close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg. )

код для вставкиСкачать
ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2010. №2. С. 85–89.
УДК 543.854.74+547.917
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО
СОДЕРЖАНИЯ ПОЛИФРУКТАНОВ В КОРНЯХ ОДУВАНЧИКА
ЛЕКАРСТВЕННОГО (TARAXACUM OFFICINALE WIGG.)
©
Л.М. Танхаева, Д.Н. Оленников*
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6,
Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: oldaniil@rambler.ru
Исследован процесс экстракции полисахаридов корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg., сем.
Asteraceae) и найдены оптимальные параметры извлечения полифруктанов. Разработана методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в пересчете на фруктозу с относительной ошибкой не более 2%. Установлено, что
содержание полифруктанов в корнях T. officinale коммерческих образцов сырья составляет 15–33%.
Ключевые слова: корни одуванчика, Taraxacum officinale Wigg., фруктаны, спектрофотометрия, ВЭТСХ, резорциновый метод.
Сокращения: ВЭТСХ – высокоэффективная тонкослойная хроматография, СП – степень полимеризации, Frc –
фруктоза, Glc – глюкоза, Kes – 1-кестоза, M – молекулярная масса, Nys – нистоза, Sac – сахароза.
Введение
Одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg., сем. Asteraceae) – растение, включенное в большинство мировых фармакопей. Химический состав данного растительного вида разнообразен; в T. officinale
обнаружены углеводы, флавоноиды, фенольные кислоты, терпеновые соединения и др., комплекс которых
обусловливает его биологическую активность [1].
Фруктаны корней T. officinale являются предметом многочисленных научных исследований; к настоящему времени известно о присутствии низко- и высокомолекулярных производных 1-кесто-n-озы (n = 3–10) и
инуло-n-озы (n = 2–5) [2–6]. Фармакологические эксперименты показали, что суммарные полисахаридные
фракции корней T. officinale обладают сахароснижающим [7], диуретическим [8], бифидогенным [9] и противоопухолевым действием [10].
Качество сырья «Корни одуванчика» в России регламентируется фармакопеей, которая не предлагает методик
количественной оценки содержания полисахаридов (полифруктанов) [11], поэтому целью настоящей работы является определение оптимальных параметров экстракции полифруктанов из корней T. officinale, разработка методики количественного определения суммарного содержания полифруктанов и ее метрологический анализ.
Экспериментальные условия
Корни T. officinale приобретены через аптечную сеть (№1 – ООО «Здоровье», серия 010504; №2 – ООО
«Старт-фито», серия 391003; №3 – ООО «ЛекС+», серия 010804). В работе использованы стандартные образцы веществ: фруктоза, глюкоза, сахароза, инулин (Acros Organics), 1-кестоза, нистоза (Carbosynth Lim.);
остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а.
ВЭТСХ проводили на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер); спектроскопические исследования
– на спектрофотометре CE 2011 (Cecil) в кварцевых кюветах 10 мм. Оптическое вращение ([α]D) определяли на
поляриметре СМ-3 (Загорский оптико-механический завод), в кювете длиной 1 дм при 20 °С. ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum 100 (Perkin-Elmer) в пленке на пластинах КРС-5 в интервале 4000–450 см–1. Гель-хроматографию проводили на Сефадексе G-75 (Pharmacia) [12].
*
Автор, с которым следует вести переписку.
86
Л.М. ТАНХАЕВА, Д.Н. ОЛЕННИКОВ
Условия гидролиза, экстракции, ВЭТСХ и выделения водорастворимых полисахаридов корней T. officinale (ToPs) описаны ранее [13]. Из 50 г сырья получено 8,52 г ToPs.
Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях T. officinale в пересчете на фруктозу. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих
сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в
колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 95% спирта этилового, присоединяют обратный
холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл экстрагента.
К обработанному сырью приливают 100 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию сырья повторяют
еще 2 раза со 100 и 50 мл воды очищенной в течение 60 и 45 мин соответственно. Объем объединенного
фильтрата доводят водой очищенной до метки (раствор А).
1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины,
1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в
мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б определяют при длине волны 480 нм.
Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 9 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную
смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной.
Суммарное содержание полифруктанов (Х) в пересчете на фруктозу в % и абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле:
X 
mFrc
100
D  KV  K G


 100 ,
m
DFrc  K VFrc 100  W
где D – оптическая плотность исследуемого раствора; DFrc – оптическая плотность раствора стандартного образца фруктозы; m – масса сырья, г; mFrc – масса стандартного образца фруктозы, г; KV – коэффициент разбавления исследуемого раствора (50000); KVFrc – коэффициент разбавления раствора стандартного образца фруктозы (10000); KG – коэффициент гидролиза (0,91); W – потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора стандартного образца фруктозы. Около 0,080 г (точная навеска) фруктозы
переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной и доводят объем раствора
до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл,
приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового,
9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение
8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят
объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Регрессионный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum
Software Inc.), метрологический анализ и обработку результатов – согласно рекомендациям [14].
Результаты и их обсуждение
Суммарный комплекс полисахаридов корней T. officinale – ToPs (выход 17,04% от массы сырья), представляет собой неокрашенное аморфное вещество, хорошо растворимое в воде при нагревании, растворы
которого обладают оптической активностью {[α]D -43° (c 2.0, Н2О)}. ToPs содержит 87,94±2,19% углеводов;
после гидролиза обнаружены фруктоза и следы глюкозы, а спектр поглощения окрашенного комплекса ToPs
с резорцином совпадает с таковым инулина (рис. 1).
В ИК-спектре выявлены полосы поглощения, характерные для фруктанов типа инулина (ν: 1427, 1332,
1250, 1245, 1134, 1087, 1071, 1031, 915, 874, 852, 817 см–1). Гель-хроматография показала, что ToPs гетерогенен и содержит ряд полимеров с М 2,0–7,0 кДа (рис. 2). Полученные данные подтверждают результаты ранних исследований и позволяют отнести полисахариды корней T. officinale к фруктанам.
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ …
Рис. 1. Спектры поглощения комплексов с
резорцином ToPs (1) и инулина (2)
87
Рис. 2. Градуировочный график для колонки с Сефадексом
G-75 (2,5×80 см). ● – положения стандартных веществ
с М 0,3–13,5 кДа; Vo – объем выхода синего декстрана;
ToPs – диапазон М для комплекса водорастворимых
полисахаридов корней T. officinale
Фруктозосодержащие соединения также обнаружены в составе свободных углеводов корней T. officinale:
хроматографически (ВЭТСХ) выявлено присутствие фруктозы, сахарозы, 1-кестозы и нистозы, а также ряда
олигомеров с более высокой СП (рис. 3). Данный факт свидетельствует о невозможности прямого определения
полимерных фруктанов из водного извлечения без предварительной обработки сырья, способствующей удалению низкомолекулярных углеводов; также исключается использование спиртового осаждения полисахаридов
вследствие неудовлетворительных преципитационных характеристик фруктанов [15].
Поэтому в ходе разработки методики определения полисахаридов в корнях T. officinale на начальном
этапе необходимо было подобрать оптимальные условия для удаления моно- и олигосахаридов из сырья.
Для решения данной задачи были применены подходы, предложенные ранее для двух видов фруктансодержащего сырья – корневищ и корней девясила [16] и корней лопуха [13]. Установлено, что для более
полного удаления свободных углеводов необходимо проведение 3-кратной экстракции 95% спиртом этиловым при 100 °С в течение 60 мин каждая и соотношение сырье : экстрагент 1 : 100. Применение данных условий позволяет добиться 98% экстракции свободных углеводов из сырья (табл. 1, рис. 4).
Рис. 3. Денситограмма раствора стандартных
образцов углеводов (1) и спиртового извлечения
T. officinale (2). Детектор – мочевина – H3PO4
Рис. 4. Денситограммы спиртовых извлечений
T. officinale 1–4 экстракций. Детектор –
дифениламин – фталаниловая кислота – H3PO4
88
Л.М. ТАНХАЕВА, Д.Н. ОЛЕННИКОВ
Таблица 1. Концентрация моно- и олигосахаридов в извлечениях при последовательной экстракции 95%
спиртом этиловым, мкг/мл (% от общего содержания спирторастворимых углеводов в сырье)
Кратность экстракции
2
3
26 (3,01)
4,5 (0,52)
1 (0,12)
2,3 (0,27)
19 (2,20)
9 (1,04)
14 (1,62)
2,2 (0,26)
14 (1,62)
8 (0,93)
57 (6,60)
55 (6,37)
131 (15,17)
81 (9,38)
Вещество
1
Frc
194 (22,46)
Glc
4 (0,46)
Sac
118 (13,66)
Kes
82 (9,49)
Nys
60 (6,95)
СП ≥ 5
179 (20,72)
Σ*
637 (73,75)
* Суммарные показатели.
4
0,7 (0,08)
14 (1,62)
14,7 (1,70)
Σ*
224,5 (25,99)
7,3 (0,85)
146 (16,90)
98,2 (11,37)
82,7 (9,58)
305 (35,31)
863,7 (100)
Анализируя хроматографические данные, следует отметить, что скорость экстракции фруктозы и
1-кестозы наибольшая, а нистоза и более высокомолекулярные олигомеры могут присутствовать в извлечениях 4-й кратности. Общее содержание свободных углеводов в пересчете на фруктозу в корнях T. officinale
составляет 13,16–17,95% от массы сырья.
В таблицах 2 и 3 приведены результаты выбора оптимальных условий экстракции фруктанов из корней
T. officinale.
Определено, что оптимальными параметрами экстракции полифруктанов являются степень измельчения
сырья 0,5–1,0 мм, температура экстракции 100 °С, трехкратная экстракция длительностью 60 мин каждая
при соотношении сырье : экстрагент 1 : 100 (1 и 2 контакты фаз) и 1 : 50 (3 контакт фаз).
С применением метода «введено-найдено» выявлено, что относительная ошибка определения не превышает 2% и может быть положительной и отрицательной (табл. 4).
В ходе определения метрологических характеристик разработанной методики установлено, что относительная ошибка не превышает 2% (табл. 5).
Таблица 2. Влияние степени измельчения на степень экстракции спирто- и водорастворимых углеводов из
корней T. officinale
Содержание углеводов в пересчете на Frc, %
спирторастворимых
водорастворимых
9,87±0,24
32,11±0,80
9,44±0,20
32,81±0,83
9,42±0,25
32,39±0,84
7,67±0,18
33,62±0,81
6,11±0,13
35,69±0,96
4,26±0,10
34,76±0,83
4,04±0,10
30,12±0,75
Степень измельчения, мм
<0,5
0,5–1,0
1,0–2,0
2,0–3,0
3,0–5,0
5,0–7,0
>7,0
общее
41,98
42,25
41,81
41,29
41,80
39,02
34,16
Таблица 3. Влияние технологических параметров на степень экстракции полифруктанов из корней T. officinale
Исследуемый параметр
Суммарное содержание
полифруктанов в пересчете
на Frc, %
Температура
20
40
60
80
100
Время экстракции, мин
15
30
45
60
75
90
105
120
5,15±0,12
10,37±0,25
22,20±0,42
30,29±0,72
32,17±0,82
1 (±0,49–0,86)
19,73
31,24
33,28
34,47
33,78
33,02
33,01
32,84
Исследуемый параметр
Суммарное содержание
полифруктанов в пересчете
на Frc, %
Соотношение сырье : экстрагент
1 : 20
3,07±0,07
1 : 30
11,10±0,26
1 : 50
25,47±0,63
1 : 70
27,15±0,67
1 : 100
31,89±0,80
Кратность экстракции
2 (±0,17–0,21)
3 (±0,03–0,05)
4 (±0,01–0,02)
6,96
1,34
–
7,13
1,38
–
7,17
1,42
0,03
7,64
1,38
0,03
7,23
1,38
0,04
7,17
1,36
0,03
7,12
1,36
0,03
7,10
1,35
0,03
89
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ …
Таблица 4. Метод «введено-найдено»
Содержание полифруктанов в аликвоте, мкг Frc
Введено инулина, мкг Frc
3215
3215
3215
3215
800
1600
2400
3200
Должно быть полифруктанов, мкг
Frc
4015
4815
5615
6415
Ошибка
Найдено полифруктанов, мкг Frc
абc., мкг
отн., %
3997
4751
5692
6341
–18
–64
+77
+74
0,45
1,33
1,37
1,15
Таблица 5. Метрологические характеристики разработанной методики (n = 10, P = 0,95, tP,f = 2,26)
x, %
S2
Сырье*
1
15,27
9,96·10-2
2
33,05
5,67·10-1
3
33,42
6,32·10-1
* Производители указаны в экспериментальной части.
Sx
9,99·10-2
2,38·10-1
2,52·10-1
x, %
0,23
0,54
0,57
E, %
1,51
1,63
1,71
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная методика является правильной и воспроизводимой и может быть рекомендована в практике фармацевтического анализа для количественной
характеристики корней T. officinale.
Выводы
В ходе исследования официнального растительного сырья – корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) определены оптимальные параметры экстракции полисахаридов (полифруктанов).
Разработана методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов, основанная на
резорциновом методе определения кетоз, с величиной относительной ошибки не более 2%.
Список литературы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Schültz K., Carle R., Schieber A. Taraxacum – A review on its phytochemical and pharmacological profile // J. Ethnopharmacol. 2006. V. 107. Pp. 313–323.
Yanovsky E., Kingsbury R.M. New sources of inulin // J. Am. Chem. Soc. 1931. V. 53. Pp. 1597–1601.
Bacon J.S.D., Edelman J. The carbohydrates of the Jerusalem artichoke and other Compositae // Biochem. J. 1951.
V. 48. Pp. 114–126.
Rutherford P.P., Deacon A.C. The mode of action of dandelion root β-fructofuranosidases on inulin // Biochem. J.
1972. V. 129. Pp. 511–512.
Rutherford P.P., Deacon A.C. Seasonal variation of dandelion roots of fructosan composition // Ann. Bot. 1974. V. 38.
Pp. 251–260.
Ernst M., Chatterton N.J., Harrison P.A. Purification and characterization of a new fructan series from species of Asteraceae // New Phytol. 1996. V. 132. Pp. 63–66.
Akhtar M.S., Khan Q.M., Khalid T. Effect of Portulaca olearaceae (Kulfa) and Taraxacum officinale (Dhudhai) in
nornoglycaemic and alloxan-treated hyperglycaemic rabbits // J. Pak. Med. Assoc. 1985. V. 35. Pp. 207–210.
Taraxacum officinale. Monograph // Altern. Med. Rev. 1999. V. 4. Pp. 112–114.
Trojanová I., Rada V., Kokoška L., Vlková E. The bifidogenic effect of Taraxacum officinale root // Fitoterapia. 2004.
V. 75. Pp. 760–763.
Baba K., Abe S., Mizuno D. Antitumor activity of hot water extract of dandelion, Taraxacum officinale – Correlation
between antitumor activity and timing of administration // Yakkugaku Zasshi. 1981. V. 101. Pp. 538–543.
Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. С. 356–357.
Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Углеводы Lamiaceae. I. Пектиновые вещества и гемицеллюлозы Mentha x
piperita // Химия природных соединений. 2007. №5. С. 411–416.
Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях лопуха (Arctium spp.) // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 115–120.
Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М., 1994. 252 с.
Ku Y., Jansen O., Oles C.J., Lazar E.Z., Rader J.I. Precipitation of inulins and oligoglucosides by ethanol and other
solvents // Food Chem. 2003. V. 81. Pp. 125–132.
Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Чехирова Г.В., Петров Е.В. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корневищах и корнях девясила высокого (Inula helenium L.) // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 95–99.
Поступило в редакцию 13 ноября 2008 г.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа