close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Георгадзе Ц. В. Изучение стафилококкового лейкоцидина PV

код для вставкиСкачать
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР
МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
ВАКЦИН И СЫВОРОТОК имени И.И.МЕЧНИКОВА
На правах рукописи
Ц.В. ГЕОРГАДЗЕ
ИЗУЧ01НЕ СТАФИДОКОККВОГО ЛЕЙКОЦИДННА Р\/.
(096 - микробиология)
А в т о р е ф е р а т
диссертация на соискание ученой с т е п е й
кандидата медицинских наук
о к 1Ь. М'!1.)Г Е К А
М еимияитяй М и с т и
Москва -1 9 7 0
Работа выполнена в Институте эпидеииологии и шжробиологии
1лиена почетного акаденика Н.Ф.Гамалеи А1Ш СССР (директор
института - академик АМН СССР, профессор О.Б.Бароян) в
отделе раневых инфекций (за в.отд ел ом - академик АМН СССР,
профессор Г.В.Выгодчиков).
Научный руководитель:
Академик АМН СССР, профессор Г.В.Выгодчиков
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук
Д.Ы.Кушнарев
Кандидат медицинских наук
В.В.Ковалева
Научное учреждение, дающее отзыв - Московский научно-исследо­
вательский институт
эпидемиологии и микробиологии М3 РСФСР.
Автореферат разослан
_ 1970 г .
Защита состо и т ся на заседании Совета по присуждению ученых
степеней Московского научно-исследовательского и н с т и т у т
вакций и сывороток имени И.И.МЕЧНИКОВА
О С )сО С р Я 1970
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Адрес института: Москва К -64, пер.Мечникова 5а.
Ученый секретарь Совета
канд.биол. наук
Е.Г.ПЫЦКАЯ
в настоящее время изучение стафилококковых инфекций
является весьма актуальной проблемой в связи с широким рас­
пространением ряда инфекционных заболеваний, к числу которых
относятся заболевания стафилококковой этиологии. Несмотря на
значительные успехи, достигнутые в борьбе с гн ойно-свп 1 1 ческ 1 ни
инфекциями, вызванными стафилококками, удельный вес этих за ­
болеваний во в сех странах продолжает оставаться довольно вы­
соким.
Разнообразные клинические формы, как се п си с, пневмония,
менингиты, остеомиелиты, гнойные осложнения после операций,
послеродовые насти’>'ы, карбункулы с бактериемией, эндокардиты,
перикардиты, синуситы и
другие-таков далеко не полный перечень
заболеваний стафилококковой этиологии. Большов количество
заболеваний, вызванных патогенными стафилококками, объясняется
особенностями самого микроба: его убиквитарностьо, относитель­
ной устойчивосты ) к действию внешних факторов и быстрым возник­
новением резистентности к антибиотикам и ко многим другим
лекарственным препаратам.
Ыногочислевныии исследованиями отечественных и зарубежных
ученых установлено, что ведущая роль в возникновении заболева­
ний стафилококковой этиологии, а также и в создании иммунитета
к ним, принадлежит токсическим субстанциям.
Как известн о,
стафилококки продуцируют разнообразные
растворимые экзотоксины (а л ьф а -,бета .гамма , дельта— гем отоксины; лейкоцидияы; энтеротоксин) и обладают больжим набором
фернентов (в оагу л аза, ДНК-аза, гиадуронидаза, фосфатаза,
липазы и д р . ) .
Токсины стафилококка характеризуются гемолитическими, дермоневротическими,
летальными и лейколитическими свойствани,
которые находятся в определенных количественных соотн ом н и ях
друг с другом и являются проявлением единой антигенной суб­
станции.
- 2 Наиболее детально изучен альфа-токсин, ариоритет открытш
и описания которого принадлв1ит^е<«’г ^ ( 1 9 2 9 - 1 9 3 1 ). Изучение
природы и свойств альфа-токсина, его основньа особенн остей,
ведущей роди в патогенезе стафилококковых инфекций позволило
создать ддр инмунопрофилавтиви и лечения стафилококковых за­
болеваний безвредный
дериват-анатоксин, с успехЬм применяощий
как в Советском Союзе, так и за рубежом (
1929,
1930, 1931; Г .В . Внгодчивов., 1950; Б.В.Воскресенский и З.И.
Лебедева, 1 9 5 9 ).
4то касается других экзотоксинов стафилококка, то их учас­
тив в формировании стафилококковых поражений изучено пока не­
достаточно полно. Наибольмий интерес представляют дейвоцидины
стафилококка, нарувающне структуру и функцию полиморфноядерных
лейкоцитов различных видов животных и человека.
Впервые лейкоцитоцидная активность патогенных стафилокок­
ков была
описана '^оп с^е
(1 8 9 4 ).
В настоящее время работами
а.
(1 9 3 2 ), \/а€еп€сп,е о .Р ь о с т ,' '
(1 9 0 1 ),
(1 9 3 7 ),
У е п з е п а. и Х о о ^ о е
(1 9 5 6 ),
Р а п (о г г а
У а с/ гзоп о .
$Й »с6^о/г^
(1 9 5 7 ),
О.
(1 9 6 6 ) установлено существование четЕфех разди’
яых лейкоцйдинов, а именно: лейкоцидина
лейкоцидина
Р о п 'С о п - ' У'аВеп'б/пе.
лейкоцидина", л
е
й
к
о
ц
и
д
и
или "истинного
н
а
и
л
и
"лейколи-
зина", и наконец, лейкоцидина ^ о п о ^ и е Как показали дальнейшие исследования, лейкоцидин
тождествен
ал^фа-токсмну;
он лизирует эритроциз
- 3 и убнвает лейкоциты кролнка, не вызывая значительных изменений
в 1а норфохогва. Сходство ряда других св ой ств с альфа-токсином
(т е 1ш очувствитехьнос 1 ь , дармонекротическая активность, анти­
генные свойства я д р . ) , а также прямо пропорциональное обра­
зование е го альфа-токсину, послужило основанием считать лейкоцидин
и<'ес>^5^^^1двнтичным альфа-токсину.
Детальное изучение природы и св ой ств дел ы а-ток си н а пока­
зал о, что он ш е е т много общих свой ств с лейкоцидином
•
з^.опе^//еуп^п^п{о^к<^тял^ к нагреванию, подавление его
действия холестерином, специфические антигенные свой ства и д р . ) .
Все препараты, в которых обнаруживают дел ьта-ток си н , содержат
лейкоцидин 5^5й»Л лй?/т^-У/^/7/^^^наблю дается корреляция между
их титрами. Лейкоцидин 5/ой^^<>т«»-?У«»^/т/л^/тдивнрувт эритро­
циты и убивает лейкоциты в се х видов животных, кроме бараньих.
В процессе микроскопического изучения лейкоцитов установлено,
что под действием лейкоцидива
(ввиду значительного увеличения ядер и скопления гранул к
одной стен к е) становятся похожими на "кольца с печаткой” .
При высоких ковдевтрациях наступает лизис кл еток,
поэтому дан­
ный лейкоцидин носит также название "лейколиэина".
Лейкоцидин р егп 'б оп нооть
, в противоволож-
двум выне описаянш лейкоцндияан, оказывает гибельное
дествие только на лейкоциты человека, не обладая гемолитической
и дермовекротической активностью в отн < м ен а различных життных
и человека. Ори микроскопическом изучеяии разруиення лейкоцитов
в мазках, характерным для действия лейкоцидина РУ является
потеря дольчатоети ядер гранулоцнтов, в процессе созфанеЕвя
оболочек клеток*
- 4 Ч ю касается лейкоцядиыа 2>огт а^ие- вси€о6у^'>п.
, то по
характеру морфологяческвх изменений, вызываемых в полиморфнс^
ядерных лейкоцитах человека, данная субстанция сходна с дейкоцидивом
Р о п 'б о г г - ]/я.Рет ^'гге.
Однако, установлено, что лейкоцидиы ^опоАи«-Вл€</\*/^г 1 про­
дуцируется только эпидемическими итаммами фаготипов 8 0 /8 1 .
В литературе пока
еце нет сообщений о природе и свойствах
данного лейкоцидина, поэтому в настоящее время нельзя сделать
окончательных выводов об идентичности лейкоцидина
Во
лейвоцидину
9 )о п а ^ и е -
Р V.
Таким образом, из в сех лейкоцидияов только лейкоцидин
Р<^гх^оп.-\/ск€€п-ип€
( РУ
) является самостоятельной
субстанцией, представляя собой "истинный лейкоцидиы".
Определенную роль лейкоцидин р\^грает и в патогенезе стафилокок­
ковых инфекций. Активность данной субстанции направлена на полиморфноядервые лейкоциты человека, вызывает их тяжелые поврежде­
ния и,таким обраэом^препятствует осуществлеаищ фагоцитарных
функций лейкоцитов. Отсутствие же в восприимчивом организме
анти-Р V-xейкоциднва может привести к развитяп тяжелых
стафилококковых
форм
заболеваний. Следовательно, сп особн ость стафило­
кокков продуцировать лейкоцидиы Р У
, очевидно, характеризует
е го агрессивные св о й ств а .
Однако, об основных свой ствах лейкоцидина Р У
, а также
о е г о ролм 1 аначевш 1 в развнтви стафклохоквовых нвфекцхй
нввеотно очень нало. Исоладованиянк некоторых авторов (З .И .Л абед е в а , 1962; В.Н. Световидова (1 9 6 5 ); И.А.Сытвнх 1966; УоАапо\/‘
19 5 7 ,
о . 1 /о л си »г^ ^
1959,
1 9 6 7 ), уста­
новлена раопространенвость итаммов, ородуцврующвх лейкоцидвн
Р У среди патогенЕШ стафилококков; обваружена связь продужцяв
- 5 коагулазы и хейвоциджна Р У ; большая устойчивость в антшбиотикам; изучены невоторые свойства дейкоцидина
: антигенные
св ой ств а , отношение в яагреванжш, действию холестерина.
В работах
'^ о о с С »п ,
(1 9 5 9 -1 9 6 5 ), И о ^ ^ о п с ^ е г
(1963)
изучены отдельные способы очистви и концентрации дейкоцидина
Р У , а также его хиническое строение и иолекудярвый в е с.
Так как данные литературы о дейкоцидине РУ немногочислен­
ны, возникает необходю ю сть дальнейшего детального изучения
роли и значения е го в патогенезе стафилококковых инфекций.
Задача нашей работы - изучение распространенности РУ
дейкоцидин - прдуцирующих нтакнов среди патогенных штаммов
стафилококка; выявление в исследуемых штаммах-продуктах
дейкоцидина РУ корреляции с другими экзотоксинами и ферментами;
отбор патогенных штаммов с максимальной активностью дейкоцидина
РУ
для получения возможно очиненных и концентрированных пре­
паратов дейкоцидина
РУ
; изучение цитотоксического действия
нативных и концентрированных препаратов лейвоцидина
РУ
на
лейкоциты человека и возможная дифференциация е го от других
экзотоксинов стафилококка.
Для определения силы дейкоцидина
Р У , продуцируемого
исследуемыми штаммами, мы использовали метод, предложенный
о. V'^^^си^^X{1ЭЪЭ), Исследовали 448 штаммов патоген­
ного стафилококка, выделенных из зева и носа здоровых людей и
из патологического материала больных
маститом, пневмонией и
эмпиемой плевры, пидермитом, фурункулезом, сепсисом и септикопиемией, а также у больных с послеоперациониш нагноением,
инфицированным ожогом и д р . Из 448 штаммов 150 выделено от
взрослых (и з них 39 от здоровых) и 298 - от детей (и з них - 70
- 6 эдоровьсс). Стафилококки изучали по следующим признакам:
коагудазная активность в отнонвнии плазмы кролика, наличие
и активность лейкоцидина
наличие ДНЕ-ааы, лецитивааы,
фибринолизина, наличие и титры альфа-и дельта-генолиэинов,
чувствительность к 5 антибиотикам (пенициллину, стрептомицину,
левомицину, террамицину, биомицину) и принадлежность к ф аготипу.
Для оценки достоверности полученных результатов в процес­
с е изучения соотнонения между отдельными признаками мы приме­
няли статистический анализ. При сопоставлении биологических
свой ств мтаммов использовали критерий у
, а для выявления
корреляции между наличием и степенью выраженности разных приз­
наков - подихорический показатель связи
Штаммы-продуценты лейкоцидина практически были обнаружены
в одинаковых количествах в материале (г н о й , отделяемое ран
и свищей, кровь и т . д . ) , выделенном
от больных с заболевания­
ми стафилококковой этидогии, независимо от характера заболева­
ния.
Среди больных детей продуценты лейкоцидина составляли
6 7 ,7 ^ , среди взрослых - 83,2% . Довольно высокий процент про­
дукции лейкоцидина Р V отмечался и среди здоровых взрослых
- 67,5% и детей - 48,6% . Следует отметить, что стожь высокий
процент лейкоцидни-продуцирумоа штаммов среди здоровых бмл
обусловлен, в основном, сдаботокеигенными штаммами (титры лейкоцидлна 1 :5 - 1 :1 0 ) .
Сопоставление плазомокоагулнрующей активности изученных
нтаммов с продукцией лейкоцидина Р Ч выявило высокую степень
|
I'
- 7 корреляции, т . е . практически в се итаниы-продуценты дейкоцидина РУ коагулировали кроличью цитраткую плазму (100% ).
Лейкоцидпн-отрицательные штаюш с продукцией козхулааы с о с ­
тавляли 87,3%.
Активность лецитиназы среди дейкоцидин-положительных
атаииов, выделенвых как от д етей , так и от взрослых,составляла
92-99% ч т о , очевидно , следует учитывать при характеристике и
установлении патогенности стафилококков.
Продукция фибринолкзина выявлена у меньиего количества
штаммов-продуцентов лейкоцидина Р У , что составляло 70-71%,
причем среди здоровых продукция фибринолизина была ниже 97-63%. При рассмотрении продукции фибринолизина среди лейкоцидин-отрицательных втаммов относительно высокая продукция
была выявлена среди больных, как взрослы х, так и детей 60-70%;
число фибринолиэин-положительных втаммов среди здоровых не
превывало 50%.
Как один на критериев патогенности мы использовали один
из высокоспецифических методов определения патогенности стафи­
лококков - определение ДНК-аэвой активности.
В доступной нам литературе мы не
встретили работ о взаимо­
связи лейкоциднновой к ДНЕ-азной активности, ДНК-азная актив­
ность
среди лейхоциднн-продуцвруюцих втаммов была выявлена в
80%, продукция же ДНК-азы среди лейкоцидин-негативных втаммов
составляла 65,2% . Штаммы стафилококка, с одновременной продукци­
ей лейкоцидина Р У и ДНК-азы,были выделены в основном от боль­
ных с пневмонией, сепсисом и маститом, что составляло 83-87%
■8 общего числа лейкоциднннюзятнвных культур. Лейкоцвдннположмтельвые мтаммы, выделенные от здоровых, продуцнро]
ДНК-азу в 60% случаев.
- 8 Пошшо определения вышеперечисленных признаков мы подверг
гали в се дейкоцидин-продуцирусщие штаммы фаготипированию с по­
мощью мехдународвого набора типовых стафилококковых бактерио­
фагов* Поскольку значительная часть изучаемых нами лейкоцидинпродуцирующих штаммов получена из детских лечебных учрехдений,
представляло интерес выяснить их ф агоструктуру, так как ни в
отечественной, ни в зарубехной литературе мы не встретили
данных по этому в оп р осу . Однако, мы не смогли установить какихлибо особенностей в отношении типируемости фагами лейкоцидинпродуцирующих штаммов. Как и большинство патогенных штаммов
стаф и л ^ окка, штаммы-продуценты лейкоцидина типировались фагами
Ш группы (72% ), Среди детей типируемость фагами Ш группы с о с ­
тавляла 64,2% , т . е . основная часть лейкоцидин-продуцируемых
штаммов относилась к Ш фагогруппе.
Следует указа ть, что для получения данных о типируемости, мы
ограничились дозой фага 100ТР. Возмохно, применение более высех х х доз фага (ХОООТР и д р .) могло повысить процент типируеных
штаммов. '
У в се х лейкоцидин-продуцирующих штаммов изучали такхе
чувствительность к наиболее часто применяемым пяти антибиотикам
^пенициллин, стрептомицин, левомидитин, биомицин и террамицин).
Нахи не выявлено прямой взаимосвязи мехду продукцией лейвоцидива Р У и резистентностью в антибиотикам. Как и среди лейкоцидиннегативных штаммов, большинство продуцентов лейкоцидина (около
2 /3 штаммов - 87-89%) были резистенты к пенициллину и с т р е п о мицину.
- 9 Е остальным антибиотикам резистентные нтзммы составляли почти
половину из числа иаучевных культур.
У в с е х выделенных штаммов, помимо установления гемолити­
ческой активности, определяли силу продуцируемых альфа-и дель­
та-токси н ов в опытах титрования их на эритроцитах кролика и
человека. Следует отметить, что больнинство лейкоцидин-автивных итаммов продуцировало-одновременно с лейкоцидином альфа-и
дельта-генолианы (7 6 ,7 % ). Значительно реже итаммы продуцировали
один из экзотоксинов. Изолированная продукция лейкоцидина Р V
выявлена только в 2,8% , в комбинации с дельта-гемолизином - в
3,5% и несколько выне в комбинации с альфа-гемолизином - в
16,8% . Таким образом, продукция лейкоцидина Р У патогенными
нтаммами стафилококка встречалась в основном при одномременном
наличии в одних и тех же образцах культур обеих гемолизинов.
Сопоставленяе данных по продукции гемолизинов среди лейкоцидинпоантивных и лейкоцидин -негативных мтаммов показало одинаково
высокую продукцию альфа-гемолизина в обеих группах (96-97%
мтаммов), в то время как нтаммы-продуценты дельта-токсина в
первой группе составляли 80%, а во второй - только 47%. В
процессе определения силы лейкоцидина Р V и гемолизинов (альфаи д ел ь т а -) путем титрования установлено, что сила выделяемого
нтаммами лейкоцидина Р У , как и дельта-токсина относительно
невысока - 1 :2 0 - 1 :8 0 , в то время как гемолитические титры
альфа-токсина более высокие - от 1 :8 0 от 1 :6 4 0 . Статистическая
обработка изученного материала выявила корреляцию по величине
титров между продукцией лейкоцидина Р V и продукцией гемоли­
зинов.
- 10 Была сделана также попытка установить корреляцию между
продукцией экзотоксинов (комбинированной иди изолированной)
с ферментативной активностью стафилококков. Более полный
набор
изученных нами ферментов
об: 1аружен среди штаммов
стафилококка с одновременной продукцией в
одних и т е х же
образцах культур всех трех экзотоксинов (лейкоцидин Р V и
альфа>дельта>гемолизины). Но так как штаммы с продукцией в сех
трех экзотоксинов составляли 7 6 ,7 ^ , а с изолированной продук­
цией одного из эк зотоксин ов, например, с продукцией лейкоциди
на 2,8% , трудно предположить искомую взаимосвязь.
На основании всех полученных
данных мы сделали вывод с
тесной взаимосвязи продукции лейвоцидина Р V с патогенностью
стафилококков и возможном использовании определения активност
дейкоцидина Р V в
качестве одного из основных т е ст о в патоген
ности стафилококков.
Для получения нативных и концентрированных препаратов
дейкоцидина Р V первоначально мы использовали метод
(1 9 3 3 ). Штаммы-продуценты дейкоцидина РУ
вырацив
на агаре Хоттингера (р Н «б,8 - 7 , 2 ) , покрытом целлофаном.
Преимуществом метода
являлась хорошая
аэрация растущей на поверхности целлофана культуры, накоплен!
лейкоцидина Р V на целлофане в
высоких титрах, отсутстви е
в нативном токсине белковых компонентов питательной среды в
ряда продуктов ыетаболизна клеток, которые диффундируют в ап
в связи с
чем облегчается дальнейшая концентрация и очистка
лейкоцидина Р V . Однако, получение сравнительно малых количе*
нативного токсина (в с е г о 100-150 мы в 1 опыте) и большая тру,
емкость - недостатки данного метода.
- II Кроме т о г о , величины титров лейкоцидива
в смыве с разных
чашек Петри колебались в значительных пределах (о т 1 :5 до
1 :8 0 ) , что влияло ка величины титров исходного нативного
лейкоцидива Р V.
В связи с необходимостью получения больших объемов на­
тивного токсина с использованием дальнейших методов концен­
трации, основанных на растворении белкового осадка в малом
объеме жидкости по сравнению с исходным, мы решили получить
лейкодидиы Р V в жидкой ср е д е . С целью выбора наиболее при­
годной
среды для продукции лейкоцидива Р V испытали
три
различные питательные среды: казеиново-растительную ср еду,
мясо-пептонный бульон и бульон Хоттингера (РН в се х сред *
6 ,8 - 7 ,2 ).
Штаммы-продуценты лейкоцидива Р V выращивали в жидкой
питательной среде ( I литр
в 5-литровой бутыли). Бутыли по­
мещали в шюттель-аппарат, культуры выращивали в течение 18-22
часов при 37*^ с о встряхиванием (8 0 -1 0 0 раз в минуту).
Встрахивание питательной среды обуславливало лучшую аэрацию
культуры.
Оптимальной для продукции лейкоцидива в этих
условиях оказалась казеиново-растительнея ср еда. Эту среду
использовали в дальнейших опытах для получения больших
количеств нативного препарата лейкоцидиыа Р V . Чтобы устано­
вить динамику накопления лейкоцидина Р V в различных жидких
питательных ср едах, из бутылей стерильно брали пробы через
каждые 2 часа в течение в се го
периода выращивания.
Ыаксимальное накопление лейкоцидина Р V при выращивании на
казеиново-растительной среде отмечалось после 18-22 ч а с.р о ст а
культуры, причем титры лейкоцидина Р
полученного данным
методом, не отличалнсь существенно от титров лвйкощцина Р V ,
- 12 выяынв 1шх при использовании метода
В 1ьлА-
(1 :1 6 0 - 1 :3 2 0 ) . Активность лейвоцидиыа РУ/ при исиильаовании
двух других сред была ниже. Оптимальная активность величин
титрОА лейкоцидина РУ/ выявлена при рН среды = 6 * 8 -7 ,2 и
количестве микробных тел в пределах 15-30 млрд в конце инку­
бации (чер ез 18-22 час
с момента посева культуры).
Нативный лейкоцидин Р V получали после
выращивания
культуры путем отделения микробных тел центрифигурованием при
4 .0 0 0 -5 .0 0 0 об/мин в течение 30 мин.
Однако* метод получения лейкоцидина Р V в жидкой среде
имел также определенные недостатки: образование при встряхи­
вании значительного количества пены* которая могла сорбировать
белковые компоненты* в том числе и лейкоцидин Р V* наличие в
нативном препарате компонентов питательной среды, продуктов
метаболизма стафилококков и пигмента. Все это осложняло вы­
деление лейкоцидина Р V в очищенном виде и влияло на его
активность, поэтому мы использовали данный метод только при
необходимости получения больиих количеств нативного лейко­
цидина Р V .
Для повыяения специфической активности лейкоцидина Р V
проводили концентрацие и очистку нативного препарата лейко­
цидина Р V , подученного как на плотных* так и на жидких пи­
тательных ср едах. Концентрацие лейкоцидина Р V проводили путем
осаждения препарата сернокислым аммонием. Для осаждения исполь­
зовали 3 различные концентрации сернокислого аммония: полное
насыщение (7 5 г на 100 м л ), 75^ насыщение (5 0 г на 100 мд) и
50% насыщение (3 9 г на 100 мл). Максимальная кратность увели­
чения титров лейкоцидина Р V (в 8 р а з) подучена при 75% насы­
щении* в то время как при 50% и 100% насыщении кратность
- 13 нарастания титров была вдвое неньше.
Для далвнеВией концентрации лейкоцидина Р V проводили
трехкратное элюирование препарата с использованием растворов
сернокислого аммония различных молярностей - 3*5 14, 2 ,1 14 и
I » ! и { ' ^ о о с С / п,
1959; И.В.Кушсо 1 9 6 5 ). Максимальная актив­
ность лейкоцидина Р V выявлена после элюирования 1 ,1 Ы рас­
твором сернокислого аммония. Выход токсина составлял 66,7% .
Дальнейшую очистку и отделение лейкоцидина Р V от основной
массы экстрацелдюлярных белковых продуктов проводили путем филь­
трации концентрированных токсинов через сеф а д ек сы ^ - 100
^ - 200
(
Ио€бапсСе'с
и
, 1 9 6 3 ). Препараты, подлежащие
очи стке, обычно имели титры лейкоцидина = 1 :6 4 0 - 1:1280 и
содержали белок до 45 мг/мл. Фильтрацию проводили фосфатным
буфером (рН = 6 , 8 - 7 , 2 ) , молярность = 0 ,0 5 .
Фракции собирали в объеме 3 -5 мл и определяли в них титры лейкоциднна Р V
, фракции, содержащие
и содержание белка по
лейкоцидив РV переосажцали сернокислым аммонием для повышения
концентрации лейкоцидина РУ и получали, таким образом, частич­
но очищенный препарат лейкоцидина Р У
. Средние титры лейко­
цидина в полученном препарате были равны 1 :8 0 -1 :1 6 0 -1 :3 2 0 ,
содержание бедка от 6 ,5 до 1 2 ,3 мг в 1 мл.
В качестве продуцента лейкоцидина РУ во в с е х опытах по
очистке и концентрации
стафилококка: У .8 ,
использовали 2 патогенных штамма
выделенный в 1936 г .
я й* 9 3 ,
выделенный
в 1964 г . при хроническом фурункулезе. Изученные штаммы коагу­
лировали кроличью цитратную плазму, продуцировали децитинаау,
фибрмволиэша, ДНК-аау и были устойчивы к антибиотикам. Титр
лейкоцидина штамма
V 8 -1 :1 6 0 № 9 3 -1 :8 0
- 14 В аастояцее вреня использование недостаточно стандартных
и унифицированных ыетодов определения лейкоцидиновов активно­
сти вызывает больвше трудности при установлении
типа лейко-
цидинов в их дифференциации* В приыеняемых методах определение
активности лейкоцидинов основано на количественных изменениях
в соотношении живых и погибших лейкоцитов под действием
стафилонокковых токсинов. В 1957
а.\/ап
изучая характер морфологических изменений при действии стафилокок­
кового д ел ы а -ток си н а , применяли для микроскопии мазков крови
(лейкоцитов) фазовый контраст.
Для изучения структурных изменений в гранулоцитах человека
под действием лейкоцидина РУ
и
гемолизинов (альфа-и дельта)
при микроскопии мазков крови мы также применяли фаговый кон­
т р а ст .
С цедьо изучения морфологических изменений в гранулоцитах
человека мы использовали следующие препараты стафилококковых
токсинов:
1.
Концентрированный и очищенный препарат лейкоцидина РУ
с активностью равной 1 :8 0 -1 :1 6 0 .
2* Прдпарат дельта-токсина, приготовленный из штамма-продуцвнта К 88 в ЙЭН им. Н.Ф.Гамелей, использовали его в
концен­
трированном и очищенном виде. Гемолитическая активность равня­
лась 1 :8 0 -1 :1 6 0 .
3 . Нативный препарат стафмлиловоквового альфа-токсина, при­
готовленный из атамма-продуцента альфа-токсина (нтаим 0 -1 5 ) .
Гемолитическая активность составляла 1 :1 6 0 -1 :3 2 0 .
- 15 Виявдвнные намн морфологичесвю ■вмевенш! в клетках к р о н
человека (гранулоцнтах), обусловлевные жойетвиен различных
стафилококковых токсинов, носили разнотипный характер.
Под влиянием дейкоцидина
изменялись в оеновом ядра к л е т о !.
Ухе через 5*10 мин. после добавления препарата ядра нейтрофилов
теряли выраюнкую очерченность, распадаясь на
отдельные дольки.
Срок от начала воздействия до наступления морфологических изме­
нений зависел от силы -применяемого токсина и длился от 20 мня.
до 1 ,5 ч а сов . В течение э т о г о периода
ядра
почтя полвоотью исчазалх
клеток при сохранении гранул и клетки напоминали собой
” меххи с гранулами".
Несколько иным был характер изменений в структуре клеток
при
д е й с т в а стафилококкового дельта-токсина. Через 1 -2 мин.
после воздействия препарата наступала вырахекная деформацш бол ьи в с т в а нейтрофилов, которые одновременно т е р я л о ч е р ч е л о е т ь к л
ядер, так и обол очек. В течение 1 5 -2 0 мин. эти клетки лизировал с ь и в поле з р е н и обн ар ухи вал сь лихь отдельные г р а н у л .
Сохранившеся единичные клетки такие п о д в е р га л с ь д е е т р у к д и и
лизису в последущ не несколько минут. Срок е момента в о з д е й с х в и
до наступления морфологических изменений зависел (как и при ис­
п ол ьзов ал и аейкоцидина Р у ) от с и л применяемого!
токсина,
однако в данном случае б ш короче - о т I до 40 л в у т .
При испытани препарата ал ьф а-токол а в т е ч е л е первых 50-60
л н . деструктл н ы х лмевений в гранулоцитах л
не в а бл в д а л ,
отм еч а л лихь п р екрац еле п о л и х в о ст и л е т о к . Обваружнмвщноея
через 1 ,5 - 2 часа
л м е н е н ш в морф олога ней тр оф л ов, которца
н о с и л разнотипный характер, очевидио, б ы л -о б у о л о л е ш хфмоутотвига в препарате д р у п х токсических вонаавеитов и, ирова
- 16 т о г о , естественное гибелью клеток.
Таким образом, зарегистрированные особенности картины при
действии различных препаратов экзотоксинов стафилококка указы­
вали на т о , что каждому из них свойственно свое цитотоксическое
действие. Разнотипность изменений, возникаомих под действием
указанных препаратов, подтверждала существованне различных
лейкоцидинов, продуцируемых стафилококками.
В ЫВ ОДЫ
■V
1 . В результате комплексного изучения 448 патогенных отамыов стафилококка, выделенных от здоровых носителей и больных,
показано, что эти отаммы представляют собой группу микроорга­
низмов разнородную по билогическим признакам.
2 . Установлена широкая распространенность штаммов ста ­
филококка, продуцирующих лейкоцидин
среди патогенных
стафилококков различного происхождения. Ые найдена взаимосвязь
итаммов-продуцентов дейкоцидина Р\/ с источником выделения
культур.
3. Показана корреляция продукции дейкоцидина РУ с при­
знаками патогенности стафилококков; с коагулазной и лецитиназной активностью, продукцией гемолизинов (альфа-и д е л ь т а -), ДНКазыой активностью, устойчивостью к антибиотикам.
4 . Установлено, что величина лейкоцидиновой силы проду­
цируемых штаммов стафилококка в среднем находится в пределах
1 :2 0 -1 :8 0 .
5 . Для получения дейкоцидина РУ использован метод вырацивания культур на плотных питательных ср едах. Показана воз­
можность получения дейкоцидина РУ в жидкой среде при условии
ее непрерывного встряхивания. Определены преимушества и н е -
- 17 достатки эт ого метода.
6 . Показана эффективность концентрации деВкоцидина Р\/
осаждением сернокислым аммонием. Установлено повышение актив­
ности лейкоцидина после концентрации в 15-20 р а з.
7 . Показана возможность использования гелевой фильтрации
через сефалексы
- 100 и ^
- 200 для
частичной очистки
лейкоцидина Р V и отделения е го от основной массы белковых
экстрацеллилярных продуктов.
8 . Выявлены некоторые особенности цитотоксического
действия лейкоцидина Р У и гемолизинов (альфа-и д е л ьта -) на
гранулоциты крови человека при изучении их морфологии.
- 18
Р аб о м . ддтб дко »йяш 1 а о _ т т дисортм ш и
I . ГЮРГАД8Е Ц.В.
О распространеыыости патогенных
■таммов стафилококка, выдедяоних
лейвоцнднн РУ и связи е го продук­
ции с признаками патогенности.
Материалы второй научной се сси и ,
посвяценной проблемам стафилокок­
ковых инфекций. Д. 1967, 2 1 .
2 . ГЕОРГАЛЗБ Ц.В.
О распространенности патогенных
■танмов стафилококка, выдедявщих
лейкоцидиЕ и св я зь его продукции
с прианаками патогенности.
ЭМЭИ. 1969, 2 , 158.
3 . ГЕОРГАДЗЕ Ц.В<
Современное представление о приро­
де и свой ствах стафилококковых
лейкоцидннов (в печати).
4 . ГЕОРГАДЗЕ Ц.В.
Некоторые особенности действия
стафилококковых лейкодидинов на
гранулоциты человека.
Бвлдетень зкспернментахъной биоло­
гии и медицины 1969, 8 , 8 7 -8 9 .
5 . ГЕОРГАДЗЕ Ц.В.
Концентрация и очистке стафилокок­
кового лейкоциднва РУ.
Материалы научной конференции мо­
лодых научных сотрудников и аспи­
рантов ТбнлЮШВС и ГрузНИНСиГ
Тбилиси, 1970, 3 8 -3 8 .
- 19 6 . ГЕОРГАДЗЕ Ц.В.
7. Т з У -^ ео х -^ а с С г.^
Изучение лейкоцидин-продуцируюфис
юфакиов стофилококка* выделенных в
детсвих лечебных учреждениях.
Материалы научной концеренции моло­
дых научных сотрудников и аспирантов
ТбилНиИВС и ГрузНИИСиГ.
Тбилиси, 1970, 39 -3 9 .
С ^ € си п .
0.5/оес^ о/ас^Юп,
5 ^ ар ^ ^ €осассо5
^ еи сосс-
сС/п^ Огг. ^ и гп а п . р^Опсс^су^& 5.
М }С 1 :о ^ ^ о б о ^ Й ёз^ -сос^ ^ . В ^ 53^ .
(ЮМ зсо«)д/)(Юь ^м^эсо /хюамэ
Р \/ сэозтоообоь аоьб^УК^•^
Кош1ро»адьвон 1вож1 «е 2ЬВый отдел РВЦ ЦС7 ГССР 7В11466
Закад
Т ар .2 ^ 0
1970г. ТбЕдасж, Пекжна 4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
2 524 Кб
Теги
лейкоцидина, стафилококкового, георгадзе, изучения
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа