close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Совершенствование способа получения моноклональных антител к структурному белку р30 вируса африканской чумы свиней с использованием рекомбинантных конструкций.

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Першин Андрей Сергеевич
Совершенствование способа получения моноклональных антител к
структурному белку р30 вируса африканской чумы свиней с использованием
рекомбинантных конструкций
06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с
микотоксикологией и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Покров - 2013
2
Работа выполнена в Государственном научном учреждении
Всероссийский
научно-исследовательский
институт
ветеринарной
вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных
наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).
Научный руководитель:
кандидат ветеринарных наук,
ведущий научный сотрудник
ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии
Капустина Ольга Владимировна
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук,
профессор,
ведущий научный сотрудник
ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии
Кушнир Анатолий Тимофеевич
доктор биологических наук,
зав. лабораторией иммунологии
ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии
Ездакова Ирина Юрьевна
Ведущая
организация:
Государственное
научное
учреждение
Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт
биологической промышленности (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково.
Защита диссертации состоится «17» октября 2013 г. в «1000» часов на
заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном
научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт
ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу:
601120, Владимирская обл., Покров. Тел/факс: (49243) 62125.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ
Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «29» августа 2013г. и размещен на
официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru
и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru
Ученый секретарь
диссертационного совета
ГНУ ВНИИВВиМ
Россельхозакадемии,
кандидат биологических наук
Балашова Елена Алексеевна
3
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность работы
Африканская
чума
свиней
(АЧС)
–
вирусная
болезнь,
характеризующаяся контагиозностью и летальностью, получила в настоящее
время широкое распространение на европейской территории Российской
Федерации.
Одним из основных белков вируса АЧС является структурный белок
vр30 входящий в состав внутренней мембраны вириона. vp30 имеет важное
диагностическое значение, поскольку синтезируется на ранних и поздних
стадиях
инфицирования
и
является
высококонсервативным
белком,
присущим большинству известных изолятов вируса АЧС. Данные факты
объясняют перспективность получения и изучения моноклональных антител,
специфичных к указанному белку.
В доступной литературе имеется ограниченное количество работ
посвящённых использованию ДНК-иммунизации для получения МкАт [14].
Обычно при получении МкАт в качестве иммуногена используют
очищенные и концентрированные вирусные антигены. Однако даже при
высокой степени их очистки не удаётся избавиться от примеси балластных
контаминирующих антигенов, часто имеющих высокую иммуногенность [4].
Использование рекомбинантных конструкций для иммунизации мышей
с целью получения МкАт заданной специфичности позволяет исключить
недостатки использования вирусных антигенов, так как устраняет наличие
контаминирующих антигенов, тем самым достигается стандартизация и
чистота иммуногена.
ДНК-иммунизация как метод доставки генетического материала имеет
ряд преимуществ перед иммунизацией белками. Наиболее важным является
запуск обоих ветвей иммунного ответа, что обеспечивает высокое качество
В-лимфоцитов для слияния, а так же увеличивает долю антител,
специфичных к конформационным эпитопам заданного белка.
4
S. Mazumder et al. (2011) при изучении индукции и длительности
иммунного ответа у мышей линии BALB/c при различных комбинациях
ДНК/белок
показали
преимущество
иммунизации
с праймированием
ДНК-плазмидой и последующим введением белка в растворимой форме [9].
Использование рекомбинантных антигенов и моноклональных антител,
полученных
на
их
основе,
также
позволяет
совершенствовать
иммунодиагностику, причем, эти подходы фактически позволяют исключить
использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве
диагностических тест-систем.
1.2 Степень разработанности проблемы
T.C. Whyard [11], A. Sanz [12] и рядом других зарубежных
исследователей получены МкАт к вирусу АЧС.
Во ВНИИВВиМ Н.И. Митиным с соавт. получены гибридомы
секретирующие МкАт к вирусу АЧС и разработаны диагностические
иммуноферментные тест-системы на основе МкАт к мажорному вирионному
белку р72 [3].
Т.Р. Кирюхиной отработан сэндвич вариант ТФ ИФА на основе МкАт к
vp72 для тестирования антигена вируса АЧС в культуральных и органных
материалах [2].
А.А. Пиря с соавт. получили 8 гибридных линий, продуцирующих
МкАт к вирусным полипептидам, пять из которых специфичны к
полипептиду с м.м. 31 кДа [4]. Однако их конформационные особенности не
позволили
использовать
полученные
МкАт
в
таких
реакциях
как
иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция.
Для получения моноклональных антител в данных исследованиях
использовали классические подходы иммунизации хроматографически
очищенными вирусными белками, без применения методов иммунизации
рекомбинантными
латекс-агглютинации.
конструкциями
и
скринирования
в
реакции
5
1.3 Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось совершенствование методологии
получения МкАт заданной специфичности, изучение их иммунохимических
свойств и возможности использования в различных серологических
реакциях.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить
следующие задачи:
1) подобрать оптимальные условия изготовления препаратов антигена
белка vр30 вируса АЧС;
2) отработать оптимальную схему иммунизации мышей линии BALB/c
-
доноров
спленоцитов,
используя
комбинированное
введение
ДНК/рекомбинантный белок;
3) получить стабильные линии гибридом, продуцирующие МкАт
заданной специфичности;
4) отработать методы скрининга позволяющие тестировать клоны
гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к vр30 вируса АЧС;
5) изучить иммунохимические свойства полученных МкАт.
1.4 Научная новизна результатов исследования
Впервые в Российской Федерации разработана схема иммунизации
мышей линии BALB/c с использованием комбинированного введения
плазмидной ДНК и рекомбинантного белка.
Впервые в Российской Федерации получены линии гибридом,
секретирующие
специфические
моноклональные
антитела
к
рекомбинантному белку p30 вируса АЧС, специфически взаимодействующие
как с рекомбинантным вирусспецифическим белком p30, так и с
натуральным.
Определены изотип, конформационная и эпитопная специфичность
полученных моноклональных антител клонов 7F7, 2B7, 1C12, 5D11.
С
помощью
полученных
МкАт
установлено
наличие
на
консервативном конформационном участке молекулы белка р30 трех не
6
перекрывающихся
антигенных
сайтов.
Один
из
них
является
конформационно зависимым.
С использованием полученных моноклональных антител показана
динамика накопления фосфопротеина р30 в чувствительной линии клеток
CV-1, инфицированных вирусом АЧС штамм 691/88.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
Усовершенствованная технология получения и скрининга МкАт на
основе плазмидной ДНК, несущей ген белка р30 вируса АЧС и
рекомбинантного белка р30 использована для получения МкАт заданной
специфичности.
Разработаны
«Методические
положения
по
получению
моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку р30 вируса
африканской чумы свиней (АЧС)», утвержденные академиком-секретарем
Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии А.М. Смирновым
10.11.2011 г.
Разработаны
«Методические
положения
по
получению
моноклональных антител к структурному белку p30 вируса африканской
чумы свиней с использованием метода «прайм-бустерной» иммунизации
рекомбинантными конструкциями», которые рассмотрены на учёном совете
и
утверждены
директором
ГНУ
ВНИИВВиМ
Россельхозакадемии
Д.В. Колбасовым 12.03.2013 г.
Получены, охарактеризованы, паспортизированы и заложены на
длительное
хранение
в
музей
гибридом
ГНУ
ВНИИВВиМ
Россельхозакадемии четыре клона гибридом - 7F7, 2B7, 1C12, 5D11,
продуцирующие моноклональные антитела к белку p30 вируса африканской
чумы свиней взаимодействующие как с рекомбинантным белком р30, так и с
вирусным антигеном.
Разработаны условия постановки ДАС ТФ ИФА, РНИФ, ИЦХ на
основе
МкАт
к
белку
р30,
предназначенные
для
обнаружения
специфических антигенов вируса АЧС в инфицированном материале.
7
1.6 Степень достоверности и апробация работы
Степень
подтверждена
достоверности
результатов
статистическими
приведённых
исследованиями
и
исследований
комиссионными
испытаниями. Научные положения и выводы диссертационной работы
аргументировано отражают содержание работы.
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены
на заседании секции «Инфекционной патологии животных» отделения
ветеринарной медицины РАСХН (27 апреля 2011 г), на 2й Международной
научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной
патологии
в
ветеринарной
медицине»
(Покров,
30
мая
2012г),
Международной научно-практической конференции «Достижения молодых
ученых в ветеринарную практику» ВНИИЗЖ (Владимир, 18 октября 2012г),
на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (2011-2013 гг.), совещаниях
научных сотрудников лаборатории «Биотехнологии» ВНИИВВиМ (20112013 гг.).
1.7 Публикации
По результатам исследований, выполненных по теме диссертации,
опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в журналах, входящих в
перечень ВАК.
1.8 Структура диссертации
Диссертация изложена на 119 листах машинописного текста по
общепринятой схеме и включает: введение, обзор литературы, материалы и
методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы,
практические предложения и список литературы (229 источников, в том
числе 26 – отечественных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами, 17
рисунками и дополнена приложениями.
1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
- использование комплекса методов сочетанной ДНК иммунизации и
введения рекомбинантного белка позволяет получить более 70% гибридом
заданной специфичности;
8
- полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку р30
взаимодействуют
в
различных
серологических
реакциях
только
с
антигенными детерминантами vp30 вируса африканской чумы свиней и
Rec p30;
- полученные моноклональные антитела позволяют установить наличие
на консервативном конформационном участке молекулы белка vр30 по
крайней мере, трех не перекрывающихся антигенных сайтов;
- полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку р30
выявляют локализацию вирусспецифического антигена в инфицированных
культурах клеток в иммуноцитохимической реакции.
1.10 Личный вклад автора в выполнение работы
Основной объём исследований проведён автором самостоятельно.
Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной помощи
сотрудников
лабораторий
Биохимии,
Биофизики,
Диагностики
и
Биотехнологии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
Исследования проведены в лабораториях Биотехнологии и Биохимии
ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы
Животные: в работе использовали мышей линии BALB/c 5-6-ти
недельного возраста для иммунизации при получении моноклональных
антител.
Взрослых
мышей
линии
BALB/c,
мышей
гибридов
(BALB/c х БЛНМ) F1 использовали в качестве доноров перитонеальных
макрофагов.
Вирусы: авирулентный штамм 691/88 вируса АЧС (6,5 lg ТЦД50/см3),
адаптированный к перевиваемой культуре клеток CV-1, полученный из
коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; вирус
болезни Тешена, штамм «Закарпатский» (8,5 lg ТЦД50/см3); вирус болезни
Ауески, штамм АС-21/07 (8,5 lg ТЦД50/см3).
9
Культуры клеток: в качестве партнера для слияния при получении
гибридом использовали клетки мышиной миеломы линии SP2/0-Ag14
(SP2/0), дефектные по гену гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы.
Для культивирования вируса АЧС и накопления антигена использовали
перевиваемые культуры клеток CV-1, катал.№ 43.3, и ППК-66б, катал.№ 9.4
полученные из лаборатории Биотехнологии ВНИИВВиМ. В качестве сырья
для
получения
препаратов
нормальных
антигенов
использовали
монослойные культуры клеток CV-1, РК-15, катал.№ 2.2
и ПСГК,
катал.№ 25.2 (каталог ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).
Бактериальные штаммы: штамм клеток E.coli BL21(DE3)pLysS, клон
рТТ9/ASFVp30, полученный во ВНИИВВиМ, содержащий рекомбинантную
плазмиду со встройкой участка гена CP204L вируса африканской чумы
свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка р30.
Латекс: для создания специфического латексного диагностикума в
качестве носителя использовали латекс АКРОЛАР-к (ТУ-6-09-10-1824-88) монодисперсные полиакролеиновые частицы, имеющие средний диаметр
5-7 мкм и концентрацию альдегидных групп 30 мкмоль/гр, окрашенные
сафранином Т в розовый цвет (Институт биоорганической химии, Москва).
2.2 Методы
2.2.1 Получение и очистка рекомбинантного белка
Рекомбинантный белок получали и очищали по методу, описанному
Т.Э. Южук с соавторами [6].
2.2.2 Получение гибридом
Гибридомы получали по методу G. Köhler и C. Milstein [10] в
модификации St.G. Fazekas и D. Scheidegger [8].
2.2.3 Получение препаратов нормальных антигенов
Культуры клеток однократно замораживали-оттаивали, осветляли
центрифугированием при 2500 об./мин. в течение 30 мин. Надосадок
отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 10 см3 бессывороточной среды
Игла МЕМ.
10
2.2.4 Иммуноэлектрофорез
Иммуноэлектрофорез проводили по методу П.Н. Грабара и С.
Уильямса в модификации J.J. Sheideger [1].
2.2.5 Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ)
Проводили
согласно
стандартной
методике,
рекомендованной
Международным эпизоотическим бюро и методике, описанной P.H. Bool et.
al. (1970) и C. Sanchez-Botija et al. (1970) [7, 13]. В качестве антивидового
конъюгата использовали ФИТЦ-конъюгат IgG козы к IgG мыши в рабочем
разведении.
Учет
реакции
проводили
в
отраженном
синем
свете
на
люминесцентном микроскопе при увеличении 1×90.
2.2.6 Непрямой вариант ТФ ИФА для скрининга МкАт
Скрининг и определение активности полученных МкАт, специфичных
к белку р30 вируса АЧС проводили в непрямом варианте твердофазного
иммуноферментного анализа и общепринятой методике, на полистироловых
пластинах (Cliniplate, Dynatech microelisa) [5].
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Определение иммуногенности рекомбинантного р30
Перед получением МкАт к рекомбинантному антигену изучали его
иммуногенность
и
способность
полученных
сывороточных
антител
реагировать, как с рекомбинантным белком, так и с вирусным антигеном.
В результате прайм-бустерной иммунизации кроликов препаратами
рекомбинантной плазмиды (рТТ9/ASFVp30) со встройкой участка гена
CP204L вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный
эпитоп белка р30 и очищенного рекомбинантного белка р30 получены
моноспецифические гипериммунные сыворотки крови. Анализ активности
полученных сывороток проводили в реакции непрямого ТФ ИФА.
Активность антител исследуемых сывороток со специфическим вирусным
антигеном АЧС составила 1:256-1:1024, а с Rec р30 достигала значений
1:1024-1:4096 (таблица 1).
11
Таблица 1 – Активность моноспецифических сывороток, полученных
к рекомбинантному белку р30
Активность сывороток в ТФ ИФА с различными
антигенами
Испытуемые сыворотки,
Специфический
культуральный антиген
вируса АЧС
Рекомбинантный антиген р30
1:256 - 1:1024
1:1024 - 1:4096
1:8192
1:16384
NS кролика
0
0
NS крови свиньи
0
0
SS кроликов к
рекомбинантному белку
р30, n=5*
SS крови свиньи к вирусу
АЧС (гипериммунная)
Примечания: SS – специфическая сыворотка; NS – нормальная сыворотка;
знаком 0 обозначено отсутствие выявления вирусспецифических антител;
*- представлены средний диапазон величины активности полученных сывороток
При
проведении
детекции
антигенов
вируса
АЧС
иммуноцитохимическим методом ИФА с использованием сыворотки к
рекомбинантному белку p30 было установлено, что антитела сыворотки
взаимодействовали с антигенами вируса африканской чумы свиней, в
частности, белком р30, в разведениях с 1:20 до 1:160. Антитела сыворотки не
взаимодействовали с антигенами интактной культуры клеток (рисунок 1).
Таким образом, можно заключить, что антитела, вырабатывающиеся к
рекомбинантному
белку
р30,
способны
распознавать
эпитопы
специфического белка вируса АЧС и, следовательно, рекомбинантный белок
пригоден для иммунизации мышей с целью получения моноклональных
антител к данному белку.
При
исследовании
моноспецифической
сыворотки
в
иммуноэлектрофоретической реакции с препаратами рекомбинантного и
специфического антигенов (рисунки 2 и 3) чёткость и яркость линии
преципитации показывает чистоту полученного препарата рекомбинантного
белка.
12
Рисунок 1 - Иммуноцитохимическая демонстрация выявления антигенных
детерминант белка р30 вируса АЧС в клетках CV-1 с применением специфической
сыворотки.
Примечание: А-В – гипериммунная сыворотка кролика к рекомбинантному белку
p30, в разведениях 1:20, 1:40, 1:160 (соответственно). Г. – интактная культура. Д. –
специфическая сыворотка свиньи; Е. – нормальная сыворотка кролика
Рисунок 2 – Иммуноэлектрофореграмма.
Примечание: в лунке препарат рекомбинантного белка р30. В канавке
гипериммунная моноспецифическая сыворотка крови кролика к рекомбинантному белку
р30
Рисунок 3 – Иммуноэлектрофореграмма.
Примечание: в лунке лизат инфицированных вирусом АЧС клеток CV-1. В канавке
гипериммунная моноспецифическая сыворотка крови кролика к рекомбинантному белку
р30
13
3.2 Изготовление культурального препарата вирусспецифического
антигена, содержащего vp30 вируса АЧС
Для получения препарата культурального антигена содержащего
максимальное количество vp30 проводили изучение динамики накопления
vр30 в клеточных культурах CV-1 и ППК-66б, инфицированных вирусом
АЧС штамм 691/88 (рисунок 4). Контроль уровня накопления проводили
непрямым ТФ ИФА и ИЦХ ИФА на основе полученной моноспецифической
сыворотки к рекомбинантному белку р30. Результаты представлены на
рисунке 4.
Динамика накопления р30 в культуре клеток CV-1
0,80
Показатель оптической плотности ОП405
0,70
Доза
заражения
0,001 ТЦД на
клетку
Доза
заражения
0,01 ТЦД на
клетку
Доза
заражения
0,1 ТЦД на
клетку
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
1
2
3
4
5
6
Сутки после инокуляции культуры
вирусом АЧС
Рисунок 4 - Динамика накопления антигена р30 вируса АЧС при заражении
культуры клеток CV-1 штаммом 691/88.
Примечание: средние значения оптических плотностей для построения диаграммы
рассчитывали на основании данных опытов, проведенных в 5 повторностях
Наибольшее накопление антигена вирусного белка р30 получено в
культуре клеток CV-1 при множественности заражения 0,001 ТЦД50 на
14
клетку, времени инкубирования 72-96 часов при достижении 40% ЦПД.
Лучший результат выхода антигена белка р30 получен при обработке
вируссодержащего материала 1,1,2-трифтортрихлорэтаном (фреон-113).
При изучении динамики накопления антигенов р30 в культуре клеток
CV-1 в реакции ИЦХ ИФА максимальное специфическое окрашивание
инфицированных клеток также наблюдали на 4е сутки (рисунок 5).
А
Б
Рисунок 5 - Динамика накопления р30 в культуре клеток CV-1 в
иммуноцитохимическом иммуноферментном анализе.
Примечание: А – взаимодействие специфического антигена АЧС инфицированной
культуры с моноспецифической сывороткой через 24 часа после заражения.
Б - взаимодействие специфического антигена АЧС инфицированной культуры с
моноспецифической сывороткой через 96 часов после заражения
3.3 Сравнительный анализ методов иммунизации животных
Так как ДНК-иммунизация относительно новый метод получения
доноров иммунных лимфоцитов, и нет общепринятого протокола введения
иммуногенных субстанций, было необходимо разработать и протестировать
оптимальную схему иммунизации мышей линии BALB/c рекомбинантным
белком р30 и плазмидой, кодирующей продукцию этого белка.
Иммунизацию проводили по схеме, представленной в таблице 2. Схема
иммунизации
для
первой
группы
предусматривала
праймирование
15
рекомбинантной плазмидой, несущей целевой ген, и последующую
трёхкратную иммунизацию рекомбинантным белком с равным по объёму
количеством адъюванта Фрейнда (АФ). Схема иммунизации для второй
группы состояла из праймирования и последующего трёхкратного введения
рекомбинантного белка сорбированного на целлюлозе. Третья группа –
четырёхкратное введение рекомбинантного белка в смеси с АФ. Интервал
между введениями составлял 14 дней.
Таблица 2 – Схемы иммунизации мышей линии BALB/c
Номер
группы
Сутки
1
Введение
0
в/м ДНК
плазмида
Титр
антител
34
Rec p30
(100
мкг/мышь)
38
НАФ, в/бр
1600
ПАФ, п/к
1600-3200
800-1600
НАФ, в/бр
3200
400-800
НАФ, в/бр
1600
Титр
антител*
Rec p30 (100
мкг/мышь)
Титр антител
Rec p30 (100
мкг/мышь)
Титр
антител
10
10
20
24
0
ПАФ, п/к
800-1600*
2
в/м ДНК
плазмида
0
3
в/м рек.белка
-
ЗФР,
целлюлоза,
в/м
ПАФ
ЗФР,
целлюлоза,
п/к
ПАФ, п/к
48
3200-6400
1600
Примечание: ПАФ, НАФ – полный и неполный адъювант Фрейнда; введение антигенов: п/кподкожное, в/м-внутримышечное, в/бр-внутрибрюшинное.*- обратные величины титров антител
сывороток мышей в непрямом ТФ ИФА с рекомбинантным белком р30
В результате экспериментов, установлено, что активность сыворотки
при иммунизации с праймированием ДНК значимо выше, чем при введении
одного белка. Активность сыворотки при использовании целлюлозы в
качестве адъюванта значимо выше, чем при использовании полного
адъюванта Фрейнда.
Очевидно, что сорбция рекомбинантного белка р30 на целлюлозе в
значительной степени увеличивает размер вводимого антигена и усиливает
иммунный ответ, значительно повышая эффект иммунизации.
3.4 Получение гибридом секретирующих МкАт к структурному
белку р30 вируса АЧС
За три дня до проведения процедуры гибридизации провели мышам
внутриселезёночную инъекцию в дозе 100 мкг рекомбинантного белка р30 на
животное, активность сыворотки после этой инъекции составила 1:12800.
После скринирования полученных гибридом через 7-10 суток,
продукция специфичных к р30 иммуноглобулинов была зарегистрирована в
16
493 лунках, т.е. более 70% от числа рассаженных (672 лунки). В результате
было отсажено более 1500 клонов.
Из общего количества гибридных клонов было отобрано 7 - 1С2, 1D12,
2B10, 5F5, 5D11, 2B7, 7F7, имеющие наивысший титр активности в
непрямом ТФ ИФА с рекомбинантным белком р30 и специфическим
антигеном вируса АЧС. Клонированные клетки отобранных гибридом,
культивировали in vitro в бессывороточной среде HSF Serum-Free Medium for
Hybridoma Cells (Sigma, USA) в количестве достаточном для проведения
дальнейших
исследований.
Уровень
накопления
специфичных
иммуноглобулинов в культуре клеток составлял до 100-350 мкг/см3.
3.5 Скрининг и оценка диагностических свойств полученных
МкАт в реакции латекс-агглютинации
Работу
проводили
при
оказании
научно-консультативной
и
практической помощи д.б.н. Пономарёвым В.Н.
В
реакции
латекс
агглютинации
(рисунок
6)
выявили
486
положительных лунок, таким образом, РЛАГ показала 98% совпадение с
непрямым ТФ ИФА (493 положительные лунки) при скрининге продукции
антител клонами гибридом. Следовательно, учитывая время постановки
реакции, равное 10-30 минутам, РЛАГ может быть использована для
быстрого скрининга продукции МкАт гибридомами.
3.6 Использование реакции латекс-агглютинации для выявления
гибридных клеток, продуцирующих специфические антитела
Наличие рецепторов иммуноглобулинов на поверхности B-лимфоцитов
и гибридных клеток (миелома+лимфоцит), позволило изучить использование
РЛАГ
на основе рекомбинантного белка р30 для отбора клонов,
секретирующих МкАт к белку р30. В результате наблюдали агглютинацию
частиц латекса присутствующими в культуральной жидкости антителами, а
также адсорбцию частиц латекса на поверхности клеток (рисунок 7).
17
Рисунок 6 - Реакция латекс агглютинации с культуральными жидкостями гибридом
Рисунок 7 - Результаты взаимодействия латексного диагностикума и клеток
гибридом
18
3.7
Определение
полипептидной
специфичности
полученных
моноклональных антител в иммуноблоттинге
При определении полипептидной специфичности МкАт полученных к
рекомбинантному белку р30 вируса АЧС было установлено, что они
взаимодействовали со специфическим культуральным антигеном вируса
АЧС штамма 691/88 (окрашивание реплики на уровне 30 кДа) и с лизатом
клеток клона pTT9/ASFVp30, продуцирующего рекомбинантный белок p30
(окрашивание реплики на уровне 14 кДа) и не взаимодействовали с
нормальным культуральным антигеном, полученным из лизата перевиваемой
культуры
клеток
взаимодействовали
CV-1.
только
Моноклональные
с
антитела
рекомбинантным
клона
белком
и
2B7
не
взаимодействовали с культуральным антигеном, что, вероятно, обусловлено
изменением конформации распознаваемых эпитопов при денатурации пробы
во время электрофореза (рисунок 8).
Рисунок 8 - Полипептидная специфичность полученных МкАт.
Примечание: А – белковый электрофорез в 10% ПААГ (в качестве источника
рекомбинантного белка р30 использовали лизат клеток рекомбинантного клона
pTT9/ASFVp30); Б – блоттограмма исследования культуральной жидкости клона 7F7; В –
блоттограмма исследования клона 5D11; Г – блоттограмма исследования клона 2B7
3.8 Определение класса и подкласса моноклональных антител
Изотип секретируемых гибридомными клонами моноклональных
антител определяли методом ТФ ИФА с использованием набора "Mouse
19
Monoclonal Antibody Isotyping Kit" (Sigma). В результате проведенных
исследований установлено, что клоны МкАт 2B7, 7F7 и 5D11 имеют изотип
IgG1, а клон 1C2 изотип IgG2a.
3.9 Изучение активности и специфичности моноклональных
антител к рекомбинантному белку р30 вируса АЧС в реакции непрямой
иммунофлуоресценции
Полученные моноклональные антитела, продуцируемые клонами
гибридом 7F7, 2B7 и 5D11, специфически взаимодействовали с антигеном
вируса АЧС в РНИФ. Специфическую гранулярную цитоплазматическую
флуоресценцию в инфицированных клетках (рисунок 9) наблюдали при
использовании разведений проб трех клонов до 1:256. Титр МкАт,
определенный в РНИФ составил 8 log2.
Рисунок 9 - Выявление вируса АЧС в инфицированной культуре клеток в РНИФ.
Примечание: А – нормальный культуральный тест-препарат культуры клеток CV-1,
инкубированный с культуральной жидкостью клона 7F7; Б – специфический
культуральный тест-препарат, инкубированный с культуральной жидкостью клона 7F7
3.10 Изучение динамики накопления белка р30 в перевиваемых
культурах клеток CV-1 с использованием моноклональных антител
Полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку р30
позволяют
выявлять
локализацию
вирусного
антигена
в
иммуноцитохимической реакции. Для определения оптимальных параметров
постановки
иммуноцитохимического
ИФА
с
использованием
МкАт
20
специфичных к белку р30 вируса АЧС проводили изучение динамики
накопления vр30, в инфицированной культуре клеток CV-1, используя
полученные моноклональные антитела (рисунок 10).
А
Б
Рисунок 10 - Динамика накопления р30 в культуре клеток CV-1 в
иммуноцитохимическом иммуноферментном анализе.
Примечания: А – взаимодействие инфицированной культуры с моноклональными
антителами клона 7F7 через 24 часа после заражения. Б - взаимодействие
инфицированной культуры с моноклональными антителами клона 7F7 через 96 часов
после заражения
Окрашенные отдельные клетки и группы клеток выявляли через 18-24
часа после заражения, а через 48 часов окрашивание клеток приобретало
массовый характер, достигая максимального уровня через 96 часов. МкАт
пригодны для выявления антигена вируса АЧС в культуре клеток начиная с
18 часов после заражения. Оптимальное время для постановки реакции
лежит в диапазоне 48-96 часов.
3.11 Изучение использования МкАт в иммуноферментном анализе
В непрямом ТФ ИФА моноклональные антитела отобранных клонов
специфически взаимодействовали с антигеном вируса АЧС и с очищенным
рекомбинантным белком р30 и не взаимодействовали с отрицательными
антигенами - с лизатом интактных культур клеток CV-1, PK-15, ПСГК и
лизатом клеток E.coli штамма BL21(DE3)pLysS. У МкАт клонов 7F7, 2B7 и
5D11 активность с препаратом рекомбинантного белка р30 составила 1:1000,
21
со специфическим вирусным антигеном АЧС составила 1:1000, 1:500 и
1:2000 соответственно, что подтверждено комиссионными испытаниями.
Имея набор высокоактивных МкАт клонов 2B7, 1С2 и 7F7, и
конъюгатов с пероксидазой хрена на их основе исследовали различные
сочетания пар МкАт при постановке двухсайтового “сэндвич” - варианта
ТФ ИФА. На планшетах сенсибилизированных МкАт клона 7F7, титровали
препараты антигенов, выявляя их конъюгатом, приготовленным на основе
МкАт клонов 2B7 либо 1С2. Такое сочетание обеспечивало выявление
антигена вируса в максимальных титрах и одновременно не давало
ложноположительных результатов с нормальным антигеном и антигенами
гетерологичных вирусов и позволяло выявлять специфический антиген в
разведении 1:1600.
В результате проведённых исследований разработана схема постановки
ДАС ИФА для обнаружения антигена вируса АЧС с использованием
полученных МкАт (таблица 3).
22
Таблица 3 - Схема постановки двухсайтового “сэндвич” - варианта ТФ
ИФА для обнаружения антигена вируса АЧС
Основные этапы реакции:
Условия постановки реакции:
18 часов при 4С или 90 минут при 37С по
100 мкл на лунку в концентрации 0,4 мкг/
лунку
сорбция МкАт (7F7)
процедура отмывки
ФБР-твин, 3 раза
1%-ный раствор БСА на ФБР по 200 мкл
лунку, инкубация 30 минут при 37С
блокирование свободных сайтов связывания
процедура отмывки
ФБР-твин, 3 раза
внесение разведений антигена в объеме 100
мкл на лунку, инкубация 1 час при 37С
внесение антигена
процедура отмывки
ФБР-твин, 3 раза
пероксидазный конъюгат на основе МкАт
клона 2B7
инкубация 1 час при 37С по 100 мкл лунку в
рабочем разведении
процедура отмывки
ФБР-твин, 5 раз
субстратный раствор
инкубация 20 минут при комнатной
температуре по 100 мкл на лунку
АБТС
используя “Multiscan” при  = 405нм
учет результатов
4 ВЫВОДЫ
1.
Совершенствование
технологии
получения
МкАт
заключающееся в праймировании и последующей стимуляции иммунной
системы мышей линии BALB/c комбинированным введением плазмидной
ДНК и рекомбинантного белка р30 позволяет получить МкАт заданной
специфичности и сократить время их получения до 2-3 месяцев.
2.
Иммунизация рекомбинантным белком и кодирующей его
плазмидной
ДНК
по
разработанной
схеме
обеспечивает
развитие
гуморального иммунитета, позволяет получить сыворотки с титром
вирусспецифических антител 1:3200 – 1:6400, а так же выход более 70%
МкАт заданной специфичности.
3.
Получены и охарактеризованы четыре линии гибридом 1С2;
5D11; 7F7 и 2B7, на протяжении 10-15 пассажей (срок наблюдения)
23
стабильно
продуцирующие
МкАт
к
антигенным
детерминантам
фосфопротеина р30 вируса АЧС.
4.
Подобраны оптимальные условия проведения скрининга МкАт к
антигенным
детерминантам
белка
р30
вируса
АЧС
в
реакции
латекс-агглютинации: добавление в соотношении 1:10 0,5% суспензии на
ФБР-Т-БСА, рН 7,4 частиц латекса, сенсибилизированных рекомбинантным
белком р30 в дозе 3-5 мкг/0,1см3 к культуральной жидкости тестируемых
гибридом
позволяет
проводить
предварительное
скринирование
их
антителопродукции в течение 10-30 минут.
5.
Экспериментально
установлено,
что
полученные
клоны
гибридом 1C2, 5D11, 7F7 и 2B7 продуцируют МкАт, специфически
взаимодействующие в различных вариантах иммуноферментного анализа с
антигенными детерминантами специфического фосфопротеина р30 вируса
АЧС и не дают перекрёстных реакций с антигенами других вирусов возбудителей болезней свиней.
6.
С помощью полученных МкАт на консервативном участке
молекулы фосфопротеина р30 вируса АЧС установлено наличие трёх
неперекрывающихся антигенных детерминант, одна из которых, выявляемая
МкАт клона 2B7, является конформационно зависимой.
7.
выявлению
Полученные МкАт позволяют проводить исследования по
антигенов
вируса
АЧС
в
различных
вариантах
иммуноферментного анализа: непрямом и ДАС ТФ ИФА, методом
иммуноцитохимии,
реакции
непрямой
иммунофлуоресценции
и
иммуноблоттинге.
8.
Полученные МкАт специфичные к антигенным детерминантам
фосфопротеина р30 вируса АЧС пригодны для усовершенствования средств
диагностики АЧС.
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
«Методические
положения
по
получению
моноспецифической
сыворотки к рекомбинантному белку р30 вируса африканской чумы свиней
24
(АЧС)», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной
медицины
Россельхозакадемии
А.М.
Смирновым
10.11.2011г.
и
«Методические положения по получению моноклональных антител к
рекомбинантному
белку
р30
вируса
африканской
чумы
свиней
с
использованием метода прайм-бустерной иммунизации», утверждённые
директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым
12.03.2013 г., рекомендуются для применения при проведении научноисследовательской
работы
в
области
гибридомной
технологии
и
иммунологии.
Полученные клоны гибридом 7F7, 2B7, 1C12, 5D11, продуцирующие
МкАт специфичные к антигенным детерминантам фосфопротеина р30 вируса
АЧС, заложенные на длительное хранение в музей гибридом ГНУ
ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, предлагаются для усовершенствования
средств диагностики АЧС.
6 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Иммунологические методы / под редакцией Г.Фримеля; пер. с нем.
А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987. 472 с.
2. Кирюхина, Т.Р. Моноклональные антитела в совершенствовании
твёрдофазного иммуноферментного анализа при африканской чуме свиней /
Т.Р. Кирюхина, А.В. Киселёв, И.Ф. Вишняков // Актуальные вопросы
ветеринарной вирусологии: материалы научной конференции ВНИИВВиМ
«Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики».Покров, 1995. – С. 146.
3. Митин, Н.И.
Моноклональные антитела к полипептидам вируса
АЧС / Н.И. Митин, С.И. Сидоров, Е.Г. Реутова // Актуальные вопросы
ветеринарной вирусологии. Материалы научной конференции ВНИИВВиМ
«Классическая чума свиней – неотложные проблемы науки и практики» 9-11
ноября 1994 г. – Покров, 1995. – С. 137.
4.
Пиря,
А.А.
Характеристика
моноклональных
антител
к
полипептидам вируса АЧС / А.А. Пиря, А.В. Устин, А.А. Колонцов, Е.Г.
25
Реутова, Н.И. Митин // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии
и эпизоотологии: материалы научной конференции ВНИИВВиМ. – Покров,
1992. – Ч. 2. – С. 333.
5. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров, А.П.
Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова -М.: Выс. шк., 1991.-288с.
6. Южук, Т.Э Приготовление препаратов рекомбинантных белков
вируса африканской чумы свиней / Т.Э. Южук, А.С. Казакова, И.Ю.
Хухорова, Н.Н. Власова // Задачи ветеринарной науки в реализации
доктрины
материалы
продовольственной
Междунар.
безопасности
науч.-практ.
Российской
конф./ГНУ
Федерации:
ВНИИВВиМ
Россельхозакадемии. – Покров, 2011. – С. 224-229.
7. Bool, P.H. Le diagnostic par immunofluorescence de la peste porcine
Africana/ P.H. Bool, A. Ordas, C. Sanchez-Botija // Rivista Del Patronato De
Biologia Animal. – 1970. – Vol.14. – P.115-132.
8. Fazekas, St. G. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics /
St. G. Fazekas, D. Scheidegger // J. Immunol.Meth.- 1980. - Vol. 35. – P. 1-21.
9. Mazumder, S. Potency, Efficacy and Durability of DNA/DNA,
DNA/Protein and Protein/Protein Based Vaccination Using gp63 Against
Leishmania donovani in BALB/c Mice / S. Mazumder [et. al.] // PLoS ONE –
2011. – Vol. 6, No 2.
10. Milstein C, Hybrid hybridomas and their use in immunohistochemistry //
C. Milstein, A.C. Cuello // Nature – 1983. – P. 537-540.
11. Whyard, T.C. Monoclonal Antibodies against African Swine Fever Viral
Antigens // T. C. Whyard, S.H. Wool, G.J. Letchworth // Virology. -1985. – 142. –
P. 416-420.
1 2 . S a n z , A . M onoclonal Antibodies Specific for African Swine Fever
Virus Proteins / A. Sanz [et. al.] // Journal of Virology. – 1985. - Vol. 54. – P.
199-206.
26
13.
Sanchez-Botija,
C.
Diagnosis
of
African
swine
fever
by
immunofluorescence/ C. Sanchez-Botija // Bull. Off. Int. Epiz. – 1970. – Vol.73. –
P. 1025-1044.
14. Zhang, C. Potent monoclonal antibodies against Clostridium difficile
toxin A elicited by DNA immunization / C. Zhang, K. Jin, Y. Xiao // Human
Vaccines & Immunotherapeutics. – 2013. – Vol. 9. – P. 16 – 23.
7 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1. Моноклональные антитела к рекомбинантному белку P30 вируса
африканской чумы свиней для диагностики АЧС / А.С. Першин, А.С.
Казакова, Н.Н. Власова, О.В. Капустина // Научно-теоретический журнал
вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.2013. – № 2. – С. 30-35.
2. Моноспецифическая сыворотка к рекомбинантному белку р30 для
изучения африканской чумы свиней (АЧС) / А.С. Казакова, А.А. Варенцова,
А.С. Першин, С.А. Белянин, Т.Э. Южук, В.М. Лыска, С.П. Живодеров, Н.Н.
Власова // Научный журнал КубГАУ. - 2011. - №71(07). [Электронный
ресурс]. – Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2011/07/pdf/45.pdf
3. Першин, А.С. Иммуногистохимический метод выявления вируса
АЧС с использованием гипериммунной сыворотки к рекомбинантному
белку р30 / А.С. Першин, А.С. Казакова, Е.Ю. Прудникова // Ветеринария и
кормление. - 2011. - №6. - C. 39-40.
4. Получение моноклональных антитела к рекомбинантному белку p30
вируса африканской чумы свиней с использованием метода прайм-бустерной
иммунизации / А.С. Першин, А.С. Казакова, Т.Э. Южук, И.В. Лягоскин, О.В.
Капустина, Н.Н. Власова // Актуальные проблемы инфекционной патологии
в ветеринарной медицине: материалы конференции молодых учёных. –
Покров, 2012 – C. 77-83.
27
8 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЧС – африканская чума свиней,
ВП – вирусный протеин,
ДАС ТФ ИФА – двойной антительный сэндвич вариант ТФ ИФА,
ИФА – иммуноферментный анализ,
ИЦХ ИФА – иммуноцитохимический вариант ИФА,
кДа – килодальтон,
МкАт – моноклональные антитела,
НАФ – не полный адъювант Фрейнда,
ОП – оптическая плотность,
ПАФ – полный адъювант Фрейнда,
РЛАГ – реакция латекс агглютинации,
РНИФ – реакция непрямой иммунофлуоресценции,
ТФ ИФА – твёрдофазный иммуноферментный анализ,
ФИТЦ – флюоресцеинизотиоцианат,
vp30 – virus protein, 30 кДа,
Rec p30 – рекомбинантный белок р30.
Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии,
г. Покров Владимирской области
Тираж 80 экз.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа