные о структуре комплекса цитохрома с с кардиолипином и
механизме реакций, которые он катализирует, имеют решающее значение для
контроля апоптоза с целью профилактики и лечения болезней человека.
Автором были разработаны или усовершенствованы ряд аналитических
хемилюминесцентных методик для определения антиоксидантной активности,
пероксидазной активности и количества липидных гидропероксидов в системе.
Все эти методы могут найти применение в лабораторной практике.
Полученные данные могут быть использованы при преподавании курсов
медицинской биофизики в медицинских вузах и университетах.
Положения, выносимые на защиту
1.
Комплекс Цит-КЛ представляет собой соединение определенного состава,
малорастворимое в воде и хорошо растворимое в гидрофобной среде,
причем состав комплекса и структура осадка зависит от рН среды.
2.
Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму
действия других пероксидаз; пероксидазная активность комплекса на два
порядка величины меньше активности пероксидазы из корней хрена.
Пероксидазной функцией также обладает комплекс цитохрома с с
линолевой кислотой.
3.
Комплексы цитохрома с с кардиолипином или с линолевой кислотой
катализируют реакцию разложения липидных гидропероксидов, при этом
образуются свободные радикалы и вторичные продукты перекисного
окисления. Было показано образование пероксильных радикалов при
окислении липидов пероксидом водорода, катализируемое комплексом
цитохрома с; таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает
липопероксидазной активностью.
5
4.
Антиоксиданты действуют на пероксидазную функцию Цит-КЛ путем
взаимодействия с продуктом реакции свободных радикалов со вторым
субстратом (люминолом). Антиоксиданты также действуют на реакции
образования липопероксильных радикалов при разложении липидных
гидропероксидов.
Внедрение результатов
Разработанные
хемилюминесцентные
методики
определения
антиоксидантной активности, пероксидазной активности и определения
липидных гидропероксидов в водной среде являются частью практического
курса
кафедры
медицины
медицинской
Московского
биофизики
факультета
государственного
фундаментальной
университета
имени
М.В.Ломоносова. Полученные данные о структуре и свойствах комплекса ЦитКЛ являются составной частью лекционных курсов указанной кафедры.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных научных работ, в том
числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личное участие автора
Все данные в диссертации, были получены лично автором; в немногих
случаях, когда в работе участвовали также и другие сотрудники, это
специально оговорено в тексте диссертации. С этой целью автор освоил все
используемые в работе методы. Лично автором проведена также и обработка и
статистический анализ результатов.
Апробация работы
Основные результаты диссертации были представлены в устных
докладах, а также тезисах трех конференций, среди которых: Пироговская
студенческая
научная
медицинская
конференция
(Москва,
2011);
9-я
Международная специализированная выставка по аналитической химии
«Аналитика Экспо» (Москва, 2011); научный Симпозиум с международным
участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012).
6
Диссертационная работа апробирована 17 сентября 2012 г.
совместном
заседании
кафедры
медицинской
биофизики
на
Факультета
фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова и кафедры общей и
медицинской биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава
РФ.
Структура и объем работы
Диссертация
состоит из введения, обзора литературы, описания
материалов и методов, 4 главы результатов и обсуждения результатов, выводов
и списка цитируемой литературы, включающего 133 источника. Работа
выполнена на 128 страницах машинописного текста. Иллюстрированный
материал представлен 88 рисунками и 5 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали трис-HCl, KH2PO4, KOH, Na2SO3, калия
гидрофталат, Н2О2, хлороформ, н-гексан, метанол, FeSO4 (все не ниже х.ч.),
цитохром с из сердца лошади, линолевая кислота, линоленовая кислота (все
фирмы ―Sigma‖), 1,1',2,2'-тетраолеилкардиолипин (КЛ) (―Avanti Polar Lipids‖),
соевый
лецитин
(―ICN
Biochemicals‖),
люминол,
2,2'-азо-бис(2-
амидинопропан)гидрохлорид (АБАП), пероксидаза из корней хрена (ПХ),
трет-бутилгидропероксид (все фирмы ―Fluka‖), кумарин С-525 ("АльфаАконис"), антиоксиданты: тролокс (―Aldrich‖), кверцетин, аскорбат натрия (все
фирмы ―Fluka‖).
Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра
SPECORD 200 (―Analytic Jena‖, Германия). Измерения проводили в стеклянных
и пластиковых кюветах с длиной оптического пути 1,00 см.
Для
измерения
хемилюминесценции
(ХЛ)
использовали
хемилюминометр SmartLum-5773 (―ИнтерОптика-С‖, Россия).
Измерения интенсивности малоуглового рассеяния проводились при
фиксированной длине волны излучения λ = 0,1542 нм (CuKα – линия
7
острофокусной
трубки
ISO-DEBYEFLEX 3003
с медным анодом), и
коллимационной системой Кратки.
Все измерения проводили при комнатной температуре 22°С.
Математическое моделирование
Для изучения механизма хемилюминесцентных реакций использовали
подход,
основанный
на
математическом
моделировании
кинетики
хемилюминесцентной кривой. Математическое моделирование производили
при помощи программы ―Kinetic Analyser‖ (автор Д.Ю.Измайлов) путем
построения теоретических кинетических кривых при заданных константах
скоростей и начальных концентрациях и сопоставления с экспериментальными
зависимостями.
Статистический анализ
Данные представлены в виде среднего значения M и погрешности δ (M±
δ). Погрешность δ рассчитывали по формуле: δ = t(p,f)·SD/√n, где t(p,f) –
коэффициент Стьюдента, p – доверительная вероятность, где n – число
измерений, f – число степеней свободы (f=n-1). Относительное стандартное
отклонение sr рассчитывали по формуле: sr=SD/M. Предел обнаружения cmin
рассчитывали по формуле: cmin=3∙SD0/k, где SD0 – стандартное отклонение
фонового сигнала, k – коэффициент чувствительности.
За коэффициент
чувствительности k принимали коэффициент наклона градуировочной прямой.
Линеаризацию данных проводили с использованием метода наименьших
квадратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I.
Исследование структуры комплекса Цит-КЛ
Определение состава осадка комплекса Цит-КЛ и его растворимости
К известному количеству цитохрома с добавляли известные разные
количества кардиолипина, при этом кардиолипин связывался с белком с
образованием
осадка.
После
добавления
кардолипина
раствор
центрифугировали, супернатант отделяли от осадка и измеряли спектр
поглощения в диапазоне 360–460 нм, в котором поглощает цитохром с или его
комплекс (полоса Соре 409 нм). Концентрация цитохрома с в растворе линейно
8
уменьшалась в зависимости от количества добавленного кардиолипина до
момента, когда осадок переставал образовываться, а дальнейшее добавление
кардиолипина приводило к увеличению экстинкции за счет светорассеяния
(рис. 1). В точке А (рис. 1), по всей видимости, присутствует комплекс в
растворенном виде, таким образом, по оптической плотности в точке А может
c (Цит), мкМ
быть оценена молекулярная растворимость комплекса.
с(КЛ):с(Цит) = 59
А
c (КЛ), мкМ
Рис.
1.
Определение
состава
комплекса
Цит-КЛ
методом
спектрофотометрического титрования при рН 7,4. Добавление 1 мМ кардиолипина
каждый раз связывает 17 мкМ цитохрома с с образованием осадка. Экстраполяция
полученной зависимости на ось абсцисс дает количество кардиолипина, полностью
связывающего цитохром с и позволяет рассчитать стехиометрическое соотношение в
осадке. В точке А добавление КЛ не приводит к дальнейшему образованию осадка,
поглощение, по всей вероятности, обусловлено растворимой формой комплекса.
Предполагаемая схема образования комплекса (без учета протонов):
Цит + nКЛ ↔Цит-КЛn (водн) ↔ Цит-КЛn↓
(схема 1)
Существование в водной фазе комплекса подтверждено наличием у
раствора над осадком пероксидазной активности, характерной для комплекса
Цит-КЛ, но не для цитохрома с.
При различных значениях рН установлен стехиометрический состав
комплекса и рассчитаны значения растворимости (табл. 1).
9
Таблица 1. Растворимость S и состав комплекса Цит-КЛ, полученного при различных
значениях рН в водной среде.
Буферный
КН2PO4
КН2PO4
КН2PO4
КН2PO4
Фталатный
раствор
20 мМ
20 мМ
20 мМ
20 мМ
50 мМ
рН
7,4
6,5
5,5
4,1
3,7
КЛ:Цит
59±7
38±5
13±3
14±3
13±4
32
28
—
—
S, мкмоль/л 31
Таким образом, в нейтральной среде (рН 7,4) вокруг молекулы цитохрома
с координируется 59±7 молекул кардиолипина. Эта величина согласуется с
вышеизложенной
гипотезой
о
строении
комплекса
и
подтверждается
простейшими расчетами. Глобула этого белка имеет форму эллипсоида с
соотношением осей 4,0 × 3,5 × 3,0 нм, площадь поверхности составляет
примерно 40 нм2. Данные о размерах фосфолипидной головки кардиолипина
варьируют, но поперечное сечение трех жирнокислотных цепей (четвертая
погружена вглубь цитохрома) составляет примерно 0,6 нм2. Таким образом, на
поверхности белка при плотной упаковке могут расположиться до 65 молекул
кардиолипина.
При понижении рН среды от 7,4 до 5,5 соотношение КЛ:Цит
уменьшается, и далее остается постоянным, что, вероятно, связано с
протонированием кислотных групп кардиолипина (pКа = 6 (Haines, 2002)) и
ослабеванием электростатических взаимодействий.
Определение состава комплекса Цит-КЛ в гидрофобной среде
Методом
спектрофотометрии
показано,
что
цитохром
с
при
взаимодействии с кардиолипином экстрагируется в гидрофобную среду в виде
комплекса
определенного
кардиолипином
состава.
различного
Готовили
состава
10
и
смеси
цитохрома
экстрагировали
в
с
с
смесь
метанол:хлороформ = 1:2 по объему, далее измеряли оптическую плотность
гидрофобной фазы. При увеличении соотношения КЛ:Цит оптическая
плотность
гидрофобной
фазы
линейно
увеличивалась
(рис.
2),
что
свидетельствовало об увеличении в ней концентрации комплекса.
Рис. 2. Зависимость концентрации
c (ЦитС), мкМ
перешедшего
в
гидрофобную
среду
цитохрома с от концентрации КЛ. рН
исходного водного раствора 7,4 (r =
0,988).
c (КЛ), мкМ
По тангенсу угла наклона прямой на рис. 2 определено соотношение КЛ:
Цит. При рН 7,4 эта величина составляет 57±6, что хорошо согласуется
величиной, полученной для осадка (59±7). Таким образом, экстрагируется
именно комплекс цитохрома с с кардиолипином. Полученные данные также
свидетельствуют в пользу гидрофобности комплекса, в молекуле которого
жирнокислотные хвосты кардиолипина направлены наружу, а гидрофильные
головки внутрь.
Исследование кристаллической структуры осадка комплекса Цит-КЛ
Цитохром с в присутствии кардиолипина образует нерастворимый в
одной среде комплекс. Исследование осадка комплекса Цит-КЛ методом
малоуглового рентгеновского рассеяния показало, что при рН 7,4 осадок
представляет собой микрокристаллическую структуру с межплоскостным
расстоянием между кристаллами 10,5±0,4 нм. При рН 3,7 межплоскостные
расстояния равны 7,0±0,3 нм.
Полученные результаты позволяют предположить пространственное
строение комплекса. При высоком содержании липида в комплексе (рН 7,4),
липидные молекулы ориентированы перпендикулярно поверхности белка (рис.
3А). Эта гипотеза подтверждается расчетами. Если принять диаметр молекулы
11
цитохрома с 5 нм (свободный цитохром с имеет диаметр глобулы 4 нм, но
данный параметр увеличивается при внедрении жирнокислотных остатков
кардиолипина внутрь глобулы), а длину молекулы кардиолипина 3 нм, то при
перпендикулярном расположении кардиолипина к поверхности получим
диаметр глобулы около 11 нм. При снижении числа молекул липида,
окружающих белок, что происходит при кислых рН, липидные молекулы
находятся под некоторым углом к поверхности белка, таким образом, размер
частицы комплекса Цит-КЛ уменьшается (рис. 3Б).
ЦитС
Б
А
Рис. 3. Предполагаемое строение комплекса Цит-КЛ при нейтральных (А)
(Владимиров с сотр., 2011) и кислых рН (Б). Частица комплекса состоит из белкового ядра
и липидной оболочки. При нейтральных рН реализуется плотная упаковка липидных молекул,
а липидные хвосты ориентированы перпендикулярно поверхности; при низких рН молекулы
липида координированы неплотно, и хвосты располагаются под углом к поверхности, при
этом диаметр частицы комплекса уменьшается.
II. Исследование пероксидазной функции комплекса Цит-КЛ
Для исследования пероксидазной функции изучена активность комплекса
в присутствии органического субстрата (люминол) при различных условиях
протекания реакций.
Влияние рН и концентраций субстратов на пероксидазную активность
комплекса Цит-КЛ
Исследовалось влияние pH на интенсивность хемилюминесценции при
окислении люминола в системе с Цит-КЛ при различных соотношениях
12
КЛ:Цит. Зависимость максимума амплитуды хемилюминесценции от pH имеет
нелинейный S-образный характер с точкой перегиба при рН около 7 (рис. 4).
При повышении ионной силы пероксидазная активность незначительно
возрастает. При постоянных значениях рН увеличение соотношения КЛ:Цит
приводило к возрастанию пероксидазной активности.
35
Imax, В
Рис.
1
30
2
3
25
20
максимума интенсивности ХЛ от
рН при различных соотношениях
концентраций КЛ-Цит: 1 – 120; 2 –
4
15
Зависимости
4.
60; 3 – 40; 4 – 30; 5 – 14. Во всех 20
10
мМ фосфатный буферный раствор.
5
0
4
5
6
7
8
рН
9
Было изучено влияние количества добавляемого пероксида водорода на
интенсивность хемилюминесценции. В отсутствие Н2О2 хемилюминесценция
не наблюдается. Добавление Н2О2 в систему приводит к появлению
хемилюминесценции, пропорциональной количеству введенного H2O2, при
этом сама форма кривых хемилюминесценции почти не изменяется,
Аналогичные кривые были получены для пероксидазы из корней хрена.
Зависимость максимальной интенсивности (амплитуды) хемилюминесценции
от концентрации Н2О2 была линейной при малых концентрациях, причем эта
зависимость имеет такой же наклон, как и в системе с пероксидазой из корней
хрена.
Влияние
концентрации
люминола
на
интенсивность
хемилюминесценции может быть описано кривой с насыщением.
Полученные
результаты
позволяют
предположить,
что
механизм
окисления органического субстрата комплексом Цит-КЛ в целом соответствует
механизму действия известных пероксидаз. По аналогии с известными
реакциями пероксидаз и на основании экспериментальных данных была
предложена следующая схема (схема 2) реакций окисления люминола в
системе Цит-КЛ:
13
Схема 2
1)
Цит + КЛ → Е
(1)
2)
Е + H2O2 → С1 + Н2О
(2)
3)
С1 + Lum → С2 + Lum*
(3)
4)
С2 + Lum → Е + Lum* + H2O
(4)
5)
Lum* → P + hν
(5)
Математическое моделирование механизма пероксидазного действия
комплекса Цит-КЛ
Было проведено математическое моделирование нестационарной
кинетики хемилюминесценции в системе Цит-КЛ/H2O2/органический субстрат
(люминол) на основании экспериментальных кинетических кривых (рис 5А).
14
12
10
8
6
4
2
0
0
1
2
3
Время, мин
4
5
Б
Скорость реакции, мкМ/мин
А
16
Iхл, В
6
Время, мин
Рис. 5. А – Экспериментальная кинетика хемилюминесценции системы, состоящей из
10 мкМ Н2О2, 80 мкМ люминола и различных концентраций комплекса Цит-КЛ – 1, 2.5, 5,
7.5 и 10 мкМ; Б – результаты математического моделирования экспериментальных кривых
при использовании схемы 2 и 3 и констант скоростей реакций для схемы 3.
В процессе работы моделировали возможные схемы реакций, в том числе
схему 2. В целом, эта схема реакций подтвердилась, поскольку она позволила
смоделировать
экспериментальную
кинетику
хемилюминесценции,
наблюдаемую при различных условиях. Однако точный подбор всех пяти
констант скоростей реакции оказался практически невозможным из-за того, что
кинетика зависит от наиболее медленных звеньев в цепи последовательных
реакций, а изменение скорости быстрых звеньев в широких пределах на
кинетику процесса в целом влияния практически не оказывает. В этом смысле
предложенная схема 2 в двух отношениях является избыточной. Прежде всего,
14
очень велика скорость реакции 1 (образование комплекса Цит-КЛ) и можно
считать, что в присутствии всех компонентов системы сразу начинается
реакция 2 и последующие на схеме 2. Реакции 3 и 4 протекают последовательно
и приводят к восстановлению исходного комплекса Цит-КЛ и образованию
электронно-возбужденного продукта люминола, поэтому они могут быть
описаны одной общей реакцией. Таким образом, можно упростить схему 2 до
трех реакций (схема 3). В этом случае константы скоростей всех трех реакций
удалось подобрать с достаточной точностью.
Схема 3
1) Е + H2O2 → С1 + Н2О
k1 = 0,3 мкМ─1×мин─1
2) С1 + Lum → Е + Lum*
k2 = 0,002 мкМ─1×мин─1
3) Lum* → P + hν
k3 = 9 мин─1
Расчеты, проведенные с использованием данной схемы и приведенных
констант скоростей дают кривые, весьма сходные с экспериментальными (Рис.
5Б).
Сравнение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ с активностью
пероксидазы из корней хрена
Кривые хемилюминесценции при окислении люминола пероксидом в
присутствии Цит-КЛ или в присутствии «классической» пероксидазы из корней
хрена (ПХ) были очень похожи по форме, что вполне объяснимо сходством
механизмов пероксидазного цикла в этих двух случаях. Нами было проведено
сравнение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ по отношению к ПХ и
оказалось, что при молярном соотношении КЛ:Цит = 30 комплекс Цит-КЛ в
416 раз менее активен, чем ПХ.
Действие антиоксидантов на пероксидазную активность Цит-КЛ
Влияние антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса ЦитКЛ изучали с помощью разработанной хемилюминесцентной методики. В
качестве модельных антиоксидантов использовали тролокс (водорастворимый
аналог витамина Е), аскорбат натрия и кверцетин. Хемилюминесцентные
кривые, полученные при добавлении разных количеств тролокса в систему
Цит-КЛ/Н2О2/люминол, показаны на рис. 6. После добавления антиоксиданта
15
хемилюминесценция развивается с некоторой задержкой (рис. 6А); при этом
длительность латентного периода пропорциональна количеству антиоксиданта
(рис. 6Б).
14
А
0
Iхл, В
12
0,1
10
Б
2500
2000
S, В*мин
0,2
8
1500
0,3
6
1000
0,4
4
0,5
2
500
0
0
0
1
2
3
4
5
6
Время, мин
7
8
9
0
10
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
с тролокса, мкМ
0,6
Рис. 6. Влияние количества добавленного антиоксиданта (тролокса) на кинетику
развития ХЛ в системе, состоящей из 80 мкМ люминола, 5 мкМ Цит, 150 мкМ КЛ, 10 мкМ
Н2О2;концентрации тролокса указаны на рисунке в мкМ (А). Зависимость площади под
кривой хемилюминесценции от концентрации тролокса (r=0,967) (Б).
Аналогичные результаты были получены для аскорбата натрия и
кверцетина.
Сходное
действие
антиоксиданты
оказывали
на
систему
ПХ/H2O2/люминол, а также на хемилюминесцентную систему, в которой
генератором
свободных
радикалов
является
2,2'-азо-бис(2-
амидинопропан)гидрохлорид (АБАП), а активатором хемилюминесценции
служил люминол. Во всех трех указанных системах каждый из антиоксидантов
действовал примерно в одних и тех же концентрациях, а хемилюминесцентные
кривые имели схожую кинетику. Можно предположить, что мишенью действия
изученных антиоксидантов являются не первичные свободные радикалы,
образующиеся
при
разложении
АБАП
или
взаимодействии
H2O2
с
гемопротеидом (разные в этих случаях), а продукт их взаимодействия с
люминолом, вероятно, радикал люминола, который везде один и тот же.
Математическое моделирование действия антиоксидантов
Механизм действия антиоксидантов на кинетику хемилюминесценции в
системе АБАП/люминол был смоделирован с использованием компьютерной
программы Kinetic Analyser. На рис. 7 на экспериментальные кривые наложены
16
кривые, полученные в результате математического моделирования. Видно, что
формы кривых близки при всех исследованных концентрациях антиоксиданта –
тролокса.
Iхл, В
0
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Время, мин
Рис. 7. Кинетические кривые, рассчитанные при помощи
моделирования
и
экспериментальные
данные
с
математического
антиоксидантом
–
тролоксом.
Концентрации реагентов: АБАП – 3 мМ, люминол – 10 мкМ, концентрации тролокса (мкМ)
указаны на рисунке.
Моделирование осуществляли по следующей схеме реакций:
Схема 4
1) AБАП → R + R
k1=1,7·10-5 мин─1
2) R + Lum → Lum*
k2=7·105 мкМ─1×мин─1
3) Lum* + тролокс → P
k3=3,9·109 мкМ─1×мин─1
Можно
видеть,
что
результаты
моделирования
согласуются
с
предположением, что антиоксидант действует на продукт взаимодействия
свободных радикалов с люминолом (Lum*).
III. Образование липопероксильных радикалов при окислении
липидов в присутствии цитохрома с и комплекса Цит-КЛ
В этих исследованиях в качестве липидного субстрата использовали
линолевую
кислоту. Было показано, что при взаимодействии цитохрома с
линолевой кислотой образуется осадок, как и в случае с кардиолипином. В
расчете на одинаковое количество цитохрома с этот осадок обладал
пероксидазной активностью, даже большей, чем комплекс Цит-КЛ. Таким
образом, в наших опытах с линолевой кислотой последняя играла роль не
17
только субстрата, но и молекулы, образующей с цитохромом с комплекс (ЦитЛК), по свойствам и функции аналогичный комплексу Цит-КЛ. В качестве
активатора хемилюминесценции во всех экспериментах использовали кумарин
С-525,
селективно
усиливающий
свечение
при
взаимодействии
липипероксильных радикалов (LOO•).
При добавлении как цитохрома с, так и комплекса Цит-КЛ к
полиненасыщенной жирной кислоте (обозначим как LH), содержащей
некоторое количество гидропероксидов (LOOH), наблюдалась вспышка
хемилюминесценции, свидетельствующая о появлении радикалов LOO• в
системе.
Было
показано,
что
амплитуда
и
светосумма
вспышки
хемилюминесценции определяются количеством LOOH в системе. Мы
готовили растворы линолевой кислоты с разным количеством гидропероксидов
путем продувания воздуха через раствор в течение разного времени.
Количество гидропероксидов определяли методом ХЛ, при котором в качестве
внутреннего
известной
стандарта
служили
концентрации.
Было
растворы
показано,
трет-бутилгидропероксида
что
светосумма
вспышки
хемилюминесценции прямо пропорциональна количеству LOOH в системе
(рис. 8).
Цит-Кл
Рис.
Цит
в
8.
Зависимость
светосуммы
вспышки хемилюминесценции в системе с
Цит+линолевая кислота, либо Цит-КЛ +
линолевая
кислота
от
количества
гидропероксидов в линолевой кислоте.
Было показано, что после взаимодействия цитохромом с липидные
гидропероксиды в линолевой кислоте почти полностью исчезают.
Оптические спектры поглощения линолевой кислоты в гептане после ее
взаимодействия с цитохромом с и с Цит-КЛ свидетельствуют об образовании
триеновых
конъюгатов
(поглощение
18
при
278
нм)
и
вторичных
кислородосодержащих продуктов перекисного окисления липидов (максимумы
поглощения 257 и 267 нм) (рис. 9).
278 нм
А
267 нм
257 нм
3
2
1
λ, нм
Рис. 9. Спектры поглощения в УФ области: 1 – линолевой кислота, 2 – линолевой
кислоты после взаимодействия с комплексом Цит-КЛ, 3 – линолевой кислоты после
взаимодействия с Цит. Концентрации реагентов: линолевая кислота – 4 мМ, Цит – 20 мкМ,
КЛ – 600 мкМ. На рисунке вертикальными линиями обозначены основные полосы поглощения
с указанием их длин волн.
На
основании
(Владимиров
с
полученных
сотр.,
1972)
результатов
была
и
литературных
предположена
схема
данных
разложения
липогидропероксида LOOH с образованием радикалов LOO• и вторичных
продуктов липопероксидации под действием комплекса Цит-ЛК (схема 5).
Схема 5
1) LOOH + Цит-ЛК → LO• + C2
2) LOOH + С2 + → LO• + C1
3) LO• + LH → LOH + L•
4) L• + O2 → LOO• → хемилюминесценция в присутствии C-525
5) LOO• + LOOH → вторичные продукты липопероксидации
В результате разложения LOOH происходит разрушение гемопротеина
через стадию его окисления (C1) и образование пероксил-радикалов LOO•, часть
из которых атакует липогидропероксиды с образованием вторичных продуктов
окисления липидов.
19
В следующей серии экспериментов было показано увеличение количества
липопероксильных радикалов (светосуммы хемилюминеценции) при введении
пероксида водорода в систему, содержащую линолевую кислоту, цитохром с и
кумарин С-525. При этом концентрация пероксида водорода была в 6,5 раз
меньше, чем содержание липидных гидропероксидов в линолевой кислоте, хотя
в присутствии H2O2 светосумма ХЛ увеличивалась вдвое. Данный факт говорит
о том, что Цит-ЛК проявляет липопероксидазную активность, а образование
дополнительных липопероксильных радикалов можно объяснить, предположив
схему реакций 6:
Схема 6
1)
Цит + ЛК → Цит-ЛК
2)
Цит-ЛК + Н2О2 → С1 + H2O
3)
С1 + LH → C2 + L•
4)
C2 + LH → Е + L• + H2O
5)
L •+ O2 → LOO •
Таким образом, одна молекула пероксида водорода порождает два
липидных
алкил-радикала
(реакции
3
и
4)
и,
следовательно,
два
липопероксильных радикала в реакции 5.
Действие антиоксидантов на взаимодействие цитохрома с с жирными
кислотами
Введение в систему антиоксиданта тролокса приводило к уменьшению
интенсивности вспышки ХЛ, что говорит о его взаимодействии с радикалами
LOO
•
(рис. 10). При этом антиоксидантное действие тролокс оказывал при
концентрациях 30-100 мкМ, что на два порядка больше концентраций,
оказывающих действие на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ,
измеренную по хемилюминесценции в присутствии люминола. Причина этого,
вероятно, заключается в том, что в водной среде хорошо растворимый в воде
тролокс легко реагирует с радикалами люминола, а при разложении липидных
гидропероксидов
взаимодействие
антиоксиданта
с
радикалами
LOO●,
образующимися в липидной фазе, ограничено плохой растворимостью тролокса
в липидах.
20
Iхл, В
0 мМ
1 мкМ
Линолевая кислота,
кумарин С-525,
тролокс
Рис.
10.
тролокса
30 мкМ
указаны
50 мкМ
Действие
(концентрации
на
рисунке)
на
интенсивность вспышки ХЛ в
80 мкМ
Цит 5мкМ
системах, состоящих из 5 мкМ
100 мкМ
Цит, 1 мМ линолевой кислоты,
20 мкМ кумарина С-525.
Время, мин
ВЫВОДЫ
1)
Цитохром с, взаимодействуя с кардиолипином в водной среде, образует
кристаллический осадок, межплоскостные размеры которого зависят от рН
(10,5 нм при рН 7,4 и 7,0 нм при рН 3,7). Осадок частично растворим в воде,
причем в водной фазе присутствует молекулярная форма комплекса
(растворимость при рН 7,4 составляет около 30 мкмоль/л). Предположительно,
молекулы комплекса состоят из белка, окруженного липидной оболочкой,
причем гидрофильные головки липида направлены в сторону белка, а
гидрофобные цепи наружу. При нейтральных рН реализуется плотная упаковка
липидных молекул, а липидные хвосты ориентированы перпендикулярно
поверхности; при низких рН молекулы липида координированы неплотно, и
хвосты располагаются под углом к поверхности, при этом размер частицы
комплекса уменьшается.
2)
Комплекс Цит-КЛ характеризуется определенным составом, зависящим от
рН (соотношение КЛ:Цит составляет 59±7 при рН 7,4 и 13±4 при рН= 3,7).
Комплекс Цит-КЛ может быть переведен в гидрофобную фазу, причем
стехиометрический состав комплекса аналогичен составу комплекса в осадке.
3)
Пероксидазная активность Цит-КЛ зависит от рН, особенно сильно в
области нейтральных значений. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ
аналогичен механизму действия других известных пероксидаз, но активность
Цит-КЛ в 416 раз меньше, чем активность пероксидазы хрена. Пероксидазной
функцией также обладает комплекс цитохрома с с линолевой кислотой.
21
4)
Комплексы Цит-КЛ и Цит-ЛК катализируют реакции разложения
липидных гидропероксидов, при этом расходуются липидные гидропероксиды
и накапливаются вторичные продукты перекисного окисления. В результате
разложения LOOH происходит разрушение гемопротеина через стадию его
окисления и образование пероксил-радикалов LOO•, часть из которых атакует
липогидропероксиды с образованием вторичных продуктов окисления липидов.
В окислении полиненасыщенных жирных кислот, катализируемых комплексом
Цит-ЛК, участвует пероксид водорода, таким образом, комплекс цитохрома с с
липидами обладает липопероксидазной активностью.
5)
Антиоксиданты
действуют
на
пероксидазную
функцию
комплекса
цитохрома с с кардиолипином путем их взаимодействия с продуктом окисления
второго субстрата (люминола). Антиоксиданты действуют также и на реакции
окисления
липидов,
катализируемые
Цит-ЛК,
причем
антиоксидантное
действие проявляется при концентрациях, на два порядка больших, чем при
действии тех же антиоксидантов на пероксидазную активность Цит-КЛ по
отношению к люминолу.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
Алексеев А.В., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Определение
антиоксидантов
методом
активированной
хемилюминесценции
с
использованием 2,2′-азо-бис(2-амидинпропана) // Вест. Моск. Ун-та. сер. 2.
Химия. 2012. Т. 53. № 3: 187-193.
2.
Алексеев А.В. Разработка методики определения антиоксидантной
емкости биологических жидкостей // Вестник РГМУ. 2012. №1: 225.
3.
Проскурнина Е.В., Жидкова Т.В., Алексеев А.В., Демин Е.М., Измайлов
Д.Ю., Владимиров Ю.А., Хемилюминесценция как аналитический метод в
медико-биологических
исследованиях.
Тезисы
докладов
к
семинарам
«Химический анализ медицинских объектов», Москва, 2011. С. 34–37.
4.
Проскурнина Е.В., Алексеев А.В., Жидкова Т.В., Образцов И.В.,
Полимова А.М., Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А. Хемилюминесцентные
методы клинической лабораторной диагностики. Научный симпозиум с
22
международным участием «Проблемы медицинской биофизики». Материалы
конференции, Москва, 2012. С. 36.
5.
Алексеев
А.В.,
Проскурнина
Е.В.,
Владимиров
Ю.А.
Хемилюминесцентное определение антиоксидантов и гидроперекисей липидов.
Научный симпозиум с международным участием «Проблемы медицинской
биофизики». Материалы конференции, Москва, 2012. С. 51.
6.
Викулина А.С., Проскурнина Е.В., Алексеев А.В., Владимиров Ю.А.
Определение пероксидаз в биологических системах хемилюминесцентным
методом. Научный симпозиум с международным участием «Проблемы
медицинской биофизики». Материалы конференции, Москва, 2012. С. 60.
23
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
22
Размер файла
1 061 Кб
Теги
комплекс, структура, кардиолипином, функции, цитохрома
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа