close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

10144.Влияние салициловой кислоты на антиоксидантную и прооксидантную активности в растительных клетках

код для вставкиСкачать
Сер. 3. 2009. Вып. 2
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
УДК 577.123.:577.15.:612.014.43.
Ю. В. Белых, Н. В. Кириллова, А. И. Спасенков
ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА АНТИОКСИДАНТНУЮ
И ПРООКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТИ В РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
Введение. В настоящее время в литературе появляется все больше данных об особой
роли салициловой кислоты (СК) в возникновении индуцированной устойчивости растений
к патогенам и неблагоприятным условиям среды [22]. Известно, что стрессовые факторы
смещают прооксидантное-антиоксидантное равновесие в клетках растений, что связано
с усилением продукции активных форм кислорода (АФК). Установлено, что СК влияет
на генерацию перекиси водорода и супероксидного иона [19], в свою очередь, повышение
концентрации АФК стимулирует образование новых порций СК, что приводит к усилению
эффекта [10]. В то же время известно, что предобработка растительных тканей СК и затем
подвергнутых биотическим и абиотическим стрессам нивелирует неблагоприятные для
жизни растения последствия этих воздействий [10, 17, 21]. Данный эффект, по-видимому,
можно объяснить повышением в присутствии СК активности супероксиддисмутазы,
пероксидазы и каталазы, задействованных в утилизации АФК [19]. Однако в настоящее
время в литературе нет единого мнения о влиянии экзогенной СК на антиоксидантную
активность в растительных клетках, некоторые исследователи пишут о повышении, другие
о снижении уровня активности основных ферментов-антиоксидантов [4].
В связи с этим в данном исследовании на модели окислительного стресса была проведена оценка содержания фенолкарбоновых кислот в клетках культуры ткани полисциас
Polyscias filicifolia. Изучено влияние экзогенной СК на такие биохимические показатели
растительных клеток, как содержание внутриклеточного белка, протеолитическую активность, перекисное окисление липидов и активность каталазы, одного из основных
ферментов антиоксидантной защиты.
Методика исследования. Объектом работы служила культура ткани полисциас
Polyscias filicifolia (Moore ex Fournter) Bailey (сем. Araliaceae) в процессе ее длительного
культивирования на стандартной агаризованной среде Мурасиге и Скуга, модифицированной Н. Ф. Писецкой [9, 20]. Исследуемую биомассу культивировали на питательной
среде в темноте, при температуре 26 + 1 °С и относительной влажности воздуха 70 %,
с циклом культивирования 30–35 суток (один пассаж). После чего разрыхленную ткань
весом около 5 г пересаживали на свежую питательную среду объемом 70 мл. В работе
использовали ткань полисциас 20-суточного возраста, отобранную из 5–7 сосудов одного пассажа, повторности опытов из 5–6 пассажей. Навески ткани гомогенизировали
в ступке на холоде с 0,05 М фосфатным буфером pH = 7,8, в соотношении 0,5 мл буфера
на 1 г сырого веса ткани в присутствии 0,05 мл 3 %-ного тритона Х-100. Полученный
гомогенат оставляли в течении 30 мин при 4 °С, затем центрифугировали на микрофуге Beckman (США) в течение 3 мин при 12000 g. Осадок отбрасывали, а в супернатанте определяли активность каталазы (КФ 1.11.1.6) ― перманганатометрическим
© Ю. В. Белых, Н. В. Кириллова, А. И. Спасенков, 2009
145
методом [6], содержание малонового диальдегида (МДА) ― спектрофотометрически с использованием тиобарбитуровой кислоты [11], протеолитическую активность ― по приросту свободных аминогрупп после предварительного осаждения
белков трихлоруксусной кислотой [13]. Содержание внутриклеточного белка определяли общеизвестным методом Лоури [18], перекиси водорода — по методу [12],
основанному на окислении перекисью водорода комплексного реагента, состоящего
из аммоний-сернокислого железа II, серной кислоты и ксиленолового оранжевого.
После предварительного осаждения белков из супернатанта (12 000g) при помощи
70 %-ного этанола (1:5) в надосадочной жидкости оценивали содержание некоторых
фенолкарбоновых кислот методом ВЭЖХ на приборе «Миллихром 5.0» на колонке
«Silasorb RP-18» размером 2×7,5 мм при температуре 35 °С в системе ацетонитрил:
3 %-ная уксусная кислота в градиентном режиме. Различные разведения и количества исходных растворов ― 100 ммоль/л перекиси водорода [14] или стерильные
исходные 100 ммоль/л растворы феназин метасульфата [14], или стерильные исходные 0,05 ммоль/л растворы СК [3, 5] вносили в асептических условиях в каллусы
20-суточного возраста. О влиянии данных соединений на биохимические показатели
судили через 24 ч после инкубирования культуры в стандартных условиях.
Представленные в данной работе результаты обрабатывали статистически. Результаты выражали в средних значениях со стандартным отклонением (SD). Для оценки различий между экспериментальными данными использовали критерий ― непарный t-тест
Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне вероятности р ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. В предварительных опытах методом
ВЭЖХ было определено содержание фенолкарбоновых кислот в 100 г суховоздушной биомассы культуры ткани полисциас. Согласно полученным данным, культивируемые клетки
содержали значительное количество таких фенолкарбоновых кислот, как хлорогеновая,
кофейная, ванилиновая, п-оксикоричная, феруловая и салициловая.
Данные о влиянии различных концентраций прооксидантов ― перекиси водорода и феназина метасульфата (генератор супероксидных радикалов) на содержание
ряда фенолкарбоновых кислот представлены в табл. 1. Как видно из представленных
данных, низкие концентрации перекиси водорода снижали уровень СК почти вдвое.
Интересно, что при воздействии низких концентраций перекиси водорода наблюдали
падение содержания ванилиновой и коричной кислот практически до нуля. В то же
время данная концентрация перекиси водорода не вызывала изменения содержания
сиреневой кислоты в культивируемых клетках. Высокие концентрации экзогенной
перекиси водорода, наоборот, достоверно увеличивали содержание салициловой, сиреневой, ванилиновой и коричной кислот по сравнению с контрольными значениями
этого показателя.
Добавление в среду культивирования различных концентраций феназина метасульфата (генератор супероксидных радикалов) вызывало достоверное увеличение концентрации в растительных клетках СК (см. табл. 1). В то же время содержание сиреневой
и ванилиновой кислот в присутствии данного реагента резко падало, а в ряде случаев
понижалось практически до нуля. Интересно отметить, что под влиянием феназина метасульфата в культивируемых клетках содержание коричной кислоты возрастало, при этом
повышение ее содержания зависело от дозы добавленного реагента.
В последние годы появились данные, указывающие на то, что при заражении
патогенами содержание СК в клетках растений резко повышается. Полагают, что экзогенная СК увеличивает содержание перекиси водорода и таким образом повышает
146
Таблица 1
Оценка содержания основных фенолкарбоновых кислот в растительных клетках
на модели окислительного стресса
Концентрация
прооксиданта,
мкмоль/100 г сырой биомассы
Содержание ФК, мкмоль/100 г сырой биомассы
Салициловая
кислота
Сиреневая
кислота
Ванилиновая
кислота
Коричная кислота
Контроль
0
12,5
250
1250
5
10
20
25
30
40
1,739 ± 0,013
0,998 ± 0,005
p < 0,05
2,915±0,028
p < 0,05
3,732 ± 0,012
p < 0,05
2,114 ± 0,127
p < 0,05
3,793 ± 0,011
p < 0,05
4,638 ± 0,040
p < 0,05
4,907 ± 0,028
p < 0,05
6,380 ± 0,074
p < 0,05
3,258 ± 0,037
p < 0,05
0,139 ± 0,025
0,055 ± 0,001
Перекись водорода
0,140 ± 0,001
0
р>0,05
p < 0,05
0,354 ± 0,001
0,0110 ± 0,0002
p < 0,05
p < 0,05
0,100 ± 0,001
Не определяли
p < 0,05
Феназин метасульфат
0
Не определяли
p < 0,05
0
-//p < 0,05
0,052 ± 0,001
Не определяли
p < 0,05
0
Не определяли
p < 0,05
0,0110 ± 0,0001
Не определяли
p < 0,05
0,0320 ± 0,0004
Не определяли
p < 0,05
0,023 ± 0,001
0
p < 0,05
0
p < 0,05
0,135 ± 0,007
p < 0,05
0,061 ± 0,006
p < 0,05
0,051 ± 0,004
p < 0,05
0,085 ± 0,001
p < 0,05
Не определяли
0,129 ± 0,002
p < 0,05
0,115 ± 0,001
p < 0,05
устойчивость растительного организма к инфекции [16]. В наших исследованиях было
также установлено, что добавление экзогенной СК в среду культивирования приводит
к достоверному повышению концентрации перекиси водорода в культивируемых клетках
полисциас (табл. 2).
Согласно, имеющимся в литературе сведениям каталаза является эффективным
салицилатсвязывающим белком. Кроме того, считается, что СК действует на каталазу
ингибирующе. При этом в результате подавления активности каталазы происходит нарушение механизма основного расщепления перекиси водорода и приводит к ее накоплению
[15]. Накопление перекиси водорода в растительных клетках в свою очередь приводит,
не только к интоксикации патогенов, но и к целому комплексу важнейших ответных реакций
Таблица 2
Влияние экзогенного салицилата на содержание Н2О2 в растительных клетках
Индексы
Содержание
Н2О2, мкмоль/100 г
сырой биомассы
Концентрация салицилата, мкмоль/100 г сырой биомассы
0
0,025
0,100
0,125
0,175
61,5 ± 2,6
162,3 ± 7,3
p < 0,05
215,2 ± 5,97
p < 0,05
198,2 ± 9,27
р < 0,05
161,2 ± 3,7
р < 0,05
147
для развития иммунитета у растений. Например, к сверхчувствительности с последующей
некротизацией инфицированных клеток [8].
В связи с вышеизложенным в данной работе были проведены опыты по влиянию
экзогенной СК на активность каталазы в клетках культуры полисциас. В предварительных опытах in vitro было установлено, что добавление СК в водные вытяжки из клеток
культуры ткани полисциас вызывало дозозависимое ингибирование каталазы. Данные
об уровне каталитической активности каталазы в культивируемых клетках обработанных
СК представлены в табл. 3. Как видно из представленных результатов, низкие концентрации СК приводили к снижению активности каталазы (на 14 %), однако более высокие
ее концентрации не вызывали достоверных изменений уровня активности фермента.
Таблица 3
Влияние экзогенного салицилата на активность каталазы
Количество салицилата, мкмоль/100 г сырой биомассы
Индексы
Активность каталазы, мкмоль/мг
белка в мин
0
0,025
0,100
0,125
0,175
289,287 ± 3,01
241,428 ± 0,8
p < ,05
240,714 ± 0,62
p < 0,05
289,287 ± 0,45
p > 0,05
291,429 ± 4,7
p > 0,05
Возможно, именно этим можно объяснить противоречивые данные, полученные
некоторыми авторами о влиянии СК на каталитическую активность каталазы в растительных клетках [4, 15].
Известно, что снижение активности каталазы перекрывает основной канал расходования перекиси водорода и концентрация перекиси водорода и других активных форм
кислорода возрастает, что приводит к развитию окислительного стресса. И, как следствие,
ведет к поражению мембран клеток и накоплению продуктов перекисного окисления липидов [8, 15]. При этом уровень перекисного окисления липидов является не только способом,
характеризующим устойчивость растений к различным стресс-факторам, но и служит
тестом развития свободно-радикальных процессов в тканях растений [1].
Проведенное в данном исследовании определение маркера перекисного окисления
липидов, малонового альдегида выявило следующее: добавление в среду культивирования
низких концентраций СК достоверно повышало содержание малонового альдегида, а при
воздействии более высоких концентраций СК― практически не вызывало изменения его
содержания по сравнению с контрольными значениями (табл. 4).
Таблица 4
Влияние салициловой кислоты на содержание малонового альдегида
Индексы
Содержание малонового
альдегида, мкмоль/100 г
сырой биомассы
Концентрация салицилата, мкмоль/100 г сырой биомассы
0
0,025
0,1
0,125
0,175
358,50 ± 7,14
425,00 ± 7,14
p < 0,05
400,00 ± 5,12
p < 0,05
360,00 ± 6,2
p > 0,05
330,5 ± 27,5
p > 0,05
Полученные данные полностью коррелировали с данными о воздействии СК на активность каталазы в культивируемых растительных клетках.
Ранее рядом исследователей было установлено, что обработка СК приводит к изменению биосинтеза белка в растительных клетках, в их число входят некоторые ферменты,
148
включая протеазы и их ингибиторы [2, 3, 8]. В данной работе исследование влияния
экзогенной СК на содержание внутриклеточного белка показало, что увеличение ее концентрации в среде культивирования приводило к повышению содержания общего белка
в растительных клетках (рис. 1). В то же время обработка СК ткани полисциас вызывала
увеличение протеолитической активности в культивируемых клетках, что согласуется
с литературными данными. В частности, ранее было установлено, что СК и ее производные подавляют экспрессию генов ингибиторов протеиназ в тканях растений [3, 7]. Как
показали проведенные нами исследования, изменение протеолитической активности
в культивируемых клетках при воздействии СК не коррелировало с уровнем внутриклеточного белка (рис. 2).
Рис. 1. Влияние экзогенной салициловой кислоты на содержание белка
По оси ординат ― концентрация белка, мг / 1 г сырой биомассы, по оси абсцисс ― концентрация СК, мкмоль / 100 г
сырой биомассы.
Рис. 2. Влияние экзогенной салициловой кислоты на протеиназную активность
По оси ординат ― протеолитическая активность, % (за 100 % принята активность контроля), по оси абсцисс ― концентрация СК, мкмоль/100 г сырой биомассы.
149
Выводы. Таким образом, в данном исследовании было показано, что салициловая
кислота может не только регулировать процессы через соответствующие рецепторные
системы растительных клеток, но и непосредственно участвовать в регуляции работы
ряда ферментов, в частности каталазы.
Литература
1. Абилова Г. А. Перекисное окисление липидов как способ оценки устойчивости растений к экстремальным условиям // Материалы V съезда Общества физиологов растений России и Междунар. конф.
«Физиология растений ― основа фитобиотехнологии». Пенза, 2003. С. 240.
2. Андрианова Ю. Е., Ирза Л. В., Захарова О. Ю. Полипетидный состав белков колеоптилей ячменя
при действии салициловой и янтарной кислот на фоне низких положительных температур // Материалы
V съезда Общества физиологов растений России и Междунар. конф. «Физиология растений ― основа
фитобиотехнологии». Пенза, 2003. С. 242–243.
3. Валуев Т. А., Ревина Т. А., Гвоздева Е. Л., Герасимова Н. Г., Ильинская Л. И., Озерецковская О. Л. Влияние элиситоров на накопление ингибиторов протеиназ в пораженных клубнях картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37, № 5. С. 601–606.
4. Васюкова Н. И., Герасимова Н. Г., Озерецковская О. Л. Роль салициловой кислоты в болезнеустойчивости растений // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35, № 5. С. 557–563.
5. Герасимова Н. Г., Придворова С. М., Озерецковская О. Л. Участие L-фенилаланинаммиаклиазы
в индивидуальной устойчивости и восприимчивости картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, № 1. С. 17–120.
6. Комов В. П., Шмелев В. К. О некоторых особенностях кинетики ферментативных реакций
на примере каталазы // Биохимия. 1975. Т. 40. Вып. 40. С. 21–24.
7. Максютова Н. Н. Белковый обмен растений при стрессе: автореф. дис. … докт. биол. наук.
М., 1998. 38 с.
8. Молодченкова О. О., Адамовская В. Г., Левицкий Ю. А., Гонтаренко О. В., Соколов В. М. Ответная реакция растений кукурузы на действие салициловой кислоты и Fusarium moniliforme // Прикладная
биохимия и микробиология. 2002. Т. 38, № 4. С. 441–446.
9. Писецкая Н. Ф. К вопросу о подборе питальной среды для культуры ткани женьшеня // Растительные ресурсы. 1970. Т. 6. Вып. 4. С. 516–522.
10. Сахабутдинова А. Р., Фатхутдинова Д. Р., Шакирова Ф. М. Влияние салициловой кислоты
на активность антиоксидантных ферментов у пшеницы в условиях засоления // Прикладная биохимия
и микробиология. 2004. Т. 40, № 5. С. 579–583.
11. Тугушева Ф. А., Куликова А. И., Зубина И. М. Особенности перекисного окисления липидов
крови больных хроническим гломерулонефритом в стадии нарушения функции почек на фоне нефротического синдрома // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, № 2. С. 18–21.
12. Bellincampi D., Dipierro N., Salvi G., Gervone G., Lorenzo C. D. Extracellular H2O2 induced by
oligogalacturonides is not involved in the inhibition of the auxin-regulated rolB gene expression in tobacco leaf
explants // Plant Physiol. 2000. Vol. 122, N 4. P. 1379–1386.
13. Barret A. J., Kirschke H., Cathepsin H., Cathepsin L. Meth. Enzym.: Proteolytic enzymes / ed. by
L. Lorand. Vol. 80. New York, 1981. C. P. 535–561.
14. Bu-Yeo Kim, Min-Joon Han, An-Sic Chung. Effect of active oxygen species on proliferation of Chinese
hamster lung fibroblast (V79) cells // Free Radical Biology. 2001. Vol. 30, N 6. P. 686–697.
15. Chen Z., Silva H., Klessig D. Active Oxygen Species in the Induction of Plant Systemic Acquired
Resistance by Salicylic Acid // Sci. 1993. Vol. 262, N 10. Р. 1883–1886.
16. Kauss H., Jeblick W. Echaces Pretreatment of Parsley Suspension Cultures with Salicylic Acid
Spontaneous and Elicited Production of H2O2 // Plant Physiol. 1995. Vol. 108, N 3. P. 1171–1178.
17. Kang H. M., Salveit M. E. Chilling tolerance of maize, cucumber and rice seedling and roots are
differentially affected by salicylic acid // Physiol. Plant. 2002. Vol. 115, N 4. P. 571–576.
18. Lowry O. H., Rosenhrough J., Farr A., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol
reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, N 1. P. 268–275.
19. Minibayeva F. V., Gordon L. K., Kolesnikov O. P., Chasov A. V. Role of extracellular peroxidase in
the superoxide production by wheat roots cells // Protoplasma. 2001. Vol. 217, N 1–2. P. 125–128.
150
20. Muraсhige T., Skoog F. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. Vol. 15, N 5. P. 473–497.
21. Rock C. D. Pathways to abscisic acid-regulated gene expression // New Phytol. 2000. Vol. 148, N 3.
P. 357–396.
22. Raskin I. Role of Salicylic Acid in Plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. Vol. 13.
P. 439–463.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
98 Кб
Теги
кислоты, антиоксиданты, влияние, активности, салициловой, растительном, клетка, 10144, прооксидантную
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа