close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

141163

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
НИКОЛЬСКАЯ Анна Борисовна
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ
ВОДОРОДА БИОФОТОЛИЗОМ ВОДЫ
02.00.15 – кинетика и катализ
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва - 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук и на
кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского
государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научные руководители:
член-корр. РАН, доктор химических наук
Варфоломеев Сергей Дмитриевич,
доктор биологических наук, профессор
Ефременко Елена Николаевна.
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
Ярополов Александр Иванович,
заведующий лабораторией химической
энзимологии Федерального государственного
бюджетного учреждения науки института
биохимии им. А.Н. Баха Российской академии
наук;
доктор биологических наук, профессор
Василов Раиф Гаянович,
начальник научно-технического комплекса
биоэнергетики Национального
исследовательского центра «Курчатовский
институт».
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт химической
физики им. Н.Н. Семенова Российской
академии наук, г. Москва.
Защита состоится «3» декабря 2013 г. в 1500 часов на заседании
Диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском
государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва,
Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии,
аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной
Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
библиотеке
Автореферат разослан « 1» ноября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат химических наук,
Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Водород широко применяется в различных химических
процессах, связанных с гидрированием, но также рассматривается в качестве
перспективной альтернативы традиционным ископаемым топливам.
Основное производство водорода сегодня связано с реализацией различных
термохимических процессов. Однако огромный научно-практический интерес и
актуальность представляет собой биологический способ получения водорода, так
как он позволяет избежать загрязнения окружающей среды и использования
ископаемого топлива, применить в качестве катализаторов клетки микроорганизмов
при условиях, характерных для их жизнедеятельности, создать экологичные
каталитические системы производства, функционирующие в отсутствие высоких
температур и давления в рабочем реакторе.
К числу методов получения водорода биологическим путем относятся:
анаэробная ферментация углеводсодержащих сред с участием клеток бактерий,
прямой или непрямой биофотолиз воды, катализируемый клетками микроводорослей
или цианобактерий и т.д. Однако все они находятся пока на стадии технологических
разработок и характеризуются низкой эффективностью. Альтернативой таким
методам может служить биофотолиз воды, осуществляемый в две стадии клетками
разных микроорганизмов, включающими накопление биомассы клеток кислородпродуцирующих микроорганизмов (КМ), способных осуществлять фотосинтез, и
последующую
ее
анаэробную
конверсию
клетками
водород-продуцирующих
бактерий. Принципиальная схема процесса выглядит следующим образом:
h
CO2 + H2O
CH2O + H2O
CH2O + O2 (осуществляется клетками КМ);
темнота
2H2 + CO2 (осуществляется клетками бактерий).
Такой процесс является весьма перспективным в связи с тем, что он использует
единственный и исключительно чистый источник энергии, имеющий неограниченные
резервы, – свет, и имеет огромное практическое значение с точки зрения получения
альтернативных
видов
топлив.
Применение
иммобилизованных
клеток
в
обсуждаемых процессах позволяет повысить выходы конечных продуктов, упростить
_____________________________
Список сокращений: АБЭ-ферментация – ацетон-бутанол-этанольная ферментация; АТФ –
аденозинтрифосфат; ИБК – иммобилизованный биокатализатор; ПВС – поливиниловый
спирт; КМ – кислород-продуцирующие микроорганизмы.
1
операции выращивания и хранения культур микроорганизмов, а также позволяет
создать новую перспективную технологию получения водорода.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы была разработка системы
сопряжения процессов фоторазложения воды и образования водорода на основе
иммобилизованных клеток микроорганизмов.
В рамках этой работы решались следующие основные задачи:
1 – разработать биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий
рода Clostridium, продуцирующих водород в процессе ацетон-бутанол-этанольной
ферментации
(АБЭ-ферментации),
оптимизировать
его
состав
и
условия
функционирования, а также определить основные каталитические характеристики
биокатализатора;
2 – определить возможность использования биомассы различных КМ для ее
конверсии иммобилизованными клетками бактерий рода Clostridium в водород, и
отобрать культуры КМ, позволяющие накапливать биомассу, подлежащую наиболее
эффективной конверсии в целевой продукт;
3 – разработать методы эффективного накопления биомассы клеток КМ для их
конверсии в водород, а также метод иммобилизации клеток этих микроорганизмов;
4
–
определить
возможность
использования
культуральной
жидкости,
получаемой после стадии применения иммобилизованных клеток рода Clostridium в
качестве среды для накопления биомассы клеток КМ;
5 – установить режим эффективного функционирования биокаталитической
системы получения водорода биофотолизом воды из биомассы КМ.
Научная новизна. Предложена оригинальная кинетическая модель роста клеток
анаэробных
бактерий
Clostridium
acetobutylicum
в
режиме их
инактивации
нейтральными продуктами, которые образуются в процессе АБЭ-ферментации.
Впервые установлено, что использование криогеля поливинилового спирта
(ПВС) в качестве носителя для иммобилизации клеток Clostridium acetobutylicum
приводит к существенному повышению выходов водорода в процессе АБЭферментации глюкозосодержащих сред.
Впервые показана возможность использования биомассы широкого спектра КМ
в качестве потенциального субстрата для получения водорода в процессе АБЭферментации иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum. Обнаружено
2
влияние биохимического состава и условий культивирования клеток КМ на выходы
целевого продукта.
Впервые установлено, что использование криогеля ПВС в качестве носителя для
иммобилизации клеток зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris позволяет
значительно повысить эффективность накопления биомассы свободных клеток КМ в
средах
различного
состава
в
полунепрерывном
и
непрерывном
режимах
культивирования.
Впервые предложен двухстадийный процесс биофотолиза воды по замкнутому
циклу с использованием клеток микроводорослей и анаэробных бактерий для
получения водорода.
Научно-практическая значимость. Разработан и оптимизирован по составу
новый
биокатализатор
acetobutylicum,
на
основе
иммобилизованных
клеток
в
анаэробных
криогель
ПВС,
бактерий
который
Clostridium
может
быть
многократно использован для получения водорода в процессе АБЭ-ферментации сред
разного состава в реакторах различного типа, при этом скорость накопления целевого
продукта может быть улучшена в 17 раз.
Установлено, что в качестве сред для получения водорода в процессе АБЭферментации иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum можно
использовать среды, содержащие термически предобработанную биомассу клеток
КМ. Предлагаемые среды являются экологически чистым и доступным сырьем, но, в
отличие от целлюлозо- или крахмало- содержащих сред, требуют значительно
меньших затрат на их получение, предобработку и использование.
Разработан новый биокатализатор на основе клеток микроводорослей Chlorella
vulgaris, включенных в поры криогеля ПВС, который позволяет накапливать
биомассу клеток данного вида в средах различного состава в полунепрерывном и
непрерывном режимах культивирования со скоростью в 8 раз выше, чем в случае
использования известного из литературы аналога.
Впервые предложена новая замкнутая биокаталитическая система получения
водорода биофотолизом воды, представляющая собой двухстадийный процесс с
участием клеток КМ и водород-продуцирующих бактерий, полный рабочий цикл
которого может быть осуществлен многократно.
3
Основные положения, выносимые на защиту: 1 – Кинетическая модель роста
клеток анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum в режиме их инактивации
нейтральными продуктами, которые образуются в процессе АБЭ-ферментации.
2
–
Биокатализатор
на
основе
клеток
Clostridium
acetobutylicum,
иммобилизованных в криогель ПВС, может быть многократно использован для
эффективного получения водорода в процессе АБЭ-ферментации сред различного
состава в реакторах разного типа;
3 – Использование термически предобработанной биомассы клеток зеленых
микроводорослей Chlorella vulgaris, культивирование которых проводилось в
минеральной среде с добавлением глюкозы, в качестве субстрата для АБЭферментации иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum позволяет
получить максимальные выходы водорода;
4 – Биокатализатор на основе клеток Chlorella vulgaris, включенных в криогель
ПВС, может быть успешно использован для накопления биомассы клеток данного
вида с высокой скоростью в средах различного состава в полунепрерывном и
непрерывном режимах культивирования;
5 – Сопряжение процессов накопления биомассы Chlorella vulgaris и АБЭферментации
клетками
Clostridium
acetobutylicum
позволяет
создать
новую
биокаталитическую систему получения водорода биофотолизом воды.
Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в постановке задач,
проведении
экспериментов,
обобщении,
анализе
и
трактовке
полученного
экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. Все
изложенные в диссертации результаты получены автором лично или при его
непосредственном участии в подготовке и проведении экспериментов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих
конференциях: VIII, IX, X, XI Ежегодная молодежная конференция ИБХФ РАНВУЗЫ “Биохимическая Физика” (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011), International
conference «Catalysis for renewable sources: fuel, energy, chemicals» (Tsars Village, St.
Petersburg suburb, Russia, 2010), 18th and 19th European Biomass Conference and
Exhibition (Lion, France, 2010, and Berlin, Germany, 2011).
Публикации. Основные результаты работы по теме диссертации представлены
в 19 печатных работах: из них 5 статей в рецензируемых журналах, входящих в
4
Перечень ВАК, 4 статьи и 10 тезисов в сборниках трудов международных
конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 169 стр., включая 58
рисунков, 34 таблицы, и состоит из введения, 3 глав (литературный обзор, материалы
и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка литературы
(209 источников).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы исследований, определены цель и
основные задачи исследования, приведена схема разрабатываемой в рамках данной
работы системы, показана практическая значимость данной работы.
Литературный обзор состоит из трех разделов, в которых изложены способы
получения водорода биологическим путем; показаны преимущества использования
анаэробной ферментации клетками бактерий рода Clostridium для получения целевого
продукта и приведен широкий спектр субстратов, которые могут использоваться для
этих целей; обсуждены методы иммобилизации клеток рода Clostridium; представлен
обзор по публикациям, посвященным анаэробной ферментации биомассы клеток КМ
с образованием водорода; рассмотрены условия культивирования и методы
иммобилизации
клеток
микроводорослей
рода
Chlorella,
биомасса
которых
рассматривается как субстрат для получения водорода.
Материалы и методы:
Объектами исследования данной работы были клетки анаэробных бактерий
Clostridium acetobutylicum B-1787, клетки зеленых микроводорослей Cosmarium sp.,
Chlorella vulgaris C-1, Dunaliella salina Teod. штамм rsemsu–D-1, Dunaliella tertiolecta
штамм rsemsu–D-3, Nannochloropsis sp. штамм rsemsu–N-1, клетки цианобактерий
Nostoc sp., Arthrospira platensis (NORDST.) GEITL. штамм 1/02-П и клетки красных
микроводорослей
Galdieria
partita
Sentz.
штамм
rsemsu-G-3.
Условия
культивирования для каждой из перечисленных культур микроорганизмов были
индивидуальными.
При
работе
с
ними
применялись
традиционные
микробиологические методы. Содержание углеводов в клетках КМ определялось
фенольным методом.
5
Состав среды, в которой культивировались клетки Clostridium acetobutylicum B1787, был следующим (в г/л): триптон 10,0; дрожжевой экстракт 5,0; глюкоза 50,0 (pH
6,8). Клетки Chlorella vulgaris C-1 выращивались в минеральной среде, в состав
которой входили: KNO3 – 5,0; КН2РО4 – 1,25; K2HPO4×3H2O – 3,35, MgSO4×7Н2О –
2,5; FeSО4×7Н2О – 0,009; трилон Б – 0,037; раствор микроэлементов А – 1 мл. Раствор
микроэлементов А содержал (г/л): Н3ВО3 – 2,86; MnCl2×4H2О – 1,81; ZnSO4×7Н2О –
0,22; NH4VO3 – 0,023; МоО3 – 0,015 (рН 6,8 – 7,0). Стерилизация сред осуществлялась
при температуре 108 оС и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин.
Иммобилизация клеток Clostridium acetobutylicum B-1787 и Chlorella vulgaris C-1
проводилась с использованием криогеля ПВС, полученного путём «замораживанияоттаивания» раствора полимера определенной концентрации. Накопленная биомасса
клеток Clostridium acetobutylicum отделялась от культуральной жидкости и
смешивалась с раствором ПВС в необходимом соотношении. Полученная смесь с
помощью стерильного шприца распределялась по ячейкам 96-луночных планшетов,
которые помещались далее в морозильную камеру при -20 оС и впоследствии
размораживались. Клетки Chlorella vulgaris принудительно вводились в поры
носителя, предварительно сформированного в виде блоков, после процедуры
«замораживания-оттаивания».
АБЭ-ферментация иммобилизованными клетками Clostridium acetobutylicum в
средах различного состава проводилась анаэробно в атмосфере аргона при 37 оС в
реакторах объемом 0,015 л, 0,5 л и 5 л. Оптическую плотность суспензии клеток
микроорганизмов определяли спектрофотометрически (λ = 540 нм). Значение pH
приготовленных
сред
и
отбираемых
в
процессе
экспериментов
проб
контролировалось потенциометрически. Концентрация глюкозы в среде определялась
глюкозидазным методом, а концентрация внутриклеточного аденозинтрифосфата
(АТФ) – люциферин-люциферазным методом с использованием биолюминесцентного
реагента ООО «Люмтек» (Россия). Газовая хроматография применялась для анализа
содержания водорода в газовой фазе.
Для представления полученных в работе данных проводились расчеты
кинетических параметров роста клеток микроорганизмов, показателей конверсии
субстрата в водород, скорости накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации
под действием свободных или иммобилизованных клеток Clostridium acetobutylicum, а
6
также скорости накопления водорода, отнесенные к единице массы разработанного
биокатализатора. При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали
среднее
значение и
значение стандартного отклонения.
Все
эксперименты
проводились не менее, чем в трех повторностях.
Результаты и обсуждение:
1.
Разработка иммобилизованного биокатализатора (ИБК) на основе клеток
бактерий Clostridium acetobutylicum и исследование его свойств.
На рис. 1а представлена кривая роста свободных клеток C. acetobutylicum в
среде, содержащей 50 г/л глюкозы. Наибольшая плотность клеток в среде (OD540 =
25,3; концентрация биомассы 15,9 г/л) достигалась к 30 ч культивирования клеток
данного
штамма,
чему
соответствовал
значительный
рост
концентрации
внутриклеточного АТФ в клетках бактерий (рис. 1б). Удельная скорость роста клеток
30
Концентрация АТФ, 10 моль/мл
бактерий  составила 0,56 ч-1.
а
OD540
-7
25
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
Время, ч
60
б
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
Время, ч
Рис. 1. Кинетика роста свободных клеток C. acetobutylicum (а) и кинетика изменения
концентрации внутриклеточного АТФ в процессе их роста (б) в среде с 50 г/л
глюкозы (OD540 – оптическая плотность при длине волны 540 нм).
После 32 ч концентрация
внутриклеточного АТФ
и
плотность
клеток
C. acetobutylicum быстро снижались. Это было обусловлено тем, что катализ АБЭферментации клетками бактерий данного вида осуществлялся в две стадии: на первой
фазе происходили активный рост свободных клеток бактерий и накопление в среде
уксусной и масляной кислот, образование которых сопровождалось выделением
водорода и быстрым снижением pH среды до значений 4,5 – 5,0. Это влекло за собой
переключение метаболических процессов на вторую фазу процесса ферментации –
7
рост клеток C. acetobutylicum заметно замедлялся, скорость накопления целевого
продукта падала, и начиналось интенсивное образование нейтральных продуктов
(ацетона, бутанола и этанола), которые в высоких концентрациях отрицательно
воздействовали
на
жизнедеятельность
свободных
клеток
C. acetobutylicum.
Полученные данные по pH-зависимости процесса АБЭ-ферментации хорошо
согласовывались с литературными данными. В целом, скорость накопления водорода
в
процессе
АБЭ-ферементации
клетками
C. acetobutylicum
достигала
58,2 ± 2,5 мл/л среды/сут.
Кинетику изменения концентрации клеток по концентрации внутриклеточного
АТФ (рис. 1б) можно описать следующей системой дифференциальных уравнений:
 dN
n
 dt  N  aNP
,

dP

 dt  N
в которых N – число живых клеток бактерий, выраженное через концентрацию
внутриклеточного АТФ (10-7 моль/мл); P – количество образующегося продукта в
жидкой фазе, выраженное в тех же единицах измерения, что и параметр N;  –
удельная скорость роста (ч-1); a – коэффициент, отражающий скорость гибели клеток;
 – стехиометрический коэффициент, отражающий прирост продукта на единицу
концентрации АТФ в клетке в единицу времени (ч-1); n – безразмерная величина,
показывающая, сколько молекул продукта является губительным для одной клетки
бактерий. При  = 0,56 ч-1, a = 0,08 (мл/моль)1/2 ч-1,  = 0,189 ч-1 и n = 0,5
рассчитанная зависимость числа живых клеток бактерий C. acetobutylicum хорошо
коррелирует с экспериментальной кривой (рис. 2). Индукционный период составил
17 ч и фаза, соответствующая ему, была отсечена.
При варьировании одного из параметров , a,  или n при фиксированных
значениях всех остальных в приведенных выше дифференциальных уравнениях
можно сделать следующие выводы:
– чем выше удельная скорость роста  клеток C. acetobutylicum, тем выше
концентрация внутриклеточного АТФ этих клеток и тем раньше достигается ее
максимальное значение (рис. 3а);
8
-7
Концентрация АТФ, 10 моль/мл
60
50
Рис.
40
Рассчет
30
Эксперимент
Корреляция
2.
между
экспериментальной и теоретически
рассчитанной кинетической кривой
20
изменения
10
внутриклеточного АТФ в клетках
0
C. acetobutylicum в среде с 50 г/л
0
10
20
30
40
концентрации
50
60 глюкозы.
Время, ч
– чем ниже параметры a и , тем выше концентрация живых клеток бактерий
(рис. 3б и 3в);
– чем выше значение параметра n, тем более чувствительны клетки бактерий к
присутствию продуктов их метаболизма в жидкой фазе (рис. 3г).
Полученная кинетическая модель роста свободных клеток C. acetobutylicum в
среде, содержащей 50 г/л глюкозы, наглядно подтверждает то, что образуемые этими
клетками в жидкой фазе продукты, являются сильными ингибиторами, и наличие их в
высокой концентрации является губительным для них.
Для иммобилизации клеток C. acetobutylicum их биомасса отбиралась
приблизительно через 23 – 26 ч после начала их роста (рис. 1). В качестве носителя
был выбран криогель ПВС в связи с тем, что именно этот носитель зарекомендовал
себя одним из лучших для иммобилизации клеток различных микроорганизмов,
успешно использованных в разнообразных биотехнологических процессах.
Первоначально было исследовано влияние состава ИБК на выход водорода в
процессе АБЭ-ферментации клетками C. acetobutylicum. Для этого были разработаны
образцы
биокатализатора,
в
которых
варьировалась
концентрация
ПВС,
используемого для иммобилизации клеток, (10%, 12,5% и 15%) и концентрация
иммобилизуемой бактериальной биомассы (7%, 10% и 13%). Эти образцы
экспонировались в мини-реакторах в среде с 50 г/л глюкозы в течение 48ч. Начальная
концентрация иммобилизованных клеток во всех средах была одинаковой и
составляла 10 г/л. В ходе процесса контролировалась скорость накопления водорода в
газовой фазе и концентрация внутриклеточного АТФ в культуральной жидкости
9
(жидкой
фазе)
с
целью
контроля
прироста
свободных
клеток
бактерий
C. acetobutylicum.
а
б
в
г
Рис. 3. Теоретически рассчитанные кривые изменения концентрации клеток по
концентрации
внутриклеточного
АТФ
в
процессе роста свободных клеток
C. acetobutylicum при варьировании параметров  (а), a (б),  (в), n (г).
В результате проведенной оптимизации состава ИБК с использованием
аддитивно-решетчатого
метода
описания
объекта
было
установлено,
что
максимальная скорость накопления водорода наряду с минимальной концентрацией
внутриклеточного АТФ свободных клеток в культуральной жидкости (1,4х10-7
моль/мл) достигалась при использовании ИБК следующего состава: 15% ПВС и 7%
биомассы клеток C. acetobutylicum. Скорость накопления водорода в процессе АБЭферментации глюкозы в данном случае составила 80,6 ± 3,4 мл/л среды/сут, что было
выше в 1,4 раза, чем в случае использования клеток C. acetobutylicum в
неиммобилизованном виде (58,2 ± 2,5 мл/л среды/сут). Это позволяет сделать вывод о
10
том, что иммобилизация клеток данного вида снижает ингибирующее воздействие на
них образующихся в жидкой фазе продуктов.
Исследование свойств разработанного ИБК было проведено в реакторах трех
типов: в мини-реакторе (0,015 л), в 0,5 л-реакторе с pH-контролем и в 5 л-реакторе с
pH-контролем и непрерывным перемешиванием. Кинетика накопления водорода в
процессе АБЭ-ферментации под действием ИБК на основе клеток C. acetobutylicum во
всех рассматриваемых системах
приведена на
рис.
4.
Во
всех системах
использовалась среда, содержащая 50 г/л глюкозы. Процесс велся в анаэробных
Накопление водорода, мл/л среды
условиях в атмосфере аргона при 37 оС в течение 96 ч.
2500
Рис. 4. Кинетика накопления
водорода в процессе АБЭ-
2000
ферментации под действием
1500
ИБК
на
основе
клеток
1000
C. acetobutylicum в среде с
500
глюкозой (50 г/л) в миниреакторе (), 0,5 л-реакторе
0
0
20
40
60
80
100
Время, ч
(□) и 5 л-реакторе (▲).
Было установлено, что при функционировании ИБК на основе клеток
C. acetobutylicum в мини-реакторе максимальная скорость накопления водорода в
процессе АБЭ-ферментации глюкозы (100,8 ± 4,2 мл/л среды/сут) достигалась при
отводе газовой фазы из мини-реактора и при концентрации иммобилизованных
клеток 15 г/л в среде и была в 1,7 раза выше величины аналогичного параметра,
полученного для свободных клеток бактерий. Было отмечено наличие индукционного
периода (24 ч, рис. 4) в процессе накопления водорода, что, вероятно, было
обусловлено адаптацией клеток к новым условиям и активацией метаболических
процессов после процедуры «замораживания-оттаивания». Степень конверсии
глюкозы составила 50%.
При
переходе
иммобилизованных
к
0,5
клеток
л-реактору
оказалось,
C. acetobutylicum
в
что
установленная
мини-реакторе
для
оптимальная
концентрация не удовлетворительна для успешного проведения АБЭ-ферментации.
Это было связано с тем, что при переходе к реакторам большего объема,
11
значительную
роль
начинали
играть
массообменные
процессы.
Наилучшие
результаты в данном случае были получены при концентрации иммобилизованных
клеток в среде 5,5 г/л.
Несмотря на то, что индукционный период в этом случае длился 48 ч, скорость
накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы под действием ИБК на
основе клеток C. acetobutylicum в 0,5 л-реакторе с постоянным отводом газовой фазы
превысила аналогичную величину, полученную в мини-реакторе с тем же ИБК, в 3
раза (302,4 ± 11,5 мл/л среды/сут) (рис. 4). Это было связано с тем, что в случае 0,5 лреактора осуществлялось pH-статирование среды 1М раствором KOH в интервале 6,0
– 6,5, что не позволяло клеткам бактерий в полной мере переключить метаболические
процессы с пути преимущественного накопления водорода на стадию образования
нейтральных продуктов.
Было показано, что разработанный ИБК на основе клеток C. acetobutylicum
может быть многократно использован в средах, содержащих 50 г/л глюкозы. При этом
индукционный период отсутствовал и скорость накопления водорода, полученная для
четвертого цикла функционирования используемого ИБК, превысила аналогичную
величину, достигнутую в первом цикле АБЭ-ферментации иммобилизованными
клетками C. acetobutylicum, в 1,8 раза и составила 557,8 ± 13,4 мл/л среды/сут.
Степень конверсии глюкозы составила 91,8%.
Концентрация иммобилизованных клеток C. acetobutylicum в 5 л-реакторе с
перемешиванием среды (70 об/мин) и постоянным отводом газовой фазы, как и в 0,5
л-реакторе,
составила
5,5 г/л
(рис.
5а).
В
используемом
реакторе
также
осуществлялось pH-статирование среды 1М раствором KOH в интервале 6,0 – 6,5.
Разработанный
ИБК
на
основе
клеток
C. acetobutylicum
показал
высокую
эффективность функционирования в течение 4 циклов процесса АБЭ-ферментации
(рис. 4, рис. 5б). Так, скорость накопления водорода к концу 3-его рабочего цикла
составила 983,7 ± 24,1 мл/л среды/сут (степень конверсии глюкозы составила 98,2%),
что было в 16,9 раз выше, чем для свободных клеток, и в 9,8 раз выше, чем для 0,5 лреактора. Таким образом, постоянное перемешивание позволило снизить влияние
массообменных процессов и в сочетании с pH-статированием среды значительно
повысить
эффективность
процесса
получения
иммобилизованных клеток C. acetobutylicum.
12
водорода
при
использовании
Накопление водорода, мл/л среды
а
2000
б
1500
1000
500
0
0
50
100
150
200
Время, ч
Рис. 5. Внешний вид 5 л-реактора с ИБК на основе клеток C. acetobutylicum (а) и
кинетика накопления водорода в нем в процессе АБЭ-ферментации глюкозы (б).
Пунктиром отмечено время замены среды в реакторе с ИБК.
В табл. 1 представлены основные кинетические параметры конверсии глюкозы в
водород свободными и иммобилизованными клетками C. acetobutylicum в реакторах
разного типа. Как видно, выход водорода (YHydr) и коэффициент конверсии глюкозы в
водород (YP/S) возрастали при переходе от мини-реакторов к 5 л-реактору с ИБК на
основе клеток C. acetobutylicum не менее, чем в 2,5 раза. Скорость накопления
водорода (Qp) достигала в 5 л-реакторе максимальных значений – 42,3 мл/л/ч. Это
превысило значение аналогичного параметра, полученного в мини-реакторе со
свободными клетками, в 17,6 раз. Таким образом, иммобилизация клеток
C. acetobutylicum в криогель ПВС и многократное использование этих клеток в 5 лреакторе позволили значительно улучшить производительность клеток по водороду.
В табл. 1 также представлены данные по скоростям накопления водорода,
отнесенным к единице массы разработанного ИБК, (Пкат), при этом максимальное
значение было достигнуто в 5 л-реакторе (572 мл/кг биокатализатора/ч), что
превысило в 25 раз аналогичную величину для мини-реакторов, а в сравнении с
клетками
Clostridium
butyricum,
иммобилизованными
в
агаровый
гель
(450 мл/кг биокатализатора/ч; Karube I., 1982), полученный ИБК характеризовался
скоростью накопления водорода в 1,3 раза выше. Полученные результаты могут
иметь огромное значение для процессов получения альтернативных видов топлив
биологическим путем.
13
Таблица 1. Кинетические параметры конверсии глюкозы в водород свободными и
иммобилизованными клетками C. acetobutylicum в реакторах разного типа: 1 – миниреактор со свободными
иммобилизованными
C.
клетками
иммобилизованными
функционирования),
клетками
клетками
4
–
5
C.
acetobutylicum,
acetobutylicum,
–
2
–
3
0,5
C. acetobutylicum
л-реактор
с
мини-реактор с
л-реактор
(четвертый
иммобилизованными
с
цикл
клетками
C. acetobutylicum (третий цикл функционирования).
Тип реактора
1
2
3
4
YHydr, % от теорет.возм.уровня 3,70
6,50
19,50
16,10
YP/S
0,07
0,13
0,39
0,32
Qp, мл/л/ч
2,40
4,20
23,24
42,30
Параметр
Пкат, мл/кг биокатализатора/ч
2.
–
23,11 313,80 571,92
Конверсия предобработанной биомассы КМ в водород под действием
иммобилизованных клеток C. acetobutylicum.
В качестве субстрата для АБЭ-ферментации под действием ИБК на основе
клеток C. acetobutylicum была взята биомасса клеток зеленых микроводорослей
Cosmarium
sp.,
Chlorella
vulgaris,
Dunaliella
salina,
Dunaliella
tertiolecta,
Nannochloropsis sp., клеток цианобактерий Nostoc sp., Arthrospira platensis и клеток
красных
микроводорослей
Galdieria
partita.
Для
всех
отобранных
культур
микроорганизмов был проведен анализ содержания белков, углеводов и липидов в
клетках, который показал, что большая часть использованных КМ отличается весьма
высоким содержанием углеводов (выше 40%).
Все образцы биомассы клеток КМ подвергались предобработке путем термолиза
при 108оС и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин и помещались в виде
водной суспензии в мини-реактор в концентрации 20 – 30 г сух.в-в/л. Также туда
вносился ИБК на основе клеток C. acetobutylicum так, что концентрация
иммобилизованных клеток в среде составляла 15 г/л. Процесс велся в анаэробных
условиях в атмосфере аргона при 37 оС в течение 96 ч. Полученные данные по
накоплению водорода при использовании предобработанной биомассы КМ в качестве
единственного источника всех питательных компонентов представлены в табл. 2 и на
14
рис. 6. Как видно, во всех случаях, кроме образца №11 (Chlorella vulgaris),
отсутствовал индукционный период (рис. 6).
Таблица 2. Скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации под
действием иммобилизованных клеткок C. acetobutylicum в среде, содержащей
предобработанную биомассу клеток различных КМ.
Концентрация
№
Название штамма
углеводов в
среде, г/л
Скорость накопления
YHydr,
водорода, мл/л среды/сут
%
Arthrospira platensis
8,2
69,4±3,3
27,2
2
Arthrospira platensis
7,8
20,2±1,4
8,3
3
Nannochloropsis sp.
14,7
38,1±1,9
8,3
4
Nannochloropsis sp.
15,1
~0
-
5
Nannochloropsis sp.
15,4
80,6±3,4
16,8
6
Nannochloropsis sp.
23,2
40,3±2,1
5,6
7
Dunaliella tertiolecta
14,4
4,5±0,2
1,0
8
Dunaliella tertiolecta
12,7
15,7±1,3
4,0
9
Dunaliella salina
16,1
6,7±0,3
1,3
10
Galdieria partita
14,4
~0
-
11
Chlorella vulgaris
14,5
33,6±1,8
7,4
12
Cosmarium sp.
12,7
2,2±0,1
0,6
13
Nostoc sp.
10,8
6,7±0,3
2,0
Накопление водорода, мл/л среды
1
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Рис.
Кинетика
6.
водорода
в
процессе
накопления
конверсии
предобработанной биомассы клеток
КМ под действием ИБК на основе
клеток
C. acetobutylicum
(1-ый
рабочий цикл): □ – №5, ▲ – №1, ◊ –
№2, ∆ – №6, ♦ – №3, ● – №8, × –
0
20
40
60
80
100
Время, ч
№11. Контроль (○) – 50 г/л глюкозы.
В табл. 2 также приведены данные по концентрациям углеводов в средах,
содержащих разрушенную биомассу клеток микроводорослей и цианобактерий, и по
выходам водорода (YHydr), полученным из расчета того, что концентрация углеводов
15
считалась равной концентрации глюкозы в среде. Было принято, что конверсия
углеводов так же, как и глюкозы в мини-реакторах, осуществлялась на 50%.
Было обнаружено, что при использовании образцов биомассы КМ №6, №7, №8,
№9, №12 и №13 выходы водорода были ниже выхода, полученного в случае
использования среды с глюкозой (50 г/л) – 6,5% (табл. 2). Во всех остальных случаях
полученные значения превышали эту величину. Вероятно, это было связано с
различиями в строении клеток микроводорослей и цианобактерий в каждом
отдельном случае, а также с тем, в каких условиях культивировались клетки КМ.
Наибольшие выходы водорода были получены в мини-реакторах со средой,
содержащей предобработанную биомассу клеток Nannochloropsis sp. и A. platensis
(табл. 2, образцы №5 и №1). Однако с использованием этих клеток связан ряд
существенных
проблем.
В
случае
клеток
Nannochloropsis
sp.
технически
затрудненной является стадия отделения биомассы клеток от среды, используемой
для ее наращивания, в связи с крайне малыми размерами этих клеток. Клетки
цианобактерии A. platensis растут в морской воде или в средах с повышенным
содержанием солей, вследствие чего требуются весьма значительные затраты на
дорогостоящее оборудование, устойчивое к коррозии, которую могут вызывать
солесодержащие среды.
В связи с этим, наиболее выгодным субстратом для АБЭ-ферментации с точки
зрения выходов водорода и условий его накопления, а также отделения биомассы,
используемой в качестве субстрата для этого процесса, являются клетки Chlorella
vulgaris (табл. 2, образец №11). Размеры этих клеток составляют 5 – 10 мкм. Составы
сред, требуемых для их культивирования, содержат минимальное количество солей.
При
многократном
использовании
ИБК,
полученного
на
основе
клеток
C. acetobuylicum, для трансформации биомассы клеток C. vulgaris в водород
полностью отсутствовал индукционный период, характерный для 1-ого цикла
процесса АБЭ-ферментации той же биомассы клеток (рис. 6). К концу 4-ого цикла
скорость накопления водорода составила 44,0 ± 2,1 мл/л среды/сут, что было выше на
24% скорости, полученной в течение 1-ого цикла функционирования ИБК (рис. 7).
Эта же скорость осталась и на 5-ом цикле использования иммобилизованных клеток
C. acetobuylicum в аналогичной среде.
16
Накопление водорода, мл/л среды
Рис. 7. Кинетика накопления
200
водорода
150
при
многократном
использовании ИБК на основе
клеток бактерий C. acetobuylicum
100
в
50
среде
биомассой
(пунктиром
0
0
100
200
300
400
500
Время, ч
с
предобработанной
клеток C. vulgaris
отмечено
время
замены среды в реакторе с ИБК).
Выход водорода в 4-ом цикле работы ИБК составил 9,8% от теоретически
возможного уровня, что превысило выход, полученный в процессе 1-ого цикла
функционирования ИБК в виде иммобилизованных клеток C. acetobuylicum, в 1,3
раза и в случае мини-реакторов с глюкозой – в 1,5 раза. Это позволяет сделать вывод
о том, что использование предобработанной биомассы клеток C. vulgaris,
представляющую собой экологически чистое, дешевое и доступное сырье, в качестве
субстрата
для
получения
водорода
в
процессе
АБЭ-ферментации
иммобилизованными клетками C. acetobuylicum является весьма перспективным.
3.
Влияние условий накопления биомассы клеток C. vulgaris на характеристики
этого процесса и на параметры проведения АБЭ-ферментации под действием
иммобилизованных клеток C. acetobuylicum.
Для эффективного накопления биомассы клеток C. vulgaris использовалась
минеральная среда (Tamiya H., 1953) при круглосуточном освещении (1000 Люкс).
Источником углерода являлся углекислый газ, содержавшийся в воздухе. Удельная
скорость роста клеток () составила 0,21 сут-1, концентрация накопленной биомассы к
120 суткам культивирования достигала 35 – 40 г/л.
Было исследовано влияние введения в минеральную среду дополнительных
органических источников углерода, в частности глюкозы и глицерина, на накопление
биомассы клеток C. vulgaris. Это было связано с тем, что глюкоза является основным
компонентом отходов переработки целлюлозосодержащего сырья или отходов
сельскохозяйственной
промышленности,
а
глицерин
содержится
в
больших
количествах в отходах производства биодизеля. Для сравнения в данной работе в
качестве источника углерода также был взят ацетат натрия, являющийся весьма
дешевым субстратом. Использование таких субстратов для накопления биомассы КМ
17
в комбинации с углекислым газом в качестве основных источников углерода могло
бы сделать этот процесс еще более привлекательным с экологической точки зрения.
На рис. 8 приведена кинетика накопления биомассы клеток C. vulgaris в
минеральной среде с добавлением глюкозы, глицерина или ацетата натрия в
концентрации 5 г/л. Вне зависимости от вносимого органического субстрата удельная
скорость роста () возрастала не менее, чем в 1,5 раза (табл. 3) по сравнению с
OD540
режимом культивирования, проводившимся в отсутствии добавок.
12
Рис.
10
C. vulgaris
Кинетика
8.
при
роста
клеток
круглосуточном
8
освещении в минеральной среде без
6
добавления (○) и с добавлением (5
4
г/л): глюкозы (), глицерина (□) или
2
ацетата
0
натрия
оптическая
0
5
10
Время, сутки
(▲)
плотность
(OD540
при
–
длине
волны 540 нм).
Таблица 3. Значения удельной скорости роста (µ) и скорости накопления биомассы
(V) клеток C. vulgaris при введении в минеральную среду определенного
дополнительного органического источника углерода в концентрации 5 г/л.
Субстрат
СО2
Глюкоза
Глицерин
Ацетат натрия
µ, сут-1
0,21±0,04
0,42±0,06
0,39±0,06
0,32±0,04
V, г/л/сут 0,05±0,001
1,53±0,03
1,22±0,02
0,32±0,01
Наилучшие скорости накопления биомассы клеток C. vulgaris были получены в
случае добавления в минеральную среду в качестве дополнительного источника
углерода глюкозы (табл. 3). Уровень накопления биомассы в этом случае достигал
13 – 14 г/л за 10 сут, что было выше уровня накопления биомассы в отсутствии
глюкозы за этот же период времени в 30 раз.
Интересным оказалось то, что в случае добавления в минеральную среду
органического субстрата возрастало существенно содержание в клетках C. vulgaris
углеводов – в 1,3 раза – в сравнении с режимом накопления клеток в отсутствие
добавок. В связи с этим была исследована эффективность АБЭ-ферментации
предобработанной
биомассы
клеток
рассматриваемого
вида,
выращенных
в
минеральной среде с глюкозой, и ее сравнение с данными, полученными в случае
18
использования биомассы этих же клеток, культивирование которых проводилось в
отсутствие глюкозы.
Биомасса клеток C. vulgaris, накопленная в минеральной среде с глюкозой,
подвергалась термолизу при 108 оС и избыточном давлении 0,5 атм в течение 30 мин.
Затем, в концентрации 26 г сух.в-в/л она вносилась в мини-реакторы вместе с
иммобилизованными в криогель ПВС клетками бактерий C. acetobutylicum в
концентрации 15 г/л. Процесс АБЭ-ферментации осуществлялся в течение 96 ч
анаэробно при 37 оС. Накопление водорода в данном случае происходило без
индукционного периода, и скорость накопления целевого продукта достигла
58,2±2,3 мл/л среды/сут, что было выше в 1,3 раза, чем в случае 4-ого цикла
функционирования того же ИБК в среде с биомассой клеток C. vulgaris,
культивирование которой проводилось в отсутствие глюкозы. Выход водорода от
теоретически возможного уровня не изменился и составил 9,8%.
Вероятно, полученные данные были связаны с одной стороны, с тем, что в
случае внесения в мини-реактор биомассы клеток C. vulgaris, накопленной в
минеральной среде с глюкозой, концентрация углеводов составляла 18,8 г/л, что выше
в 1,3 раза той концентрации, которая создавалась в случае использования биомассы
клеток C. vulgaris, полученной в отсутствие органического субстрата. С другой
стороны, режим культивирования в первом случае, возможно, стимулировал
образование таких углеводов в клетках C. vulgaris, которые клетки бактерий
C. acetobutylicum способны были деградировать с большей скоростью, чем те
углеводы, которые были доступны им в случае использования в качестве субстрата
биомассы клеток C. vulgaris, выращенной во втором случае.
Длительное культивирование клеток C. vulgaris в минеральной среде с глюкозой
было проведено в полунепрерывном режиме при высокой концентрации исходно
вносимых клеток. При этом процедуру внесения свежей среды возможно было
осуществлять многократно, и она сопровождалась увеличением скорости накопления
биомассы клеток C. vulgaris и достижением стабильно высоких ее значений.
Концентрация биомассы клеток микроводорослей достигала 31,5 ± 0,5 г/л.
Накопленная в полунепрерывном режиме культивирования биомасса клеток
C. vulgaris в дальнейшем использовалась для осуществления непрерывного режима
культивирования в экспериментальном лабораторном фотобиореакторе (ООО
19
«АСПЕКТ», Россия) (рис. 9а). Суспензия клеток микроводорослей помещалась в
реактор объемом 20 л, из которого посредством центробежного насоса она
прокачивалась со скоростью 20 л/мин через систему стеклянных трубок с внутренним
диаметром 35 мм и внешним диаметром 38 мм. Через среду круглосуточно
барботировался углекислый газ со скоростью 1 – 2 мл/мин. Также в данной системе
осуществлялось постоянное освещение мощностью 5000 Люкс источниками света с
длиной волны в интервалах 450 – 480 нм и 640 – 700 нм одновременно.
Фотобиореактор был оснащен полностью автоматизированной системой контроля pH
среды, проводимости среды, температуры культивирования и концентрации
растворенного кислорода в среде. Регулярно производилась замена 4 л суспензии
клеток C. vulgaris на 4 л свежей среды. Полученная в непрерывном режиме
культивирования в минеральной среде с глюкозой зависимость концентрации и числа
клеток C. vulgaris, накапливающихся в среде, от времени представлена на рис. 9б.
Видно, что в данном случае оказалось возможным весьма эффективное наращивание
и поддержание культуры клеток C. vulgaris в концентрации 8 – 10 г/л в течение не
менее 50 суток культивирования в автоматизированной системе используемого 20 л-
б
15
12
13
10
8
11
6
9
4
7
2
5
0
22
Рис.
9.
Общий
вид
32
42
Время, сутки
фотобиореактора,
используемого
Число клеток, 107 /мл
а
Концентрация клеток, г/л
фотобиореактора.
52
для
непрерывного
культивирования клеток C. vulgaris, (а) и кинетика накопления этих клеток в нем (б):
 - концентрация клеток C. vulgaris в среде, ○ - число клеток C. vulgaris в среде.
Пунктиром отмечено время замены 20% объема суспензии клеток микроводорослей
на свежую среду.
Для
иммобилизации
клетки
микроводорослей
С. vulgaris
принудительно
вводились в поры криогеля ПВС, сформированного в виде полимерных блоков
20
размером 220  220 мм, высотой 5 мм и массой 72,0 ± 0,2 г (рис. 10а) путем
«замораживания-оттаивания» 11%-ного раствора ПВС, которые далее помещались в
фильтрационную установку ФД-293-3 (НПК «Биотест», Россия) (рис. 10б). Через
такую систему посредством перистальтического насоса прокачивалась со скоростью
70 мл/ч суспензия клеток С. vulgaris (1 л) с концентрацией 7х107 кл/мл (10 г/л, рис. 9).
а
б
в
Рис. 10. Фотографии, иллюстрирующие процесс получения ИБК на основе клеток
C. vulgaris: а – пласты криогеля ПВС; б – фильтрационная установка для
иммобилизации клеток C. vulgaris, в – пласт криогеля ПВС с иммобилизованными
клетками C. vulgaris.
При внесении разработанного ИБК на основе клеток C. vulgaris в концентрации
54 г/л в минеральную среду с глюкозой (5 г/л) он обеспечивал скорость накопления
этих клеток в ней, равную 20,2 ± 0,6 г сух.в-в/м2/сут. Появившийся в процессе
выполнения данной работы зарубежный аналог, представлявший собой клетки
Chlorella sp.,
иммобилизованные
методом
абсорбции
в
объеме
подложки,
изготовленной на основе пенополистирола, обеспечивал лишь 2,57 г сух.в-в/м2/сут
биомассы клеток.
На основании вышесказанного можно заключить, что внесение разработанного
ИБК на основе клеток C. vulgaris в минеральную среду с добавлением глюкозы
позволяет
накапливать
биомассу
клеток
микроводорослей
с
высокой
эффективностью, что, несомненно, является положительным фактором в процессе
получения водорода путем АБЭ-ферментации предобработанной биомассы КМ
иммобилизованными клетками C. acetobutylicum.
4.
Сопряжение
процессов
с
участием
двух
биокатализаторов
на
основе
иммобилизованных клеток микроводорослей C. vulgaris и клеток бактерий
C. acetobutylicum
Клетки C. vulgaris успешно росли в минеральной среде, содержавшей 25%
термообработанной культуральной жидкости, полученной после АБЭ-ферментации
21
иммобилизованными клетками C. acetobutylicum, с удельной скоростью 0,56 сут-1, что
было выше в 1,3 раза, чем в случае выращивания клеток микроводорослей этого же
вида в минеральной среде с добавлением 5 г/л глюкозы. Концентрация биомассы
клеток микроводорослей к 24 суткам культивирования достигала 26 ± 0,4 г/л.
Принципиальная схема получения водорода биофотолизом воды, разработанная
на основе полученных в данной работе результатов, приведена на рис. 11.
Концентрирование
биомассы клеток C. vulgaris
CO2
Термическая предобработка
биомассы клеток C. vulgaris
O2
h
H2
Накопление биомассы КМ
Биомасса клеток зеленых
микроводорослей C. vulgaris
АБЭ-ферментация
Биомасса клеток анаэробных
бактерий C. acetobutylicum
Термолиз культуральной
жидкости
Отделение культуральной жидкости
от биомассы клеток C. acetobutylicum
Рис. 11. Принципиальная схема получения водорода биофотолизом воды с
использованием биомассы клеток микроводорослей
C.
vulgaris
и
бактерий
C. acetobutylicum.
Полный рабочий цикл предлагаемой схемы (рис. 11) может быть осуществлен
непрерывно не менее 5 раз без замены используемых ИБК на основе клеток
микроорганизмов. Каждый такой цикл сопровождается поглощением углекислого
газа, являющегося одним из основных загрязнителей воздуха, а также раздельным
образованием кислорода и водорода, которые имеют широкое практическое
применение на сегодняшний день. В частности, водород может напрямую
использоваться в качестве альтернативного источника энергии.
ВЫВОДЫ
1.
Обнаружен и детально исследован феномен экстремальной зависимости от
времени количества физиологически активных клеток Clostridium acetobutylicum.
Предложена оригинальная кинетическая модель роста этих клеток на базе
системы
дифференциальных
уравнений,
22
учитывающая
их
инактивацию
избыточным
количеством
органических
растворителей,
образующихся
в
процессе АБЭ-ферментации. Получено хорошее соответствие кинетической
модели и экспериментальных данных.
2.
Разработан и оптимизирован по составу новый биокатализатор на основе клеток
Clostridium acetobutylicum, иммобилизованных в криогель ПВС. Показано, что
скорость накопления водорода в процессе АБЭ-ферментации глюкозы под
действием такого биокатализатора в мини-реакторах в 1,7 раза превышает
скорость накопления водорода свободных клеток.
3.
Показана возможность масштабирования и многократного использования
иммобилизованного
биокатализатора
на
основе
Clostridium
клеток
acetobutylicum, при этом скорость накопления водорода в процессе АБЭферментации глюкозы может быть увеличена в 17 раз.
4.
Впервые
установлена
и
количественно
охарактеризована
возможность
использования биомассы различных КМ в качестве субстрата для получения
водорода в ходе АБЭ-ферментации, катализируемой иммобилизованными
клетками Clostridium acetobutylicum. Показано, что для получения максимальных
выходов целевого продукта целесообразно использовать биомассу клеток
зеленых
микроводорослей
Chlorella
vulgaris,
накопление
которой
осуществлялось в минеральной среде с добавлением глюкозы.
5.
В результате оптимизации условий культивирования клеток микроводорослей
Chlorella vulgaris установлено, что наиболее эффективное накопление биомассы
достигалось в минеральной среде с добавлением глюкозы при круглосуточном
люминесцентном освещении и высокой концентрации исходно вносимых клеток
в полунепрерывном и непрерывном режимах культивирования.
6.
Разработан новый биокатализатор на основе клеток микроводорослей Chlorella
vulgaris,
которые
принудительно
вводились
в
поры
криогеля
ПВС,
сформированного в виде полимерных блоков. Он позволяет в минеральной среде
с добавлением глюкозы накапливать в 8 раз больше биомассы клеток
микроводорослей, чем при использовании известного аналога.
7.
Впервые показана возможность создания замкнутой биокаталитической системы
получения водорода биофотолизом воды, полный рабочий цикл которой может
быть осуществлен многократно.
23
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Никольская А.Б., Сенько О.В., Спричева О.В.,
Варфоломеев С.Д. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток
микроорганизмов в процессах получения биоэтанола и биобутанола // Катализ в
пром-ти, 2010. № 5. С.70 – 76. (ВАК)
2. Efremenko E.N., Nikolskaya A.B., Lyagin I.V., Senko O.V., Makhlis T.A., Stepanov
N.A., Maslova O.V., Mamedova F., Varfolomeev S.D. Production of biofuels from
pretreated microalgae biomass by anaerobic fermentation with immobilized
Clostridium acetobutylicum cells // Bioresource Technology, 2012. V. 114. P. 342 –
348. (ВАК)
3. Сенько О.В., Гладченко М.А., Лягин И.В., Никольская А.Б., Маслова О.В.,
Чернова Н.И., Киселева С.В., Коробкова Т.П., Ефременко Е.Н., Варфоломеев
С.Д. Трансформация биомассы фототрофных микроорганизмов в метан //
Альтернативная энергетика и экология, 2012. Т. 108(3). С. 89 – 94. (ВАК)
4. Никольская А.Б., Холстов А.В., Лягин И.В., Мамедова Ф., Ефременко Е.Н.,
Варфоломеев С.Д.. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris для решения
задач альтернативной энергетики и экологии // Альтернативная энергетика и
экология, 2012. Т. 108(4). С. 95 – 100. (ВАК)
5. Ефременко Е.Н., Никольская А.Б., Мамедова Ф.Т., Сенько О.В., Трусов Л.И..
Полунепрерывный и непрерывный процесс накопления биомассы клеток
микроводорослей Chlorella vulgaris в минеральной среде // Альтернативная
энергетика и экология, 2013. Т. 2. С. 44 – 45. (ВАК)
6. Никольская А.Б., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Биокаталитические
системы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в процессе
получения водорода // VIII ежегод. междунар. молод. конф-ция ИБХФ РАНВУЗы, 2008, 11 – 13 ноября, C. 159 – 160.
7. Nikolskaya A.B., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D. Biocatalytic systems based on
immobilized cells of microorganisms for hydrogen production // International
conference «BIOCATALYSIS-2009: FUNDAMENTALS & APPLICATIONS»,
Arkhangelsk, 2009, 19 – 24 June, P. 106.
8. Никольская А.Б., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Биокаталитические
системы получения водорода на основе иммобилизованных клеток
микроорганизмов // 13-я междунар. Пущинская школа-конференция молодых
ученых, Пущино, 2009, 28 сентября – 2 октября, С. 174 – 175.
9. Никольская А.Б., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Биокаталитические
системы получения водорода на основе иммобилизованных клеток бактерий
Clostridium acetobutylicum // III междунар. научно-практ. конф-ция «Актуальные
проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 2009, 1 – 4
октября, С. 22 – 23.
10. Никольская А.Б., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Получение биотоплив с
использованием биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток
микроорганизмов // IX ежегод. междунар. молод. конф-ция ИБХФ РАН-ВУЗы,
2009, 9 – 11 ноября, C. 184.
11. Никольская А.Б., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Производство водорода
иммобилизованными клетками бактерий из различных субстратов // 14-я
24
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
междунар. Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 2010, 19 –
23 апреля, С. 277.
Efremenko E., Stepanov N., Nikolskaya A., Senko O., Gudkov D., Spiricheva O.,
Varfolomeev S. Immobilized cells of various microorganisms in production of liquid
biofuels // In book: 18th European Biomass Conference and Exibition, 3 – 7 May 2010
Lyon, France (Eds. J. Spitzer, J.F. Dallemand, D. Baxter, H. Ossenbrink, A. Grassi,
P.Helm), ETA-Florence Renewable Energies, P. 1753 – 1758.
Nikolskaya A.B., Efremenko E.N., Varfolomeyev S.D. Fermentation processes of free
and immobilized cells of Clostridium acetobutylicum on different media //
International conference «Catalysis for renewable sources: fuel, energy, chemicals»,
Tsars Village, St. Petersburg suburb, Russia, 2010, 28 June – 2 July, P. 128.
Никольская А.Б., Сенько О.В., Степанов Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев
С.Д. Водород-продуцирующий иммобилизованный биокатализатор: состав и
свойства // X ежегод. междунар. молод. конф-нция ИБХФ РАН-ВУЗы, 2010, 8 –
10 ноября, C. 175.
Никольская А.Б., Сенько О.В., Степанов Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев
С.Д. Иммобилизованные клетки бактерий как улучшенные продуценты
биобутанола // III междунар. научно-техн. конф-ция «Альтернативные
источники сырья и топлива», Минск, 2011, 24 – 26 мая, С. 47.
Efremenko E., Stepanov N., Senko O., Nikolskaya A., Maslova O., Zorov I., Sinitsyn
A. Butanol production from cellulose-containing sources by simultaneous
saccharification and fermentation using immobilized cell biocatalysts // In book: 19th
European Biomass Conference and Exhibition, 6 – 10 June 2011, Berlin, Germany
(Eds. Faulstich, M., Ossenbrink, H., Dallemand, J.F., Baxter, D., Grassi, A., Helm, P.),
ETA-Florence Renewable Energies, P. 1735 – 1738.
Никольская А.Б., Сенько О.В., Лягин И.В., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д.
Возможность конверсии предобработанной биомассы микроводорослей
иммобилизованным биокатализатором на основе клеток рода Clostridium в
водород // XI ежегод. междунар. молод. конф-ция ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва,
2011, 9 – 11 ноября, С. 172 – 174.
Никольская А.Б., Сенько О.В., Ефременко Е.Н. Трансформация биомассы
фототрофных микроорганизмов в биотоплива // Междунар. научно-практ. конфция «Рациональное использование ресурсного потенциала регионов России и
сопредельных государств», Брянск, 2011, 18 – 19 ноября, С. 118 – 125.
Nikolskaya A., Stepanov N., Senko O., Lyagin I., Efremenko E., Varfolomeyev S.
Hydrogen-producing immobilized biocatalyst: composition and properties // Modern
Problems in Biochemical Physics. New Horizons. Nova Science Publ., N.Y., 2012.
P. 163 – 170.
Автор
выражает
искреннюю
благодарность
за
помощь
в
проведении
экспериментов н.с. Сенько О.В., к.х.н. Лягину И.В., к.т.н. Степанову Н.А., м.н.с.
Холстову А.В. и м.н.с. Сироткиной М.С., за поддержку и терпение автор благодарит
свою семью.
25
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
25 182 Кб
Теги
141163
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа