close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

ADMA-eNOS-детерминированные пути фармакологической коррекции гестоза.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Гуреев Владимир Владимирович
ADMA-eNOS-детерминированные пути
фармакологической коррекции гестоза
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
доктора медицинских наук
Москва - 2013
Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава РФ и ФГАОУ ВПО «Белгородский
государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки РФ
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор Покровский Михаил Владимирович
Официальные оппоненты:
Тюренков Иван Николаевич, член-корреспондент РАМН, доктор
медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, заведующий кафедрой
фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей
Гуськова Татьяна Анатольевна, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор,
ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБФ России, главный научный
сотрудник лаборатории клинической фармакологии
Резников Константин Михайлович, заслуженный деятель науки
российской федерации, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО
«Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко» Минздрава РФ, заведующий кафедрой фармакологии
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»
Защита состоится « ____ » ________________ 2013 г. в 14.00
на заседании диссертационного совета Д 208.040.13 ГБОУ ВПО «Первый
Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава РФ (119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый
Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава РФ (117997, г. Москва, Нахимовский пр-т, д.49)
Автореферат разослан «____» _____________ 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
2
Архипова Дария Евгеньевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность научного исследования
Гестоз второй половины беременности является наиболее часто
встречающейся акушерской патологией. В развитых странах его частота
может достигать 21% среди всех случаев беременности (Айламазян Э.К.,
2009; Савельева Г.М., 2008). В структуре материнской смертности гестоз
занимает 2-3 место. На его долю приходится до 25% случаев. У детей, родившихся у матерей, перенесших гестоз, перинатальная заболеваемость
достигает 78%, а смертность в 3-4 раза превышает популяционную (Айламазян Э.К., 2009). Кроме этого, страдает умственное и физическое развитие ребенка, а у женщин повышается вероятность развития хронической
патологии почек и артериальной гипертензии (Логутова Л.С., 2008; Радзинский В.Е., 2009; Иванова О.Ю., 2011).
Патогенез гестоза еще далек от полного понимания, но все больше
внимания исследователи уделяют дисангиогенезу в плаценте и нарушению
регуляции тонуса мелких артериальных сосудов (Мозговая Е.В. 2003; Айламазян Э.К., 2009; Тюренков И.Н. 2013). При морфологическом исследовании плаценты многие авторы описывают специфическую гистологическую картину, которая заключающуюся в диспропорциях развития ее пограничного участка между материнской и плодными частями (Crocker I.
2007; Ducray J.F. 2011; Oppenraaij R.H. 2011). Происходит неполная инвазия цитотрофобласта в спиральные артерии матери, что приводит к ишемическим явлениям в плаценте и повышению проницаемости фетоплацентарного барьера (Gilbert J.S., 2008).
Поступление в системный кровоток из ишемизированной плаценты
свободных радикалов, гормонов, факторов роста, провоспалительных цитокинов, антигенов плода и других гуморальных факторов вызывает повышение содержания молекул клеточной адгезии и накоплению в крови
эндогенных ингибиторов eNOS - метилированных аналогов L-аргинина
асимметричного диметиларгинина (ADMA) и монометиларгинина (LNMMA). Конечным финалом сложных патофизиологических механизмов
является нарушение реологических и коагуляционных свойств крови и эндотелиальная дисфункция, которые служат причиной полиорганной недостаточности.
Развитие плаценты представляет собой сложное сочетание процессов
ангиогенеза и апоптоза регулируемых большим количеством факторов роста (Kaufmann P., 2003; Forbes K., 2007). Многочисленные исследования
показали их дисбаланс у женщин с гестозом, а раннее его появление и повышенное содержание ADMA и его аналогов, служат диагностическими
критериями этого грозного заболевания, на его доклинической стадии (Сидорова И.С., 2007; Солоницын А.Н., 2008; Крукиер И.И., 2009; Smith C.L.,
2003; Speer P.D., 2008; Herr F., 2009). С учетом того, что в реализации эффектов многих факторов роста значительную роль играет NO, ишемия
плаценты и эндотелиальная дисфункция являются взаимосвязанными и
взаимообуславливающими звеньями в патогенезе гестоза.
3
Обобщая многочисленные литературные данные можно сказать, что
эндотелиальная дисфункция не только фактор определяющий тяжесть
клинического протекания заболевания, но и является основным звеном патогенетических процессов (Блощинская И.А., 2003; Сидорова И.С., 2003;
Мозговая Е. В., 2003; Айламазян Э.К., 2009).
Основные принципы современной фармакологической терапии гестоза направлены на коррекцию и компенсацию ишемических явлений в
плаценте и борьбу с нарушением функции жизненно важных органов организма женщины. Они включают в себя улучшение микроциркуляции в
тканях, снижение артериального давления, нормализацию водно-солевого
обмена, коррекция реологических и коагуляционных свойств крови, увеличение доставки кислорода к тканям, оптимизация клеточного метаболизма, антиоксидантная терапия и др. (Венцковский Б.М., 2005; Кулакова
В.И. 2005; Савельева Г.М., 2008; Айламазян Э.К., 2009). В свете современных представлений о патогенезе гестоза, ее существенным недостатком
является отсутствие целенаправленного использования препаратов для
коррекции NO-продуцирующей функции эндотелия и активации естественных противоишемических защитных механизмов.
В более ранних исследованиях, проведенных в нашей лаборатории,
было показано, что препараты, повышающие содержание субстрата для
синтеза NO – L-аргинина, увеличивают активность NO-синтазы, усиливают образование NO и предотвращают развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов при ADMA-подобном L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота. Кроме этого, эффективными на данной модели оказались активатор eNOS – резвератрол, антиоксиданты, эритропоэтин и др.
Определенное развитие получили исследования эндотелиопротективной
активности на других «eNOS–ассоциированных» экспериментальных моделях: гипоэстроген-индуцированной, гомоцистеин-индуцированной, метаболического Х синдрома, при реактивном поствакцинальном васкулите и
сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции (Покровский М.В. и
соавт., 2005-2013)
Еще одним перспективным направлением лечения и профилактики
гестоза может явиться использование фармакологических препаратов в основе механизма действия которых лежит активация защитных процессов
наблюдаемых при ишемическом прекондиционировании. Дистантное
ишемическое прекондиционирование, и как его вариант, фармакологическое прекондиционирование, оказывает положительное влияние на различные звенья патогенеза гестоза, реализуя свое действие через триггеры
«1-го окна» (К+АТФазный механизм) и «2-го окна» (NO-опосредованный
механизм) защиты (Галлямов Н.В., 2009; . Маслов Л.Н., 2009).
Таким образом, в настоящее время накопилось достаточно большое
количество сведений о влиянии различных факторов на течение гестоза и
их роли в развитии эндотелиальной дисфункции как основного патогенетического звена этого грозного заболевания и возможности коррекции эндотелиальной дисфункции фармакологическими агентами различных
4
групп. Однако, в доступной литературе не обнаружено сведений об изучении эндотелиопротективного действия в условиях ADMA-подобного гестоза L-аргинина, L-норвалина, тадалафила, а также их комбинаций с препаратами, входящими в стандартную антигипертензивную терапию гестоза, витамином В6 и фолиевой кислотой, поливитаминно-минеральными
комплексами, эритромицином, азитромицином, рекомбинантным эритропоэтином, а также эффективности направления в основе которого лежит
дистантное ишемическое прекондиционирование.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу
«Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и
профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007–2012 гг.,
номер госрегистрации 0120.0710379. Номер государственной регистрации
темы диссертационного исследования 01201058348.
Цель исследования: провести оценку коррекции экспериментального гестоза с помощью фармакологических подходов, направленных на
ADMA-eNOS-детерминированные пути, и методами, в основе реализации
которых лежат биологические процессы, протекающие при дистантном
ишемическом прекондиционировании.
Основные задачи исследования
1. Провести комплексную оценку функциональных, биохимических
и морфологических нарушений при ADMA-подобной модели гестоза с использованием результатов функциональных проб, данных ЛДФ-метрии
плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфологического исследования плаценты и почек.
2. Провести исследование эффективности коррекции экспериментального гестоза препаратами стандартной фармакологической терапии
артериальной гипертензии при гестозе (метилдопа и амлодипин) с использованием выбранных критериев: результатов функциональных проб и данных биохимического и морфологического исследований.
3. Оценить степень коррекции морфофункциональных нарушений у
беременных животных с экспериментальным гестозом фармакологическими агентами с доказанной ранее эндотелиопротективной активностью
влияющих на путь L-аргинин – NO – цГМФ, а также их комбинаций с
препаратами входящими в стандартную антигипертензивную терапию гестоза на основании предложенной методологии.
4. Изучить эффективность коротких эпизодов ишемии-реперфузии
при коррекции
экспериментального гестоза. Оценить роль АТФ+
зависимых К каналов и iNOS в реализации эндотелиопротективного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования.
5. Исследовать эффективность фармакологического прекондиционирования рекомбинантным эритропоэтином при коррекции экспериментального гестоза.
6. Изучить эффективность применения ингибитора ФДЭ5 – тадалафила, обладающего прекондиционирующим эффектом, при коррекции
5
экспериментального гестоза.
7. Оценить степень коррекции морфофункциональных нарушений у
беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии антибактериальными препаратами из группы макролидов, обладающими актиоксидантной и противовоспалительной активностью.
8. Провести исследование эффективности коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии препаратами из группы витаминно-минеральных комплексов для беременных и витаминами В6 и фолиевой кислотой, обладающими
различными механизмами действия.
Научная новизна исследования
В работе впервые разработан комплекс методических подходов для
оценки морфофункциональных нарушений возникающих при моделировании ADMA-подобной патологии у беременных животных. Продемонстрировано, что экспериментальная ADMA-подобная патология у животных в
период гестации характеризуется нарушениями, характерными для клинических проявлений гестоза второй половины беременности у женщин.
Проведенное сравнительное исследование эффективности препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную терапию гестоза (амлодипин и метилдопа) и фармакологических агентов увеличивающих содержание субстрата для синтеза NO (L-аргинина и L-норвалина) при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMAподобной патологией показало более выраженный положительный эффект
у последних. Это объясняется их прямой направленностью на преодоление
ADMA-подобного ингибирования eNOS. Еще более выраженных эффект
наблюдался при комбинированном использовании фармакологических
агентов увеличивающих количество субстрата для синтеза NO с препаратами, входящими в стандартную антигипертензивную терапию гестоза, что
происходит за счет воздействия на различные звенья патогенеза.
Использование 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии задних
конечностей оказывает выраженное протективное действие при коррекции
морфофункциональных изменений при моделировании ADMA-подобной
патологии. Значительную роль в реализации положительных эффектов дистантного ишемического прекондиционирования при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной
моделью гестоза играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
Введение рекомбинантного эритропоэтина при ADMA-подобной патологии у животных приводит к коррекции морфофункциональных нарушений. Однако по силе своего эффекта рекомбинантный эритропоэтин
уступает L-аргинину.
В настоящей работе выявлена эффективность использования для
коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с
ADMA-подобной моделью патологии фармакологического препарата «Тадалафила», относящегося к группе ингибиторов фермента фосфодиэстеразы 5.
6
Проведенное исследование показало уменьшение морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью
патологии при использовании антибактериальных препаратов из группы
макролидов: азитромицина и эритромицина, обладающих актиоксидантной
и противовоспалительной активностью.
Впервые показана эффективность использования поливитаминноминеральных комплексов: «Компливит триместрум 2 триместр®» и «Компливит триместрум 3 триместр®» для коррекции морфофункциональных
нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии.
Научно-практическая значимость
В работе обоснована эффективность применения фармакологических агентов для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии, точками приложения в механизмах действия которых являются различные eNOSобусловленные патогенетические звенья. Показано, что использование
различных препаратов, улучшающих NO-продуцирующую функцию, позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, артериальное
давление, предотвратить альбуминурию, а также изменение соотношений
сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация)
и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить
снижение показателей биохимических маркеров (Тоtal NO), добиться положительной динамики морфологических показателей в плацентарной и
почечной ткани.
Полученные данные позволяют обосновать новое перспективное
направление для поиска и создания эффективных лекарственных препаратов для лечения гестоза и преэклампсии, в основе реализации механизма
действия которых будет лежать патогенетическое воздействие на различные ADMA-eNOS-детерминированные механизмы развития этой патологии.
На основании результатов проведенной исследовательской работы
разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение в развитии перспективных направлений в фармакологии, клинической фармакологии, состоящее
в экспериментальном обосновании новых патогенетических подходов к
лечению гестоза.
Внедрение результатов научных исследований
На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-норвалина,
L-аргинина, тадалафила, коротких эпизодов ишемии-реперфузии, а также
их комбинаций с препаратами, входящими в стандартную фармакологическую терапию эндотелий-ассоциированной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндотелиопротективной активности препаратов «Компливит триместрум 2 триместр» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР7
008560/10) и «Компливит триместрум 3 триместр» производства ОАО
«Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008555/10), включены в состав
документов, поданных на регистрацию в М3 РФ.
Полученные результаты используются в учебных программах кафедр
фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии
Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и
фармакологии Белгородского государственного университета, кафедры
фармакологии Воронежской медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. ADMA-подобная патологии у беременных животных характеризуется морфофункциональными нарушениями, характерными для клинических проявлений гестоза.
2. Введение препаратов, входящих в стандартную терапию гестоза, и
фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO – цГМФ,
оказывает протективное действие при коррекции морфофункциональных
нарушений при ADMA-подобной модели патологии у беременных животных, причем наибольшей эффект наблюдается при их комбинированном
использовании.
3. Использование коротких эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного эритропоэтина как препарата, обладающего прекондиционирующими свойствами, оказывает выраженное протективное действие на
коррекцию морфофункциональных изменений при моделировании ADMAподобной патологии. Важную роль в реализации протективных эффектов
коротких эпизодов ишемии-реперфузии играют АТФ-зависимые К+ каналы
и iNOS.
4. Введение антибактериальных препаратов из группы макролидов
азитромицина и эритромицина оказывает выраженный положительный
эффект при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных
животных с ADMA-подобной моделью патологии.
5. Применение новых поливитаминно-минеральных комплексов:
«Компливит триместрум 2 триместр®» и «Компливит триместрум 3 триместр®» для коррекции мофофункциональных нарушений, возникающих у
беременных животных, при ADMA-подобной модели патологии оказывает
выраженный положительный эффект.
Апробация диссертации
Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010, 2011 и 2012 гг.,
V и ХIV национальных конгрессах «Человек и лекарство», V конгрессе
«Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (СанктПетербург, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), X итоговой научно-практической конференции
клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» НИУ БелГУ, конфе8
ренции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине»,
Франция (Париж, 2012), конференции «Фундаментальные и прикладные
исследования в медицине», Россия (Сочи, 2012).
Апробация диссертации проведена 25 мая 2012 г. на совместном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии, патофизиологии, гистологии, внутренних болезней № 2, акушерства и гинекологии,
акушерства и гинекологии ФПО, НИИ экологической медицины КГМУ и
на кафедре фармацевтических дисциплин Белгородского государственного
национального исследовательского университета.
Личный вклад автора
Автору принадлежит основная роль при определении направления
исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Лично автором проведен анализ отечественных и зарубежных источников по теме выполняемой диссертации. На основании анализа литературных данных
выдвинуты рабочие гипотезы о возможных путях фармакологической коррекции экспериментального гестоза с помощью подходов, направленных
на ADMA-eNOS-детерминированные механизмы, и методами, в основе
реализации которых лежат процессы, протекающие при дистантном
ишемическом
прекондиционировании.
Вклад
автора
является
определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах
исследования.
В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором
лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при
моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора осуществлялось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с
помощью программного комплекса Asqknowledge 3.8.1, забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, из них 20 в
российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень
изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций,
отражающих полностью содержание работы. Получено 13 патентов РФ на
изобретения и 1 патент РФ на полезную модель.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и
методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов,
выводов и списка литературы, включающего 441 источников, из них
81 отечественного и 360 зарубежных авторов. Диссертация изложена на
281 странице машинописного текста, содержит 35 таблиц, 97 рисунков.
9
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Моделирование ADMA-подобного гестоза
Эксперимент выполнен на 970 белых крысах-самках линии Wistar
массой 250–300 г. Для формирования групп беременных животных с заданными сроками, находящихся на раздельном содержании, к самкам (3
животных) подсаживали самцов (2 животных) на 24 часа. Затем животных
рассаживали и через 10-14 суток в условии эфирного сна пальпаторно
определяли наличие беременности. В наших экспериментах беременность
наступала в 30-40%. ADMA-подобный агент - неселективный блокатор
NO-синтазы N-нитро-L-аргинин-метиловый эфир (L-NAME) вводили внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут в течение семи дней (14-20 сутки беременности). По данным литературы, такой умеренно пролонгированный
среднедозовый режим введения L-NAME приводит к блокаде NO-синтазы
в эндотелии плацентарных сосудов, что, в свою очередь, приводит к деструктивным изменениям в тканях плаценты, артериальной гипертензии и
протеинурии.
Оценка степени развития эндотелиальной дисфункции
при моделировании патологии
Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции
(КЭД), предложенному в лаборатории кардиофармакологии НИИ экологической медицины коллективом авторов под руководством профессора
М.В. Покровского.
При оценке результатов функциональной пробы на ЭЗВД использовалась площадь прямоугольного треугольника над кривой восстановления
АД в ответ на введение ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг. При этом за меньший из катетов данного треугольника принималась разность между исходным значением АД (перед проведением пробы) и минимальным значением
АД после окончания кардиального компонента.
При оценке результатов ЭНВД с введением нитропруссида в дозе
30 мкг/кг также использовалась площадь прямоугольного треугольника
над кривой восстановления АД, точками меньшего катета которого являлись: исходное значение АД (перед проведением пробы) и точка максимального падения АД при сосудистой реакции.
Большими катетами в обоих треугольниках являлись показатели
времени восстановления АД в ответ на внутривенное введение ацетилхолина и нитропруссида соответственно, выражаемое в секундах. Площадь
исчисляемых треугольников выражалась в условных единицах (усл. ед.).
Предложенный коэффициент эндотелиальной дисфункции является
отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ
на введение НП (SНП) к площади треугольника над кривой восстановления
АД в ответ на введение АХ (SАХ):
S
КЭД = НП
SАХ
10
Определение биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции
Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов, NOx) определяли колориметрическим методом по развитию
окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящим в
состав реактива Грисса.
Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота
(eNOS) определяли в клеточном лизате по методу Хендриксона (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2002). Детекцию полосы eNOS проводили методом усиленной хемолюминесценции (ECL).
Оценка плацентарной микроциркуляции
Для получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте на
21 сутки беременности под наркозом в 4 точках измеряли уровень микроциркуляции на расстоянии 1 мм от края плацентарного диска. Для получения данных о состоянии микроциркуляции в плаценте использовали оборудование производства компании Biopacsystems: полиграф MP100 с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и инвазивным игольчатым датчиком TSD144, который устанавливался непосредственно на проекцию плацентарного диска. Регистрация и обработка результатов ЛДФ производилась с помощью программы AcqKnowledge версии 3.8.1., значения микроциркуляции выражались в перфузионных единицах (ПЕд).
Исследование протеинурии
Сбор мочи у интактных и опытных групп крыс проводился с использованием специальных метаболических клеток. Животное помещалось в
клетку на 12 часов с обеспечением свободного доступа к воде.
В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая
проба Геллера. Для определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности синезеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально с помощью тест-полосок или с помощью анализаторов мочи. Тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически
весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную
(появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями.
Морфологические методы оценки изменений в плаценте и почках
при моделировании ADMA-подобного гестоза
Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препара11
тов проведено гистологическое исследование (во всех сериях эксперимента), почек и плаценты. Материал фиксирован в 10% формалине с последующей заливкой в парафин. Срезы почек производили перпендикулярно основной оси органа через лоханку. Гистологические срезы плаценты производили в строго вертикальном направлении через середину плацентарного
диска с захватом всех слоев плаценты и стенки рога матки. Изучение микропрепаратов, фотопротоколирование и морфометрию проводили на микроскопе Leica DM4000B с системой видеорегистрации и обработки изображений. При всех морфологических исследованиях использовали окраску
гематоксилином и эозином. Для возможности сравнительной оценки морфологические изменения оценивали в рангах. Иммуногистохимическое исследование экспрессии eNOS и iNOS в плаценте проводили с использованием антител фирмы "Spring Bioscience".
Выбор режимов введения фармакологических агентов
и воспроизведения эпизодов ишемии-реперфузии
В рамках данной работы проведено исследование эндотелиопротективной активности ряда фармакологических агентов.
Исследована
эндотелиотропная
активность
L-аргинина
("EUROBIOPHARM", GmgH) в дозе 200 мг/кг/сут внутрь однократно с 14
по 20 сутки беременности.
L-норвалин ("WIRUD", GmgH) вводился в дозе 10 мг/кг/сут внутрь
однократно с 14 по 20 сутки беременности.
Исследование активности антагониста кальция дигидропиридинового ряда - амлодипина («Амлотоп», ЗАО «Макиз-Фарма») производили в
дозе 0,5 мг/кг/сут однократно внутрь с 14 по 20 сутки беременности.
Гипотензивный препарат центрального действия - метилдопа (Допегит, «Эгис») вводился в дозе 0,086 (2 x 0,043) г/кг/сут внутрь однократно с
14 по 20 сутки беременности.
В эксперименте с воспроизведением 10-минутных эпизодов ишемииреперфузии использовались 2 режима их воспроизведения. В первом случае эпизод ишемии-реперфузии воспроизводили на 21 день беременности
за 90 минут до начала проведения функциональных проб. Второй режим
заключался в ежедневном с 10 по 20 сутки беременности однократном
воспроизведении эпизода ишемии-реперфузии задней конечности.
Рекомбинантный эритропоэтин (Эпокрин, ФГУП ГосНИИ ОЧБ) вводили подкожно в дозе 50 МЕ/кг однократно в сутки на 7, 10, 13, 16, 19
сутки беременности.
Антибиотики из группы макролидов: эритромицин (ОАО «Биосинтез») и азитромицин (Сумамед, Плива Хрватска д.о.о. ) вводились внутрибрюшинно однократно в сутки в дозе 30 мг/кг с 14 по 20 сутки беременности.
Фолиевую кислоту (ОАО «Валента Фармацевтика») вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мг/кг/сутки однократно с 14 по 20 сутки беремен12
ности. Витамин В6 (ОАО «Верофарм») вводили внутрибрюшинно в дозе 2
мг/кг/сутки однократно с 14 по 20 сутки беременности.
Препараты «Компливит триместрум 2 триместр» и «Компливит триместрум 3 триместр» (ООО «Фармстандарт-УфаВИТА») вводили в дозе
0,084 таб/кг/сутки однократно внутрь с 14 по 20 сутки беременности.
Ингибитор фосфодиэстеразы 5 - тадалафил (Сиалис, ELI LILLY &
Company Limited) вводили в дозе 0,9 мг/кг 1 раз в сутки внутрь с 14 по 20
сутки беременности.
Блокатор АТФ-зависимых К+ каналов – глибенкламид (Манинил,
Берлин-Хеми АГ) вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг с 14 по 20
сутки беременности.
Селективный ингибитор iNOS – аминогуанидин (Aminoguanidine
hemisulfate sate, Sigma-aldrich chemine GmbH) вводили внутрибрюшинно в
дозе 300 мг/кг.
При комбинированном применении препаратов использовались те
же дозы, пути введения и та же продолжительность применения.
Дизайн эксперимента состоит из следующих блоков:
1. Контрольная группа (животные с пероральным введением NaCl в
эквивалентных дозах с 14 по 20 сутки беременности).
2. Моделирование ADMA–подобного гестоза (животные с внутрибрюшинным введением L-NAME в дозе 25 мг/кг однократно в сутки с 14
по 20 сутки беременности) (рис. 1).
3. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений препаратами, входящими в стандартную терапию лечения гестоза:
метилдопой 0,086 (2 x 0,043) г/кг/сут и амлодипином 0,5 мг/кг при моделировании ADMA–подобного гестоза.
4. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием фармакологических агентов с доказанной эндотелиопротективной активностью, реализующих свое действие за счет увеличения количества субстрата для синтеза NO – L-аргинина: L-аргинина 200
мг/кг и L-норвалина 10 мг/кг при моделировании ADMA–подобного гестоза.
5. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием фармакологических агентов с доказанной эндотелиопротективной активностью, реализующих свое действие за счет увеличения количества субстрата для синтеза NO – L-аргинина: L-аргинина
200 мг/кг и L-норвалина 10 мг/кг в комбинации с препаратами, входящими
в стандартную терапию лечения гестоза: метилдопой 0,086 г/кг/сут и амлодипином 0,5 мг/кг при моделировании ADMA–подобного гестоза.
6. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии
при моделировании ADMA–подобного гестоза.
7. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии
13
на фоне введения аминогуанидина при моделировании ADMA–подобного
гестоза.
8. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии
на фоне введения глибенкламида при моделировании ADMA–подобного
гестоза.
9. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием рекомбинантного эритропоэтина 50 Ме/кг при
моделировании ADMA–подобного гестоза.
10. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием ингибитора ФДЭ5 – тадалафила 0,9 мг/кг при моделировании ADMA–подобного гестоза.
11. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием эритромицина 30 мг/кг и азитромицина 30 мг/кг
при моделировании ADMA–подобного гестоза.
12. Оценка эффективности коррекции морфофункциональных нарушений с использованием фолиевой кислоты 0,2 мг/кг, витамина В6 2 мг/кг,
препаратов «Компливит триместрум 2 триместр» 0,084 таб/кг и «Компливит триместрум 3 триместр» 0,084 таб/кг/ при моделировании
ADMA–подобного гестоза.
1
2
10
14
сутки
20 21
Рис. 1. Дизайн моделирования ADMA-подобного гестоза.
Примечания:
- Спаривание животных
- Пальпаторное определение факта беременности
- Введение L-NAME
- Проведение функциональных проб, забор материала для
биохимического и морфологического исследований
Статистическая обработка результатов исследования
Цифровые данные обрабатывали методами вариационной статистики:
вариационные ряды проверяли на нормальность распределения, при его
соблюдении количественные величины характеризовали средней арифметической (М) и ошибкой средней арифметической (±m), статистическую
значимость количественных величин оценивали по критерию Стьюдента
(t); статистическую значимость различий между морфологическими изменениями после их ранжирования оценивали с помощью метода анализа
непараметрических данных Манна-Уитни. Все расчеты выполнены с помощью пакета статистических программ Microsoft Excel 7.0.
14
РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА МЕТОДИЧЕСКИХ
ПОДХОДОВДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ У БЕРЕМЕННЫХ
КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ADMA-ПОДОБНОГО ГЕСТОЗА1
Введение ADMA-подобного агента – L-NAME небеременным самкам не приводило к статистически значимым изменениям. При введении LNAME беременным самкам мы наблюдали развитие патологии, по своим
проявлениям соответствующей критериям клинических проявлений гестоза. Происходило статистически значимое (p<0,05) повышение систолического и диастолического АД с 125,0±6,3 мм рт. ст. и 82,0±5,8 мм рт. ст.
до 183,1±9,4 мм рт. ст. и 136,7±7,4 мм рт. ст. соответственно (табл. 1). Дефицит NO приводил к увеличению КЭД до 3,06±0,32 (p<0,05). Обращает
на себя внимание, что значения КЭД, полученные у беременных самок, отличаются от полученных в нашей лаборатории результатов у самцов, что
отражает, вероятно, специфичность, связанную с половыми различиями.
Однако само различие в значениях КЭД у интактных беременных и с моделированием гестоза в 2,5-3 раза указывает на
адекватность модели
(табл. 1).
Значение уровня микроциркуляции на наружной поверхности рога
матки в группе интактных беременных крыс составляет 425,9±
39,6 ПЕд (перфузионных единиц). Результаты изучения уровня микроциркуляции, проведенного на 21 сутки беременности при моделировании гестоза, обнаружили ее существенное снижение до 210,0±21,1
ПЕд.
У интактных беременных крыс 12-часовой диурез составил 5,6±
1,2 мл, что соответствовало нормальным показателям у животных
массой 250-300 г при протеинурии, значения которой соответствовали 0,90±0,10 г/л, т.е. до 1,0 г/л.
Моделирование L-NAME-индуцированного гестоза не оказывало существенного влияния на 12-часовой диурез. Визуально также не
наблюдались отеки на конечностях. При анализе мочи обнаружено
умеренно выраженное увеличение протеинурии со значениями
1,88±0,19 (p<0,05). Однако нужно отметить, что при измерении микроциркуляции в почечной ткани статистически достоверной разницы между
группой интактных беременных животных и животных с моделируемым
ADMA-подобным гестозом не наблюдалось.
Исследование NO-продуцирующей функции эндотелия показало, что
моделирование L-NAME-индуцированного дефицита NO приводило к резкому снижению экспресии eNOS и содержания нитрит-ионов (NOx) соответственно в 1,9 и 1,8 раза (табл. 2).
– Отдельные фрагменты разработки комплекса методических подходов для
оценки морфофункциональных нарушений при ADMA-подобном гестозе выполнены в
нашей лаборатории совместно с аспирантами А.А. Барсук и О.С. Полянской.
1
15
Таблица 1
Значения АД, КЭД, микроциркуляции в плаценте и протеинурии при
моделировании ADMA-подобного гестоза (M±m; n=10)
Показатель
Группа
САД
мм рт. ст.
ДАД
мм рт. ст
КЭД
усл. ед.
Микроциркуляция
пер. ед.
_______
Небеременные
131,4±4,7y
89,1±4,6y
0,98±0,12y
интактные
Небеременные +
134,2±5,8y
87,7±3,8y
1,30±0,15y
_______
L-NAME
Беременные
125±6,3y
82,0±5,8y
1,28±0,23y
425,9±39,6y
интактные
Беременные +
183,1±9,4*
136,7±7,4*
3,06±0,32y
210,0±21,1*
L-NAME
Примечания: *- при р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами; yпри р<0,05 в сравнении с беременными крысами с L-NAME;
Таблица 2
Концентрация NOx в сыворотке крови и экспрессия eNOS в эндотелии
при моделировании ADMA-подобного гестоза (M±m; n=10)
Показатель
NOx,
eNOS,
Группа
мкмоль/дЛ
%
y
Небеременные интактные
2,24±0,15
107,2±4,38y
y
Небеременные + L-NAME
2,16±0,13
104,6±3,9y
Беременные интактные
2,35±0,21y
112,2±6,99y
Беременные + L-NAME
1,33±0,09*
61,4±4,46*
Примечания: *- при р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами; yпри р<0,05 в сравнении с беременными крысами с L-NAME;
Гистологическая картина почек у интактных беременных крыс (21
сутки беременности) была следующей: клубочки умеренно полнокровны,
базальная мембрана не утолщена, воспалительные изменения в интерстиции клубочков и пирамид отсутствуют; спастические и гипертрофические
изменения мелких артерий и артериол не обнаружены (рис. 2).
Плацента крыс на 21 сутки беременности без признаков повреждения (рис. 3).
У крыс с экспериментальным гестозом в клубочках почек выявлены
признаки ишемического повреждения в виде их малокровия, а также дистрофические изменения базальной мембраны капилляров клубочков с её
утолщением в виде проволочных петель (рис. 4 (в, г)). Заметной реакции
мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило
39,9+3,02 (в норме 38,5+3,29). Описанные изменения гломерулярного аппарата могут объяснять имеющуюся у крыс данной группы гиперфильтрацию с выраженной протеинурией. Юкстагломерулярный аппарат многих
клубочков был гипертрофирован (рис. 4 (в)). В мелких артериях и артериолах отмечались спазм и выраженная гипертрофия стенок (рис. 4 (а, б)).
В канальцах обнаруживались цилиндры (рис. 4 (д)).
16
А
В
А
Б
Рис. 2. Почка беременной крысы в
норме.
Примечания: а, б – мелкая артерия в
корковом веществе без признаков гипертрофии стенок, её эндотелий не поврежден; в – базальная мембрана капилляров клубочка не утолщена, клеточная воспалительная реакция отсутствует. Окраска гематоксилином и
эозином. Микрофото. Х 280.
Б
Рис. 3. Строение интактной плаценты.
Примечания: А – спонгиозный слой;
Б - слой гигантоклеточного трофобласта; В - децидуальная ткань; Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото.
Х 200.
В
17
Морфологическая картина плаценты при L-NAME-индуцированном
гестозе проявлялась в виде ишемии ворсин и интервиллезных пространств
и слущиванием эндотелия в сосудах плаценты (рис. 5). В отдельных случаях это приводило к появлению очагов некроза децидуальных клеток в
ткани плаценты. На внешней поверхности плаценты наблюдали массивные отложения фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки изменения морфологических показателей при моделировании ADMA-подобного гестоза представлена в табл. 3.
Результаты количественного анализа данных, полученных при иммуногистохимическом исследовании экспрессии еNOS в плаценте интактных беременных животных, показали, что удельная площадь иммунореактивного вещества составила 5,4±0,21%. В группе животных с экспериментальным гестозом экспрессия eNOS в эндотелии капилляров практически
не выявлялась.
Таблица 3
Комплексная оценка патоморфологических изменений в почках и
плаценте при моделировании ADMA-подобного
гестоза (n=10)
Серия экспериментов
Комплексная оцен- Экспрессия eNOS
ка в баллах
в плаценте, %
Интактные беременные самки
0-1
5,4± 0,21
Беременные самки + L-NAME
5-6*
0,04± 0,01*
Примечания: * - р<0,05 в сравнении с интактными беременными самками;
Таким образом, вышеизложенное свидетельствует о том, что длительное, в течение 7 суток, внутрибрюшинное введение L-NAME в дозе
25 мг/кг вызывает у беременных самок крыс комплекс функциональных,
биохимических и морфологических изменений, связанных с развитием дефицита NO вследствие блокады NO-синтетазы. В частности, на 8 сутки
развивалась выраженная гипертензия и эндотелиальная дисфункция, резко
уменьшался уровень нитрит-ионов. При лазердопплерфлоуметрическом
исследовании обнаружены нарушения плацентарной микроциркуляции,
сопровождавшиеся протеинурией. Гистологически обнаруживались признаки ишемических повреждений почек и плаценты. Описанный симптомокомплекс соответствует патофизиологическим нарушениям, возникающим при развитии гестоза у беременных женщин.
Гистологические исследования выполнены под руководством проф. А.А. Должикова и проф. В.С. Барсукова
18
А
В
Д
Б
Г
Рис. 4. Почка беременной крысы с гестозом (21 сутки беременности).
Примечания: а, б – спазм артериолы; в –
гиперплазия темного пятна; г – клубочки
малокровны, базальные мембраны капилляров резко утолщены и имеют вид проволочных петель (мембранозная гломерулопатия); д - цилиндры в канальцах.
Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото.
Х 280.
С учетом проведенного анализа литературных данных о патогенезе
гестоза, того факта, что выраженные морфофункциональные изменения в
организме экспериментального животного при ADMA-подобном ингибировании eNOS, возникают только в условии беременности, а так же характер самих патофизиологических изменений, о созданной модели патологии
можно говорить как модели достаточно близко отражающей процессы
происходящие в организме беременной женщины при гестозе, как сточки
зрения клинических проявлений, так и с точки зрения патогенетических
механизмов.
19
А
Б
В
Г
Рис. 5. Патологические изменения в плаценте при моделировании ADMAподобного гестоза.
Примечания: А – неравномерное кровенаполнение спонгиозного
слоя;
Б - вакуольная дистрофия гигантоклеточного трофобласта; В - очаги некроза на границе гигантоклеточного трофобласта и децидуальной ткани; Г - дистрофические изменения, малокровие децидуального слоя. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. Х 200.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ,
ВХОДЯЩИХ В СТАНДАРТНУЮ АНТИГИПЕРТЕНЗИВНУЮ
ТЕРАПИЮ ГЕСТОЗА, ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ,
ВЛИЯЮЩИХ НА ПУТЬ L-АРГИНИН – NO - цГМФ, И ИХ
СОЧЕТАННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ1
Исследование эффективности препаратов, входящих в стандартную
антигипертензивную терапию гестоза: метилдопы и амлодипина, фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO - цГМФ: Lаргинина, L-норвалина и тадалафила, и их сочетанного использования при
коррекции ADMA-подобного гестоза выявило статистически значимое
снижение артериального давления под влиянием метилдопы, L-аргинина,
тадалафила и комбинированного использования препаратов входящих в
стандартную антигипертензивную терапию гестоза и фармакологических
агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO - цГМФ (табл. 4).
– Отдельные фрагменты исследования эффективности препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную терапию гестоза, фармакологических агентов, влияющих
на путь L-аргинин – NO - цГМФ, и их сочетанного использования при коррекции
ADMA-подобного гестоза выполнены в нашей лаборатории с аспирантами А.А. Барсук
и О.С. Полянская.
1
20
Таблица 4
Влияние препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную
терапию гестоза, и фармакологических агентов, влияющих на путь Lаргинин – NO - цГМФ, на артериальное давление, КЭД и микроциркуляцию в плаценте при коррекции ADMA-подобного гестоза у
крыс (M±m; n=10)
Показатель
САД,
ДАД,
КЭД,
МикроцирГруппа
мм рт.ст.
мм рт.ст.
усл. ед.
куляция, ПЕд
Интактные
125±6,3y
82,0±5,8y
1,28±0,23y
425,9±39,6y
L-NAME
183,1±9,4*
136,7±7,4*
3,06±0,32*
210,0±21,1*
L-NAME + метилдопа
135,4±2,8y
101,4±3,8y
2,8±0,01*
242,6±10,9y
(0,086 г/кг/сут)
L-NAME + амлодипин 165,7±6,8*
123,5±6,3*
1,48±0,21y
202,8±18,5y
(0,5мг/кг/сут)
L-NAME + L-аргинин
151,2±5,3y
112,8±6,8y
1,50±0,25y
342,5±29,3y
(200 мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин 194,5±8,3*
146,4±8,2*
1,51±0,15y
455,7±41,5y
(10 мг/кг/сут)
L-NAME +
149,7±2,2y
97,6±3,2y
1,85±0,08y
398,7±24,84y
тадалафил (0,9 мг/кг)
L-NAME + L-аргинин
145,5±5,7y
109,6±7,1y
1,39±0,16y
434,8±50,8y
(200 мг/кг/сут) + амлодипин (0,5мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин 120,1±2,9y
92,4±3,3y
1,50±0,25y
394,2±25,8y
(10 мг/кг/сут) + метилдопа (0,086 г/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин 156,3±2,0y
108,9±4,6y
1,69±0,07y
398,6±18,4y
(10 мг/кг/сут)+ амлодипин (0,5мг/кг/сут)
Примечания: *- p<0,05 – в сравнении с интактными; y - р<0,05 – в сравнении с
L-NAME;
Обращает на себя внимание тот факт, что, не обладая собственным
выраженным гипотензивным эффектом при данной моделируемой патологии, амлодипин и L-норвалин в комбинации проявляют его, что свидетельствует о положительном фармакологическом взаимодействии. Все используемые препараты и их сочетания, кроме метилдопы в монотерапии, снижали коэффициент эндотелиальной дисфункции.
При исследовании микроциркуляции в плаценте было выявлено ее
улучшение под влиянием фармакологических агентов, влияющих на путь
L-аргинин – NO - цГМФ, и их сочетанного использования с препаратами
входящими в стандартную антигипертензивную терапию гестоза. Метилдопа и амлодипин в монотерапии влияния на нее не оказывали (табл. 4).
Все используемые препараты и фармакологические агенты, влияющие на путь L-аргинин – NO - цГМФ, а также их сочетания уменьшали
протеинурию (табл. 5).
При исследовании влияния препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную терапию гестоза, фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO - цГМФ, и их сочетанного использования на
21
NO-синтезирующую функцию эндотелия при коррекции ADMAподобного гестоза было выявлено ее улучшение под влиянием фармакологических агентов, повышающих количество субстрата для синтеза NO и их
комбинаций с препаратами, входящими в стандартную антигипертензивную терапию гестоза (p<0,05) (рис. 6). Это касается как содержания конечных метаболитов NO, так и уровня экспрессии eNOS.
Таблица 5
Влияние препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную
терапию гестоза, фармакологических агентов, влияющих на путь
L-аргинин – NO - цГМФ, на значения показателей 12-часового
диуреза и протеинурии при коррекции ADMA-подобного
гестоза (M±m; n=10)
Показатель
Кол-во 12-часовой
Протеинурия
Группа
мочи (мл)
(г/л)
Интактные беременные
5,52±0,43
0,90±0,10у
L-NAME
5,22±0,35
1,88±0,19*
L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг/сут)
5,62±0,27
0,98±0,11у
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут)
5,32±0,32
0,90±0,06у
L-NAME + тадалафил (0,9 мг/кг)
5,72±0,33
1,01±0,06 у
L-NAME + метилдопа (0,086 г/кг/сут)
5,59±0,24
0,96±0,06у
L-NAME + амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
5,6±0,33
0,79±0,11у
L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг/сут) +
5,29±0,31
0,83±0,08у
амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут) +
5,64±0,38
1,04±0,04у
метилдопа (0,086 г/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут) +
5,99±0,38
0,98±0,11у
амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
Примечания: * - p<0,05 – в сравнении с интактными беременными животными;
у
– р<0,05 – в сравнении с беременными самками, получавшими L-NAME.
IV
110,4±4,03y
116,1±5,77y
III
108,9±5,41y
117,7±5,65y
II
112,6±4,57y
20
IX
X
65,5±3,36*
0,50
66,4±3,76*
40
64,5±3,01*
60
61,4±4,46*
80
112,2±6,99y
100
eNOS, %
2,19±0,09y
2,11±0,1y
1,36±0,1*
2,19±0,1y
120
2,10±0,14y
2,33±0,15y
1,40±0,09*
1,00
1,32±0,09*
1,50
1,33±0,09*
NOx, мкмоль/дЛ
2,00
2,35±0,21y
2,50
0
0,00
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
I
V
VI
VII
VIII
Рис. 6. Исследование влияния на концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS препаратов, входящих в стандартную терапию гестоза, фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO – цГМФ, и их сочетанного использования при коррекции ADMA-подобного гестоза.
Примечания: I – интактные беременные; II – L-NAME; III – метилдопа; IV –
амлодипин; V – L-аргинин; VI – L-норвалин; VII – тадалафил; VIII – амлодипин + Lаргинин; IX – метилдопа + L-норвалин; X – амлодипин + L-норвалин;
*
- при р<0,05 по сравнению с интактными беременными крысами; Y- р<0,05 в сравнении с группой беременных животных, получавших L-NAME;
22
Морфологическое и иммуногистохимическое исследования выявили
в почках и плаценте протективный эффект при применении фармакологических агентов, влияющих на метаболический путь L-аргинин – NO цГМФ, и препаратов, входящих в стандартную схему лечения гестоза для
коррекции L-NAME-индуцированного гестоза, что выразилось в приближении интегральной оценки к группе интактных беременных животных.
Наибольший эффект наблюдался при сочетанном применении препаратов,
влияющих на метаболический путь L-аргинин – NO - цГМФ, и препаратов,
входящих в стандартную антигипертензивную терапию гестоза (табл. 6).
Таблица 6
Влияние препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную
терапию гестоза, фармакологических агентов, влияющих на путь
L-аргинин – NO - цГМФ, на интегральную оценку комплекса патоморфологических изменений в почках и плаценте и экспрессию eNOS
при коррекции ADMA-подобного гестоза (n=10)
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
0-1
5-6*
2-3*
2-3*
3*
3*
3-4*
1-2*
Экспрессия eNOS
в плаценте, %
5,4±0,21
0,04±0,01*
5,12±0,26
4,85±0,28
5,04±0,26
2,39±0,16*
2,63±0,13*
4,84±0,23
Интактные беременные самки
L-NAME
L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут)
L-NAME + тадалафил (0,9 мг/кг)
L-NAME + метилдопа (0,086 г/кг/сут)
L-NAME + амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг/сут)
+ амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут)
2*
5,1±0,23
+ метилдопа (0,086 г/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут)
1-2*
5,11±0,13
+ амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
Примечания: * - p<0,05 в сравнении с интактными беременными самками;
Микроскопическое исследование почек у животных получавших
комбинированное лечение, выявило однотипную картину, которая резко
отличалась от контрольной группы беременных крыс. Мелкие артерии
коркового вещества почки без признаков гипертрофии мышечного слоя.
Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны не
утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствует. Заметной реакции
мезангия не отмечено. Так, среднее количество клеток на клубочек в группе с использованием метилдопы в комбинации с L-норвалином составило
35,5+3,31 (в норме 38,5+3,29).
Морфологическая картина плаценты при L-NAME-индуцированном
гестозе, леченном комбинацией препаратов, влияющих на метаболический
путь L-аргинин – NO, и препаратов, входящих в стандартную схему лечения гестоза, приближалась к группе интактных животных. Отмечалось мономорфная структура слоев плаценты без очаговых изменений, умеренное
23
кровенаполнение спонгиозного слоя. На внешней поверхности плаценты
наблюдались следы отложения фибрина (рис. 7).
Рис. 7. Морфологическая картина плаценты при коррекции ADMA-подобного
гестоза метилдопой в сочетании с L-норвалином.
Примечания: А - общий вид слоев плаценты, имеющих мономорфную структуру без очаговых изменений; Б – спонгиозный слой с умеренным кровенаполнением,
В – граница спонгиозного слоя и слоя гигантского трофобласта, Г – структура слоя
гигантского трофобласта без дистрофических изменений; Окр. гематоксилином и
эзином. Микрофото. Х 50 (А), Х 200 (б, в, г).
Таким образом, сочетанное использование фармакологических агентов, влияющих на метаболический путь L-аргинин – NO – цГМФ, и препаратов, входящих в стандартную антигипертинзивную терапию гестоза,
оказывало наиболее выраженное эндотелиопротективное действие на модели ADMA-подобного гестоза, что выражалось в потенцировании гипо24
тензивного эффекта, снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции
КЭД до уровня интактных животных, а также в полном предотвращении
снижения содержания нитрит-ионов NOx и экспрессии eNOS. Одновременно результаты исследований микроциркуляции плаценты выявили
предотвращение снижения показателей перфузии на фоне полного предотвращения протеинурии. Морфологические исследования почек и плаценты
в этих группах выявили максимальное приближение гистологической картины к группе интактных беременных животных. Данный эффект можно
объяснить различными патогенетически обоснованными воздействиями и
рекомендовать к широкому клиническому изучению.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности подхода создания новой группы лекарственных препаратов для лечения и профилактики гестоза направленного на преодоление ADMA-обусловленного
ингибирования eNOS и коррекции вызванной ею патофизиологических
изменений.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ 10 МИНУТНЫХ
ЭПИЗОДОВ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ И РЕКОМБИНАНТНОГО
ЭРИТРОПОЭТИНА ПРИ ADMA-ПОДОБНОМ ГЕСТОЗЕ И РОЛИ
iNOS И АТФ–ЗАВИСИМЫХ К+ КАНАЛОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ИХ
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ЭФФЕКТОВ
Исследование эффективности 10 минутных эпизодов ишемииреперфузии и рекомбинантного эритропоэтина при коррекции морфофункциональных нарушений при ADMA-подобном гестозе
Воспроизведение однократного ишемического эпизода за 90 минут
до снятия проб не приводило к какому-либо значимому изменению артериального давления. 10-кратное воспроизведение ишемического эпизода и
введение рекомбинантного эритропоэтина приводило к статистически значимому снижению артериального давления: систолического до 141,6±5,5 и
143,5±4,3 мм рт.ст., диастолического до 104,2±5,7 и 98,1±5,9 мм рт.ст.
(р<0,05) соответственно (табл. 7).
Воспроизведение как однократного ишемического эпизода за 90 минут до снятия проб, так и 10-кратного эпизода ишемии-реперфузии с 10 по
20 день беременности, а также введение рекомбинантного эритропоэтина
приводило к нормализации взаимоотношения вазодилатирующих и вазоконстрикторных реакций при ADMA-подобном гестозе, о чем свидетельствует снижение КЭД до 1,52±0,09, 1,56±0,13 и 1,67±0,15 соответственно
(табл. 7).
Обращает на себя внимание, что однократное воспроизведение эпизода ишемии-реперфузии снижало КЭД на фоне L-NAME-индуцированной
патологии, не влияя на артериальное давление. Это свидетельствует об отличительных особенностях механизмов действия однократного и многократного воспроизведения эпизодов ишемии-реперфузии и их различном
влиянии на вовлеченные в патогенетический процесс элементы гуморального и нейрогенного контуров регуляции системы кровообращения.
25
Таблица 7
Влияние 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного эритропоэтина на артериальное давление, микроцикуляцию в
плаценте и КЭД при коррекции ADMA-подобного гестоза (M±m; n=10)
Показатель
САД,
мм рт.ст.
125,0±6,3y
183,1±9,4*
ДАД,
мм рт.ст.
82,0±5,8y
136,7±7,4*
КЭД,
усл. ед.
1,28±0,23y
3,06±0,32*
Микроциркуляция, ПЕд
425,9±39,6y
210,0±21,1*
Группа
Интактные
L-NAME
L-NAME
+
Ишемия177,1±9,8*
124,9±8,4* 1,52±0,09y
327,3±17,2y
реперфузия(1)
L-NAME
+
Ишемия141,6±5,5y
104,2±5,7y 1,56±0,13y
339,6±20,4y
реперфузия(10)
L-NAME + рекомбинантный 143,5±4,3y
98,1±5,9y
1,67±0,15y
301,1±19,4y
эритропоэтин (50 МЕ/кг)
Примечания: САД, ДАД – систолическое и диастолическое артериальное давление; КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции; микроциркуляция в плаценте;
ПЕд – перфузионные единицы; *- р<0,05 - в сравнении с группой беременных интактных животных; y- р<0,05 - в сравнении с группой беременных крыс, получавших
L-NAME.
Воспроизведение однократного, 10-кратного эпизода ишемииреперфузии и введение рекомбинантного эритропоэтина вызывало
существенное улучшение микроциркуляции до 327,3±17,2, 339,6±20,4
и 301,1±19,4 соответственно, что было достоверно выше, чем у беременных самок с гестозом (p<0,05).
Воспроизведение 10-кратных эпизодов ишемии-реперфузии с 10 по
20 сутки и введение рекомбинантного эритропоэтина у беременных животных с моделированием ADMA-подобного гестоза нормализовало показатели белка в моче, значения которых не выходили за пределы нормы и
составили 1,02±0,04 и 1,01±0,06 г/л соответственно, что статистически различимо (р<0,05) по сравнению с группой нелеченых беременных животных (табл. 8).
Влияние 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного эритропоэтина на NO-продуцирующую функцию эндотелия
исследовано на основании данных увеличения экспрессии eNOS и содержания нитрит-ионов NOx (рис. 8). Обнаружено, что при однократном воспроизведении эпизода ишемии-реперфузии не происходило увеличения ни
экспрессии eNOS, ни уровня нитрит-ионов в плазме крови. Увеличение
показателей экспрессии eNOS происходило как под влиянием рекомбинантного эритропоэтина, так и при воспроизведении 10-кратного эпизода
ишемии-реперфузии. Увеличение содержание конечных метаболитов NO в
плазме крови происходило только при 10-кратном воспроизведении эпизодов ишемии-реперфузии.
26
Таблица 8
Влияние 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного эритропоэтина на значения показателей 12-часового диуреза и
протеинурии при моделировании ADMA-подобного гестоза
(M±m; n=10)
Показатель
Кол-во мочи,
мл
5,52±0,43
Группа
Интактные
Протеинурия,
г/л
0,90±0,10у
5,22±0,35
1,88±0,19*
L-NAME
5,51±0,29
1,02±0,04у
L-NAME+Ишемия-реперфузия (10)
L-NAME+рекомбинантный эритропоэтин (50 МЕ/кг)
5,32±0,23
1,01±0,06у
Примечания: * - p<0,05 – в сравнении с интактными беременными животными;
у
– р<0,05 – в сравнении с беременными самками, получавшими L-NAME.
120
2,50
20
116,5±4,44y
53,4±2,54*
40
61,4±4,46*
60
112,2±6,99y
eNOS, %
1,39±0,12*
1,92±0,18y
1,11±0,09*
0,50
80
1,33±0,09*
1,00
2,35±0,21y
NOx, мкмоль/дЛ
1,50
87,3±6,50y
100
2,00
0,00
Интактные
L-NAME
ИшемияИшемияреперфузия(1) реперфузия(10)
Эритропоэтин
0
Интактные
L-NAME
ИшемияИшемияреперфузия(1) реперфузия(10)
Эритропоэтин
Рис. 8. Влияние 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного эритропоэтина на концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS в эндотелии при коррекции ADMA-подобного гестоза.
Примечания: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой беременных крыс, получавших L-NAME.
При морфологическом исследовании почек и плаценты так же обнаружен протективный эффект 10-кратного воспроизведения эпизодов ишемии-реперфузии и введения рекомбинантного эритропоэтина.
При морфологическом исследовании сосудов почек у животных с
10-кратным воспроизведением 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии
картина резко отличалась от контрольной группы беременных крыс. Мелкие артерии коркового вещества почки со слабовыраженными признаками
гипертрофии и спазма мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков
полнокровны, базальные мембраны не утолщены, симптом «проволочных
петель» отсутствует. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее количество клеток на клубочек составило 36,8+3,16 (в норме 38,5+3,29).
Морфологическое исследование плаценты при коррекции L-NAMEиндуцированного гестоза 10-кратным воспроизведением эпизода ишемииреперфузии выявило устранение ишемических повреждений в плацентарной ткани (рис. 9). Наблюдалось относительно равномерное кровенаполнение спонгиозного слоя, отсутствие повреждения слоя гигантоклеточного
27
трофобласта и децидуальной оболочки. На внешней поверхности плаценты
наблюдались слабые отложения фибрина.
Б
А
В
Рис. 9. Плацента у животных с 10-кратным воспроизведением кратковременных ишемических эпизодов на фоне ADMA-подобного гестоза.
Примечания: А – децидуальный слой: мономорфная структура, отсутствие
дистрофических изменений; Б – равномерное кровенаполнение спонгиозного слоя;
В - отсутствие дистрофических изменений трофобласта; Окр. гематоксилином и
эозином. Микрофото. Х 200.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических
показателей и результаты иммуногистохимического исследования представлены в табл. 9, из которой следует, что 10-кратное воспроизведение
кратковременного эпизода ишемии-реперфузии и введение рекомбинантного эритропоэтина достоверно снижали интегральную оценку в баллах и
восстанавливали экспрессию eNOS в плаценте по сравнению с L-NAMEиндуцированным гестозом (табл. 9).
Таблица 9
Влияние 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии на комплекс
патоморфологических изменений и экспрессию eNOS
при моделировании ADMA-подобного гестоза (n=10)
№
п/п
1
2
3
4
28
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
0-1
5-6*
2-3*
3*
Экспрессия eNOS
в плаценте, %
5,4±0,21
0,04±0,01*
5,18+0,31
5,18+0,27
Интактные беременные самки
L-NAME-индуцированный гестоз
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10)
L-NAME
+
рекомбинантный
эритропоэтин (50 МЕ/кг)
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками.
Исследование роли iNOS и АТФ-зависимых К+ каналов в реализации
положительных эффектов 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии
при коррекции ADMA-подобного гестоза
Введение аминогуанидина, являющегося селективным ингибитором
iNOS, или глибенкламида, являющегося блокатором АТФ-зависимых К+
каналов, здоровым беременным животным не приводило к статистически
значимому изменению артериального давления, КЭД, микроциркуляции в
плаценте и протеинурии.
Введение аминогуанидина или глибенкламида беременным животным с экспериментальным гестозом, леченным 10 минутными эпизодами
ишемии-реперфузии, приводило к полному устранению их гипотензивного
эффекта, ухудшало микроциркуляцию в плаценте (рис. 10) и повышало
протеинурию до уровня нелеченых животных. Только КЭД, несмотря на
статистически достоверное свое повышение, оставался ниже группы нелеченых животных (p<0,05).
КЭД
40
1,5
1
0,5
2,34±0,09y
2
2,24±0,17y
2,5
3,06±0,32*
181,3±4,6*
198,5±13,1*
3
1,56±0,13y
60
ДАД
1,28±0,23y
80
3,5
САД
133,5±3,3*
100
139,2±8,3*
125±6,3y
120
82,0±5,8y
АД, мм рт. ст.
140
141,6±5,5y
160
104,2±5,7y
180
136,7±7,4*
183,1±9,4*
200
20
0
0
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
Интактные
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
450
2
400
1,8
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
0,6
0,4
1,61±0,07*
0,8
1,49±0,06*
1
1,02±0,04у
1,88±0,19*
Протеинурия, г/л
256,8±24,6*
1,2
0,2
0
0
Интактные
1,4
0,90±0,10у
50
233,2±21,58*
100
339,6±20,4y
150
210,0±21,08*
200
425,9±39,6y
Микроциркуляция, ПЕд
250
Ишемияреперфузия(10)
1,6
350
300
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
Рис. 10. Влияние аминогуанидина (300 мг/кг) и глибенкламида (50 мг/кг) на
АД, КЭД, микроциркуляцию в плаценте и протеинурию при коррекции ADMAподобного гестоза 10 минутными эпизодами ишемии-реперфузии.
Примечания: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.
При введении аминогуанидина или глибенкламида беременным животным принципиально значимого снижения уровня нитрит-ионов в плазме крови и активности eNOS не происходило. При введении их животным
с ADMA-подобным гестозом, леченным 10-минутными эпизодами ише29
мии-реперфузии, увеличение уровня нитрит-ионов в плазме крови конечных метаболитов NO и экспрессии eNOS под влиянием последних не происходило (рис. 11).
Обращает на себя внимание то, что отрицательное влияние аминогуанидина и глибенкламида на функциональные показатели проявляется
только при попытке коррекции моделируемой патологии, что указывает на
важную роль iNOS и АТФ-зависимых К+ каналов в реализации эндотелиопротективного эффекта короткими эпизодами ишемии-реперфузии.
При морфологическом исследовании почек и плаценты животных,
которым вводился аминогуанидин или глибенкламид, обнаружено отсутствие какого-либо их влияния на микроскопическую картину в органах,
которая соответствовала группе интактных беременных животных (0-1 в
баллах).
2,50
120
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
20
0
Интактные
L-NAME
Ишемияреперфузия(10)
62,6±2,72*
40
116,5±4,44y
60
61,4±4,46*
eNOS, %
1,31±0,06*
1,29±0,07*
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
80
Ишемияреперфузия(10)
+Глибенкламид
59,3±3,00*
0,00
1,92±0,18y
0,50
1,33±0,09*
1,00
2,35±0,21y
NOx, мкмоль/дЛ
1,50
112,2±6,99y
100
2,00
Ишемияреперфузия(10)
+Аминогуанидин
Рис. 11. Влияние аминогуанидина (300 мг/кг) и глибенкламида (50 мг/кг) на
концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS при коррекции ADMAподобного гестоза 10 минутными эпизодами ишемии-реперфузии.
Примечания: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.
При введении аминогуанидина или глибенкламида животным с экспериментальным гестозом, леченным короткими эпизодами ишемииреперфузии, наблюдалось практически полное устранение положительного
влияния последних как в плацентарной ткани, так и в почках. В почках
наблюдались спазм и гипертрофия мышечного слоя мелких артерий. Эпителий канальцев уплощен, на значительных участках десквамирован. Заметной реакции мезангия не отмечено.
Морфологическая картина плаценты проявлялась ишемией ворсин и
интервиллезных пространств и слущиванием эндотелия в сосудах плаценты. Отмечаются очаги некроза децидуальных клеток в ткани плаценты. На
внешней поверхности плаценты наблюдали массивные отложения фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических
показателей и результаты иммуногистохимического исследования представлены в табл. 10, из которой следует, что 10-кратное воспроизведение
кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии на фоне введения амино30
гуанидина или глибенкламида положительного эффекта на морфофункциональные нарушения при ADMA–подобном гестозе не оказывало.
Таблица 10
Влияние аминогуанидина и глибенкламина на комплекс
патоморфологических изменений и экспрессию eNOS при
коррекции короткими эпизодами ишемии-реперфузии
ADMA-подобного гестоза (n=10)
№
п/п
1
2
3
4
5
Серия экспериментов
Комплексная
Экспрессия eNOS
оценка в баллах
в плаценте, %
Интактные беременные самки
0-1
5,4±0,21
L-NAME-индуцированный гестоз
5-6*
0,04±0,01*
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10)
2-3*
5,18±0,31
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10) +
5-6*
0,03±0,01*
аминогуанидин (300 мг/кг)
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10) +
5-6*
0,04±0,01*
глибенкламид (50 мг/кг)
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками.
Таким образом, однократное и 10-кратное воспроизведение 10 минутных ишемических эпизодов и введение рекомбинантного эритропоэтина проявило выраженное эндотелиопротективное действие на модели
ADMA-подобного гестоза, что выражалось в усилении эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной
дисфункции КЭД до уровня интактных животных, а также в уменьшении
нарушений микроциркуляции в плаценте. Кроме этого, 10-кратное воспроизведение 10 минутных ишемических эпизодов и введение рекомбинантного эритропоэтина приводило к снижению артериального давления, нормализации протеинурии, восстановлению функции NO-продуцирующей
системы. Морфологическое исследование выявило предотвращение деструктивных явлений ишемического генеза, вызванных введением LNAME при воспроизведении 10-кратных ишемических эпизодов и введении рекомбинантного эритропоэтина. Однако полной нормализации морфологической картины в почках и плаценте не наступало.
Следует отметить, что эффекты однократного воспроизведения и 10кратного воспроизведения ишемических эпизодов на NO-синтезирующую
функцию разнонаправленные. Данный факт говорит о различных механизмах реализации их эндотелиопротективного действия.
В представленных экспериментах показано, что введение аминогуанидина, являющегося ингибитором iNOS, или глибенкламида, являющегося блокатором АТФ-зависимых К+ каналов, животным с экспериментальным ADMA-подобным гестозом, леченным воспроизведением эпизодов
ишемии-реперфузии, практически полностью снимает положительный эффект последних. Это проявляется в устранении их гипотезивного эффекта,
снижении выраженности положительного влияния на функцию эндотелия,
снижении микроциркуляции в плацентарной ткани и показателей NO31
продуцирующей функции эндотелия до уровня нелеченых животных, а
также в восстановлении деструктивных повреждений в плацентарной ткани и почках ишемического генеза. Это говорит о важной роли iNOS и
АТФ-зависимых К+ каналов в реализации протективных эффектов эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции ADMA-подобного гестоза в эксперименте.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭРИТРОМИЦИНА
И АЗИТРОМИЦИНА ПРИ ADMA-ПОДОБНОМ ГЕСТОЗЕ
Введение азитромицина (30 мг/кг) приводило к статистически значимому снижению как систолического, так и диастолического давления у
животных с экспериментальным ADMA-подобным гестозом (рис. 12).
Введение эритромицина (30 мг/кг) не оказывало сколь-нибудь существенного влияния на данные показатели. Оба препарата примерно в равной
степени статистически значимо снижали КЭД до 1,88±0,16 и 1,82±0,09 соответственно (р<0,05), тогда как в группе нелеченых беременных самок,
получавших L-NAME, он составлял 3,06±0,32. Однако целевого уровня
снижение КЭД не достигало.
Курсовое введение эритромицина и азитромицина вызывало существенное улучшение микроциркуляции до 381,9±16,6 и 362,1±16,7
перфузионных единиц соответственно, что было достоверно выше,
чем у беременных самок с гестозом (p<0,05), и статистически не отличалось от значений микроциркуляции у интактных беременных
крыс. Кроме этого, происходило снижение белка в моче до уровня
интактных животных (рис. 12).
Введение эритромицина и азитромицина вызывало улучшение NOсинтезирующей функции эндотелия, что выразилось в увеличение уровня
нитрит-ионов в плазме крови под действием эритромицина и в статистически достоверном увеличение экспрессии eNOS под действием обоих препаратов (рис. 13).
При морфологическом исследовании почек и плаценты также обнаружен протективный эффект эритромицина и азитромицина. В сосудах
почек у животных, получавших L-NAME на фоне лечения эритромицином
и азитромицином, картина отличалась от контрольной группы беременных крыс. Наиболее выраженный положительный эффект от проводимой
терапии наблюдался в группе животных с использованием азитромицина.
Мелкие артерии коркового вещества почки с умеренными признаками гипертрофии мышечного слоя. Капилляры почечных клубочков полнокровны, базальные мембраны незначительно утолщены, симптом «проволочных петель» отсутствует. Заметной реакции мезангия не отмечено: среднее
количество клеток на клубочек составило 39,4+2,74 и 39,3+2,55 соответственно (в норме 38,5+3,29).
32
КЭД
20
150,5±2,3y
2
1,5
1
0,5
3,06±0,32*
180,8±11,1*
2,5
1,82±0,09y
40
3
1,88±0,16y
60
ДАД
1,28±0,23y
80
3,5
САД
107,7±4,8y
100
132,6±6,7*
120
82,0±5,8y
АД, мм рт. ст.
140
125±6,3y
160
136,7±7,4*
180
183,1±9,4*
200
0
0
Интактные
L-NAME
Эритромицин
Интактные
Азитромицин
L-NAME
Эритромицин
Азитромицин
2
450
1,8
400
0,6
0,4
0,2
0
Интактные
0
Интактные
L-NAME
1,88±0,19*
Протеинурия, г/л
1
0,8
0,79±0,11у
50
1,2
0,96±0,06у
100
1,4
0,90±0,10у
150
362,1±16,7y
200
381,9±16,6y
250
210,0±21,08*
300
425,9±39,6y
Микроциркуляция, ПЕд
1,6
350
Эритромицин
L-NAME
Эритромицин
Азитромицин
Азитромицин
Рис. 12. Влияние эритромицина (30 мг/кг) и азитромицина (30 мг/кг) на значения АД, КЭД, микроциркуляцию в плаценте и протеинурию при коррекции ADMAподобного гестоза.
Примечания: *- р<0,05 в сравнении с интактными беременными крысами;
Y
- р<0,05 по сравнению с группой беременных животных, получавших L-NAME.
2,50
120
L-NAME
Эритромицин
Азитромицин
105,4±4,16y
40
61,4±4,46*
60
112,2±6,99y
80
20
0,00
Интактные
eNOS, %
1,48±0,01*
1,84±0,17y
0,50
1,33±0,09*
1,00
2,35±0,21y
NOx, мкмоль/дЛ
1,50
117,0±3,55y
100
2,00
0
Интактные
L-NAME
Эритромицин
Азитромицин
Рис. 13. Влияние эритромицина (30 мг/кг) и азитромицина (30 мг/кг)на концентрацию NOx в плазме крови и экспрессию eNOS в эндотелии при коррекции ADMAподобного гестоза.
Примечания: *- р<0,05 в сравнении с интактными крысами; Y- р<0,05 в сравнении с группой животных, получавших L-NAME.
Морфологическое исследование плаценты при коррекции эритромицином и азитромицином L-NAME-индуцированного гестоза выявило однотипность гистологической картины в обеих группах, но более положительные явления выявлены у животных группы, получавшей азитромицин.
Плацента без патологических изменений, ворсины и интервиллезные про33
странства полнокровны. Имеются признаки ишемии плаценты функционального характера. На внешней поверхности плаценты наблюдались отложения фибрина.
Интегральная характеристика балльной оценки морфологических
показателей и результаты иммуногистохимического исследования представлены в табл. 11, из которой следует, что эритромицином и азитромицином достоверно снижали интегральную оценку в баллах (3-4) по сравнению с ADMA-подобным гестозом и повышали экспрессию eNOS в эндотелии сосудов плаценты.
Таблица 11
Влияние эритромицина и азитромицина на комплекс патоморфологических изменений и экспрессию eNOS в плаценте при моделировании
ADMA-подобного гестоза (n=10)
№
п/п
1
2
3
4
Серия экспериментов
Комплексная
Экспрессия eNOS
оценка в баллах
в плаценте, %
Интактные беременные самки
0-1
5,4±0,21
L-NAME-индуцированный гестоз
5-6*
0,04±0,01*
L-NAME + эритромицин (30 мг/кг)
3-4*
3,77±0,12*
L-NAME + азитромицин (30 мг/кг)
3*
4,28±0,21*
Примечание. * - р<0,05 в сравнении с интактными беременными самками.
Таким образом, эритромицин и азитромицин в дозе 30 мг/кг проявляли отчетливое эндотелиопротективное действие на модели L-NAMEиндуцированного гестоза, что выражалось в снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции до уровня интактных животных, улучшении
микроциркуляции в плаценте, а также в уменьшении снижения экспрессии
eNOS на фоне полного предотвращения протеинурии. Кроме этого, азитромицин проявлял умеренное гипотензивное действие, эритромицин
уменьшал падение стабильных метаболитов NOх в плазме крови. Морфологические исследования обнаружили уменьшение под влиянием эритромицина и азитромицина в указанных дозах развития нарушений в почках и
ишемических изменений в плаценте, не достигающих повреждения структур.
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВИТАМИНА B9,
СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ВИТАМИНОВ B9 И В6,
ВИТАМИННО-МИНЕРАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ «КОМПЛИВИТ®
ТРИМЕСТРУМ 2 ТРИМЕСТР» И «КОМПЛИВИТ® ТРИМЕСТРУМ
3 ТРИМЕСТР» ПРИ ADMA-ПОДОБНОМ ГЕСТОЗЕ
Введение исследуемых препаратов: фолиевой кислоты, сочетания
фолиевой кислоты и витамина В6, поливитаминно-минеральных комплексов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3
триместр» не оказывало сколь-нибудь значимого влияния на артериальное
давление на фоне моделируемого экспериментального ADMA-подобного
гестоза (рис. 14).
34
КЭД
0,5
0
100
50
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
2,0±0,1y
КТр3Тр
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
1,33±0,06у
358,1±30,8y
301,1±19,4y
316,4±17,4y
150
389,3±29,3y
200
210,0±21,08*
350
250
Интактные
1,41±0,07у
400
300
0
КТр3Тр
1,66±0,11*
КТр2Тр
1,69±0,15*
B6+B9
Протеинурия, г/л
B9
450
425,9±39,6y
Микроциркуляция, ПЕд
L-NAME
2,1±0,08y
1
2,10±0,1y
1,5
2,69±0,22*
2
20
Интактные
3,06±0,32*
182,1±5,1*
180,9±5,0*
170,2±7,2*
2,5
1,88±0,19*
40
3
1,28±0,23y
60
ДАД
0,90±0,10у
82,0±5,8y
80
3,5
САД
121,3±5,0*
100
138,9±6,1*
120
133,2±5,8*
125±6,3y
140
137,1±7,6*
160
188,2±7,4*
183,1±9,4*
180
136,7±7,4*
АД мм рт. ст.
200
0
0
Интактные
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
Интактные
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
Рис. 14. Влияние витамина B9 (0,2мг/кг), сочетанного применения витаминов B9
(0,2 мг/кг) и В6 (2 мг/кг), препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» (0,084
таб/кг) и «Компливит® триместрум 3 триместр» (0,084 таб/кг) на АД, КЭД, микроциркуляцию в плаценте и протеинурию при коррекции ADMA-подобного гестоза.
Примечание. Здесь и далее - КТр2Тр - «Компливит® триместрум 2 триместр»;
КТр3Тр - «Компливит® триместрум 3 триместр»; *- р<0,05 в сравнении с интактными
беременными крысами; Y- р<0,05 в сравнении с группой беременных животных, получавших L-NAME.
Введение фолиевой кислоты в монотерапии не приводило к коррекции КЭД. Введение фолиевой кислоты в сочетании с витамином В6, а также обоих поливитаминно-минеральных комплексов приводило к улучшению функции эндотелия, что выразилось в статистически значимом снижении КЭД. Улучшение микроциркуляции в плаценте происходило во
всех исследуемых группах (рис. 14).
Использование витаминно-минеральных комплексов «Компливит®
триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» у беременных животных с моделированием L-NAME-индуцированного гестоза статистически достоверно уменьшало количество белка в моче,
доводя его значение в последней группе животных до значения интактных животных. Использование фолиевой кислоты и сочетания
фолиевой кислоты и витамина В 6 не приводило к статистически значимому снижению протеинурии на данной модели патологии
(рис. 14).
35
Исследование влияния витамина B9, сочетанного применения витаминов B9 и В6, препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» на NO-синтезирующую функцию эндотелия при коррекции ADMA-подобного гестоза показало, что использование поливитаминно-минеральных препаратов «Компливит® триместрум 2
триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» статистически значимо
повышало концентрацию нитрит-ионов (рис. 15). Введение фолиевой кислоты и сочетания ее с витамином В6 не приводило к статистически значимому повышению концентрации нитрит-ионов в плазме крови у животных
с ADMA-подобным гестозом.
2,50
20
84,8±3,48y
40
82,8±3,74y
60
63,4±3,50*
1,69±0,1y
1,61±0,06y
1,40±0,06*
1,38±0,07*
0,50
1,33±0,09*
1,00
2,35±0,21y
NOx, мкмоль/дЛ
80
1,50
60,6±3,33*
100
61,4±4,46*
2,00
112,2±6,99y
eNOS, %
120
0
0,00
Интактные
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
Интактные
L-NAME
B9
B6+B9
КТр2Тр
КТр3Тр
Рис. 15. Влияние витамина B9 (0,2 мг/кг), сочетанного применения витаминов
B9 (0,2 мг/кг) и В6 (2 мг/кг), препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» (0,084
таб/кг) и «Компливит® триместрум 3 триместр» (0,084 таб/кг) на концентрацию NOx
в плазме крови и экспрессию eNOS при коррекции ADMA-подобного гестоза.
Примечание. Здесь и далее - КТр2Тр - «Компливит® триместрум 2 триместр»;
КТр3Тр - «Компливит® триместрум 3 триместр»; *- р<0,05 в сравнении с интактными
беременными крысами; Y- р<0,05 в сравнении с группой беременных животных, получавших L-NAME.
Динамика показателей экспрессии eNOS при применении описываемых в этой главе препаратов носила тот же характер, что и концентрация
стабильных метаболитов NO (рис. 15). Отмечалось статистически значимое увеличение показателей экспрессии еNOS только в группах животных,
получавших поливитаминно-минеральные препараты «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр».
При морфологическом исследовании почек и плаценты было выявлено, что введение фолиевой кислоты и ее комбинации с витамином В 6 не
приводило у улучшению гистологической картины в почках и плаценте.
При введении витаминно-минеральных комплексов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» отмечалась умеренно выраженная положительная динамика как в почках, так и в плаценте
(табл. 12). Кроме этого, происходило повышение экспрессии eNOS в эндотелии сосудов плаценты.
36
Таблица 12
Влияние витамина B9, сочетанного применения витаминов B9 и В6,
препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит®
триместрум 3 триместр» на комплекс патоморфологических
изменений и экспрессию eNOS при коррекции
ADMA-подобного гестоза (n=10)
№
п/п
1
2
3
4
5
6
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
0-1
5-6*
5-6*
5-6*
Экспрессия eNOS
в плаценте, %
5,4±0,21
0,04±0,01*
0,04±0,01*
0,03±0,01*
Интактные беременные самки
L-NAME
L-NAME + B9 (0,2 мг/кг)
L-NAME + B9 (0,2 мг/кг)+
B6 (2 мг/кг)
L-NAME +КТр2Тр (0,084 таб/кг)
4*
2,02±0,12*
L-NAME +КТр3Тр (0,084 таб/кг)
4*
1,83,±0,21*
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными беременными самками.
Таким образом, приведенные данные исследования указывают на то,
что минимальные протективные свойства были выявлены при использовании фолиевой кислоты в монотерапии и при сочетанном ее применении с
витамином В6. Выраженность положительных эффектов от применения
поливитаминно-минеральных препаратов «Компливит® триместрум 2 триместр» и «Компливит® триместрум 3 триместр» носила значимый характер
и проявилась в улучшении функции эндотелия, увеличении показателей
микроциркуляции в плаценте и повышении NO-синтезирующей функции
эндотелия, снижении протеинурии и положительной динамике морфологической картины в почках и плаценте.
Анализируя в сравнительном аспекте полученные данные с использованием в качестве критерия интегральный показатель морфологических
изменений, нужно отметить, что наиболее эффективным оказалось использование сочетания препаратов входящих в стандартную антигипертензивную терапию гестоза с фармакологическими агентами, влияющими на путь
L-аргинин – NO – цГМФ (табл.13). Это легко объясняется воздействием на
различные звенья патогенеза, в том числе, и на ключевое (рис.16). Кроме
этого, особого внимания заслуживают данные полученные при коррекции
экспериментального гестоза короткими эпизодами ишемии-реперфузии и
рекомбинантного эритропоэтина. В клинической ситуации, где значительно возрастает роль ишемических явлений в плаценте их применение будет
более актуальным.
Менее выраженные терапевтический эффект макролидов и поливитаминно-минеральных комплексов объясняется их влиянием на часть опосредованных звеньев патогенеза. Однако, это не сколько на уменьшает
проведенного исследования. Обе эти группы препаратов не могут рассматриваться как препараты выбора при целенаправленном лечении гестоза, но
37
НЕБЛАГОПРИЯТНЫЕ
ВНЕШНИЕ ФАКТОРЫ
ДИСАНГИОГЕНЕЗ
Нарушение синтеза и
функции факторов
роста, усиление
апоптоза
Нарушение инвазии
трофобласта, незрелость спиральных
артерий
Стресс, авитаминозы,
гиперхолистеринемия ожирение, интоксикации
Повреждение клеточных структур
ИШЕМИЯ
ТРОФОБЛАСТА
ОКСИДАТИВНЫЙ
СТРЕС
Образование перекисных
радикалов
Макролиды
Выделение ET-1,
TNF-α
Ингибирование еNOS,
недостаток NO
Короткие эпизоды
ишемии-реперфузии
Спазм сосудов
Ингибирование DDAh
Тадалафил
Нарушение
синтеза NO
Амлодипин
ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ
ДИСФУНКЦИЯ
ADMA,
DDMA
Гипергомоцистеинемия
Повышение чувствительности к ренину
Гиповитаминоз
В9, В12
L-аргинин
L-норвалин
Рис. 16. Современные представления о патогенезе гестоза и точки приложения
механизма действия исследуемых подходов его коррекции.
наличие у них данного плеотропного эффекта повышает актуальность
сбалансированного витаминного рациона при беременности, а в случае необходимой антибиотикотерапии для макролидов становиться немаловажным свойством в пользу их выбора.
Интегральная оценка комплекса патоморфологических изменений в
почках и плаценте при коррекции ADMA-подобного гестоза (n=10)
Серия экспериментов
Комплексная
оценка в баллах
0-1
5-6*
3*
3-4*
2-3*
2-3*
1-2*
Интактные беременные самки
L-NAME
L-NAME + метилдопа (0,086 г/кг/сут)
L-NAME + амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут)
L-NAME + L-аргинин (200 мг/кг/сут) +
амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут) +
2*
метилдопа (0,086 г/кг/сут)
L-NAME + L-норвалин (10 мг/кг/сут) +
1-2*
амлодипин (0,5 мг/кг/сут)
L-NAME + тадалафил (0,9 мг/кг)
3*
L-NAME + Ишемия-реперфузия(10)
2-3*
L-NAME + рекомбинантный эритропоэтин (50 МЕ/кг)
3*
L-NAME + эритромицин (30 мг/кг)
3-4*
L-NAME + азитромицин (30 мг/кг)
3*
L-NAME +КТр2Тр (0,084 таб/кг)
4*
L-NAME +КТр3Тр (0,084 таб/кг)
4*
Примечания: * - p<0,05 в сравнении с интактными беременными самками;
В заключении нужно отметить, что результаты проведенной работы
дают экспериментальное обоснование новых подходов профилактики и
лечения гестоза фармакологическими средствами направленными на преодоление и компенсацию ADMA-обусловленного ингибирования NOсинтезирующей функции эндотелия, а также активацию биологических
процессов лежащих в основе механизма положительных эффектов ишемического прекондиционирования.
Выводы
1. Разработанная модель ADMA-подобного гестоза (ежедневное внутрибрюшинное введение ADMA-подобного агента – N-нитро-L-аргининметиловый эфир крысам самкам с 14 по 20 день беременности) вызывала
развитие выраженной гипертензии, протеинурии, нарушение взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой сосудистых реакций,
снижение показателей микроциркуляции в плаценте и NO-синтезирующей
функции эндотелия почти в 2 раза. При морфологическом исследовании
плаценты и почек выявлены деструктивные изменения.
2. Использование для коррекции ADMA-подобного гестоза в эксперименте препаратов, входящих в стандартную антигипертензивную терапию гестоза, метилдопа (0,086 г/кг/сут) и амлодипин (0,5 мг/кг/сут), с 14 по
20 сутки беременности вызывало уменьшение протеинурии и структурных
нарушений в плацентарной ткани и почках, снижении артериального дав39
ления при введении метилдопы и коррекции взаимоотношения эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых механизмов вазодилатации при введении амлодипина.
3. Введение животным фармакологических агентов, влияющих на
путь L-аргинин – NO: аминокислоты L-аргинина (200 мг/кг/сут) и ингибитора аргиназы L-норвалина (10 мг/кг/сут), а так же их комбинации с препаратами, входящими в стандартную антигипертензивную терапию гестоза с
14 по 20 день беременности, приводило к выраженной коррекции патологических изменений при экспериментальном ADMA-подобном гестозе.
Наибольшая выраженность протективных эффектов наблюдалась при сочетанном использовании. Наблюдалось восстановление взаимоотношения
эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазорелаксации, улучшение
микроциркуляции в плаценте, восстановление NO-синтезирующей функции эндотелия, уменьшении протеинурии, снижение артериального давления. При морфологическом исследовании гистологическая картина в почках и плацентарной ткани приближалась к таковой в группе интактных
животных.
4. При коррекции ADMA-подобного гестоза воспроизведение однократного 10 минутного эпизода ишемии-реперфузии на 21 сутки беременности за 90 минут до проведения функциональных проб приводило к статистически значимому улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой
и эндотелийнезависимой реакций и повышению микроциркуляции в плаценте. Воспроизведение 10 10 минутных эпизодов ишемии-реперфузии с
10 по 20 сутки беременности приводило к умеренному гипотензивному
эффекту, статистически значимому улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте, снижению протеинурии, повышению NOсинтезирующей функции эндотелия, улучшению гистологической картины
в почках и плацентарной ткани. Ингибирование iNOS или блокада АТФзависимых К+ каналов снимали эффект прекондиционирования.
5. Фармакологическое прекондиционирование рекомбинантным
эритропоэтином в дозе 50 МЕ/кг однократно на 7, 10, 13, 16, 19 сутки беременности на фоне моделирования ADMA-подобного гестоза вызывало
умеренный, статистически достоверный гипотензивный эффект, улучшение взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой реакций, повышение микроциркуляции в плаценте, повышение активности
eNOS, снижение протеинурии, улучшение гистологической картины в
почках и плацентарной ткани, которая приближалась к группе интактных
беременных животных.
6. Введение тадалафила (0,9 мг/кг/сут) приводило к статистически
достоверному гипотензивному эффекту, достоверному улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте, снижению протеинурии, устранению выраженных деструктивных явлений ишемического генеза и умень40
шало нарушения функционального характера в плацентарной ткани и почках.
7. Введение эритромицина (30 мг/кг/сут) и азитромицина
(30 мг/кг/сут) с 14 по 20 сутки беременности приводило к статистически
достоверному улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте,
снижению протеинурии, статистически достоверному повышению экспрессии eNOS, устранению выраженных деструктивных явлений ишемического генеза и некоторому уменьшению нарушений функционального
характера. Под влиянием эритромицина происходило увеличение концентрации конечных метаболитов в плазме, под влиянием азитромицина
наблюдался умеренный гипотензивный эффект.
8. При использовании поливитаминно-минеральных комплексов
«Компливит® триместрум 2 триместр» (0,084 таб/кг/сут) и «Компливит®
триместрум 3 триместр» (0,084 таб/кг/сут) происходит коррекция морфофункциональных нарушений в условии ADMA-подобного гестоза. Их введение приводило к улучшению взаимоотношения эндотелийзависимой и
эндотелийнезависимой реакций, повышению микроциркуляции в плаценте,
снижению протеинурии, статистически достоверному увеличению показателей NO-синтезирующей функции эндотелия, уменьшению выраженности
деструктивных явлений ишемического генеза в почках и плаценте.
Список статей, опубликованных по теме диссертации
1.
Исследование дозозависимых кардиопротективных эффектов
макролидов / Е.С. Черноморцева, Т.Г. Покровская, Е.Б. Артюшкова,
М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Ю.В. Легкова // Российский медикобиологический вестник имени академика И. П. Павлова. – 2009. – № 1.
– С. 63-67. IP-0,036
2.
Экспериментальное изучение кардиопротекторного и эндотелиопротекторного действия макролидов и азалидов / Е.С. Черноморцева,
М.В. Покровский, В.В. Гуреев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2009. – Т. 72, № 2. – С. 29-31. IP-0,360
3.
Моделирование L-NAME-индуцированного гестоза у крыс /
А.А. Барсук, В.В. Гуреев, М.В. Покровский [и др.] // Актуальные вопросы
фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти
проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. –
С. 104-105.
4.
Использование L-аргинина в профилактике развития L-NAMEиндуцированного гестоза в эксперименте / В.В. Гуреев, А.А. Барсук,
Е.В. Проскурякова [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и
75-летию КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. – С. 165.
5.
Комбинированное использование L-аргинина и амлодипина в
коррекции L-NAME-индуцированного гестоза у крыс / М.В. Покровский,
Г.А. Лазарева, А.А. Барсук, В.В. Гуреев [и др.] // Актуальные вопросы
41
фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти
проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. –
С. 289-290.
6.
Использование
амлодипина
в
коррекции
L-NAMEиндуцированного гестоза крыс / Е.В. Проскурякова, А.А. Барсук, В.В. Гуреев [и др.] // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр.
межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию
КГМУ. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. – С. 304-305.
7.
Гуреев, В.В. Коррекция резвератролом ADMA-подобного гестоза в эксперименте / В.В. Гуреев, В.И. Кочкаров, Е.В. Проскурякова //
Научные ведомости Белгородского государственного университета.
Сер. Медицина. Фармация. – 2010. – № 22 (93), вып. 12. – С. 53–57. IP0,221
8.
Фармакологическая коррекция L-аргинином ADMA-eNOSассоциированных мишеней при экспериментальной преэклампсии /
М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Кубанский
научный медицинский вестник. – 2010. – № 1. – С. 85-92. IP-0,042
9.
Реалии и перспективы фармакологической коррекции ADMAeNOS - ассоциированных путей при преэклампсии / М.В. Покровский,
Н.Г. Филиппенко, В.В. Гуреев [и др.] // Рациональная фармакотерапия
в кардиологии. – 2010. – № 6 (6). – С. 882-887. IP-0,287
10. Комплексная оценка эндотелиопротекторной и кардиопротекторной активности макролидных антибиотиков при моделировании дефицита окиси азота / Е.С. Черноморцева, М.В. Покровский, В.В. Гуреев
[и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2010. –
Т. 73, № 9. – С. 20-23. IP-0,360
11. L-NAME–индуцированный гестоз у крыс / А.А. Барсук,
В.В. Гуреев, М.В. Покровский [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и
лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). –
М., 2010. – С. 575-576.
12. L-аргинин
в
профилактике
развития
L-NAMEиндуцированного гестоза у крыс / В.В. Гуреев, А.А. Барсук, Е.В. Проскурякова [и др.] // XVII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл. (Москва, 12-16 апр. 2010 г.). – М., 2010. – С. 601-602.
13. Cочетанное использование L-аргинина и амлодипина в коррекции L-NAME-ндуцированного гестоза в эксперименте / М.В. Покровский,
Г.А. Лазарева, А.А. Барсук, Е.В. Проскурякова, В.В. Гуреев [и др.] // XVII
Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл.
(Москва, 12-16 апр. 2010 г.). – М., 2010. – С. 704.
14. Амлодипин в коррекции L-NAME-индуцированного гестоза
крыс / Е. В. Проскурякова, А. А. Барсук, В. В. Гуреев [и др.] // XVII Рос.
нац. конгр. «Человек и лекарство»: сб. материалов конгр.; тез. докл.
(Москва, 12-16 апр. 2010 г.). – М., 2010. – С. 707.
15. Коррекция резверотролом ADMA-подобного гестоза у крыс /
О.С. Полянская, В.В. Гуреев, А.А. Барсук [и др.] // Биотехнология и био42
медицинская инженерия : материалы III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. Участием, посвящ. 75-летию Курск. гос. мед. ун-та. – Курск : Издво КГМУ, 2010. – С. 219-220.
16. Фармакологическая коррекция ADMA-eNOS-ассоциированных
мишеней при преэклампсии / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 2. – С. 16-20. IP0,628
17. Пути коррекции NO-дефицитного состояния при патологии беременных в эксперименте / В.В. Гуреев, М.В. Покровский, О.С. Полянская
[и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. – 2011. – № 4 (99), вып. 13/2. –
С. 40–43. IP-0,221
18. Влияние L-аргинина, витамина В6 и фолиевой кислоты на показатели эндотелиальной дисфункции и микроциркуляции в плаценте при
моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота /
М.В. Покровский, О.О. Новиков, В.В. Гуреев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – Т. 152, № 7. – С. 77-80.
IP-0,458
19. Arginase Inhibitor in the Pharmacological Correction of Endothelial
Dysfunction / M.V. Pokrovskiy, M.V. Korokin, V.V. Gureev [et al.] // International Journal of Hypertension. – 2011. – Vol. 2011. – Article ID 515047, doi:
10.4061/2011/515047.
20. Коррекция L-NAME-индуцированного гестоза в эксперименте
с помощью L-норвалина / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, И.В. Медведев [и
др.] // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч.
конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием (Курск, 19-20
апр. 2011 г.). – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – С. 291-292.
21. Коррекция микроциркуляции в плаценте с помощью дистантного прекондиционирования при ADMA-подобной модели гестоза /
О.С. Полянская, В.В. Гуреев, И.В. Медведев [и др.] // Молодежная наука и
современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых
ученых с междунар. участием (Курск, 19-20 апр. 2011 г.). – Курск: Изд-во
КГМУ, 2011. – С. 292-293.
22. Гуреев, В.В. Эндотелиальная дисфункция – центральное звено
в патогенезе гестоза / В.В. Гуреев // Научные ведомости Белгородского
государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. – 2012. –
№ 4 (123), вып. 17/1. – С. 5–12. IP-0,221
23. Гуреев, В.В. Роль витаминов в коррекции эндотелиальной дисфункции при экспериментальном гестозе / В.В. Гуреев // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина.
Фармация. – 2012. – № 4 (123), вып. 17/1. – С. 120–123. IP-0,221
24. Коррекция экспериментального гестоза препаратами из группы
макролидов / В.В. Гуреев, М.В. Покровский, А.А. Должиков [и др.] //
Научные ведомости Белгородского государственного университета.
43
Сер. Медицина. Фармация. – 2012. – № 4 (123), вып. 17/1. – С. 124–127. IP0,221
25. Коррекция дистантным ишемическим прекондиционированием
эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобном экспериментальном гестозе / В.В. Гуреев, М.В. Покровский, А.А. Должиков [и др.] // Научные
ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина. Фармация. – 2012. – № 4 (123), вып. 17/1. – С. 128–134. IP-0,221
26. Коррекция ADMA-подобного гестоза в эксперименте /
В.В. Гуреев, С.А. Алехин, А.А. Должиков, А.С. Мостовой // Курский
научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2012. – № 1.
– С. 14-19. IP-0,155
27. Использование L-аргинина в коррекции эндотелиальной дисфункции при экспериментальной преэклампсии / М.В. Покровский,
Т.Г. Покровская, В.В. Гуреев [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2012. – Т. 75, № 2. – С. 14-16. IP-0,360
28. Гуреев, В.В. Коррекция ADMA-подобного гестоза в эксперименте с помощью ингибитора аргиназы L-норвалина и препаратов, входящих в стандартную схему лечения / В.В. Гуреев, О.С. Полянская,
А.А. Должиков // Курский научно-практический вестник «Человек и
его здоровье». – 2012. – № 2. – С. 14-20. IP-0,155
29. Гуреев, В.В. Роль iNOS в коррекции эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобном гестозе короткими эпизодами ишемииреперфузии в эксперименте / В.В. Гуреев // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 8, Ч. 2. – С. 298-301. IP-0,193
30. Гуреев, В.В. Роль АТФ-зависимых К+ каналов в коррекции эндотелиальной дисфункции при ADMA-подобном гестозе короткими эпизодами ишемии-реперфузии в эксперименте / В.В. Гуреев [Электронный
ресурс] // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 5,
http://www.science-education.ru/105-7053. IP-0,188
31. Гуреев, В.В. Исследование роли дистантного ишемического
прекондиционирования в коррекции морфофункциональных нарушений
короткими эпизодами ишемии-реперфузии в условии ADMA-подобного
гестоза / В.В. Гуреев // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». – 2012. – № 3. – С. 5-9. IP-0,155
32. Полянская, О.С. Перспективы использования дистантного прекондиционирования в коррекции развития ADMA-подобного гестоза у
крыс / О.С. Полянская, Т.В. Корогодина, В.В. Гуреев // Молодая фармация
– потенциал будущего : материалы II Всерос. науч. конф. студентов и аспирантов (Санкт-Петербург, 18-19 апр. 2012 г.). – СПб., 2012. – С. 6-7.
33. Полянская, О.С. Коррекция экспериментального гестоза с помощью ингибитора аргиназ L-норвалина и ингибитора фосфодиэстеразы
5 тадалафила / О.С. Полянская, В.В. Гуреев, О.Ю. Иванова // Успехи современного естествознания. – 2012. – № 10. – С. 90-91.
34. Полянская, О.С. Исследование влияния коротких эпизодов
ишемии-реперфузии на течение ADMA-подобного гестоза / О.С. Полян44
ская, В.В. Гуреев, О.Ю. Иванова // Успехи современного естествознания. –
2012. – № 10. – С. 94.
35. Гуреев, В.В. Новые подходы к фармакологической коррекции
гестоза : метод. рекомендации / В.В. Гуреев, О.С. Полянская. – Курск :
Изд-во КГМУ, 2012. – 96 с.; ил.
Патенты РФ на изобретения
1.
Пат. 2449381 Российская Федерация. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции L-норвалином при ADMA-подобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.] ; заявитель и
патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию». – № 2010144195/14; опубл. 27.04.2012, Бюл. № 12. – 4 с.
2.
Пат. 2453000 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза
/ М.В. Покровский, В.В. Гуреев, Т.Г. Покровская [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский
университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному
развитию». – № 2010144193/14; опубл. 10.06.2012, Бюл. № 16. – 4 с.
3.
Пат. 2432618 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза
в эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, А.А. Барсук [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». – № 2010121673/14; опубл. 27.10.2011, Бюл. № 30. –
4 с.
4.
Пат. 2400826 Российская Федерация. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции азитромицином при моделировании хронического
грамположительного сепсиса / Е.С. Черноморцева, М.В. Покровский,
Т.Г. Покровская [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства
по здравоохранению и социальному развитию». – № 2009140129/14; опубл.
27.09.2010, Бюл. № 27. – 4 с.
5.
Пат. 2457548 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте поливитаминно-минеральным комплексом при ADMA-подобной модели гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации». – № 2011122318/14; опубл. 27.07.2012, Бюл. № 21. – 4 с.
6.
Пат. 2460149 Российская Федерация. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции поливитаминно-минеральным комплексом при
ADMA-подобной модели гестоза в эксперименте / М.В. Покровский,
В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.] ; заявитель и патентообладатель ГБОУ
ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства
45
здравоохранения и социального развития Российской Федерации». –
№ 2011122328/14; опубл. 27.08.2012, Бюл. № 24. – 4 с.
7.
Пат. 2449783 Российская Федерация. Способ коррекции LNAME индуцированного дефицита оксида азота L-норвалином в эксперименте / М.В. Покровский, Т.Г. Покровская, С.А. Цепелева [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». – № 2010132488/15; опубл. 10.05.2012, Бюл. № 13.
– 4 с.
8.
Пат. 2460148 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте при ADMA-подобной модели гестоза
в эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального
развития Российской Федерации». – № 2011116372/14; опубл. 27.08.2012,
Бюл. № 24. – 4 с.
9.
Пат. 2462766 Российская Федерация. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции рекомбинантным эритропоэтином при ADMAподобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская
[и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации». – № 2011116378/14; опубл.
27.09.2012, Бюл. № 27. – 4 с.
10. Пат. 2462253 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте азитромицином при ADMA-подобной
модели гестоза в эксперименте / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и
социального развития Российской Федерации». – № 2011116308/15; опубл.
27.09.2012, Бюл. № 27. – 4 с.
11. Пат. 2462765 Российская Федерация. Способ коррекции эндотелиальной дисфункции дистантным прекондиционированием при ADMAподобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская
[и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации». – № 2011116380/14; опубл.
27.09.2012, Бюл. № 27. – 4 с.
12. Пат. 2466462 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте рекомбинантным эритропоэтином при
ADMA-подобной модели гестоза / М.В. Покровский, В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и
социального развития Российской Федерации». – № 2011116371/14; опубл.
10.11.2012, Бюл. № 31. – 4 с.
46
13. Пат. 2481103 Российская Федерация. Способ коррекции нарушения микроциркуляции в плаценте при adma-подобной модели гестоза в
эксперименте однократным ишемическим эпизодом / М.В. Покровский,
В.В. Гуреев, О.С. Полянская [и др.]; заявитель и патентообладатель ГБОУ
ВПО «Курский государственный медицинский университет Министерства
здравоохранения и социального развития Российской Федерации». – №
2011136310/15; опубл. 10.05.2013, Бюл. № 13. – 4 с.
Патенты РФ на полезную модель
1. Пат. 97615 Российская Федерация. Устройство для дистантного
прекондиционирования / О.О. Новиков, М.В. Покровский, В.И. Кочкаров
[и др.] ; заявитель и патенообладатель ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет». – № 2010110708/22; опубл. 20.09.2010, Бюл. № 27.
– 4 с.
Список сокращений
АТ – ангиотензин
АД – артериальное давление
АГ – артериальная гипертензия
АХ – ацетилхолин
ГМК – гладкомышечная клетка
ДАД - диастолическое артериальное давление
ИЛ-1β - интерлейкин 1β
ИЛ-6 - интерлейкин 6
ИЛ-12 - интерлейкин 12
ИЛ-10 - интерлейкин 10
ИПФР - инсулиноподобный фактор роста
КЭД – коэффициент эндотелиальной дисфункции
САД – систолическое артериальное давление
СЭФР - сосудисто-эндотелиальный фактор роста
СЭФР-R - рецепторы СЭФР
ТФР-β - трансформирующий фактор роста α
ЧСС – частота сердечных сокращений
цГМФ – циклический гуанозин - монофосфат
ЭТ-1 - эндотелии-1
ЭД - эндотелиальная дисфункция
ЭЗВД – эндотелий-зависимая вазодилатация
ЭНВД – эндотелий-независимая вазодилатация
ЭК – эндотелиальная клетка
ADMA – асимметричный диметиларгинин
еNOS – эндотелиальной синтаза оксида азота
iNOS – индуцибельная синтаза оксида азота
L-NAME – NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир
L-NMMA – монометиларгинин
NO – оксид азота
NOS – NO-синтаза
PGI2 – простациклин
TNF-α – фактор некроза опухоли
47
48
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
9
Размер файла
1 281 Кб
Теги
коррекции, гестоза, пути, adma, enos, детерминированного, фармакологическая
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа