close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

155626

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
СЕЛЯСКИН КИРИЛЛ ЕВГЕНЬЕВИЧ
ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ АПОПТОЗА
ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ АЛИМЕНТАРНЫХ
И ТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
03.01.04. - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научноисследовательский институт питания" Российской академии медицинских наук
Научный руководитель:
Академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор
Тутельян Виктор Александрович
Официальные оппоненты:
Дурнев Андрей Дмитриевич, доктор медицинских
наук, профессор, член-корреспондент РАМН,
Федеральное
государственное
бюджетное
учреждение «Научно-исследовательский институт
фармакологии им. В.В. Закусова» Российской
академии
медицинских
наук,
лаборатория
лекарственной
токсикологии,
руководитель
лаборатории.
Муронец
Владимир
Израилевич,
доктор
биологических наук, профессор, заведующий
отделом биохимии животной клетки, Научноисследовательский институт физико-химической
биологии имени А.Н. Белозерского Московского
государственного
университета
имени
М.В.Ломоносова.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научноисследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской
академии медицинских наук.
Защита состоится «24» марта 2014 г. в 14.00 на заседании
Диссертационного Совета Д 001.002.01 в ФГБУ «НИИ питания» РАМН
по адресу: 119240, Москва, Устьинский проезд 2/14
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН
Автореферат разослан «___» ___________ 2013 г.
Учёный секретарь
Диссертационного Совета,
доктор биологических наук, профессор
Коденцова В.М.
2
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность темы
Программируемая гибель клеток путем апоптоза является фундаментальным
биологическим процессом, используемым организмом для ликвидации невостребованных,
закончивших свой жизненный цикл и потенциально опасных клеток (Kerr et al., 1972;
Schwartzman, Cidlowski, 1993; Rinkenberger, Korsmeyer, 1997; Meier et al., 2000; Bortner,
Cidlovsky, 2002; Bohm, Schild, 2011)
Комплексное изучение апоптоза под влиянием разнообразных средовых или
онтогенетических факторов широко представлено в научных публикациях (Wyllie, 1980;
Wyllie et al., 1980; Schwartzman, Cidlowski, 1993; Norbury, Zhivotovsky, 2009), однако влияние
алиментарных факторов на предрасположенность клетки к апоптозу остается до настоящего
времени наименее изученным аспектом проблемы. В значительной мере это связано с
отсутствием сравнительной характеристики применимости различных методов определения
активности апоптоза: биохимических методов определения степени фрагментации ДНК и
активности каспаз, гистологических методов регистрации морфологических изменений в
клетке и методов проточной цитофлюориметрии для выявления изменений активности
апоптоза.
Индукция апоптоза, то есть повышение его активности, осуществляется многими
стрессовыми факторами, включающими токсические, ишемию, вирусную инфекцию и ряд
других (Самуилов и соавт., 2000). Поскольку активность апоптоза является системным
биомаркером, отражающим уровень адаптации организма к окружающей среде и
обладающим высокой неспецифической чувствительностью к воздействиям различной
природы (Lipton, 1999; Yuan, Yankner, 2000; Hickey, Chesselet, 2003; Lawen, 2003; Lev et al.,
2003; Raina et al., 2003; Petros et al., 2010). Есть все основания полагать, что определение
активности
апоптоза
может
быть
эффективно
использовано
при
исследованиях,
направленных на изучение влияния на организм алиментарных воздействий. Особый интерес
при этом представляет изучение активности апоптоза в качестве биомаркера при оценке
безопасности новых источников пищевых веществ, в частности генно-инженерномодифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения.
Актуальность
исследований,
характеризующих
в
применимость использования различных современных методов
сравнительном
аспекте
определения активности
апоптоза при токсических воздействиях с последующим определением активности апоптоза
в качестве биомаркера, характеризующего влияние алиментарных факторов на организм
определило цель и основные задачи настоящей работы.
3
Целью настоящей работы является выявление наиболее чувствительных методов к
экспериментальному изучению активности апоптоза как системного биомаркера влияния
алиментарных и токсических факторов на лабораторных животных.
1.2. Основные задачи исследования
1.
Провести
сравнительную
оценку
чувствительности
биохимического,
морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в
различных органах крыс на различных экспериментальных моделях токсического
воздействия.
2. Охарактеризовать влияние некоторых алиментарных факторов
на изменение
активности апоптоза в тканях лабораторных животных.
3. Изучить влияние генно-инженерно-модифицированной кукурузы, устойчивой к
вредителям, на активность апоптоза у крыс.
1.3. Научная новизна
Впервые
сравнительно
морфологического
и
охарактеризована
электрофоретического
применимость
(ДНК-комет)
методов
биохимического,
для
определения
активности апоптоза в различных органах крыс при токсических воздействиях различной
интенсивности.
Установлена наивысшая чувствительность метода ДНК-комет для определения
активности апоптоза в печени крыс, при воздействии минимально действующей токсической
дозы тетрахлорметана.
Впервые
выявлено,
что
содержащего экстракта приводит
предварительное
введение
в
рацион
фитостероид-
к снижению степени фрагментации ДНК и индекса
апоптоза в тимусе крыс, подвергавшихся стрессорному воздействию.
Разработана схема оценки уровня активности апоптоза в процедуре медикобиологических
исследований
генно-инженерно-модифицированных
организмов
растительного происхождения.
1.4. Практическая значимость работы
Метод
ДНК-комет
предложен
и
экспериментально
обоснован
в
качестве
высокоинформативного и чувствительного метода определения активности апоптоза при
воздействии различных низкотоксичных и алиментарных факторов.
4
1.5. Внедрение результатов в практику
Результаты диссертационной работы использованы в специализированном курсе
лекций
для
аспирантов
ФГБУ
«НИИ
питания»
РАМН
«Генно-инженерно-
модифицированные источники пищи».
Разработаны методические подходы для определения активности апоптоза в
различных органах лабораторных животных и включены в материалы методических
указаний МУ 2.3.2.2306-07 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерномодифицированных
организмов
растительного
происхождения»
утверждённые
постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г. Г.
Онищенко 30.11.2007 № 80.
1.6. Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на X Всероссийском
конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 1-3 декабря 2008 г.),
XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов (Москва, 30 ноября – 2 декабря
2009 г.), XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным
участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» (Москва, 5 – 7 декабря
2011г.), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы
биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.).
Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН в
рамках тем № 098, № 116 и №134.
1.7. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в научном
журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
1.8. Личный вклад соискателя
Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или
при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных
результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами
публикаций.
1.9. Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалы и
методы исследования, ___ глав результатов собственных исследований, заключения, выводов,
списка цитированной литературы, включающего ___источников, из которых ___ –
зарубежные. Диссертация изложена на ___ страницах машинописного текста, включает ___
рисунков, ___ схем, ___ таблицы.
5
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Экспериментальные животные
Все модельные эксперименты выполнены на 220 крысах-самцах линии Вистар 250-270
г., полученных из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая». Крыс содержали
в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим
+21-23ºС) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде
ad libitum. На протяжении всех экспериментов не отмечено гибели крыс контрольной и
опытных групп. Состав, пищевая и энергетическая ценность использованных рационов
представлены в табл. 1.
Таблица 1. Состав полусинтетического казеинового рациона
Ингредиенты рациона
Кол-во, г Белок, г
Жиры, г Углеводы, г
Калорийность
ккал
%
84,22
22,1
203,12
53,3
44,91
11,8
44,82
11,8
4,0
1,0
-
Казеин
Крахмал маисовый
Масло подсолнечное
Лярд
Солевая смесь1
Смесь в/р витаминов2
Смесь ж/р витаминов3
25,0
58,0
5,0
5,0
4,0
1,0
0,1
20,20
0,58
-
0,38
4,99
4,98
0,1
50,2
1,0
-
Микрокристаллическая
целлюлоза
2,0
-
-
-
-
-
100,1
20,78
10,45
51,2
381,07
100
ИТОГО
Изучение влияния генно-инженерно-модифицированной (ГМ) кукурузы устойчивой к
вредителям на активность апоптоза проводили на 20 крысах самцах линии Вистар, с
исходной массой 90-100 г. Животные получали свободный доступ к корму и воде,
содержались в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в вентилируемом помещении,
по 4-5 особей в клетке.
Животные были произвольно разделены на 2 группы (по 10 особей в каждой группе):
животные опытной группы получали с рационом ГМ кукурузу устойчивую к вредителям,
животные контрольной группы – традиционный аналог ГМ кукурузы. Измельченное зерно
кукурузы включали в состав корма из расчета ~10-12 г на крысу в сутки, заменяя
ингредиенты рациона по принципу изокалорийности и идентичности химического состава
(табл. 2).
6
Таблица 2. Состав экспериментальных рационов с включением кукурузы
Калорийность
Ккал
%
Опытная группа, ГМ кукуруза устойчивая к вредителям
Казеин
15,06
12,74
0,18
52,58
15
Крахмал маисовый
24,33
0,24
20,31
82,20
24
Масло подсолнечное
2,57
2,56
23,04
7
Лярд
2,0
1,99
17,91
5
1
Солевая смесь
4,0
2
Смесь в/р витаминов
1,0
1,0
4,00
1
3
Смесь ж/р витаминов
0,1
0,1
0,90
0
Кукурузная мука
49,90
4,18
2,43
32,29
167,75
48
ИТОГО
98,96
17,16
7,26
53,60
348,38
100
Контрольная группа, традиционный аналог ГМ кукурузы
Казеин
14,75
12,48
0,18
51,54
15
Крахмал маисовый
24,21
0,24
20,21
81,80
24
Масло подсолнечное
2,75
2,74
24,66
7
Лярд
2,0
1,99
17,91
5
1
Солевая смесь
4,0
2
Смесь в/р витаминов
1,0
1,0
4,00
1
3
Смесь ж/р витаминов
0,1
0,1
0,90
0
Кукурузная мука
50,15
4,44
2,25
32,39
167,57
48
ИТОГО
98,96
17,16
7,26
53,60
348,38
100
Ингредиенты рациона
Кол-во, г
Белок, г
Жиры, г
Углеводы, г
2.2. Схемы экспериментов
Исследования включали несколько последовательных этапов, структура выполненных
экспериментов представлена в табл. 3.
В первой серии исследований на классической модели активации апоптоза под
действием адренокортикотропного гормона (АКТГ) были отработаны оптимальные методы
определения ключевых белков апоптоза – p53, Вах, Bcl-2, каспазы-3, а также метод ДНКкомет для определения степени фрагментации ДНК в различных органах крыс
(эксперимент 1).
Во второй серии исследований на модели токсического действия низких и
сверхнизких доз тетрахлорметана (CCl4) определены наиболее чувствительные методы
оценки активности апоптоза, а также восприимчивые к апоптогенным воздействиям ткани и
органы (эксперименты 2-4).
В третьей серии исследований на модели модификации пищевого статуса животных,
получавших рацион с пониженным содержанием пантотеновой кислоты изучено действие
минимальной дозы тетрахлорметана (CCl4) на изменение активности апоптоза в качестве
чувствительного биомаркера, позволяющего выявить неблагоприятное воздействие на
организм (эксперимент 5).
7
Влияние различных доз фитостероидов на активность апоптоза в различных органах
крыс, получавших с рационом фитостероиды в нормальных условиях изучено в
эксперименте 6, подвергавшихся стрессорному воздействию изучено в эксперименте 7.
Проведено определение изменения активности апоптоза в органах и тканях
лабораторных
животных
при
медико-биологических
исследованиях
ГМ
кукурузы
устойчивой к вредителям (эксперимент 8).
Таблица 3. Структура экспериментов1
Методы
определения
Воздействие
активности
апоптоза
1. Определение активности апоптоза в различных органах крыс на модели токсического
воздействия адренокортикотропного гормона (АКТГ)
Контроль
–
–
Каспаза-3;
Опыт 1
АКТГ – 4 МЕ/кг
Печень, почки,
ИГХ (p53, Bax,
массы тела
тимус, мозг,
Bcl-2);
6, 12, 24 часа
костный мозг
Метод «ДНКОпыт 2
АКТГ – 75 МЕ/кг
комет»
массы тела
2. Оценка активности апоптоза при внутрибрюшинном введение тетрахлорметана (CCl4)
лабораторным животным
Контроль
–
–
Каспаза-3;
Опыт 1
CCl4 – 0,08 мг/кг
Печень, почки,
ИГХ (p53, Bax,
массы тела
тимус, мозг,
Bcl-2);
6, 12, 24 часа
костный мозг
Метод «ДНКОпыт 2
CCl4 – 0,48 мг/кг
комет»
массы тела
3. Определение активности апоптоза в различных органах крыс на модели токсического
воздействия тетрахлорметана (CCl4)
Контроль
–
–
Печень, почки,
Каспаза-3;
тимус, мозг,
ИГХ (p53, Bax,
Опыт 1
CCl4 – 0,01 мг/кг
костный мозг
Bcl-2);
массы тела
Метод «ДНКОпыт 2
CCl4 – 0,02 мг/кг
24 часа
комет»
массы тела
Опыт 3
CCl4 – 0,04 мг/кг
массы тела
4. Оценка действия низких и минимально действующих доз тетрахлорметана (CCl4) в
различных органах лабораторным животным
Контроль
–
–
Печень, почки,
Метод «ДНКтимус, костный
комет»
Опыт 1
CCl4 – 0,04 мг/кг
мозг, мозг, сердце,
массы тела
легкие, селезенка,
Опыт 2
CCl4 – 0,08 мг/кг
24 часа
надпочечники,
массы тела
семенники,
простата
Группа
животных
Время отбора
проб
Отбираемые
органы
5. Оценка влияния дефицита пантотеновой кислоты, а также сочетанное действие дефицита
пантотеновой кислоты и минимально действующей дозы тетрахлорметана (CCl4) в
различных органах лабораторным животным.
Контроль
–
печень, почки,
Метод «ДНКтимус, костный
комет»
Опыт 1
Деф. вит. B5
30 дней
мозг, мозг, сердце,
Опыт 2
Деф. вит. B5 + CCl4 –
селезенка,
0,04 мг/кг массы тела
1
Дизайн эксперимента разработан совместно с в.н.с., к.м.н. Н.В. Тышко.
8
семенники
6. Влияние фитостероид-содержащего экстракта на изменение активности апоптоза в норме
Контроль
–
Опыт 1
Фитостероиды 5
мг/кг массы тела
тимус, мозг,
Метод «ДНК30 дней
Опыт 2
Фитостероиды 15
сердце
комет»
мг/кг массы тела
7. Влияние фитостероид-содержащего экстракта на изменение активности апоптоза после
стрессорного воздействия
Опыт 1
Стрессорное
воздействие
тимус, мозг,
Метод «ДНКОпыт 2
Фитоэкдистероиды
30 дней
сердце
комет»
2 мг/кг массы тела +
стрессорное
воздействие
8. Оценка влияния генно-инженерно-модифицированных организмов на изменение
активности апоптоза в различных органах лабораторным животным
Контроль
Традиционный
печень, почки,
(крысы)
аналог
тимус, костный
Метод «ДНК180 дней
мозг, мозг, сердце, комет»
Опыт 1
ГМ кукуруза
селезенка,
(крысы)
семенники
2.3. Биохимический метод определения активности каспазы-3
Активность каспазы-3 в тканях лабораторных животных определяли, используя тестсистему «Caspase 3 Colorimetric Kit» фирмы R&D System, США согласно (Korsmeyer А.,
2004).
Принцип метода основан на расщеплении искусственного субстрата Ac-DEVD-pNA
(Ac-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide) каспазой-3 и спектрофотометрической регистрации
продукта реакции p-нитроанилина (pNA) на спектрофотометре «StatFax 1904+» через 60 мин
после начала реакции при длине волны 405 нм (εmM = 10,5). Полученные данные
нормировали по количеству белка в пробе («iT Protein Assay Kits» фирмы Invitrogen, США)
активность каспазы-3 выражали в пмоль/мин/мг белка.
2.4. Морфометрические методы
Морфологические
исследования
включали
гистологический
и
иммуногистохимический методы. Кусочки печени крыс фиксировали в 4% растворе
параформальдегида в фосфатном буфере (рH 7,2-7,4) в течение 48 ч. Проводку, заливку в
парафин и приготовление парафиновых блоков выполняли по стандартной методике (Пирс
Э., 1962; Лили Р.,1969; Саркисов Д.С., 1996). Из каждого блока получали 10-12 серийных
срезов толщиной 4 мкм и помещали их на стекла, обработанные поли-L-лизином (MenzelGlaser®, 76×26 мм). Подготовленные к окрашиванию микропрепараты (по 3-4 среза на
стекло) использовали в гистологических и иммуногистохимических исследованиях2.
2
Автор признателен д.м.н. Сапрыкину В.П. за помощь в подготовке гистологических срезов.
9
Гистологическое исследование. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и
эозином по (Саркисов Д.С., 1996). Гистологические исследования включали выявление
клеток с начальными признаками апоптотического распада ядра (конденсация хроматина,
инвагинации (вдавления) ядерной мембраны, фрагментация ядра) и свободно лежащих
апоптозных телец. На основании результатов гистологических исследований, отбирали
препараты для иммуногистохимических исследований.
Для
иммуногистохимического
исследования
методом
двойных
иммунопероксидазной (стрептовидин-биотиновой) меткой применяли
антител
с
моноклональные
антитела: Bcl-2 (кат. № ab7973), Bax (кат. № ab7977), р53 (кат. № ab4060) фирмы Abcam,
Великобритания.
Анализ гистологических и иммуногистохимических микропрепаратов проводили с
помощью микроскопа Zeiss AxioImager Z1 в проходящем свете при увеличении ×400 и
программного обеспечения
Zeiss AxioImager Version 4.7. С каждого препарата
анализировали не менее 200 клеток. Индекс апоптоза (ИА) рассчитывали по формуле:
где А+ – количество апоптотических клеток.
2.5. Гель-электрофорез изолированных клеток «ДНК-комет»
Для оценки степени фрагментации ДНК и расчета индекса апоптоза был использован
метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (ДНК-комет) (Дурнев и др.,
2006).
Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и фрагментов ДНК
лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле:
при этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий
«хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК.
Микроскопический анализ проводили на микроскопе
Zeiss Axio Imager Z1 при
увеличении 400х. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I)
анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system,
«Metasystems GmbH». В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное
содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с
содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы ≥30%. С каждого микропрепарата анализировали
не менее 200 клеток и рассчитывали индекс апоптоза.
10
Рис. 6 Клетки печени крысы с различной степенью поврежденности ДНК.
a-клетка без повреждений (до 1% поврежденной ДНК),
b-клетка с некоторыми повреждениями (до 10% поврежденной ДНК ),
c-клетка со значительными повреждениями (до 30% поврежденной ДНК),
d-апоптоз-положительная клетка (более 30% поврежденной ДНК).
2.6.
Статистическая обработка результатов исследований
Обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ
прикладного статистического анализа StatSoft STATISTICA 8.0. Характер распределения
количественных признаков определяли с помощью
χ2-критерия. Проверка гипотезы о
равенстве дисперсий проводилась с помощью критерия
Левена.
Вычисляли среднее
значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (m). Данные
представлены как M±m.
Проводили сравнение количественных признаков двух независимых выборок,
удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий критерия
ANOVA. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости
нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0,05.
3. Результаты и обсуждение
3.1. Определение активности апоптоза в различных органах крыс на модели
токсического воздействия адренокортикотропного гормона
Изучены изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа после однократного
внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг массы тела по сравнению с
животными
контрольной
группы.
В
эксперименте
были
изучены
показатели,
характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза – содержание белков Bcl-2, Bax и
11
p53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также
этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза. Результаты исследований
уровня апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения
АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг представлены в табл. 4-7.
Как видно из табл. 4, после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг, содержание белков Bcl-2,
Bax и p53 в печени крыс опытной группы не отличалось от контрольных значений на всех
сроках отбора материала. Через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг отмечено
повышение содержания белка Bcl-2 на 61% (p<0,05) по сравнению с контрольным уровнем,
содержание данного белка через 6 и 12 часов не имело различий с контролем. Содержание
белков Bax и p53 не отличалось от контрольных величин на всех сроках отбора материала.
Таблица 4. Содержание Bcl-2, Bax и p53 белков в печени крыс после введения АКТГ
Доза АКТГ
4 МЕ/кг массы тела
75 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
6ч
12 ч
24 ч
2,34±0,47 2,19±0,54 2,55±0,73 2,17±0,56 2,55±0,79 2,04±0,65 3,77±0,49*
1,89±0,57 1,83±0,38 1,78±0,47 2,04±0,71 2,28±0,48 2,01±0,36 1,90±0,79
2,20±0,53 1,89±0,67 1,97±0,48 2,16±0,45 2,27±0,44 2,45±0,71 2,13±0,52
Содержание
белков, %
Контроль
Bcl-2
Bax
p53
M±m
M±m
M±m
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
После введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела не наблюдалось изменений
активности каспазы-3 в печени, почках, головном мозге и костном мозге крыс на всех
сроках отбора материала. Достоверное возрастание активности каспазы-3 отмечено в тимусе
(на 31%) через 24 часа после введения АКТГ. После введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг было
отмечено достоверное увеличение активности каспазы-3 в почках (через 12 часов – на 45%,
через 24 часа – на 29%) и тимусе (через 24 часа – на 19%). Изменений активности каспазы-3
в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.
Таблица 5. Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения АКТГ
Доза АКТГ
Активность
каспазы-3,
Контроль
M±m
M±m
M±m
M±m
23,07±1,02
8,89±0,27
5,31±0,19
0,07±0,01
4 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
22,91±1,08 22,04±1,21 23,83±1,01
8,97±0,31 9,13±0,21 8,80±0,19
5,21±0,17 5,73±0,29 6,97±0,14*
0,08±0,01 0,09±0,02 0,09±0,02
M±m
2,41±0,12
2,38±0,16 2,43±0,24 2,27±0,29 2,63±0,13 2,57±0,15 2,68±0,13
пмоль/мин/мг белка
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный
мозг
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
12
75 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
22,57±0,91 23,78±0,73 22,08±0,81
8,94±0,41 12,87±0,48*11,47±0,37*
5,35±0,14 5,34±0,12 6,34±0,27*
0,10±0,02 0,09±0,01 0,07±0,02
Таблица 6. Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения АКТГ
Степень
фрагментации
ДНК, % ДНК
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный
мозг
Доза АКТГ
Контроль
M±m
M±m
M±m
M±m
7,08±0,15
7,32±0,29
8,83±0,21
5,34±0,11
4 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
7,33±0,11 7,12±0,09 7,31±0,14
7,15±0,21 7,35±0,31 8,18±0,21*
8,77±0,17 8,66±0,18 8,69±0,20
5,14±0,13 5,27±0,09 5,18±0,12
75 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
6,95±0,09 7,10±0,13 7,14±0,11
7,68±0,21 8,15±0,21* 8,27±0,17*
9,02±0,14 9,58±0,19* 9,87±0,21*
5,27±0,08 5,39±0,10 5,19±0,14
M±m
8,31±0,24
8,19±0,24 8,26±0,17 8,51±0,23 8,21±0,16 8,33±0,20 8,41±0,16
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Как видно из табл. 6-7, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса
апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг в целом соответствовал
характеру изменений активности каспазы-3 (табл. 5): достоверное повышение уровня
фрагментации ДНК отмечено в почках (через 12 часов – на 11%, через 24 часа – на 13%) и
тимусе (через 12 часов – на 8%, через 24 часа – на 12%); достоверное повышение индекса
апоптоза отмечено в почках (через 12 часов – на 46%, через 24 часа – на 38%) и тимусе
(через 12 часов – на 28%, через 24 часа – на 27%). Изменений уровня фрагментации ДНК и
индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.
Характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс
после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг несколько отличался от изменений активности каспазы3: достоверное возрастание уровня фрагментации ДНК отмечено в почках (на 12%) через 24
часа после введения АКТГ, индекса апоптоза на 35%,
тогда как изменений уровня
фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе не выявлено на всех сроках отбора
материала. Также не наблюдалось изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза
в печени, головном мозге и костном мозге крыс на протяжении всего периода исследований.
Таблица 7. Индекс апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ
Доза АКТГ
Индекс апоптоза,
% ДНК
Контроль
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный
мозг
M±m
M±m
M±m
M±m
0,84±0,05
1,12±0,12
1,34±0,11
0,59±0,06
M±m
1,18±0,15 1,09±0,12 1,14±0,14 1,09±0,11 1,15±0,08 1,09±0,13 1,11±0,08
4 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
0,88±0,03 0,84±0,03 0,88±0,03
1,07±0,04 1,13±0,11 1,51±0,13*
1,29±0,15 1,28±0,16 1,33±0,14
0,54±0,05 0,61±0,05 0,58±0,03
75 МЕ/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
0,81±0,04 0,84±0,04 0,85±0,13
1,10±0,09 1,64±0,14* 1,54±0,10*
1,35±0,09 1,72±0,14* 1,71±0,13*
0,62±0,04 0,63±0,05 0,60±0,06
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Моделирование токсического воздействия в эксперименте путем внутрибрюшинного
введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг массы тела приводит к увеличению активности апоптоза в
13
тимусе и почках крыс, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня
фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе имеет сходный характер: значения этих
показателей возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения
АКТГ. При определении содержания белков Bcl-2, Bax и p53 не было выявлено какой-либо
динамики: на всех сроках отбора проб содержание белков Bax и p53 оставалось в пределах
контрольных значений, некоторое повышение содержания белка Bcl-2 через 24 часа после
введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг не позволяет расценивать этот факт, как свидетельство
усиления процессов апоптоза: поскольку
реализация апоптоза
– комплексное явление,
только комплексная реакция всех рассмотренных ключевых белков эффекторного этапа
может быть принята как доказательство активации апоптоза.
Введение АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела через 24 часа приводит к повышению
активности каспазы-3 в тимусе крыс и повышению уровня фрагментации ДНК и апоптозного
индекса в почках крыс. Поскольку реакция изученных показателей на введение 4 МЕ/кг
находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась от фонового
уровня апоптоза, такая доза АКТГ не является предпочтительным индуктором апоптоза для
постановки модельных экспериментов.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что показатели,
характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24
часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных
показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность
изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень фрагментации
ДНК>активность каспазы.
3.2. Определение активности апоптоза в различных органах крыс на модели
токсического воздействия тетрахлорметана
В исследованиях оценивали изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа
после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела по
сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели,
характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза – содержание белков Bcl-2, Bax и
p53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также
этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.
После введения CCl4 у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось какихлибо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено
каких-либо макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований
уровня апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения
CCl4 в дозе 0,08 и 0,48 мг/кг представлены в табл. 8-11.
14
Таблица 8. Содержание Bcl-2, Bax и p53 белков в печени крыс после введения CCl4
Содержание
белков, %
Доза CCl4
Контроль
0,08 мг/кг массы тела
0,48 мг/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
6ч
12 ч
24 ч
2,34±0,27 2,01±0,55 3,12±0,21* 3,03±1,05 4,74±0,62* 5,07±0,33* 4,18±0,76*
1,89±0,57 1,78±0,31 2,73±1,34 2,11±0,79 4,07±0,38* 4,70±0,64* 3,17±0,59*
2,20±0,53 2,43±0,67 2,19±0,66 2,15±0,44 3,07±0,52 4,15±0,27* 3,44±0,21*
Bcl-2
Bax
p53
M±m
M±m
M±m
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Как видно из табл. 8, через 6 часов после однократного внутрибрюшинного введения
CCl4 в дозе 0,08 мг/кг не отмечалось повышения содержания белков Bcl-2, Bax и p53, через
12 часов зарегистрировано повышение содержания белков Bcl-2 (на 33%, p<0,05) и Bax (на
44%, p>0,05), содержание белка p53 не отличалось от контрольного уровня.
После введения CCl4 в дозе 0,48 мг/кг, повышение содержания белков Bcl-2, Bax и
p53 отмечено на всех сроках отбора образцов: через 6 часов – на 103% (p<0,05), 115%
(p<0,05) и 40% (p>0,05); через 12 часов – на 117% (p<0,05), 149% (p<0,05) и 89% (p<0,05);
через 24 часа – на 79% (p<0,05), 68% (p<0,05) и 56% (p<0,05), соответственно.
Таблица 9. Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения CCl4
Активность
каспазы-3,
M±m
M±m
M±m
M±m
0,08 мг/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
23,07±1,02 22,9±1,08 24,38±1,12 34,12±1,27*
8,89±0,27 9,07±0,41 9,31±0,28 10,17±0,49*
5,31±0,19 5,21±0,17 5,73±0,29 5,87±0,31
0,07±0,01 0,08±0,01 0,09±0,02 0,09±0,02
M±m
2,41±0,12
пмоль/мин/мг белка
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный
мозг
Доза CCl4
Контроль
2,38±0,16
2,47±0,24
2,51±0,13
0,48 мг/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
28,07±0,92* 27,01±1,09* 45,98±0,87*
9,53±0,44 9,89±0,61 12,09±0,34*
4,83±0,25 5,01±0,26 5,68±0,32
0,09±0,01 0,07±0,02 0,10±0,02
2,35±0,24
2,28±0,18
3,77±0,29*
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
После введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела не наблюдалось изменений
активности каспазы-3 в тимусе, мозге и костном мозге крыс на всех сроках отбора
материала. Достоверное возрастание активности каспазы-3 отмечено в печени (на 48%) и
почках (на 15%) крыс через 24 часа после введения CCl4.
После введения CCl4 в дозе 0,48 мг/кг было отмечено достоверное увеличение
активности каспазы-3 в печени (через 6 часов – на 21%, через 12 часов – на 17%, через 24
часа – на 99%), почках (через 24 часа – на 27%) и костном мозге (через 24 часа – на 60%).
Изменений активности каспазы-3 в тимусе и головном мозге крыс не выявлено.
Как видно из табл. 10-11, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса
апоптоза в тканях крыс в целом соответствовал характеру изменений активности каспазы-3
15
(табл. 9), однако изменения уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза проявлялись на
более ранней стадии: после введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела достоверное
возрастание уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза отмечено в печени через 12 и 24
часа: на 28 и 29%, и на 81 и 155%, соответственно. Также отмечено возрастание индекса
апоптоза в почках – на 87 и 60% через 12 и 24 часа, при отсутствии изменения уровня
фрагментации ДНК, соответственно. Изменений активности апоптоза в тимусе, мозге и
костном мозге не выявлено.
Таблица 10. Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения CCl4
Степень
фрагментации
ДНК, % ДНК
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный
мозг
Контроль
Доза CCl4
M±m
M±m
M±m
M±m
7,08±0,15
7,32±0,29
8,83±0,21
5,34±0,11
0,08 мг/кг массы тела
0,48 мг/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
6ч
12 ч
24 ч
7,34±0,18 9,07±0,23* 9,14±0,14* 12,34±0,28*14,37±0,23*18,19±0,44*
7,43±0,21 7,29±0,16 7,38±0,21 7,69±0,12 8,42±0,24* 9,54±0,25*
8,71±0,18 8,64±0,15 8,89±0,22 8,71±0,18 8,64±0,15 8,89±0,22
5,14±0,09 5,21±0,12 5,17±0,08 5,14±0,09 5,21±0,12 5,17±0,08
M±m
8,31±0,24
8,24±0,31 8,09±0,18 8,16±0,15 8,05±0,17 9,24±0,21* 9,88±0,26*
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Таблица 11. Индекс апоптоза в тканях крыс после введения CCl4
Доза CCl4
Индекс апоптоза,
% ДНК
Контроль
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный
мозг
M±m
M±m
M±m
M±m
0,84±0,05
1,12±0,12
1,34±0,14
0,59±0,06
M±m
1,18±0,15 1,09±0,09 1,20±0,12 1,15±0,12 1,19±0,15 1,34±0,06* 1,48±0,04*
0,08 мг/кг массы тела
0,48 мг/кг массы тела
6ч
12 ч
24 ч
6ч
12 ч
24 ч
0,98±0,18 1,52±0,23 * 2,15±0,31 * 1,53±0,24* 2,44±0,54 * 2,43±0,19 *
1,23±0,14 2,09±0,17 * 1,79±0,26 * 1,19±0,15 1,83±0,11 * 2,23±0,12 *
1,23±0,11 1,44±0,17 1,34±0,27 1,27±0,15 1,33±0,18 1,48±0,19
0,55±0,04 0,65±0,05 0,60±0,10 0,61±0,04 0,58±0,03 0,64±0,05
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
После введения CCl4 в дозе 0,48 мг/кг было отмечено достоверное повышение уровня
фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени (через 6 часов – на 74% и 82%, через 12
часов – на 102% и 190%, через 24 часа – на 156% и 189%), почках (через 12 часов – на 15%
и 63%, через 24 часа – на 30% и 99%) и костном мозге (через 12 часов – на 11% и 14%,
через 24 часа – на 19% и 22%), соответственно. Изменений уровня фрагментации ДНК и
индекса апоптоза в тимусе и мозге крыс не выявлено.
Таким образом, моделирование токсического воздействия путем внутрибрюшинного
введения CCl4 приводит к увеличению активности апоптоза в печени, почках и костном
мозге лабораторных животных, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня
16
фрагментации ДНК и индекса апоптоза имеет сходный характер: значения этих показателей
возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения CCl4. Динамика
изменения содержания белков Bcl-2, Bax и p53 имеет иной характер, их содержание в
печени начинает увеличиваться через 6 часов после введения CCl4, достигая максимальных
значений через 12 часов и снижаясь через 24 часа. Следует отметить, что время реализации
каждой стадии апоптоза не зависело от использованных доз воздействующего фактора:
начало эффекторного этапа отмечено через 6 часов, максимальное развитие эффекторного
этапа – через 12 часов, завершение эффекторного этапа и этап деструкции – через 24 часа.
Полученные данные соответствуют современным представлениям о молекулярных
механизмах регуляции апоптоза и времени реализации стадий апоптоза.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что показатели,
характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24
часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных
показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность
изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень фрагментации
ДНК>активность каспазы. Показатели, характеризующие начало эффекторного этапа
апоптоза (содержание белков Bcl-2, Bax и p53), по чувствительности сопоставимы с
показателем индекса апоптоза, однако оптимальное время отбора образцов тканей для
регистрации содержания данных белков составляет 12 часов после однократного
воздействия.
3.3. Оценка чувствительности различных методов определения
активности апоптоза при внутрибрюшинном введение низких и минимально
действующих доз CCl4 лабораторным животным
В данной серии исследований оценивали динамику изменений показателей апоптоза
через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозах 0,04, 0,02 и 0,01
мг/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были
изучены показатели, характеризующие завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза
– активность каспазы-3, а также этап деструкции – уровень фрагментации ДНК и индекс
апоптоза.
После введения CCl4 у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось какихлибо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено
макроскопических изменений внутренних органов. Результаты определения активности
каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях и органах крыс после
однократного внутрибрюшинного введения CCl4 представлены в табл. 12-14.
17
Таблица 12. Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения CCl4
Активность каспазы-3,
пмоль/мин/мг белка
Контроль
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
23,07±1,02
8,89±0,27
5,31±0,19
0,07±0,01
2,41±0,12
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
0,04 мг/кг
массы тела
25,12±0,78
9,47±0,37
5,34±0,12
0,07±0,02
2,59±0,15
Доза CCl4
0,02 мг/кг
массы тела
23,04±0,51
8,94±0,26
5,07±0,13
0,08±0,01
2,68±0,13
0,01 мг/кг
массы тела
22,04±0,58
8,88±0,17
5,01±0,10
0,07±0,02
2,51±0,14
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
Как видно из табл. 12, активность каспазы-3 во всех исследованных органах крыс
после введения CCl4 в дозах 0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела, не отличалась от
контрольного уровня. Сравнение этих результатов с данными, представленными в табл. 9
указывают на то, что внутрибрюшинное введение CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела является
минимально действующей дозой, вызывающей изменение активности каспазы-3 в печени
крыс.
Достоверное повышение уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза было
выявлено в печени крыс после введения CCl4 в дозе 0,04 мг/100 г массы тела – на 6 и 16%
(p<0,05), соответственно. Других достоверных изменений степени фрагментации ДНК в
органах крыс не выявлено (табл. 13).
Таблица 13. Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения CCl4
Степень фрагментации
ДНК (% ДНК)
Контроль
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
7,08±0,15
7,32±0,29
8,83±0,21
5,34±0,11
8,31±0,24
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
0,04 мг/кг
массы тела
7,51±0,11*
7,58±0,13
8,09±0,12
5,13±0,09
8,51±0,09
Доза CCl4
0,02 мг/кг
массы тела
6,94±0,08
7,39±0,09
8,15±0,13
4,98±0,10
8,43±0,11
0,01 мг/кг
массы тела
7,06±0,09
7,23±0,07
8,08±0,15
5,09±0,11
8,44±0,14
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Таблица 14. Индекс апоптоза в тканях крыс после введения CCl4
Индекс апоптоза,
% ДНК
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
Контроль
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
0,84±0,05
1,12±0,12
1,34±0,11
0,59±0,06
1,18±0,15
0,04 мг/кг
массы тела
0,98±0,04*
1,08±0,13
1,29±0,14
0,62±0,03
1,15±0,13
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
18
Доза CCl4
0,02 мг/кг
массы тела
0,88±0,06
1,10±0,11
1,30±0,09
0,64±0,03
1,21±0,14
0,01 мг/кг
массы тела
0,86±0,05
1,14±0,12
1,32±0,12
0,61±0,04
1,17±0,12
В проведенном исследовании изменение активности апотоза было выявлено в печени,
что
соответствовало
ожидаемому
эффекту,
так
как
CCl4 является
классическим
гепатотропным агентом, однако реакция изученных показателей на введение CCl4 в дозе 0,04
мг/кг массы тела находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась
от фонового уровня апоптоза. Дозы 0,02 и 0,01 мг/кг не вызывали изменений изученных
показателей, поэтому в дальнейших модельных экспериментах в данной работе в качестве
минимальной действующей дозы CCl4 следует использовать 0,04 мг/кг массы тела.
Чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень
фрагментации ДНК>активность каспазы, поэтому использование методов оценки уровня
фрагментации
ДНК
оптимально
для
выявления
токсических
воздействий
малой
интенсивности.
Таким образом, метод «ДНК-комет» показал более высокую чувствительность
относительно биохимического метода определения активности каспазы-3 в печени.
Фрагментация ДНК является конечным этапом апоптоза, что позволяет
эффективно
применять метод ДНК-комет для оценки активности апоптоза при исследовании динамики
токсического действия различных химических агентов, когда низкие дозы сочетаются с
различной длительностью воздействия неблагоприятного фактора. Для определения методом
ДНК-комет возможного изменения активности апоптоза в других органах и тканях крыс при
токсическом поражении низкими и минимально действующими дозами было проведено
дополнительное исследование с отбором проб от всех основных органов, направленное на
определение в них активности апоптоза методом ДНК-комет.
3.4. Оценка действия низких и минимально действующих доз тетрахлорметана
(CCl4) в различных органах лабораторным животным
В исследовании оценивали активность апоптоза в печени, почках, тимусе, костном
мозге, головном мозге, сердце, селезенке, семенниках, тонком и толстом кишечнике методом
ДНК-комет. Образцы для исследований отбирали
через 24 часа после однократного
внутрибрюшинного введения CCl4 в низкой и минимально действующей дозах – 0,08 и 0,04
мг/кг массы тела. В эксперименте были изучены показатели апоптоза, характеризующие этап
деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.
После введения CCl4 у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось какихлибо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено
макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований уровня
фрагментации ДНК и индекса апоптоза в органах крыс представлены в табл. 15-16.
19
Таблица 15. Уровень фрагментации ДНК в органах крыс после введения
низкихи минимально действующих доз CCl4
Степень фрагментации ДНК
(% ДНК)
Контроль
Печень
Почки
Тимус
Головной мозг
Костный мозг
Селезенка
Семенники
Тонкий кишечник
Толстый кишечник
7,12±0,21
7,35±0,17
7,68±0,19
4,89±0,13
7,36±0,19
8,14±0,16
8,57±0,28
9,27±0,32
8,63±0,28
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
Доза CCl4
0,08 мг/кг
0,04 мг/кг
массы тела
массы тела
8,03±0,16*
7,84±0,17*
7,22±0,11
7,41±0,12
7,53±0,14
7,72±0,09
5,01±0,16
4,95±0,12
7,22±0,16
7,51±0,13
8,03±0,11
7,98±0,14
8,23±0,17
8,69±0,16
11,07±0,17*
9,38±0,21
8,39±0,21
8,57±0,14
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Как видно из табл. 15-16, после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в
низкой (0,08 мг/кг) и минимально действующей (0,04 мг/кг) дозах не было выявлено
изменений изученных показателей в почках, тимусе, головном мозге, костном мозге,
селезенке, семенниках, толстом кишечнике.
Повышение уровня фрагментации ДНК на 13% (p<0,05) и 10% (p<0,05), индекса
апоптоза – на 28% (p<0,05) и 22% (p<0,05) было выявлено в печени крыс при введении CCl4
в дозах 0,08 и 0,04 мг/кг массы тела, соответственно.
Повышение уровня фрагментации ДНК на 19% (p<0,05), индекса апоптоза – на 14%
(p<0,05) было выявлено в тонком кишечнике крыс при введении CCl4 в дозе 0,08 мг/кг; при
введении CCl4 в дозе 0,04 мг/кг уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тонком
кишечнике не отличались от фонового уровня.
Таблица 16. Индекс апоптоза в органах крыс после введения
низкихи минимально действующих дозCCl4
Индекс апоптоза,
%
Печень
Почки
Тимус
Головной мозг
Костный мозг
Селезенка
Семенники
Тонкий кишечник
Толстый кишечник
Доза CCl4
0,08 мг/кг
0,04 мг/кг
массы тела
массы тела
1,14±0,06*
1,09±0,05*
1,08±0,05
1,05±0,07
1,13±0,05
1,15±0,06
0,60±0,04
0,61±0,04
1,19±0,09
1,24±0,07
1,19±0,05
1,23±0,06
1,02±0,06
1,05±0,04
1,19±0,05*
1,09±0,06
1,12±0,09
1,19±0,07
Контроль
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
0,89±0,03
1,07±0,09
1,18±0,09
0,57±0,03
1,28±0,10
1,24±0,06
0,98±0,05
1,04±0,05
1,15±0,11
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
20
В проведенном исследовании чувствительность внутренних органов крысы к
воздействию низкой и минимально действующей доз CCl4 снижается в ряду печень >тонкий
кишечник>прочие органы, поэтому использование печени для оценки уровня
апоптоза
оптимально для выявления токсических воздействий малой интенсивности.
3.5.
Определение активности апоптоза в различных органах крыс на
модели сочетанного воздействия тетрахлорметана и витаминной
недостаточности
Известно, что дефицит
пантотеновой кислоты (витамина B5) и связанные с ним
метаболические нарушения приводят к снижению адаптационных возможностей организма,
и, как следствие, повышают чувствительность к токсическому воздействию. В качестве
токсического фактора, индуцирующего апоптоз,
был
использован тетрахлорметан, чье
действие на изменение активности апоптоза в тканях крыс было подробно охарактеризовано
в предыдущих разделах.
Таблица 17. Влияние дефицита пантотеновой кислоты, и сочетанного
действия дефицита пантотеновой кислоты и внутрибрюшинного введения
тетрахлорметана на фрагментацию ДНК в различных органах крыс.
Индекс апоптоза,% ДНК
Органы
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
Селезенка
Тестис
Тонкий киш.
Толстый киш.
Контроль
1-ая опытная
группа
(деф. вит. B5)
2-ая опытная
группа
(деф. вит. B5 + CCl4)
7,54±0,14
7,08±0,11
8,13±0,14
4,43±0,05
7,14±0,16
7,32±0,19
8,18±0,23
9,84±0,14
8,34±0,17
6,24±0,16*
7,15±0,13
8,05±0,13
4,21±0,06
7,58±0,12
7,55±0,21
8,32±0,21
9,89±0,16
8,16±0,14
8,75±0,14*
7,89±0,12*
7,98±0,15
4,67±0,17
7,27±0,14
7,27±0,15
8,15±0,17
11,35±0,17*
8,51±0,12
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Как видно из данных, представленных в табл. 17-18, достоверные изменения степени
фрагментации ДНК и индекса апотоза, были выявлены в печени крыс обеих опытных групп.
При этом в печени крыс, получавших дефицитный по пантотеновой кислоте рацион,
наблюдалось достоверное снижение фрагментации ДНК и индекса апоптоза, в то время как
у крыс, испытывающих сочетанное воздействие дефицитного по пантотеновой кислоте
рациона и однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы, было
выявлено достоверное увеличение фрагментации ДНК индекса апоптоза в печени и тонкой
кишке.
21
Таблица 18. Влияние дефицита пантотеновой кислоты, и сочетанного
действия дефицита пантотеновой кислоты и внутрибрюшинного введения
тетрахлорметана на индекс апоптоза в различных органах крыс.
Органы
Индекс апоптоза, %
1-ая опытная
2-ая опытная
группа
группа
(деф. вит. B5)
(деф. вит. B5 + CCl4)
Контроль
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
Селезенка
Тестис
Тонкий киш.
Толстый киш.
1,14±0,06*
1,08±0,05
1,13±0,05
0,60±0,04
1,19±0,09
1,19±0,05
1,02±0,06
1,19±0,05*
1,12±0,09
0,89±0,03
1,07±0,09
1,18±0,09
0,57±0,03
1,28±0,10
1,24±0,06
0,98±0,05
1,04±0,05
1,15±0,11
1,09±0,05*
1,05±0,07
1,15±0,06
0,61±0,04
1,24±0,07
1,23±0,06
1,05±0,04
1,09±0,06
1,19±0,07
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* отличия от контроля достоверны при p<0,05
Снижение активности апоптоза в печени крыс, получавших полусинтетический
казеиновый рацион
дефицитный по пантотеновой кислоте, может быть объяснено
«нехваткой» ряда белков участвующих в рецептор-зависимом пути апоптоза. Поскольку CCl4
вызывает апоптоз, преимущественно запуская митохондриальный путь апоптоза в клетках
печени крыс, то полученные результаты повышения активности апотоза свидетельствуют о
раннем токсическом действии данного соединения, усиленном на фоне дефицита
пантотеновой кислоты.
3.6. Влияния фитоэкдистероидов на активность апоптоза у крыс.
Как известно, общий адаптационный синдром в условиях неблагоприятного
стрессорного
воздействия
может
сопровождаться
выраженными
изменениями
интенсивности процессов апоптоза и некроза в различных органах, и, в первую очередь в
тимусе. Соответственно, представляется перспективным определение активности апоптоза в
качестве биомаркера для оценки возможного влияния алиментарного фактора на дисстресс.
Методом «ДНК-комет», определяли фрагментацию ДНК и индекс апоптоза в тимусе, мозге и
сердце у крыс, получавших фитостероид-содержащий экстракт соответственно из расчета 5 и
15 мг фитостероидов на кг массы тела. Результаты исследования представлены в табл. 19
22
Таблица 19. Влияние фитостероид-содержащего экстракта на степень
фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тканях крыс
Группа животных
Степень фрагментации ДНК
Индекс апоптоза, %
(% ДНК)
Опыт 1
Опыт 2
Опыт 1
Опыт 2
Контроль
Контроль
(5мг/кг) (15мг/кг)
(5мг/кг) (15мг/кг)
Орган
Тимус
Мозг
Сердце
M±m
M±m
M±m
7,58±0,34
7,63±0,24
7,49±0,27
1,02±0,09
1,10±0,08
1,09±0,06
4,28±0,14
7,38±0,22
4,03±0,18
7,24±0,16
4,15±0,11
7,34±0,22
0,38±0,06
0,91±0,12
0,40±0,05
1,02±0,14
0,37±0,06
0,98±0,13
Представлены средние данные (М±m) от n = 8
Не выявлено достоверных различий степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза
у животных, получавших фитостероид-содержащий экстракт в сравнении животными
контрольной группы. Полученные результаты свидетельствуют, что ежедневное получение
крысами в течение 30 дней фитоэстероидов из расчета 5 и 15 мг фитостероидов на кг массы
тела не влияло на активность апоптоза.
В следующей серии исследований, оценивали влияние фитоэстероидов на активность
апоптоза у животных подвергнутых стрессорному воздействию. Результаты эксперимента
представлены в таблице 20.
Таблица
20.
Влияние
фитостероид-содержащего
экстракта
на
степень
фрагментации ДНК в тканях крыс, подвергнутых стрессорному воздействию
Группа животных
Степень фрагментации ДНК
Индекс апоптоза, %
(% ДНК)
Орган
Тимус
Мозг
Сердце
M±m
M±m
M±m
Контроль
8,14±0,16
4,08±0,14
7,53±0,15
Опыт 1
7,61±0,14*
4,12±0,13
7,23±0,13
Контроль
1,34±0,07
0,41±0,07
1,23±0,10
Опыт 1
1,08±0,10*
0,42±0,05
1,02±0,14
Представлены средние данные (М±m) от n = 10
* – отличия между опытными группами достоверны при p<0,05
Степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тимусе у животных контрольной
группы, подвергавшихся стрессороному воздействию, были достоверно выше по сравнению
с животными подвергшихся стрессу, получавшими фитостероид-содержащий экстракт. В
других органах
не было выявлено каких-либо достоверных изменений степени
фрагментации ДНК и индекса апоптоза у этих двух групп животных. Результаты,
представленные в данном разделе, подтверждают высокую информативность показателя
активности апоптоза как биомаркера влияния алиментарного фактора на тяжесть проявления
стрессорного воздействия.
23
3.7. Влияние генно-инженерно-модифицированной кукурузы устойчивой к
вредителям на активность апоптоза у крыс
На протяжении всего эксперимента не было отмечено гибели крыс линии Вистар
контрольной и опытной групп. Общее состояние животных в обеих группах было
удовлетворительным. По
внешнему виду, состоянию шерстного покрова, поведению и
скорости роста животные опытной группы не отличались от животных контрольной группы.
Результаты определения степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза методом ДНКкомет в различных органах крыс в табл. 20-21.
Таблица 20. Степень фрагментации в различных органах крыс потреблявших ГМ
кукурузу устойчивую к вредителям и ее традиционный аналог
Степень фрагментции
ДНК, % ДНК
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
Селезенка
Тестис
Тонкий киш.
Толстый киш.
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
Контрольная
группа
Опытная
группа
Норма
7,22±0,11
7,23±0,14
7,53±0,11
4,08±0,03
7,59±0,15
6,14±0,12
7,21±0,20
8,91±0,25
8,97±0,18
7,11±0,15
7,14±0,12
7,68±0,12
4,01±0,03
7,68±0,17
6,31±0,15
7,33±0,19
9,07±0,21
9,11±0,20
7,01-7,54
7,08-7,68
7,35-8,13
3,97-4,43
7,14-7,79
6,04-7,32
7,06-8,18
8,55-9,84
8,34-9,10
Таблица 21. Индекса апоптоза в различных органах крыс потреблявших ГМ кукурузу
устойчивую к вредителям и ее традиционный аналог
Индекс апоптоза, %
Печень
Почки
Тимус
Мозг
Костный мозг
Селезенка
Тестис
Тонкий киш.
Толстый киш.
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
M±m
Контрольная
группа
Опытная
группа
Норма
0,80±0,03
1,08±0,09
1,18±0,10
0,60±0,05
1,07±0,07
1,11±0,08
1,15±0,15
1,21±0,13
1,33±0,17
0,78±0,04
1,04±0,08
1,10±0,14
0,54±0,06
1,02±0,06
1,04±0,10
1,07±0,12
1,30±0,16
1,27±0,18
0,78-0,89
0,98-1,07
1,03-1,28
0,49-0,61
0,93-1,28
1,05-1,24
0,98-1,15
1,04-1,39
1,15-1,54
Таким образом, результаты исследования активности апоптоза в органах крыс линии
Вистар не выявили различий между животными, получавших в составе полусинтетического
рациона ГМ кукурузу и ее традиционный аналог (табл. 20-21). Все показатели находились в
пределах физиологических норм и не было выявлено какого-либо влияния ГМ кукурузы на
активность апоптоза по сравнению с ее традиционным аналогом.
24
4. Заключение
Апоптоз как программируемая гибель клетки является неотъемлемой частью
процессов развития организма и поддержания его гомеостаза. Сравнительная оценка
биохимического, иммуногистохимического и электрофоретического (ДНК-комет) методов
определения активности апоптоза в различных органах крыс при воздействии АКТГ, а также
токсическом
воздействии,
моделируемым
внутрибрюшинным
введением
низких
и
сверхмалых доз тетрахлорметана, позволила установить, что метод ДНК-комет является
наиболее чувствительным методом оценки активности апоптоза. На основании результатов
проведенных исследований научно обоснована высокая информативность определения
активности апоптоза как системного биомаркера, отражающего уровень адаптации
организма
к
окружающей
среде
и
обладающего
высокой
неспецифической
чувствительностью к алиментарным и токсическим воздействиям. Полученные данные
позволяют
эффективно применять данный метод для достоверной оценки изменения
активности апоптоза при воздействии
алиментарных факторов. Так, показано, что
недостаточность пантотеновой кислоты в рационе крыс снижает активность апоптоза в
печени животных, а при сочетанном действии введения CCl4 и дефицита этой кислоты
имеет место обратный эффект – увеличение активности апоптоза, Исследование активности
апоптоза в различных органах крыс, потреблявших фитостероиды при нормальных условиях
содержания и при моделировании дистресса электрокожным раздражением позволило
получить дополнительное подтверждение безопасности и эффективности использования в
питании этих биологически-активных соединений адаптогенного действия.
Результаты
проведенных
исследований
определения
активности
различных органах крыс линии Вистар свидетельствуют об отсутствии
апоптоза
в
различий
определяемых показателей у животных, получавших в составе полусинтетического рациона
ГМ
кукурузу
и
ее
традиционный
аналог,
что
дополняет
научно-обоснованную
доказательную базу отсутствия неблагоприятных эффектов ГМО и подтверждает их
безопасность.
25
5. Выводы
1. Сравнительная
характеристика
биохимического,
морфологического
и
электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на
различных экспериментальных моделях свидетельствует, что метод ДНК-комет
является наиболее чувствительным для оценки активности апоптоза при воздействии
низких и минимально низких доз факторов физической и химической природы.
2. На модели активации апоптоза путем внутрибрюшинного введения крысам
тетрахлорметана в дозах 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела выявлено дозозависимое
повышение активности апоптоза в печени, почках и костном мозге.
Динамика
изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза
имеет сходный характер – постепенное возрастание с максимумом через 24 часа.
Содержание белков Bcl-2, Bax и p53 в печени достигает максимальных значений
через 12 часов.
3. На модели активации апоптоза путем внутрибрюшинного введения крысам
тетрахлорметана в минимально низких дозах (0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела)
обнаружено, что минимально действующей
дозой, вызывающей достоверное
повышение активности апоптоза в печени крыс, является доза 0,04 мг/кг массы тела.
4. Содержание крыс на рационе без добавления пантотеновой кислоты приводит к
достоверному (на 20%) снижению активности апоптоза в печени крыс по сравнению с
контрольным уровнем (7,54±0,14%). Однократное введение тетрахлорметана дозе 0,08
мг/кг массы тела приводит к увеличению (на 36%) активности апоптоза в печени крыс
с дефицитом пантотеновой кислоты (до 8,75±0,14%), тогда как у контрольных
животных аналогичная доза тетрахлорметана вызывает повышение активности
апоптоза до 9,14±0,14% (на 21%).
5. Введение в рацион крыс фитостероидов (20-гидроксиэкдизона и 25S-инокостерона) в
дозе 5,0 и 15,0 мг/кг массы тела не приводит к достоверным изменениям активности
апоптоза в клетках тимуса, сердца и мозга. Введение фитостероидов в дозе 2,0 мг/кг
массы тела снижает на 18% чувствительность животных к стрессорному воздействию
электрическим током по уровню апотоза в тимусе крыс.
6. Установлены физиологические границы уровня активности апоптоза, определенные
методом ДНК-комет, у половозрелых крыс, составляющие для печени 7,01-7,54%,
почек 7,08-7,68%, тимуса 7,35-8,13%, головного мозга 3,97-4,43%, костного мозга
7,14-7,79%, селезенки 6,04-7,32%, семенников 7,06-8,18%, тонкой кишки 8,55-9,84%, и
толстой кишки 8,34-9,10%.
26
7. Метод ДНК-комет впервые использован для определения уровня активности апоптоза
в качестве биомаркера при медико-биологической оценке безопасности ГМ кукурузы,
содержащей кассету экспрессии гена vip3Aa20. Не выявлено каких-либо изменений
активности апоптоза во всех исследованных органах и тканях крыс, получавших ГМ
кукурузу, по сравнению с животными, получавшими ее традиционный аналог.
8. Изучение активности апоптоза рекомендовано в качестве высокочувствительного
системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий
различных
факторов окружающей среды, в часности алиментарных факторов.
Список опубликованных работ по теме диссертации
Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах,
рекомендованных Высшей аттестационной комиссией
Минобрнауки России:
1. Тышко Н.В., Брицина М.В., Гмошинский И.В., Захарова Н.С., Зорин С.Н., Мазо В.К.,
Озерецковская М.Н., Селяскин К.Е. Медико-биологическая оценка безопасности
генно-инженерно-модифицированной сои линии mon 89788 сообщение 2.
Генотоксикологические, иммунологические и аллергологические исследования.
Вопросы питания.– 2010. –Т. 79. –№ 3. –С. 13-17.
2. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е., Сапрыкин В.П.,
Утембаева Н.Т., Тутельян В.А. Оценка влияния ГМО растительного происхождения на
развитие потомства крыс в трех поколениях. Вопросы питания. –2011. –Т. 80. –№ 1. –
С. 14-28.
3. Тышко Н.В., Селяскин К.Е., Мельник Е.А., Пашорина В.А., Жминченко В.М. Оценка
репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии
алиментарного и токсического факторов. Вопросы питания. – 2012. – Т. 81. – № 1. –
С. 33-43.
Материалы научных конференций
4. Селяскин К.Е. Поражение гепатоцитов четыреххлористым углеродом: стадия
апоптоза // Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов
«Питание и здоровье».– М., 2008.– с.97.
5. Селяскин К.Е. Сравнительная оценка методов определения активности апоптоза на
стадии фрагментации ДНК // Материалы XI Всероссийского Конгресса диетологов и
нутрициологов «Питание и здоровье».– М., 2009.– с.142-143.
6. Бучанова А.В., Селяскин К.Е. Эффективность использования новых пищевых
источников органической формы цинка в питании растущих лабораторных животных
(крыс) // Материалы XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов
«Питание и здоровье».– М., 2009.– с.26.
7. Селяскин К.Е. Влияние адренокортикотропина на активность апоптоза в некоторых
органах крыс // Материалы XIII Всероссийского Конгресса диетологов и
нутрициологов «Питание и здоровье».– М., 2012.– с.11-12.
8. Селяскин К.Е. Сравнительная оценка методов определения активности апоптоза на
стадии фрагментации ДНК в различных органах крыс // Материалы V
Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы
биологии, нанотехнологий и медицины». – Ростов-на-Дону, 2013. – с. 449-450.
27
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
762 Кб
Теги
155626
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа