close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей ультрапресных вод.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Федотова Анна Вячеславовна
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФИЛЬТРУЮЩИХСЯ ФОРМ
БАКТЕРИЙ И АРХЕЙ УЛЬТРАПРЕСНЫХ ВОД
Специальность 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Института микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук
(ИНМИ РАН)
Научный руководитель:
доктор биологических наук, заведующий
лабораторией микробиологии болотных
экосистем, ИНМИ РАН
Дедыш Светлана Николаевна
Официальные оппоненты:
Турова Татьяна Павловна
доктор биологических наук, ведущий
научный сотрудник, ИНМИ РАН
Дорофеев Александр Геннадьевич
кандидат биологических наук, главный
специалист Курьяновского отделения
Инженерно- Технологического центра ОАО
Мосводоканал
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биохимии и
физиологии микроорганизмов им. Г.К.
Скрябина Российской академии наук
Защита состоится 25 июня 2013 в 1400 часов на заседании диссертационного совета
Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институт микробиологии им С.Н. Виноградского Российской академии наук по
адресу: 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН
Автореферат разослан «__» мая 2013 года
Учёный секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
Хижняк Татьяна Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Вопрос достаточности и качества природной пресной воды является одной из
наиболее актуальных проблем XXI века. Важнейшими природными центрами
формирования ультрапресных вод в условиях равнинных ландшафтов, характерных
для бореальной зоны России и других стран Северного полушария, являются
болотные экосистемы (Заварзин, Дедыш, 2008). Формирующиеся в болотах
гумусированные кислые воды питают многочисленные озера и реки северных
регионов. Анализ вод малых ацидных озер, расположенных на заболоченных
водосборах Верхней Волги показал, что микроорганизмы в них представлены
преимущественно клетками малых размеров, которые с трудом поддаются
идентификации с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и стандартного
набора группо-специфичных зондов (Куличевская и др., 2011). Существенная часть
представлена
ультрамикроформами,
проникающими
через
этих
клеток
«бактериальные» фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, которые повсеместно
используются для очистки воды, питательных сред, сывороток и проч. от клеток
микроорганизмов.
Несмотря на то, что интерес к фильтрующимся формам микроорганизмов появился
давно (Sherman, Safford, 1928; Kleinberger-Nobel, 1951; Имшенецкий, Солнцева, 1958),
сведения
о
них
остаются
весьма
ограниченными.
Впервые
термин
«ультрамикробактерия» был применен в 1981 году для описания морских
гетеротрофных бактерий с диаметром клеток менее 0.3 мкм, которые медленно росли
на стандартных питательных средах и не увеличивались в размерах при
продолжительном культивировании в лаборатории (Torella, Morita, 1981). В настоящее
время термин «ультрамикробактерия» применяют для обозначения клеток объемом
менее 0.1 мкм3 (Schut et al., 1997; Velimirov, 2001), а имеющиеся сведения об их
биологии и разнообразии суммированы в ряде обзоров (Velimirov, 2001; Panikov, 2005;
Duda, 2011; Дуда и др., 2012). Большинство этих организмов являются
свободноживущими гетеротрофами, однако известны и паразитические формы (Huber
et al., 2002; Сузина и др., 2011), а также потенциально опасные представители (Audic
et al., 2007).
Многие ультрамикробактерии способны проникать через фильтры с диаметром пор
0.22 мкм. Признание этого факта микробиологами долгое время сдерживалось тем
обстоятельством, что фильтрующиеся формы клеток или вообще не прорастают на
стандартных питательных средах, или же образуют ультрамикроколонии, незаметные
невооруженным глазом (Torella, Morita, 1981; MacDonell, Hood, 1982; Hahn, 2004). Эту
проблему «некультивируемости» фильтрующихся форм удалось частично решить
путем использования сильно разбавленных питательных сред и продолжительной
1
инкубации посевов. Применение такого подхода для анализа образцов воды ряда рек,
озер и прудов позволило получить коллекцию изолятов фильтрующихся форм
бактерий,
относящихся
к
филогенетическим
группам
Bacteroidetes,
Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Actinobacteria и Spirochaetes, многие из
которых были в дальнейшем охарактеризованы в качестве новых таксонов (Hahn,
2004; Hahn et al., 2009, 2010, 2012).
Ни один из приемов культивирования, однако, не позволяет охватить все
разнообразие присутствующих в образце микроорганизмов. Хорошей альтернативой
здесь является использование молекулярных методов, хотя перечень работ по
молекулярной идентификации фильтрующихся форм микроорганизмов остается
крайне
скудным.
Он
ограничен
исследованиями
проб
фильтрованной
средиземноморской воды (Haller et al., 1999), грунтовых вод урановой шахты (Miyoshi
et al., 2004), а также торфа кислых сфагновых болот (Panikov, 2005; Лысак и др., 2010).
Идентификация основных популяций фильтрующихся бактерий была также проведена
для воды ряда рек и озер Швейцарии (Wang et al., 2007). Было показано, что мл воды
этих пресноводных водоемов содержит около 104 микробных клеток, способных
проникать через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, что составляет от 0.03 до 3.6% от
общей численности бактериопланктона (Wang et al., 2007). Для водоемов России таких
исследований не проводилось. Настоящая работа, таким образом, была предпринята
для восполнения дефицита информации о численности и природе фильтрующихся
форм микроорганизмов в водах пресноводных экосистем севера Европейской части
России.
Цели и задачи исследования.
Цель работы - молекулярная идентификация ультрамикро-форм бактерий и архей в
ультрапресных водах экосистем водосбора Верхней Волги, а также водах Рыбинского
водохранилища.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1.
Определение численности клеток микроорганизмов, проникающих через
фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, в водах малых озёр и болот водосбора
Верхней Волги, а также воде Рыбинского водохранилища.
2.
Оценка применимости культуральных подходов для выявления и изучения
фильтрующихся микробных клеток.
3.
Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей воды
исследуемых экосистем путём формирования и анализа библиотеки клонов
генов 16S рРНК, а также сравнение состава фильтрующихся микроорганизмов в
водах водохранилища и водосборных территорий.
2
Научная новизна и значимость работы.
В настоящей работе впервые получены данные о численности и филогенетической
принадлежности фильтрующихся форм микроорганизмов в ультрапресных водах
природных экосистем водосбора Верхней Волги и Рыбинского водохранилища. Это
первое системное исследование фильтрующихся микробных клеток, выполненное для
водоемов России. Исследование показало, что численность фильтрующихся
микроорганизмов в природных водах может быть довольно высока и достигать 104
клеток в 1 мл воды. Установлено, что состав фильтрующихся бактерий на
заболоченных водосборных территориях отличен от такового в водах водохранилища.
Организмов, близких известным патогенам в составе фильтрующихся бактерий не
обнаружено. В составе фильтрующихся архей всех исследованных пресноводных
экосистем впервые выявлены представители неизученного и не полученного пока в
культурах кластера LDS филума Euryarchaeota. Результаты настоящей работы
свидетельствуют о том, что археи этой группы представлены клетками ультрамикродиапазона.
Практическая значимость.
Идентификация и изучение ультрамикроформ микроорганизмов ультрапресных
экосистем севера России имеет приоритетное значение в рамках проблемы
водопользования, оценки потенциальных рисков и совершенствования методик
очистки воды. В ходе выполнения работы получено и проанализировано около 250
клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся
бактерий и 300 клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК
фильтрующихся архей; из них в GenBank депонировано 215 последовательностей.
База данных этих последовательностей может быть использована для разработки
молекулярных методов детекции фильтрующихся микроорганизмов, основанных на
использовании ПЦР или микрочипов.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международных и российских
конференциях и симпозиумах:
1. Международной молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты
современной микробиологии», Москва, ИНМИ РАН, 2010.
2. 16-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных
«БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА», Пущино, ИБФМ РАН, 2012.
3. Конференции молодых учёных «Молекулярная и клеточная биология:
прикладные аспекты», Москва, 2012.
4. 4th Congress of European Microbiologists (FEMS-4), Geneva, Switzerland, 2011.
3
5.
14th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-14), Copenhagen,
Denmark, 2012.
Публикации.
Материалы диссертации содержатся в 8 печатных работах: 3 экспериментальных
статьях и 5 тезисах конференций.
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, глав, заключения и выводов, изложенных на …
страницах, включая … таблиц, … рисунков и списка литературы из …наименований,
из них … - на русском и …. – на английском языке.
Место проведения работы и благодарности.
Работа была выполнена в лаборатории Микробиологии болотных экосистем
Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института
микробиологии им С.Н. Виноградского РАН с 2009 по 2013 годы под руководством
д.б.н. С.Н. Дедыш.
Использованные в работе образцы воды и торфа были предоставлены автору к.б.н.
А.Н. Буториным и д.б.н. В.Т. Комовым (ИБВВ РАН). Электронно-микроскопические
исследования фильтрованной воды были проведены совместно с В.В. Сорокиным
(ИНМИ РАН) и к.б.н. Н.Е. Сузиной (ИБФМ РАН). Сравнительный анализ видового
состава фильтрующихся микроорганизмов различных экосистем проведен совместно с
Ю.М. Серкебаевой (ИНМИ РАН).
Работа выполнена при финансировании в рамках программы Президиума РАН
«Молекулярная и клеточная биология».
Автор выражает искреннюю благодарность всем вышеупомянутым участникам
данной работы, а также особую признательность д.б.н. С.Н. Дедыш и к.б.н. С.Э.
Беловой за полезные практические советы и помощь на всех этапах работы.
4
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
1. Объектами исследования были образцы воды, отобранные из малых ацидных озёр
Дубровское и Мотыкино, и торф болота Обуховское, расположенных на заболоченном
Молого-Шекснинском водосборе бассейна Верхней Волги, а также образцы воды
Рыбинского водохранилища, отобранные в районе гидрологической станции Брейтово
(Табл. 1).
Таблица 1. Характеристика исследованных в работе пресноводных экосистем
Пресноводная
экосистема,
расположение,
время отбора
образцов
Озеро Дубровское,
Вологодская
область, 58°10′N,
37°33′E, 06.2009
Озеро Мотыкино,
Вологодская
область, 58°10′N,
37°33′E, 06.2009
Болото
Обуховское,
Ярославская обл.,
58°14′N, 38°12′E,
05.2010
Водохранилище
Рыбинское,
станция Брейтово,
Ярославская обл.,
58°18′N, 37°52′E
07.2011
Число клеток, выявленных окраской ДАФИ
Трофность
рН
Общая
численность
микробных
клеток, мл-1
Численность
фильтрующихся клеток,
мл-1 (и их доля)
Дистрофное
4.4
3.89±0.40 × 106
1.69±0.53 × 104 (0.4%)
Олиготрофное
4.7
1.03±0.10 × 106
3.16±0.43 × 104 (3.1%)
Олиготрофное
4.2
8.06±0.86×108*
3.75±0.42 × 106* (0.5%)
Мезотрофное
7.0
1.44±0.08 × 106
2.28±0.16 × 104 (1.6%)
*
Данные численности приведены в расчете на 1 г сырого торфа.
2. Общую численность микроорганизмов в образцах определяли путём учёта
клеток, осаждённых из предварительно фиксированных спиртом (1:1) проб воды на
тёмных мембранных фильтрах «Millipore» с диаметром пор 0.22 мкм и окрашенных
1мкМ раствором ДНК-специфичного красителя ДАФИ (4', 6' – диамидино-2фенилиндол). Подсчёт клеток в препаратах производили с помощью микроскопа Zeiss
Axioplan 2 (Йена. Германия) со светофильтром Zeiss 02, специфичным для окраски
5
ДАФИ. Подсчет клеток производили в 100 полях зрения, с последующим расчётом на
1 мл воды. Численность фильтрующихся клеток в воде, пропущенной через фильтр с
порами 0.22 мкм, определяли путём их осаждения на фильтрах с диметром пор 0.09
мкм с последующей окраской и подсчётом по описанной выше методике.
3. Исследование фильтрующихся клеток с помощью электронной микроскопии
проводили с использованием многократно концентрированных фильтратов воды.
Суспензии клеток наносили на формваровые пленки-подложки, высушивали,
напыляли углеродом и исследовали на просвечивающем электронном микроскопе
JEM-1400 (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 КэВ.
4. Учет фильтрующихся клеток методом посева проводили с использованием
следующих питательных сред: 1) комплексной агаризованной среды R2A («Difco»),
разведенной в 100 раз; 2) среды SB2, содержащей (мг л-1): KNO3 – 50, NH4Cl – 50,
MgSO4 × 7H2O – 60, СaCl2 × 2H2O – 20, дрожжевой экстракт – 50, пируват Na – 300;
агар «Difco» - 18 г/л. Количество выросших колоний подсчитывали спустя 2 месяца
после посева. Выделение культур фильтрующихся микроорганизмов производилось
также с использованием жидких сред следующего состава (мг л-1): 1) MgSO4 × 7H2O
– 20, NH4NO3 – 30, дрожжевой экстракт – 50, оксалат Na – 100, сукцинат Na – 100,
малат Na – 100; 2) MgSO4 × 7H2O – 20, NH4NO3 – 30, дрожжевой экстракт – 10,
казаминовые кислоты – 10, пектин – 30; 3) MgSO4 × 7H2O – 20, NH4NO3 – 30,
казаминовые кислоты – 10, пептон – 10.
5. Идентификацию полученных изолятов проводили путем выделения ДНК из
клеток с использованием модифицированного метода, основанного на применении
додецил сульфата натрия (SDS) в качестве лизирующего агента (Dedysh et al., 1998),
ПЦР-амплификации фрагментов генов 16S рРНК с праймерами 9f и 1492r (Weisburg et
al., 1991), их секвенирования и анализа.
6. Сбор фракции фильтрующихся клеток для молекулярной идентификации
осуществляли путем пропускания воды через нитроцеллюлозные фильтры с
диаметром пор 0.22 мкм фирмы «Millipore» с помощью вакуумной установки той же
фирмы и последующего осаждения фильтрующихся форм на фильтре с диаметром
пор 0.09 мкм. При работе с образцами торфа, клетки предварительно десорбировали в
гомогенизаторе BagMixer 100 “MiniMix” (Interscience, Франция). Полученную
суспензию фильтровали через мембранные фильтры «Millipore» с диаметром пор 5
мкм для удаления крупных частиц, а дальнейшую обработку проводили, как описано
выше для образцов воды.
6
Фильтры с собранными на них клетками использовали для выделения тотальной
ДНК с использованием набора “FastDNA SPIN kit for soil”. ДНК использовали в
качестве матрицы в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с амплификацией
фрагментов генов 16S рРНК бактерий (праймеры 9f и 1492r, Weisburg et al., 1991) и
архей (праймеры 109f и 915r, Grosskopf et al, 1998) на термоциклере PE GeneAmp PCR
System 9700 (“Perkin Elmer Applied Biosystems”, США). Полученные ампликоны были
клонированы с помощью набора “pGem-T Easy Vector SystemII” (“Promega”). Отбор
рекомбинантных клонов осуществляли путем амплификации клонированных
фрагментов с использованием вектор-специфичных праймеров. Сортировку
полученных клонов осуществляли с помощью рестрикционного анализа. Выделение и
очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора “WizardR Plus
Minipreps DNA Purification System” (“Promega”). Определение нуклеотидных
последовательностей проводили на секвенаторе ABI 377A (“Perkin Elmer Applied
Biosystems”, США).
Редактирование полученных нуклеотидных последовательностей проводили с
помощью программы SeqMan (Laser Gene 7.0; DNA Star Package). Сравнение
полученных последовательностей с таковыми в базе данных GenBank осуществляли с
использованием программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Проверку
полученных библиотек клонов генов 16S рРНК на наличие химер проводили с
использованием
программы
Bellerophon
3.0
(http://comp_bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl). Построение филогенетических
дендрограмм осуществляли с использованием программного пакета ARB
(http://www.arb_home.de). Статистическую достоверность дендрограмм рассчитывали
с использованием программного пакета Phylip с помощью “bootstrap”- анализа путем
построения 1000 альтернативных деревьев.
Определенные в настоящей работе нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК
фильтрующихся форм прокариот депонированы в GenBank под номерами JN825208JN825301, JQ697092-JQ697150 и KC878619- KC878680.
8. Сравнение видового состава фильтрующихся микроорганизмов различных
экосистем проводили с использованием программного пакета MOTHUR (Schloss et
al., 2009), SINA Incremental Aligner (Pruesse et al., 2012) и SILVA в качестве
референсной базы данных (Quast et al., 2013). Последовательности с уровнем сходства
выше 97% были объединены в операционные таксономические единицы (ОТЕ) с
помощью алгоритма кластеризации Average neighbor. Построение диаграмм,
отражающих соотношение уникальных и общих ОТЕ в клонотеках, полученных из
различных образцов, производили с помощью программного пакета MOTHUR.
7
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Определение численности фильтрующихся клеток методом прямого
микроскопического учета. Общая численность бактериопланктона в воде ацидных
озер Дубровское и Мотыкино составила 3.89±0.40 и 1.03±0.10×106 клеток мл–1,
соответственно (Табл. 1). В тех же образцах воды, после их пропускания через фильтр
с порами 0.22 мкм было обнаружено 1.69±0.53 и 3.16±0.43 × 104 клеток мл–1, что
составило 0.4 и 3.1% общей численности микробных клеток.
Общая численность микроорганизмов в 1 г влажного торфа болота Обуховское
составила 8.06±0.86×108 клеток. Из них, через фильтр с порами 0.22 мкм были
способны проникать 3.75±0.42 ×106 клеток г-1, то есть 0.5% общего числа микробных
клеток. Величины того же порядка были получены ранее при оценке численности
фильтрующихся клеток в почве верхового торфяника (Лысак и др., 2010) при
пересчете на 1 г влажного торфа.
При анализе воды Рыбинского водохранилища было выявлено 1.44±0.08×106
микробных клеток мл-1, что согласуется с ранее опубликованными данными
(Романенко, 1971; Рыбинское водохранилище и его жизнь, 1972). После фильтрации в
образце было выявлено 2.28±0.16×104 клеток мл-1 или 1.6% общего числа микробных
клеток в исследуемой воде.
Таким образом, численность фильтрующихся микроорганизмов достигала 104
клеток в 1 мл воды озер и водохранилища и 106 клеток в 1 г сырого торфа верхового
болота, составляя до нескольких процентов общего числа микробных клеток.
2. Электронно-микроскопические исследования. Анализ фильтрованной воды с
помощью электронной микроскопии позволил выявить ряд объектов ультрамикроразмеров (120-250 нм), имеющих сферическую форму (Рис. 1). Малые размеры
затрудняли наблюдение клеточных структур, однако у ряда объектов просматривалась
клеточная стенка (Рис. 1, А1). Принятый в настоящее время консенсус в отношении
минимального размера, обеспечивающего самостоятельное существование живой
клетки, сводится к объему от 0.014 до 0.06 мкм3 и диаметру от 0.14 до 0.30 мкм (Koch,
1997; Maniloff, 1997; Psenner, Loferer, 1997). Выявленные в фильтрованной воде
объекты имели близкие характеристики, хотя следует иметь в виду возможность
некоторого уменьшения их размеров в процессе подготовки препаратов для
микроскопии. Примечательно, что в проведенных ранее исследованиях воды
Рыбинского водохранилища также отмечалось наличие большого числа крайне
мелких, с размерами на грани разрешения светового микроскопа (0.2 мкм), очень
коротких палочковидных и сферических клеток (Рыбинское водохранилище и его
жизнь, 1972).
8
Рис. 1. Электронная микрофотография клеток микроорганизмов, выявленных в фильтрованной воде
Рыбинского водохранилища (А, Б); маркер, 200 нм. Увеличенный имидж ультрамикро-клетки (А1);
маркер, 100 нм.
3. Культивирование на питательных средах. Возможность учета фильтрующихся
клеток методом посева была оценена на примере образца воды, отобранного из озера
Дубровское. Число колоний, сформировавшихся на средах R2A (1:100) и SB2 при
посеве фильтрованной воды составило 0.93×102 и 2.00×102 КОЕ мл-1, соответственно.
Таким образом, лишь 0.5-1.2% присутствовавших в фильтрованной воде клеток были
способны сформировать колонии при посеве на плотные питательные среды.
Рассев полученных колоний позволил выделить в чистую культуру 10 штаммов
бактерий. Определение частичной последовательности гена 16S рРНК изолятов
выявило высокое сходство (97-99%) с нуклеотидными последовательностями
известных представителей родов Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Pseudomonas,
Sphingomonas и Ralstonia (Таблица 2). Полученные из фильтрованной воды изоляты
имели клетки палочковидной морфологии, с диаметром 0.3-0.5 мкм (Рис. 2). При
дальнейшем культивировании в лабораторных условиях, однако, клетки изолятов
приобретали более крупные размеры (до 1-2 мкм), характерные для представителей
этих родов. Эти изоляты не представляли численно преобладающие популяции
фильтрующихся клеток, выявленные в воде с помощью молекулярного анализа (см.
раздел 4.1).
9
Таблица 2. Результаты идентификации изолятов бактерий, полученных из
образцов фильтрованной воды методом посева на питательные среды.
Сходство
Места отбора Выделенный
Ближайший культивируемый
генов
проб воды
штамм
филогенетический родственник
16S
рРНК, %
Озёра Дубровское
DSB20
Mesorhysobium amorphae (FG025126)
99
и Мотыкино
DSB21
Bradyrhizobium elkanii (FG025139)
99
DSB22
Sphingomonas sp. (AJ926494)
98
DSB4
Pseudomonas veronii (DQ525597)
99
DSB11
Pseudomonas veronii (DQ525597)
99
Sphingomonas rhizogenes (AY962684)
IS252
99
Sphingomonas melonis (AM777422)
IS251
98
IS260
PO9
PO4
PO15
PO65
Raltsonia sp. (GU936705)
100
PO6
Brachybacterium muris (NR024571)
99
Pln1
Водохранилище
Рыбинское
99
Parvibaculum lavamentivorans
(CP000774)
Polynucleobacter nessesarius subsp.
asymbioticus (AB470420)
Ralstonia picketii (CP001644)
Microbacterium oxydans (AJ717356)
Ralstonia detusculanse (AF280433)
ISlds
Болото
Обуховское
Ralstonia picketii (CP001644)
RB1
IS P3-6
Brevundimonas sp. (JQ396622)
Marmoricola scoriae (FN386750)
98
100
99
100
100
99
98
Исключение составили лишь изоляты рода Pseudomonas, штаммы DSB-4 и DSB-11,
нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК которых были идентичны
таковым, выявленным в фильтрованной воде с помощью молекулярного анализа (см.
раздел 4.1). Аналогичные результаты были получены для фильтрованной воды болота
Обуховское и воды водохранилища Рыбинское, откуда было выделено 7 штаммов
фильтрующихся бактерий (Таблица 2). Единственным изолятом истинной
ультрамикробактерии, полученной из исследованных образцов воды был штамм Pln1
(Рис. 2З) подвида Polynucleobacter nessesarius subsp. asymbioticus, детально
охарактеризованного ранее австрийскими исследователями (Hahn et al., 2009, 2012).
10
Рис. 2. Морфология клеток изолятов, полученных из фильтрованной воды методом посева: A –
DSB4Microbacterium sp. PO4, Б - Bradyrhizobium sp. DSB21, В – Ralstonia sp. PO65, Г –
Mesorhizobium sp. DSB20, Д - Brevundimonas sp. RB1, Е - Pseudomonas sp., Ж - Parvibaculum sp. IS
lds , З - Polynucleobacter nessesarius subsp. asymbioticus Pln 1. Маркер – 2 мкм.
11
Таким образом, метод посева оказался малопригоден для идентификации
фильтрующихся клеток, поэтому для получения более полного представления об их
разнообразии был применен анализ библиотек клонов, сформированных путем ПЦРамплификации генов 16S рРНК бактерий и архей из ДНК фракции клеток, собранных
из фильтратов воды.
4.Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий
Сформированная библиотека клонированных
4.1. Малые озёра водосбора.
нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся форм бактерий
включала 86 клонов, из которых 25 были получены из озера Дубровское, а 61 – из
озера Мотыкино. Из них 74 клонированных нуклеотидных последовательностей
принадлежали представителям класса Betaproteobacteria, 4 - Alphaproteobacteria, 2 Gammaproteobacteria и еще шесть представляли филум Actinobacteria (Рис. 3).
Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК бактерий, выявленных в фильтрованной воде, и ближайших
представителей филогенетических групп Proteobacteria и Actinobacteria. Клоны, полученные из воды
озера Дубровское и Мотыкино, обозначены буквенными индексами DB и MB соответственно.
Маркер – 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.
12
Фильтрующиеся формы бетапротеобактерий, выявленные в воде ацидных озер,
относились к семействам Oxalobacteraceae, Comamonadaceae and Burkholderiaceae.
Клонированные фрагменты генов 16S рРНК обнаруживали наибольшее сходство (9499%) с таковыми у представителей родов Herbaspirillum, Herminiimonas, Curvibacter и
Burkholderia. Нуклеотидные последовательности клонов DB27 и DB28,
представляющие класс Gammaproteobacteria, обнаруживали 99% сходства с
последовательностями гена 16S pPHK представителей рода Pseudomonas, выделенных
из талых льдов Арктики и речной воды (Vardhan Reddy et al., 2009).
Последовательности
этих
клонов
были
идентичны
нуклеотидным
последовательностям генов 16S рРНК штаммов DSB-4 и DSB-11, выделенных из
фильтрованной воды озер методом посева. Четыре клона, образующие общий кластер
с представителями класса Alphaproteobacteria, обнаруживали лишь отдаленное
родство (~90% сходства генов 16S рРНК) с таксономически описанными
организмами. Они проявляли наибольшее сходство (95-97%) с последовательностью
гена 16S рРНК неохарактеризованной бактерии Ellin362, выделенной из почв
Австралии (Sait et al., 2002). Шесть клонов, представляющих филум Actinobacteria,
обнаруживали наибольшее сходство (95%) с последовательностями гена 16S рРНК
типичного представителя ультрамикро-бактериопланктона пресной воды, ‘Candidatus
Planktophila limnetica’.
4.2 Сфагновое болото водосбора. Полученная из торфа библиотека клонированных
нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся форм бактерий
включала 100 клонов, из которых 65 нуклеотидных последовательностей
принадлежали представителям филума Proteobacteria и 35 – филума Bacteroidetes
(Рис. 4). Протеобактерии были представлены двумя классами – Betaproteobacteria (44
клона) и Gammaproteobacteria (21 клон), а филум
Bacteroidetes - классами
Flavobacteria (34 клона) и Sphingobacteria (1 клон).
Все клонированные последовательности генов 16S рРНК, относящиеся к
Betaproteobacteria, обнаруживали наибольшее сходство (98-99%) с таковыми у
бактерий рода Janthinobacterium, в том числе вида J. lividum, а также таксономически
неохарактеризованными, психрофильными представителями этого рода, выделенными
из осадков антарктического озера (Shivaji et al., 2011).
Класс Gammaproteobacteria был представлен 21 клонами, двадцать из которых
обнаруживали высокое (99%) сходство с последовательностями гена 16S рРНК
психрофильных представителей рода Pseudomonas – Ps. psychrophila, Ps. antarctica и
изолятов из Антарктики. Одна клонированная последовательность принадлежала
представителю рода Acinetobacter и была наиболее близка (99% сходства) к таковой у
изолята этого рода, выделенного из осадков талых вод Арктического ледника.
13
Большая группа клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S
рРНК фильтрующихся форм болотных бактерий принадлежала к классу Flavobacteria.
Из них 10 клонов представляли бактерий рода Chryseobacterium и 24 клона - бактерий
рода Epilithonimonas. Один клон обнаруживал высокое сходство (99%) с
последовательностями гена 16S рРНК Sphingobacterium faecium, выделенного из
Альпийских ледников.
Рис. 4. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа
клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся форм
бактерий, выявленных в торфе сфагнового болота, и некоторых представителей филогенетических
групп Proteobacteria и Bacteroidetes. Клоны, полученные из торфа Обуховского болота, обозначены
буквенными индексами POB. Маркер – 0.1 замещений на нуклеотидную позицию.
4.3 Рыбинское водохранилище. Полученная из образца фильтрованной воды
библиотека клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК
бактерий насчитывала 61 клон, 60 из которых принадлежали представителям класса
Betaproteobacteria
и
обнаруживали
высокое
сходство
(99.0-99.5%)
с
последовательностями генов 16S рРНК Polynucleobacter necessarius subsp.
asymbioticus (Рис. 5). Представители этого таксона - свободноживущие
ультрамикробактерии с объёмом клеток менее 0.1 мкм3, являющиеся типичными
обитателями пресноводных водоемов (Hahn, 2003; Hahn et al., 2009; Wang et al., 2009).
14
Особенно высока численность Polynucleobacter necessarius subsp. asymbioticus в
водоемах олиготрофного типа с застойными водами и высоким содержанием
гуминовых соединений. Изолят таких бактерий был получен в настоящей работе из
воды озера Дубровское (Таблица 2). О способности клеток этих бактерий проникать
через фильтры с диаметром пор 0.22 мкм сообщалось ранее (Hahn, 2004). Эти
бактерии имеют малый размер генома (2.1 млн. пар оснований) и являются
хемоорганотрофами, использующими ограниченный спектр органических кислот,
источником которых в природных экосистемах выступает фотодеградация гуминовых
соединений (Hahn et al., 2012).
Только одна из полученных последовательностей генов 16S рРНК фракции
фильтрующихся бактерий, клон RB150, принадлежала представителю класса
Alphaproteobacteria (Рис. 5). Она обнаруживала лишь отдаленное сходство (~90%) с
последовательностями гена 16S рРНК таксономически описанных организмов и
принадлежала к той же группе последовательностей, что и клонированная
последовательность МВ47, полученная из фильтрованной воды озера Мотыкино.
Рис. 5. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа
клонированных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК бактерий, выявленных в
фильтрованной воде, и некоторых представителей классов Alpha- и Betaproteobacteria. Клоны,
полученные из воды Рыбинского водохранилища, обозначены буквенными индексами RB. Маркер –
0.1 замещений на нуклеотидную позицию.
15
Рис. 6. Состав библиотеки клонов генов 16S рРНК бактерий, полученных из фракции
фильтрующихся клеток воды малых озер (А), торфа сфагнового болота водосбора (Б) и воды
Рыбинского водохранилища (В). 1 – Alphaproteobacteria, 2 - Betaproteobacteria, 3
Gammaproteobacteria, 4 - Actinobacteria, 5 - Bacteroidetes.
Состав фильтрующихся бактерий в проанализированных пресноводных
экосистемах представлен на Рисунке 6. Во всех случаях, в качестве доминирующей
группы выступали представители класса Betaproteobacteria. Для сфагнового болота
была характерна высокая доля представителей филума Bacteroidetes. Наибольшее
разнообразие фильтрующихся бактерий было выявлено в воде ацидных озер, а
наименьшее – в воде Рыбинского водохранилища.
5. Молекулярная идентификация фильтрующихся форм архей.
5.1 Малые озёра водосбора. Библиотека клонированных нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК архей, выявленных в фильтрованной воде
ацидных озер, включала 120 последовательностей представителей Euryarchaeota, из
них 48 были получены из озера Дубровское и 72 – из озера Мотыкино.
Лишь треть этих клонов обнаруживала высокое сходство (97-99%) с генами 16S рРНК
таксономически описанных организмов – представителей порядков Methanobacteriales
и Methanosarcinales (Рис. 7). 34 клона образовывали общие кластеры с нуклеотидными
последовательностями
метаногенов
рода
Methanobacterium,
а
также
последовательностями клонов, полученных ранее из болот Финляндии и США (Metje
et al., 2005; Cadillo-Quiroz et al., 2008) и многолетней мерзлотной почвы России (Metje
et al., 2007). Группы из 3-х и 4-х клонов, выявленные в фильтрованной воде,
обнаруживали высокое сходство с нуклеотидными последовательностями генов 16S
рРНК метаногенов рода Methanobrevibacter и Methanosarcina, соответственно.
16
Рис. 7. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа клонированных нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК архей, выявленных в фильтрованной воде озер (лиловый и
красный цвет), болота (зеленый) и водохранилища Рыбинское (синий). Маркер – 0.1 замещений на
нуклеотидную позицию.
17
Остальные клонированные последовательности были значительно удалены (7174% сходства генов 16S рРНК) от таковых у всех ранее охарактеризованных архей и
принадлежали к пока неизученному классу мезофильных Euryarchaeota с условным
названием LDS (Lake Dagow Sediment). Филогенетический кластер LDS был
сформирован в 2004 году, на основе группы клонов, выявленных в озерных осадках
(Glissman et al., 2003). В составе этого кластера клоны, полученные ранее в ходе
молекулярных исследований из различных, преимущественно северных, экосистем,
таких как меромектические озера, арктический шельф и северные реки (Galand et al.,
2006, 2008; Pouliot et al., 2009).
5.2 Сфагновое болото водосбора.
Библиотека фрагментов генов 16S рРНК
фильтрующихся архей, выявленных в торфе болота Обуховское, состояла из 77
клонированных нуклеотидных последовательностей, из них 73 последовательности
относились к филуму Euryarchaeota и 4 - к филуму Thaumarchaeota (Рис. 7).
Около половины клонов генов 16S рРНК эвриархей составляли нуклеотидные
последовательности метаногенов порядков Methanobacteriales, Methanomicrobiales и
Methanosarcinales. Особенно многочисленную группу (41 клон) составляли
последовательности генов 16S рРНК, принадлежащие к порядку Methanomicrobiales и
обнаруживающие 97-98% сходства с таковыми у болотного ацидофильного
метаногена Methanoregula boonei (Brauer et al., 2011). Эти археи являются типичными
обитателями кислых болотных экосистем и имеют очень мелкие клетки с диаметром
0.2-0.3 мкм. Единственный клон, представляющий порядок Methanobacteriales,
принадлежал к филогенетической ветви Methanobacterium subterraneum, метаногена с
очень тонкими (0.10 – 0.15 мкм в диаметре) палочковидными клетками (Kotelnikova et
al., 1998). Представители порядка Methanosarcinales были обнаружены нами как в
воде ацидных озер, так и в торфе болота. Другая половина клонированных
нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся болотных архей
принадлежала к двум неохарактеризованным классам мезофильных Euryarchaeota LDS (22 клона) и RC-V (Rice Cluster V) (5 клонов). Клонированные
последовательности представителей LDS, выявленные в торфе болота, образовывали
общие кластеры с последовательностями, полученными из воды ацидных озер
Дубровское и Мотыкино.
Четыре клонированные нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК
фильтрующихся форм болотных архей представляли Thaumarchaeota. Эта группа
архей насчитывает лишь ограниченное число культивируемых и охарактеризованных
представителей, однако среди них уже известны организмы с клетками ультрамикродиапазона. Среди последних – типичный обитатель морских вод Candidatus
Nitrosopumilus martimus, палочковидные клетки которого имеют диаметр 0.17 – 0.22
18
мкм (Könneke et al., 2005). Полученные в нашей работе последовательности
таумархей, однако, обнаруживали наибольшее сходство (до 99%) с клонами,
выявленными ранее в различных болотных экосистемах. По всей видимости,
отдельные группы в пределах Thaumarchaeota являются типичными обитателями
северных болот.
5.3 Рыбинское водохранилище. Библиотека клонированных
нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся архей насчитывала 105
клонов, представляющих филум Euryarchaeota (Рис. 7). Из них, 47 клонированных
фрагментов генов 16S рРНК принадлежали метаногенам порядков Methanobacteriales
и Methanomicrobiales. Представители порядка Methanobacteriales, филогенетически
близкие к Methanobacterium subterrenium, были выявлены нами ранее в составе
фракции фильтрующихся архей как в воде ацидных озер, так и в болотной воде. 18
клонированных последовательностей представляли порядок Methanomicrobiales и
обнаруживали высокое сходство с последовательностью гена 16S рРНК болотного
метаногена Methanoregula boonei (Brauer et al., 2011). Эти археи также выявлялись
нами ранее при анализе пула ультрамелких прокариот сфагнового болота. Остальные
58 клонов представляли два неохарактеризованных класса эвриархей - LDS и RC-V.
Наиболее многочисленными были последовательности, относящиеся к классу LDS, в
составе которого можно выделить, по крайней мере, четыре отдельных
филогенетических ветви (Рис. 7). Каждая из этих ветвей представлена нуклеотидными
последовательностями генов 16S рРНК, выявленными в ходе наших исследований в
воде ацидных озер и сфагнового болота водосборных территорий, а также воде
Рыбинского водохранилища. Очевидно, что представители класса LDS являются
типичными обитателями пресноводных экосистем севера России.
Групповая представленность фильтрующихся архей в проанализированных
пресноводных экосистемах показана на Рисунке 8. Во всех исследованных в
настоящей работе экосистемах в качестве доминирующей группы выступали
эвриархеи класса LDS. Представители класса RC-V составляли относительно
небольшую долю фильтрующихся архей в водах болота и водохранилища. От трети до
половины фильтрующихся архей составляли клетки известных метаногенов классов
Methanobacteriales, Methanomicrobiales и Methanosarcinales.
19
Рис. 8. Состав библиотеки клонов генов 16S рРНК бактерий, полученных из фракции
фильтрующихся клеток воды малых озер (А), торфа сфагнового болота водосбора (Б) и (В) воды
Рыбинского водохранилища. 1 - Methanobacteriales, 2 - Methanomicrobiales, 3 - Methanosarcinales, 4
– класс LDS, 5 – класс RC-V, 6 - Thaumarchaeota.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как
показало
настоящее
исследование,
численность
фильтрующихся
микроорганизмов, проникающих через «бактериальные» фильтры с порами
диаметром 0.22 мкм, в пресноводных северных экосистемах может быть довольно
велика и достигать 104 клеток в 1 мл воды. Лишь 0.5-1.2% этих клеток способны
сформировать колонии при посеве на традиционные агаризованные питательные
среды. Спектр изолятов, полученных из фильтрованной воды методом посева,
включал представителей хорошо известных таксонов, таких как виды родов
Mesorhizobium,
Bradyrhizobium,
Pseudomonas,
Sphingomonas,
Ralstonia
и
Microbacterium. Клетки этих бактерий имели тенденцию увеличения в размерах при
есть
не
являлись
истинными
культивировании
в
лаборатории,
то
ультрамикробактериями (Дуда и др., 2012). В своем большинстве, эти организмы
были нерепрезентативны для пула фильтрующихся бактерий, выявленного в воде с
помощью молекулярного анализа. Таким образом, метод посева оказался
малопригоден для выявления и идентификации фильтрующихся клеток. Более полное
представление об их разнообразии было получено с помощью анализа библиотек
клонов, сформированных путем ПЦР-амплификации генов 16S рРНК бактерий и
архей из ДНК фракции клеток, собранных из фильтратов воды.
Результаты сравнения разнообразия пула последовательностей генов 16S рРНК
фильтрующихся форм микроорганизмов воды Рыбинского водохранилища с таковым
в воде ацидных озер и сфагнового болота Молого-Шекснинского водосбора
представлены на Рисунке 9.
20
Рис. 9. Диаграмма, иллюстрирующая количество общих и уникальных операционных
таксономических единиц (ОТЕ) с уровнем сходства 97% среди клонов генов 16S рРНК бактерий (А)
и архей (Б), полученных из образцов фильтрованной воды Рыбинского водохранилища, а также
малых озер Дубровское и Мотыкино и болота Обуховское, расположенных на водосборных
территориях.
Как видно из диаграммы, разнообразие фильтрующихся бактерий в трех
исследованных пресноводных экосистемах было довольно низким, причем пулы
фильтрующихся бактерий этих экосистем существенно различались (Рис. 9А).
Наибольшее разнообразие фильтрующихся бактерий (10 ОТЕ) было выявлено в воде
ацидных озер, тогда как в воде водохранилища оно было наименьшим (3 ОТЕ). Ни в
озерах, ни в болоте не были обнаружены нуклеотидные последовательности
ультрамикробактерий подвида Polynucleobacter necessarius subsp. asymbioticus,
характерные для воды водохранилища, хотя изолят этих бактерий был получен из
фильтрованной воды озера Дубровское. По всей видимости, в озерной воде
численность Polynucleobacter necessarius subsp. asymbioticus была очень низка.
Единственным таксоном, общим для воды озер и болота были представители рода
Pseudomonas. Таким образом, видовой состав фильтрующихся бактерий воды
Рыбинского водохранилища был отличен от такового в водах болот и малых озер,
расположенных на водосборных территориях. Причиной этого может выступать
существенное различие величин рН и природы растворенного органического вещества
вод водохранилища и экосистем заболоченных водосборов. Результаты
идентификации фильтрующихся форм бактерий позволяют классифицировать их как
21
олиготрофных хемоорганотрофов, использующих продукты деградации гуминовых
соединений, которыми богаты воды, поступающие с заболоченных водосборов.
Филотипов, близких к известным патогенам, в составе фракции фильтрующихся
бактерий изученных пресноводных экосистем выявлено не было.
Иной результат был получен при сравнении пулов фильтрующихся архей (Рис. 9Б).
Филогенетическое разнообразие этих организмов было существенно выше такового у
бактерий – от 10 ОТЕ в воде водохранилища до 17 ОТЕ в воде ацидных озер. Четыре
ОТЕ, составленные представителями класса LDS, были общими для всех трех
исследованных экосистем, что подтверждает специфическую приуроченность архей
этой группы к пресноводным экосистемам. Метаногены вида Methanoregula boonei
были таксоном, общим для водохранилища и болота, тогда как археи, родственные
Methanobacterium subterrenium, выступали в качестве таксона, общего для
водохранилища и ацидных озер.
Таким образом, в отличие от пула фильтрующихся бактерий, который был
уникален для каждой из исследованных экосистем, видовой состав фильтрующихся
архей воды Рыбинского водохранилища обнаруживал существенное сходство с
таковым в озерах и болотах водосборной территории и характеризовался
доминированием представителей класса LDS. В составе этой группы архей пока нет
культивируемых представителей, но в GenBank имеется уже более 400 нуклеотидных
последовательностей ее представителей. Детальный анализ параметров экосистем, из
которых данные нуклеотидные последовательности были получены, показал, что
основными местообитаниями этой некультивируемой группы эвриархей являются
аэробные пресноводные экосистемы и пресноводные осадки (Barberan et al., 2011).
Сведения о физиологии или метаболическом типе представителей LDS до настоящего
времени доступны не были. Как свидетельствуют наши исследования, организмы этой
группы имеют клетки ультрамикро-диапазона. Исследование биологии этих архей
представляет значительный интерес для дальнейших исследований.
22
ВЫВОДЫ
1.
Впервые осуществлена оценка численности микроорганизмов, проникающих
через «бактериальные» фильтры с порами диаметром 0.22 мкм, в пресноводных
экосистемах водосбора Верхней Волги (малых ацидных озерах и сфагновом
болоте) и водах Рыбинского водохранилища. Показано, что численность
фильтрующихся микроорганизмов составляет 104 клеток в 1 мл воды озер и
водохранилища и 106 клеток в 1 г сырого торфа верхового болота.
2.
Установлено, что методы посева неприменимы для количественного учета
фильтрующихся микроорганизмов. Лишь 0.5-1.2% присутствовавших в
фильтрованной воде микробных клеток были способны формировать колонии на
питательных средах.
3.
Молекулярная идентификация фильтрующихся бактерий показала, что во всех
исследованных пресноводных экосистемах преобладают представители
Betaproteobacteria, однако видовой состав пула фильтрующихся бактерий был
уникален для каждой из исследованных экосистем.
4.
Подавляющее большинство выявленных в исследованных экосистемах
последовательностей генов 16S рРНК фильтрующихся бактерий обнаруживали
высокое сходство (97-100%) с таковыми у представителей хорошо изученных
родов, таких как Polynucleobacter, Pseudomonas, Herbaspirillum, Herminiimonas,
Curvibacter, Burkholderia, Janthinobacterium, Chryseobacterium и Epilithonimonas.
Филотипы, близкие к известным патогенам, в составе фракции фильтрующихся
бактерий выявлены не были.
5.
В отличие от бактерий, пулы фильтрующихся архей водосборных территорий и
водохранилища обнаруживали существенное сходство и характеризовались
преобладанием представителей неизученного филогенетического кластера LDS в
пределах Euryarchaeota. Нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК
представителей этого кластера обнаруживают лишь 71-74% сходства с таковыми
у охарактеризованных архей, а их клетки, по всей видимости, имеют
ультрамикро- размеры.
23
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
2.
3.
1.
2.
3.
4.
5.
Экспериментальные статьи
Федотова А.В., Белова С.Э., Куличевская И.С., Дедыш С.Н. (2012).
Молекулярная идентификация фильтрующихся форм бактерий и архей в воде
ацидных озер севера России. Микробиология. Т. 81, № 3. С. 306-312.
Белова С.Э., Федотова А.В., Дедыш С.Н. (2012). Ультрамикро-формы
прокариот в сфагновом болоте водосбора Верхней Волги. Микробиология. Т. 81,
№ 5. С. 665-671.
Федотова А.В., Серкебаева Ю.М., Сорокин В.В., Дедыш С.Н. Фильтрующиеся
формы микроорганизмов в водах Рыбинского водохранилища. Микробиология
(в печати).
Тезисы
Федотова А.В., Белова С.Э. Молекулярная идентификация фильтрующихся
форм бактерий и архей в воде ацидного озера Дубровское. Материалы VI
Международной молодёжной школы-конфкренции с международным участием
«Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, ИНМИ РАН, 2627 октября 2012. МАКС Пресс, Москва. С. 119-120.
Федотова А.В., Дедыш С.Н. Исследование фильтрующихся форм
микроорганизмов в воде Рыбинского водохранилища. БИОЛОГИЯ – НАУКА
XXI ВЕКА: 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых
учёных, 16-21 апреля 2012, Пущино. С. 46.
Федотова А.В. Молекулярная идентификация ультрамелких, фильтрующихся
форм микробных клеток в воде Рыбинского водохранилища. Конференция
молодых учёных «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты».
13 апреля 2012, Москва. С. 13.
Fedotova A.V., Belova S.E., Dedysh S.N. Phylogenetic analysis of microorganisms in
two acidic boreal lakes that pass through 0.2-mikrometr-pore-size-filters. 4th FEMS
Congress of European Microbiologists. June 26 – 30, 2011. Geneva, Switzerland.
Fedotova A.V., Dedysh S.N. Representatives of the uncultured Euryarchaeota clade
LDS prevail among filterable archaea in Northern freshwater habitats. 14th
International Symposium on Microbial Ecology. August 19-24, 2012. Copenhagen,
Denmark.
24
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
10
Размер файла
1 437 Кб
Теги
молекулярная, бактерии, идентификация, ультрапресных, архей, формы, вод, фильтрующихся
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа