close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

«Исследование функциональной активности химически модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека in vitro и in vivo».

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Илюшин Денис Григорьевич
ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКИ
МОДИФИЦИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ
БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO И IN VIVO
Специальность 03.01.03 – «молекулярная биология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена в Лаборатории биокатализа Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).
Научные руководители: Доктор биологических наук
Пономаренко Наталья Александровна
Кандидат химических наук
Смирнов Иван Витальевич
Официальные оппоненты: Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук,
профессор, чл.-корр. РАН, заведующий лабораторией
молекулярной иммунологии Федерального государственном бюджетного учреждения науки Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
(ИБХ РАН).
Лагарькова Мария Андреевна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией генетических основ клеточных технологий Федерального государственного бюджетного учреждения
науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова
Российской академии наук (ИОГЕН РАН).
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
(ИМБ РАН).
Защита состоится «14» мая 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институте биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) по адресу: 119334,
Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова,
д. 32
Автореферат разослан «10» апреля 2013 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета
Кандидат фармацевтических наук Грабовская Любовь Сергеевна
I. ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В конце 1930-х гг. в качестве инсектицидов был синтезирован ряд фосфорорганических токсинов (ФОТ). Доступность ряда ФОТ в странах с развивающейся аграрной
экономикой приводит к частым случаям отравлений и летальных интоксикаций. По
данным Всемирной организации здравоохранения бытовое летальное отравление
ФОТ получает более 300 000 человек в год. Несмотря на то, что 185 государств в
1992 г. присоединились к Конвенции «О запрещении химического оружия», сохраняется угроза использования нервно-паралитических агентов и других ФОТ в ходе
военных действий и террористических актов.
Методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами
на настоящий момент обладают целым рядом побочных эффектов. Альтернативным
подходом к терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов. В качестве таких антидотов могут выступать антитела и ферменты,
которые изолируют и инактивируют высокотоксичные соединения до того, как те
достигнут своей биологической мишени. Из всех потенциальный кандидатов на роль
биологического антидота против ФОТ только бутирилхолинэстераза (БуХЭ, ЕС 3.1.1.8)
плазмы крови человека в 2006 г. получила статус «New development drug» (Новый лекарственный препарат, подлежащий дальнейшей разработке – англ.) от Управления
по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA).
Обзор современных биотехнологических методов получения БуХЭ позволяет сделать следующие выводы.
1.Получение БуХЭ из плазмы крови человека (чБуХЭ) – дорогостоящий процесс,
осложненный возможностью контаминации препарата патогенами из зараженной
плазмы.
2.Попытки экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (рчБуХЭ)
в клетках бактерий и дрожжей не привели к получению активного фермента;
3.Проект создания трансгенных животных в качестве источника рчБуХЭ закрыт в
связи с нерентабельностью производства.
4.Несмотря на высокий уровень продукции активной рчБуХЭ в трансгенных растениях, применение этого препарата в качестве медикамента невозможно, так как
на сегодняшний день FDA не одобрило использование трансгенных растений для
получения препаратов рекомбинантных белков, пригодных для инъекции в кровь
человека.
5.Из всех существующих на сегодняшний день систем экспрессии рчБуХЭ, только
клетки линии CHO (Chinese hamster ovary cells - англ., клетки яичников китайского хомячка) полностью удовлетворяют требованиям FDA, однако низкий уровень
продукции делает применение этой системы в промышленных масштабах нерентабельным.
Таким образом, на сегодняшний день не существует эффективной и экономически
–3–
выгодной системы экспрессии рчБуХЭ, пригодной для инъекции в кровь.
Цель работы и основные задачи исследования
Цель работы состояла в создании эффективной системы экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека и исследовании функциональной активности полученного
фермента в экспериментах in vitro и in vivo. Для ее достижения были поставлены
следующие экспериментальные задачи:
1.создание эффективной эукариотической системы экспрессии функционально активной БуХЭ человека;
2.изучение физико-химических свойств рекомбинантной БуХЭ человека;
3.оптимизация фармакокинетических характеристик рекомбинантного фермента;
4.определение эффективности полученного препарата рчБуХЭ для профилактики
отравлений ФОТ.
Научная новизна и практическая значимость работы
Для получения рекомбинантной БуХЭ человека была выбрана система экспрессии
на основе клеток линии CHO, которая сертифицирована для синтеза медикаментозных препаратов на основе рекомбинантных белков. Ген БуХЭ был клонирован под
контроль промотора фактора элонгации полипептидной цепи (EF–α1). После проведения стабильной трансфекции и оптимизации условий продукции на специализированных безбелковых ростовых средах удалось получить клон А3 продуцирующий до
30 мг рчБуХЭ на литр ростовой среды, что как минимум на порядок выше, чем в ранее
разработанных системах. Для изменения олигомерного состава рекомбинантного
фермента клон А3 был трансфицирован фрагментом ДНК, несущим ген обогащенного остатками пролина пептида PRAD под контролем промотора EF–α1. В результате
отбора был получен стабильный клеточный клон А3Н9, продуцирующий БуХЭ в
форме димера и тетрамера. Опыты на мышах линии BALB/c показали, что фармакокинетические параметры полученной рчБуХЭ не позволяют эффективно использовать
рекомбинантный фермент для профилактики отравлений ФОТ.
Для радикального увеличения времени полувыведения препарата рчБуХЭ из
крови была предложена химическая модификация гомополимерами N-ацетилнейраминовой кислоты – сиалирование. В отличие от полимеров этиленгликоля,
широко применяемых для модификаций рекомбинантных белков, гетеро- и гомополимеры сиаловой кислоты являются биодеградируемыми молекулами, не токсичны
и не накапливаются в тканях и внутренних органах. Таким образом, модификация
полисиаловыми кислотами позволяет снизить риск возможных побочных действий
рчБуХЭ, тем самым лучше вписываясь в концепцию биологического антидота. Применение комбинаторного подхода позволило определить оптимальные условия реакции химического полисилирования рчБуХЭ, при которых удалось добиться не менее
80% выхода реакции при относительно невысокой (не более 10%) потере удельной
активности рекомбинантного фермента.
Полученный конъюгат рчБуХЭ с гомополимерами сиаловой кислоты (рчБуХЭ–
–4–
САО27) был подвергнут всестороннему анализу in vitro и in vivo. Установлено, что
химическая модификация полисиалированием не влияет на олигомеризацию рчБуХЭ. Масс-спектрометрическое исследование конъюгата рчБуХЭ–САО27 позволило
выявить по меньшей мере 6 потенциальных сайтов модификации рекомбинантного
фермента. Сравнение кинетических констант (KM, kcat, KSS и b) гидролиза бутирилтиохолин иодида модифицированной и немодифицированной рекомбинантной рчБуХЭ
и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что полученные значения отличались
от известных из литературы в пределах ошибки, что свидетельствует об интактности активного центра фермента и его окружения. Фармакокинетические испытания
in vivo на мышах линии BALB/c свидетельствуют о том, что в результате химического
полисиалирования время полувыведения конъюгата рчБуХЭ–САО27 возросло в 5,5
раз по сравнению с немодифицированной рчБуХЭ и стало сопоставимо со временем
полувыведения препарата нативной БуХЭ плазмы крови человека. Таким образом
впервые успешно применен метод химического полисиалирования для модификации
сложного глобулярного фермента.
Способность рчБуХЭ и рчБуХЭ–САО27 эффективно связывать агент VR in vitro
стала основанием для проведения эксперимента на животных. В результате испытания
in vivo на беспородных мышах доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы
крови человека, модифицированный полимерами N-ацетилнейраминой кислоты при
внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса, обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая долгосрочных изменений
в поведенческой активности и физической выносливости подопытных животных.
Настоящая работа описывает метод получения конъюгата рекомбинантной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека с гомополимерами N-ацетилнейраминовой
кислоты, полностью удовлетворяющего современным требованиям к биологическому антидоту.
Публикация и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 2 статьи и подана заявка на патент. Результаты диссертации были представлены на 4 международных конференциях: XX зимней
международной молодежной научной школе «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии» (2008, Москва); Русско-французской конференции «Химия в молекулярной биологии» (2011, Москва); XXIV зимней молодежной
научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва); Международной научной конференции «The 11th Meeting on
Cholinesterases» (2012, Казань).
Структура и объем работы
Диссертация состоит из Введения, трех глав – «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», Выводов, Списка литературы, включающего 129 работы, и Приложений. Работа изложена на 107 страницах, включая 41
рисунок и 15 таблиц.
–5–
II. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Создание экспрессионных конструкций БуХЭ
Последовательность, содержащая кДНК БуХЭ человека, была любезно предоставлена Оксаной Локридж. Данная последовательность содержится в векторе pGS/CMV/
BChE, несущем ген БуХЭ человека под контролем CMV-промотора. В векторе pGS/
CMV/BChE также содержатся сайты полиаденилирования BGH polyA и ген глутаминсинтетазы в качестве селективного маркера. Данная конструкция ранее была использована для создания клона-продуцента БуХЭ человека, однако авторам не удалось
достичь приемлемого уровня экспрессии.
Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию
БуХЭ в клетках линии CHO, были созданы две новые экспрессионные конструкции:
pcDNA/CMV/BCHE (рис. 1, А) и pBudCE/EF/BCHE (рис. 1, Б), несущие ген чБуХЭ под
контролем CMV- и EF-промоторов соответственно. Корректность сборки конструкций подтверждена методом рестриктного анализа и секвенированием по Сэнгеру.
A
Б
Рис. 1. Схема создания конструкций pcDNA/CMV/BCHE (А) и pBudCE/EF/BCHE (Б)
–6–
Получение клона продуцента А3
,
/
,
/
Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию
рчБуХЭ, клетки линии CHO были трансфицированы методом липофекции кольцевой
плазмидной ДНК конструкций pGS/CMV/BCHE, pcDNA/CMV/BCHE и pBudCE/EF/
BCHE. Через 48 и 72 ч после проведения липофекции образцы культуральной среды
были отобраны для определения содержания активной формы рчБуХЭ методом Эллмана. В качестве контроля использовались кондиционные среды клеток линии CHO,
выращенных в тех же условиях, что и трансфектомы. Как видно из результатов, представленных на рис. 2, для конструкций pGS/BCMV/CHE и pcDNA/CMV/BChE уровень
экспрессии был сопоставим и составлял около 0,2 мкг/мл, тогда как для pBudCE/EF/
BChE он оказался почти на порядок выше (1,45 мкг/мл). Таким образом, конструкция
pBudCE/EF/BChE, содержащая ген БуХЭ под контролем промотора EF-α1, оказалась
наиболее перспективной.
1,6
ДНК плазмиды pBudCE/EF/
Трансфектомы CHO
1,4
Контрольные CHO
BCHE линеаризовали и про1,2
водили трансфекцию методом
1,0
липофекции в клетки линии CHO
0,8
для получения стабильно экспрес0,6
сирующего клона. Селекцию про0,4
водили добавлением в ростовую
среду зеоцина в концентрации
0,2
600 мкг/мл. Продукцию активной
0,0
pBudCE/EF/BCHE pGS/CMV/BCHE pcDNA/CMV/BCHE
формы БуХЭ на всех этапах опреРис.
2. 
Анализ эффективности временной
деляли по методу Эллмана. После
трансфекции
клеток линии CHO экспрессионнысравнительного анализа уровней
ми конструкциями pBudCE/EF/BChE, pGS/CMV/
экспрессии в одинаковых условиях BChE и pcDNA/CMV/BChE
для ряда отобранных наиболее
30
перспективных моноклонов (рис.
25
3) и проверки стабильности их
продукции на протяжении 5 поко20
лений пассажированием на 25 см2
15
флаконах, для дальнейшей работы
был выбран клон А3.
10
Были протестированы среды
5
Peprotech, (Peprotech, США), EXCell (Sigma, США) и ProCHO4
0
A3
H7
D10
C2
C4
H8
(Lonza, Швецария). Для подбора
условий экспрессии клетки клона Рис. 3.  Сравнительный анализ продукции БуХЭ
A3 предварительно наращивали в отобранными моноклонами после стабильной
среде DMEM, содержащей 2%-ную трансфекции клеток линии CHO линеаризованной конструкцией pBudCE/EF/BChE
–7–
бычью фетальную сыворотку. По достижению клетками 70–90%-ной конфлюентности среду заменяли на одну из тестируемых безбелковых сред и инкубировали в
ней клетки на протяжении нескольких суток. Инкубация клеток в средах Peprotech
и EX-Cell приводила к их гибели на 1-2 сутки. Данные среды были признаны не подходящими для моноклона А3. При инкубации клеток в среде ProCHO4 наблюдался
значительный прирост продукции рчБуХЭ клетками на 96 часу инкубации (рис. 4).
Анализ
олигомерного
состава продуцируемой клоном A3 рчБуХЭ по методу
Карновского (рис. 5) показал,
что в основном рчБуХЭ представлена в форме мономера,
в то время как продукция
тетраметра невелика. С фармакологической точки зрения
представляет интерес именно
тетрамер БуХЭ, поскольку
время его полувыведения из
организма составляет 3-4 дня,
а мономера – несколько часов.
Ранее было показано, что при
добавлении к БуХЭ пептида
PRAD – домена коллагеноподобного белка ColQ – количество тетрамеризованного
продукта увеличивается.
В настоящей работе было
решено использовать коэкспрессию рчБуХЭ и пептида
PRAD.
50
Содержание активной формы
рБуХЭ, мг/л
Олигомеризация рекомбинантной БуХЭ
ProCHO4
DMEM + 2%FBS
40
30
20
10
0
24 ч
48 ч
72 ч
96 ч
120 ч
Рис. 4.Анализ подбора условий экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека клоном А3 в различных
ростовых средах
1
2
3
Т
А
Д
M
Рис. 5.Анализ
олигомерного состава
рчБуХЭ методом Карновского. Разделение
рчБуХЭ осуществляли
в 8% ПААГ в неденатурирующих
условиях:
Культуральная среда клона А3 (1); образец плазмы крови
человека (2); образец очищенной бутирилхолиэстеразы
плазмы крови человека (3); Т – тетрамер, А - димер
альбумина и БуХЭ, Д – димер, М – мономер
Создание экспрессионных конструкций пептида PRAD
Исходная экспрессионная конструкция pRC/RSV-rQ45 была любезно предоставлена Оксаной Локридж.
Для выбора промотора, обеспечивающего наиболее эффективную продукцию
PRAD, были созданы две новые экспрессионные конструкции: pcDNA/CMV/BCHE
(рис. 6, A) и pBudCE/EF/BCHE (рис. 6, Б), несущие ген пептида PRAD под контролем
CMV и EF промоторов соответственно. Корректность сборки конструкций подтверждена методом рестриктного анализа и секвенированием по Сэнгеру.
–8–
А
Б
Рис. 6. Cхема создания конструкций pcDNA/CMV/PRAD (А) и pcDNA/EF/PRAD (Б)
Получение клона-продуцента А3H9
Экспрессионные конструкции pcDNA/CMV/PRAD и pcDNA/EF/PRAD, трансфицировали методом липофекции в клетки клона А3. Через 72 ч после проведения
трансфекции количество тетрамерной формы рчБуХЭ в среде контролировали электрофоретически по методу Карновского. По результатам проведенного анализа (рис.
7) были выбраны клетки клона A3, трансфицированные плазмидой pcDNA/EF/PRAD.
Использование EF промотора в данном случае позволяет получать клетки, производящие большее количество тетрамерной формы БуХЭ в ростовую среду.
Для получения стабильного клона экспрессионную конструкцию pcDNA/EF/
PRAD линеаризовали и проводили трансфекцию методом липофекции в клетки клона
А3. Селекцию проводили добавлением в ростовую среду 1,5 мг/мл гигромицина Б и
600 мкг/мл зеоцина. Продукцию изоформ БуХЭ моноклонами определяли по методу
Карновского. По результатам тестирования был отобран клон A3H9 (рис. 8). После
оптимизации условий экспрессии в ростовой среде ProCHO4 (Lonza) по ранее описанной схеме удалось получить стабильно продуцирующий клон А3Н9, характерной
особенностью которого является продукция тетрамерной и димерной формы БуХЭ
при полном отсутствии продукции мономера.
Разработка системы детекции и оценки продукции рекомбинантного белка
В ходе работы оценку эффективности трансфекции и отбор клонов клеток линии
CHO, продуцирующих рчБуХЭ, проводили по функциональной активности фермента
–9–
1
2
3
4
5
6
7
Т
А
Д
Рис. 7.Анализ олигомерного состава
рчБуХЭ после временной трансфекции
клеток клона А3 экспрессионными
конструкциями pcDNA/CMV/PRAD и
pcDNA/CMV/PRAD:
A3
A3Е12
A3H9
A3G11
A3D10
A3D7
A3E6
A3H5
A3F5
1
2
Т
Д
A3
A3C4
A3H3
A3G3
A3F3
A3D3
A3C3
A3A3
A3C2
M
A3B2
с применением методик Эллмана
и Карновского. В основе этих
методик лежит способность БуХЭ
гидролизовать бутирилтиохолин,
что делает их неприменимыми в
случаях, когда БуХЭ неактивна
или ингибирована.
Известно, что высокий уровень экспрессии рекомбинантных
продуктов в клетках эукариот
иногда сопровождается снижением их удельной активности, т. е.
появлением некоторой доли неактивного белка. Часто это связано
с тем, что собственная система
посттрансляционных модификаций клетки не справляется с объемом продуцируемого белка, что
приводит к появлению неактивных продуктов с некорректным
фолдингом, неотщепленным пропептидом и другими дефектами.
В связи с этим представлялось
интересным оценить удельную
активность нашего фермента
при экспрессии. Таким образом,
встала дополнительная задача
разработки системы прямой оценки содержания БуХЭ в образцах.
Для определения концентрации
A3F4
Культуральная среда клона А3 (1); культуральная среда клона А3 после временной
M трансфекции конструкцией pcDNA/CMV/
PRAD (2); культуральная среда клона А3 после
временной трансфекции конструкцией pcDNA/EF/PRAD (3); образец плазмы крови человека
(4); образец коммерчески доступной БуХЭ плазмы крови человека (Sigma, США) (5); образец
очищенной БуХЭ плазмы крови человека (6); Т – тетрамер, А - димер альбумина и БуХЭ, Д – димер,
М – мономер
1
2
Т
Д
M
Рис. 8. Сравнительный анализ количества
олигомерных форм рчБуХЭ отобранными клонами,
трансфицированными линеаризованными конструкциями pBudCE/EF/BCHE и pcDNA/EF/PRAD:
образец очищенной БуХЭ плазмы крови человека,
100 нг (1); образец очищенной БуХЭ плазмы крови,
400 нг (2); Т – тетрамер, Д – димер, М – мономер
– 10 –
белка в образцах наиболее простым и информативным является метод ИФА в формате «сэндвич». Анализ коммерчески доступных антител к БуХЭ человека показал,
что пары неконкурирующих моноклональных антител с возможностью применения в
ИФА по типу «сэндвич» на сегодняшний день не существует.
BChE
ПЦР
NheI
NotI
NheI
NotI
N1
T7
N1
NheI
T7 term
pET28-N1, pET28-N2, pET28-C
NotI
lacI
N2
NheI
N1,N2,C
Kanamycin
NotI
T7 term
T7
pET28a
lacI
Kanamycin
Рис. 9. Схема создания конструкций pET28-N1, pET28-N2 и pET28-C
Наработка полипептидных фрагментов чБуХЭ в прокариотической системе.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие С-концевой фрагмент БуХЭ
длиной 322 а.о., а также, два фрагмента N-концевого пептида БуХЭ, N1 и N2, длиной
133 и 119 а.о. соответственно, были получены методом полимеразно-цепной реакции
(ПЦР). В качестве матрицы использовалась плазмида pGS/CMV/BCHE. ПЦР продукты С, N1 и N2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NheI и NotI и лигировали
в аналогично рестрицированный и дефосфорилированный вектор pET28a, с получением экспрессионных конструкций pET28-C, pET28-N1 и pET28-N2 соответственно
(рис. 9). Далее клетки E.coli штамма BL21(DE3) трансформировали методом электропорации конструкциями pET28-C, pET28-N1 или pET28-N2. Наличие шести остатков
гистидина на С-конце экспрессируемых пептидов, позволило выделять их с помощью
металло-хелатной хроматографии. Полученные в результате фракции анализировали
методом белкового электрофореза в 15% ПААГ в восстанавливающих условиях. Полипептиды C и N1 обнаруживались во фракции, содержащей 2М мочевины, полипептид N2 – в нерастворимой фракции белков
– 11 –
Получение и анализ мышиных моноклональных антител к полноразмерной
БуХЭ плазмы крови человека
6D
8
1A
1D
11
Рис. 10. Гибридизация по
Верстерну. Мышиные моноклональные антитела 3С6D8,
1A1F1, 1B4F4, 1B4D12, 1A1F7,
C–пептид 4C6D8 и 1A1D11 к полноразмерной БуХЭ человека
N1–пептид гибридизовали с С-, N1- и
N2-полипептидами БуХЭ
4C
1B
4F
4
7
1A
1F
1B
4D
12
1
1A
1F
3C
6D
8
Мышиные моноклональные антитела 3С6D8, 1A1F1, 1B4F4, 1B4D12, 1A1F7, 4C6D8
и 1A1D11 к полноразмерной БуХЭ человека были получены стандартным методом
гидбридомной техногии.
При гибридизации по Вестерну полученных антител с С-, N1- и N2-полипептидами
БуХЭ обнаружилось, что все семь антител взаимодействуют с С-концевым фрагментом рекомбинантного фермента (рис. 10). Анализ методом конкурентного ИФА подтвердил, что все антитела конкурируют друг с другом за связывание с С-концевым полипептидом (рис. 11), из чего следует, что иммунизация мышей полноразмерной БуХЭ
плазмы крови человека стимулировало выработку антител к одну эпитопу. Таким
образом, полученные моноклональные антитела не пригодны для анализа методом
"сэндвич"–ИФА. Для преодоления возникшей проблемы были получены поликлональные сыворотки кроликов с использованием в качестве антигенов рекомбинантных
фрагментов БуХЭ N1 и N2.
N2–пептид
3C6D8
OП 450нм, OE
0.50
1A1F1
0.40
1B4F4
0.30
На оси абсцисс указан обратный десятичный
1B4D12 логарифм разведения исследуемых антител
0.20
(стартовая концентрация 100 нг/мл); концентрация биотинилированного антитела 4С6D8
4C6D8 оставалась неизменной и составляла 10 нг/мл.
1A1D11 Проявку осуществляли конъюгатом стрептавидина с пероксидазой корней хрена
1A1F7
0.10
0.00
Рис. 11. Анализ взаимодействия моноклональных антител с полноразмерной БуХЭ
методом конкурентного ИФА:
0
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
-log10(Разведенения)
Создание системы детекции БуХЭ на основе ИФА
Очищенными препаратами N1- и N2-фрагментов БуХЭ иммунизировали кроликов. Анализ полученных сывороток методом ИФА показал одинаковый титр антител
к обоим N-концевым фрагментам БуХЭ в сыворотках, однако с полноразмерной БуХЭ
лучше связывались антитела к полипептиду N1. Несмотря на высокий уровень специфического взаимодействия антител с БуХЭ в непрямом ИФА, максимальный уровень
сигнала в формате «сэндвич» ELISA не превышал 0.6 ОЕ. Было предположено, что
частичная денатурация антигена увеличит доступность эпитопов и тем самым повы-
– 12 –
сит чувствительность метода. Из опробованных методов денатурации БуХЭ (нагревание, добавление детергентов, щелочи) наиболее эффективной оказалась инкубация в
течение 15 мин при 95 °С (рис. 12, А). По результатам анализов, из панели полученных
моноклональных антител было выбрано антитело 4C6D8 проявившее максимальную
чувствительность в комбинации с антителами к N1 полипептиду.
В итоге был разработан метод определения количественного содержания БуХЭ
в образцах культуральной среды, очищенных препаратах, а также в плазме крови
человека. Сравнение полученных величин концентрации БуХЭ в образцах с данными
полученными по методике Эллмана показало, что более 95% рчБуХЭ, экспрессируемой клоном А3Н9 в ростовую среду, является активной (рис.12, Б).
2.0
1.8
1.8
1.6
1.6
OП 450нм, OE
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
50
100
150
200
Концентрация БуХЭ, нг/мл
15 мин, 95оС
1% Triton-X100, 30 мин, 37оС
250
300
0,05% SDS, 30 мин, 37оС
50мМ NaOH, 30 мин, 37оС
Неденатурированная БуХЭ
По ИФА
По методу Эллмана
0
рБ
с уХ
ра ред Э в
зв е р
ед Pr ос
ен oC то
ие HO во
рБ
1: 4 й
30
уХ
п
Э
ра ре ,
зв па оч
ед ра ищ
ен т ен
ие бе ны
1: лка й
1
Бу 000
к
ра ро ХЭ
зв ви п
ед ч ла
ен ел зм
ие ов ы
1: ека
50
00
Б
2.0
Концентрация БуХЭ мкг/мл
А
Рис. 12. Анализ различных способов денатурации антигена для определения концентрации бутирилхолинэстеразы методом «сэндвич» ELISA на примере моноклонального антитела 4C6D8 (А) и сравнительный анализ содержания бутирилхолинэстеразы в
образцах из различных источников методами «сэндвич» ELISA и Эллмана (Б)
Характеристики рекомбинантной БуХЭ
Для изучения функциональной активности рБуХЭ была очищена из ростовой
среды. Разработанный протокол очистки включал стадии ультрафильтрации, концентрирования, аффинной очистки и гель-фильтрации. На каждой стадии очистки отбирали образец для анализа на содержание активной формы БуХЭ методом Эллмана
и количественной оценки белка методом ELISA. Данные анализа представлены в табл.
1. Конечный выход белка составил около 70% с чистотой 95% (по данным электрофоретической оценки). Определение кинетических параметров очищенного препарата
– 13 –
Табл. 1. Таблица очистки рекомбинантной БуХЭ из ростовой среды
Стадия выделения
Общая активность
БуХЭ*,
ед. акт.
Выход,
%
Общее количество
БуХЭ**,
мг
Удельная активность,
ед. акт./мг
Ростовая среда
915
100
2,03
451
Концентрат среды
890
97
1,96
454
Элюат cо стадии аффинной хроматографии
825
90
1,81
456
Элюат с гельфитрации
(21-я мин)
650
71,5
1,41
461
Примечания: *по данным методики Эллман;
**по данным методики ИФА.
Табл. 2. Кинетические константы гидролиза бутирилтиохолин йодида рчБуХЭ в
сравнении с БуХЭ плазмы крови человека
K M,
мкМ
k cat,
с -1
K SS,
мМ
b
рчБуХЭ
25±1
820±10
250±30
2,4±0,2
БуХЭ плазмы крови*
23±2
665±30
140±20
2,5±0.1
* Duysen EG, Bartels CF, Lockridge O (2002) J Pharmacol Exp Ther 302:751–758.
рекомбинантной БуХЭ проводили в диапазоне концентраций субстрата 10 – 1000 мкМ
при концентрации фермента 5 нМ. На основании этих данных были рассчитаны индивидуальные кинетические параметры реакции гидролиза. Сравнение кинетических
констант рекомбинантной БуХЭ и БуХЭ из плазмы крови человека показало, что
константы KM одинаковы в пределах ошибки расчетов, а константы k2 лишь незначительно различаются, что по-видимому связано с различными способами определения
концентрации активных центров изучаемых ферментов (табл.2). Также известно,
что для бутирилхолинэстеразы, полученной из плазмы крови человека, характерна
активация субстратом в реакциях с соединениями холинового ряда. Аналогичный
эффект наблюдается и для гидролиза бутирилхолин йодида рекомбинантной БуХЭ
при концентрациях субстрата выше 500 мкМ. Это позволило рассчитать константы
KSS и параметр b. Для рекомбинантной БуХЭ параметр b отличался от литературного
значения в пределах ошибки. Таким образом, можно сделать вывод, что полученная
рекомбинантная БуХЭ функционально активна, а организация активного центра фермента идентична с природной БуХЭ (табл. 2).
Для определения фармакокинетических характеристик рекомбинантной БуХЭ
были проведены испытания на мышах. Самцам мышей BALB/c весом 25–30 г внутривенно вводили препарат рчБуХЭ в количестве 100 ед. акт. на животное быстрой
инъекцией в хвостовую вену. После введения препарата 10 мкл крови отбирали из
глазного синуса в разные временные промежутки в течение пяти дней для определения остаточной активности рчБуХЭ. По полученным данным была построена фармакокинетическая кривая, по которой, исходя из двух-камерной фармакокинетической
модели, были рассчитаны среднее время удержания (MRT), время полураспределения
– 14 –
(t1/2распр.) и полувыведения (t1/2вывед.) (табл. 3). Полученные in vivo данные находятся в
строгом соответствии с данными литературного источника. Тем не менее, препарат
рекомбинантной БуХЭ, экспрессированной клоном А3Н9, продемонстрировал на порядок более низкие параметры по сравнению с БуХЭ плазмы крови человека (табл. 3);
быстрое выведение препарата затрудняет его использование в качестве профилактического антидота против действия ФОТ.
Табл. 3. Сравнение полученных в работе фармакокинетических параметров рчБуХЭ с
литературными данными
MRT,
мин
t1/2распр.,
мин
рчБуХЭ
220±50
4±1
180±30
рчБуХЭ (CHO)*
205±50
—
144±36
2791
—
1683
чБуХЭ*
t1/2вывед.,
мин
* Saxena A et al. (1998) Mol Pharmacol 53:112–122.
Оптимизация фармакокинетических параметров рчБуХЭ
химическим полисиалированием
Исследования биологических антидотов на основе холинэстераз последние годы
сосредоточены на получении рекомбинантных ферментов с улучшенными фармакодинамическими показателями. Пегилирование стало одним из наиболее популярных
и хорошо изученных методов увеличения времени полувыведения из крови как рекомбинантной, так и нативной БуХЭ плазмы крови человека. Тем не менее, ряд исследователей отмечают, что пегилирование не влияет на иммуногенность рекомбинантного
фермента; это приводит к падению фармакодинамических параметров при повторных
введениях рекомбинантного фермента. В качестве альтернативы была предложена
модификация полисиаловыми кислотами. В отличие полимеров этиленгликоля, гетеро- и гомополимеры N-ацетилнейраминовой кислоты являются биодеградируемыми
молекулами, не накапливаются в организме и не являются токсичными. В организме
человека не обнаружено специальных рецепторов распознающих полисиаловые кислоты. Модификация полисиаловыми кислотами позволит снизить риск возможных
побочных действий рекомбинантного препарата БуХЭ, тем самым лучше вписываясь
в концепцию биологического антидота.
Препаративное выделение рчБуХЭ из ростовой среды
Для проведения химической модификации рчБуХЭ была очищена из ростовой среды. Разработанный протокол очистки был адаптирован для препаративных количеств
белка и включал стадии ультрафильтрации, концентрирования, аффинной очистки и
ионообменной хроматографии. В результате было наработано 35,8 мг рекомбинатного
фермента. По данным электрофоретической оценки, конечный выход белка составил
около 80% с чистотой 95% (рис. 13).
Так как С-концевой фрагмент чБуХЭ, отвечающий за тетрамеризацию фермента,
наиболее уязвим для действия протеаз, деградация этого участка может привести к
– 15 –
необратимому изменению олигомерного состава рчБуХЭ в сторону мономеров. Поэтому препарат рчБуХЭ проверялся на наличие протеолических повреждений в процессе очистки. Для этого образцы рчБуХЭ клона А3Н9 и чБуХЭ наносили на 8% ПААГ
в присутствии и отсутствии восстановителя β-меркаптэтанола. Отношение интенсивности полос массой ~160 кДа, соответствующих ковалентному димеру БуХЭ, свидетельствует об интактности С-концевого фрагмента БуХЭ в процессе очистки (рис. 14).
Рис. 13. Электрофореграмма основных
120 кДа фракций, собранных в процессе очистки и
82 кДа химической модификации рчБуХЭ; 10%-ный
70 кДа ПААГ в восстанавливающих условиях:
50 кДа
кондиционная среда клона А3Н9 (1); концентрат
кондиционной среды (2); элюат после аффинной
хроматографии (3); элюат после ионообменной
хроматографии (4), бутирилхолинэстераза плазмы
крови человека (5)
20 кДа
1
2
3
4
рхБуХЭ
5
Оптимизация условий химического полисиалирования рчБуХЭ
+
–
чБуХЭ
+
– β-EtSH
160 кДа
120 кДа
Очищенный препарат рчБуХЭ подвергали хими82 кДа
70 кДа
ческому полисиалированию. В работе использовали
Рис. 14. Анализ целостности
окисленные полисиаловые кислоты со средней молеС-концевого фрагмента рчБуХЭ
кулярной массой 27кДа (САО27), произведенные на
предприятии Lipoxen, Лондон, Англия. В основе этого процесса лежит реакция 7’-кетогруппы окисленных полимеров полисиаловой кислоты с N-концевой аминогруппой
фермента и/или ε-аминогруппой остатка лизина; в результате этого взаимодействия
образуются основания Шиффа, которые далее восстанавливаются NaBH3CN (рис. 15,
А). Проведение химического полисиалирования в неоптимальных условиях может не
только снизить выход реакции, но и существенно уменьшить удельную активность
фермента.
Для определения оптимальных условий реакции последовательно варьировались
основные параметры реакции: pH (6,0–8,0), молекулярное соотношение рчБуХЭ:САО
(1:15–1:100), температура инкубации (4–37 °С) и концентрация восстановителя
NaBH3CN (0–10 мг/мл). Как видно из результатов, представленных на рис. 15, Б-Е в
результате проведенных экспериментов удалось определить условия реакции, при
которых удалось добиться не менее 80%-ного выхода реакции при относительно невысокой (не более 10%) потере удельной активности фермента (рис. 15, Е).
Проведение препаративного химического сиалирования рчБуХЭ
Препаративное полисиалирование проводили в оптимальных условиях: 0,1 М
фосфатный буфер, pH=6,9, молярное соотношение рхБуХЭ:САО = 1:50, конечная концентрация восстановителя 3 мг/мл. Конъюгат рхБуХЭ-САО27 очищали с помощью
аффинной хроматографии с использованием сорбента Procainamide-Sepharose 4FF (GE
– 16 –
A
O
HO
HOOC
OH
O
NH
O
OH
O
HO
OH
OH
O
O
HOOC
HO
O
NH
O
HOOC
+ H2N―BChE
OH
O
OH
NH
OH
1) T, °C
2) NaBH3CN
O
OH
HO
O
O
3) БуХЭ:САО
4) Время, ч HOOC
5) pH
HOOC
HO
n
OH
В
OH
O
NH
O
O
HO
HOOC
OH
n
OH
NH
O
OH
HN
BChE
OH
Выход, %
Выход, %
Б
O
NH
Г
мг
нк
уб
ац
ии
, °С
Выход, %
/мл
Е
Тем
пер
атур
а ин
куб
м
г/
мг
м
л
/м
л
Выход, %
Выход, %
Те
мп
ер
ат
ур
аи
Д
аци
и, °С
Рис. 15. Схема реакции химического полисиалирования рсБуХЭ (А) и поэтапный
подбор оптимальных условий реакции химического полисиалирования. Остаточная
активность и выход реакции изображены сетчатой и цветной плоскостями соответственно (Б-Е)
Healthcare, США). В результате было получено 16 мг рчБуХЭ, модифицированной полисиаловыми кислотами, со средней молекулярной массой 27 кДа (рчБуХЭ–САО27).
Характеристики препарата рчБуХЭ–САО27
Полученный конъюгат рчБуХЭ–САО27 был подвергнут всестороннему анализу.
Данные электрофоретического анализа (рис. 16), свидетельствуют о изменении молекулярной массы комплекса минимум на 20 кДа. При электрофоретическом разделении
продуктов реакции химического сиалирования рчБуХЭ на 10%-ном ПААГ наблюдалось появление диффузной полосы с молекулярной массой более 82 кДа (рис. 16, 2),
что также свительствует о прохождении реакции.
– 17 –
Анализ препарата рчБуХЭ–САО27 по методике Карновского не обнаружил изменений олигомерного состава модифицированного рекомбинантного фермента (рис.
17). Анализ резорциноловым методом полученного рчБуХЭ–САО27 показал, что в
результате химической модификации полученный конъюгат содержал в среднем
6 молекул полисиаловой кислоты на каждый мономер рекомбинантного фермента.
Эти данные подтверждаются результатами масс-спектрометрического исследования, которым удалось выявить шесть фрагментов БуХЭ, подвергнувшихся модификации: 45–51, 453–499, 454–476, 514–544, 545–568 и 550–576 (табл. 4). Сравнение
кинетических констант гидролиза бутирилтиохолин иодида модифицированной и
немодифицированной рчБуХЭ с данными опубликованными в литературе показало,
что KM одинаковы в пределах ошибки расчетов и составляют 28±2 мкМ, 25±1 мкМ
и 23±2 мкМ соответственно, а константы k2 (830±20 с-1, 830±10 с-1 и 665±30 с-1 соответственно) лишь незначительно различаются. Для конъюгата рчБуХЭ–САО27 также
наблюдался эффект активации субстратом; параметр b отличался от литературного
значения (2,5±0,1) в пределах ошибки и составил 2,2±0,2 (табл. 5). Для определения
эффекта полисиалирования на фармакокинетические параметры рчБуХЭ–САО27
вновь были проведены испытания на животных. По полученным данным была построена фармакодинамическая кривая (рис. 18), по которой, исходя из двухкамерной
фармакодинамической модели были рассчитаны среднее время удержания, время
полураспределения и полувыведения (табл. 6).
Полученные данные свидетельствуют о том, что в результате химического полисиалирования время полувыведения рчБуХЭ–САО27 возросло в 5,5 раз по сравнению
с немодифицированной рчБуХЭ и составило 1000±140 мин и 180±30 мин соответственно. Таким образом,
– Химическое полисиалирование не влияет на олигомерный состав рчБуХЭ и не
изменяет ее кинетические параметры;
– В результате химического полисиалирования время полувыведения рчБуХЭ–
САО27 увеличилось в 5,5 раз по сравнению рчБуХЭ и стало сопоставимо с временем полувыведения БуХЭ плазмы крови человека.
A3H9
-
CAO27
ма
Оч
Пр и
еп ще
ар нн
ат ый
A3
БуХЭ плазмы
крови человека
аз
Рекомбинантная
БуХЭ человека
Пл
Рис. 16. Сравнительный
анализ рчБуХЭ (1) и
120 кДа
рчБуХЭ-САО27 (2).
82 кДа
Стрелками отмечено
70 кДа
смещение полосы белка
в результате химической
50 кДа модификации
Т
Д
M
1
2
20 кДа
Рис. 17. Сравнительный анализ олигомерного состава очищенной рчБуХЭ и конъюгата рчБуХЭ-САО27 методом Карновского
– 18 –
Табл. 4. Выявленные с помощью масс-спектрометрического анализа пептиды с
вероятной модификацией остатком N-ацетил нейраминовой кислоты (СА) в результате химического сиалирования
m/z
z
Мол. ΔМасс,
Масса,
Да
ppm
Пептид
Позиция
Модификации
1674,773 1+ 1674,773 -2,5
KPQSLTK
1226,992 5+ 6130,929
3,0
RDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQK
453–499 2xCA; Оксиление
1112,557 3+ 3335,655
3,0
DNYTKAEEILSRSIVKRWANFAK
454–476 2xСА; Метилирование
45–51
3xСА
1434,007 3+ 4300,007 -1,6
LRAQQCRFWTSFFPKVLEMTGNIDEAEWEWK
514–544 СА; 2хМетилирование
1329,562 3+ 3986,671 -1,7
AGFHRWNNYMMDWKNQFNDYTSKK
545–568 3xCА
1182,478 3+ 3545,421
WNNYMMDWKNQFNDYTSKKESCVGL
550–574 СА; Фосфорилирование
4,5
Табл. 5. Кинетические константы гидролиза
рчБуХЭ и рчБуХЭ-САО27 бутирилтиохолин
йодида в сравнении с БуХЭ плазмы крови
человека
K M,
мкМ
k cat,
с -1
K SS,
мМ
Табл. 6. Фармакокинетические
параметры рчБуХЭ и рчБуХЭ-САО27
в сравнении с БуХЭ плазмы крови
человека
b
MRT,
мин
рчБуХЭ
25±1
820±10
250±30
2,4±0,2
рчБуХЭ
рчБуХЭ–САО27
28±2
830±10
230±20
2,2±0,2
рчБуХЭ CHO*
БуХЭ плазмы крови*
23±2
665±30
140±20
2,5±0.1
* Duysen EG, Bartels CF, Lockridge O (2002) J Pharmacol Exp
Ther 302:751–758.
35
t1/2вывед.,
мин
220±50
4±1
180±30
1400±200
21±13
1000±140
2791
—
1683
чБуХЭ*
* Saxena A et al. (1998) Mol Pharmacol 53:112–122.
рчБуХЭ–CAO27
рчБуХЭ
30
Активность БуХЭ, ю/мл
30
Активность БуХЭ, ю/мл
t1/2распр.,
мин
25
20
20
10
15
10
0
5
0
75
150
Время, мин
0
0 150
500
1,000
1,500
2,000
Время, мин
2,500
3,000
Рис. 18. Фармакодинамические кривые выведения из крови препаратов рчБуХЭ и
рчБуХЭ-САО27
– 19 –
Исследование защитной эффективности модифицированной рчБуХЭ
Для определения защитной эффективности конъюгата рчБуХЭ–САО27 на первом
этапе эксперимента были определены бимолекулярные константы ингибирования
модифицированного и немодифицированного фермента агентом VR (рис. 19). Полученные данные (табл. 7) свидетельствуют о способности чБуХЭ и рчБуХЭ эффективно
связывать агент VR, а также о том, что химическое полисиалирование не влияет на
способность рчБуХЭ связывать данный ФОТ.
Способность рчБуХЭ эффективно связывать агент VR стало основанием для
проведения эксперимента на животных. Мышам внутривенно вводили препараты
рчБуХЭ–САО27 и чБуХЭ в количестве 21 мг/кг быстрой инъекцией в хвостовую вену;
через 30 мин после введения антидота внутримышечно вводили водный раствор агента VR в объеме 50–100 мкл инъекцией в большую ягодничную мышцу. Дозу агента
VR варьировали от летальной (ЛД100) до нелетальной для точного определения ЛД50.
Животных наблюдали в течение пяти дней, падеж считали через 30 минут после введения агента VR.
Полученные данные были обработаны методом пробит-анализа по методике
Девида Финни (David Finney). В результате удалось рассчитать величины защитных
индексов для двух препаратов (табл. 8): для дозы 21 мг/кг рчБуХЭ-САО27 и чБуХЭ
величина защитного индекса составила 4,2 и 4,7 соответственно.
Для контроля скрытых побочных эффектов препаратов рчБуХЭ-САО27 и чБуХЭ
на протяжении всего эксперимента животные наблюдались в серии тестов «Открытое
поле» и проходили испытание на физическую выносливость на тредбане. Результаты
наблюдений представлены на рис. 20. Видно, что в течении первых трех часов после
отравления агентом VR наблюдался значительный спад в активности испытуемых
животных во всех группах, вероятно вследствие переживаемого стресса, однако
спустя сутки все животные восстанавливали свои поведенческие показатели. Это позволяет сделать следующие выводы:
1.Внутривенное введение препаратов рекомбинантной и нативной БуХЭ плазмы
крови человека не вызывает видимых отклонений в поведении испытуемых животных. Эти данные соответствуют литературным источникам.
2.Полное восстановление испытуемых животных через сутки после отравления
агентом VR свидетельствует о том, что весь ФОТ был связан препаратами БуХЭ
до того, как достиг своей биологической цели.
Таким образом было доказано, что препарат рекомбинантной БуХЭ плазмы крови человека, модифицированный полимерами N–ацетилнейраминой кислоты при
внутривенном введении в дозировке 21 мг/кг живого веса обеспечивает профилактическую защиту от действия 4,2 ЛД50 агента VR, не вызывая побочных последствий.
Полученный конъюгат рчБуХЭ–САО27 полностью удовлетворяет основным требованиям к биологическому антидоту.
– 20 –
Табл. 7. Бимолекулярные константы
ингибирования рчБуХЭ и рчБуХЭ-САО27
агентом VR в сравнении с БуХЭ плазмы
крови человека
Мин -1 с-1
рчБуХЭ
Рис.19. Структурная формула агента VR
(8,5±0,8)⋅10 5
рчБуХЭ–САО27
(10±1)⋅10 5
БуХЭ плазмы
крови человека
(7,2±0,7)⋅10 5
Табл. 8. Защитная эффективность рчБуХЭ-САО27 и чБуХЭ простив действия агента VR
ЛД 50×10 3,
мг/кг
95% доверительный интервал
Среднее
Верхний предел
Защитный индекс,
ЛД 50(Защищенные)/ЛД 50(Контрольные)
Нижний предел
рчБуХЭ–САО27 (n=20)
79
69
90
4,2
чБуХЭ (n=24)
89
80
100
4,7
Контроль (n=61)
19
18
20
–
Б
рчБуХЭ-CAO27
чБуХЭ
Медиана и ИКР
тестовой группы
ИКР контрольной
группы
Горизонтальная
активность, %
Вертикальная
активность, %
А
В
Исследовательская
активность, %
Успех выполения
теста, %
Г
Время, мин
1
2
VR
3
Время, мин
1
2
VR
3
Рис. 20. Результаты наблюдений
за животными,
защищенными от
действия агента
VR препаратами
рчБуХЭ-САО27 и
чБуХЭ, в тестах
«Открытое поле»
(А-В) и испытании
на физическую
выносливость на
третбане (Г):
Животных наблюдали до начала эксперимента за сутки до введения препаратов белков (1), в
момент введения (2) и после отравления агентом VR (3). Медианное значение контрольной группы
во всех экспреиментах – 100%
– 21 –
III. ВЫВОДЫ
1. Разработана эффективная система экспрессии рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в клетках линии CHO, позволяющая получать до 30 мг/л активного фермента в олигомерной форме.
2.Полученный рекомбинантный фермент обладает сравнимыми структурно–функциональными характеристиками с препаратом бутирилхолинэстеразы плазмы
крови человека.
3.Впервые успешно осуществлено химическое полисиалирование гидролитического фермента. Подобраны условия реакции, позволяющие получать конъюгат
рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека с полисиаловыми кислотами с
80%-ным выходом. Показано, что данная модификация не изменяет кинетические
характеристики фермента, что свидетельствует об интактности его активного
центра.
4.Применение химического полисиалирования существенно улучшило фармакокинетические параметры рекомбинантного фермента, увеличив время полувыведения модифицированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в
5,5 раз.
5.Полисиалированный препарат показал высокую эффективность в качестве профилактического биологического антидота. Защитный индекс по веществу VR составил 4,2 ЛД50, что сопоставимо с бутирилхолинэстеразой плазмы крови человека.
– 22 –
IV. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1.Denis G. Ilyushin, Ivan V. Smirnov Alexey A. Belogurov Jr., Igor A. Dyachenko,
Tatiana Iu. Zharmukhamedovad,Tatjana I. Novozhilova, Eugene A. Bychikhin, Marina
V. Serebryakova, Oleg N. Kharybin, Arkadii N. Murashev, Konstantin A. Anikienko,
Eugene N. Nikolaev, Natalia A. Ponomarenko, Dmitry D. Genkin, G. Michael Blackburn,
Patrick Masson, Alexander G. Gabibov (2013) Chemical polysialylation of human
recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents
in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 110(4): 1243-8.
2.Д. Г. Илюшин, О. М. Эртле, Т. В. Бобик, О. Г. Шамборант, Е. А. Сурина, В. Д.
Кнорре, P. Masson , И. В. Смирнов, А. Г. Габибов, Н. А. Пономаренко (2013). Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового
поколения: разработка эукариотической системы экспрессии // Acta Naturae, том 5,
№ 1(16), C. 76–87
3.Ilyushin DG, Smirnov IV, Masson Patrick, Dyachenko IA, Novojilova TI, Bychihin EA,
Anikienko KA, Myrashev AN, Ponomarenko NA, Gabibov AG. Sialylation as a novel
approach of long-live recombinant human butyrylcholinesterase obtaining. // Материалы конференции Международная научная конференция «The 11th Meeting on
Cholinesterases». Казань, 4–9 июля, 2012 г.
4.Д.Г.Илюшин, И.В.Смирнов, Masson Patrick, И.А.Дьяченко, Т.И.Новожилова,
Е.А.Бычихин, К.А.Аникиенко, А.Н.Мурашев, Н.А.Пономаренко, А.Г.Габибов. Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового
поколения // Материалы конференции “XXIV зимняя молодежная научная школа
«Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»“,
Москва, 7–9 февраля 2012
5.Ilyushin DG, Smirnov IV, Masson Patrick, Dyachenko IA, Novojilova TI, Bychihin EA,
Anikienko KA, Myrashev AN, Ponomarenko NA, Gabibov AG. The new approach in
creating long-live recombinant human butyrylcholinesterase: sialilation // Материалы
Русско-французкой конференци «Химия в молекулярной биологии», 16–19 декабря 2011 г.
6.Илюшин Д.Г., Дурова О.М., Пономаренко Н.А., Габибов А.Г., Masson P.. Сравнительная характеристика систем экспрессии человеческой бутирилхолинэстеразы,
основанных на культуре клеток животных // Материалы конференции “XX зимняя
международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»”. Москва, 11-15 февраля 2008 г.
– 23 –
Заказ №
Подписано в печать 26.03.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа