close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Новый подход к определению подлинности комбинированных вакцин для профилактики дифтерии столбняка и коклюша.

код для вставкиСкачать
УДК 615.371.543.645
НОВЫЙ ПОДХОД К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОДЛИННОСТИ КОМБИНИРОВАННЫХ
ВАКЦИН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ДИФТЕРИИ, СТОЛБНЯКА И КОКЛЮША
А.М. Николаева, В.Н. Сперанская, О.Ю. Соснина, Е.А. Калашникова, Д.В. Грязнова, Е.В. Пушкарева
Филиал ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития России в г. Пермь “Пермское НПО “Биомед”
E;mail: a.m.nikolaeva@mail.ru
NEW APPROACH FOR DETERMINATION OF THE IDENTITY OF THE COMBINED
VACCINES FOR DIPHTHERIA, TETANUS AND PERTUSSIS PROPHYLAXIS
A.M. Nikolaeva, V.N. Speranskaya, O.Yu. Sosnina, E.A. Kalashnikova, D.V. Gryaznova, E.V. Pushkareva
“Biomed” – Perm Branch of the Federal State Unitary Company “Microgen” of the Ministry of Health and Social Development
of the Russian Federation
Разработаны оригинальные диагностические препараты на основе стафилококкового реагента, содержащего белок А, и аффинноочищенных антител для определения дифтерийного, столбнячного анатоксинов и коклюшных
антигенов в реакции коагглютинации. Реакция коагглютинации информативна, легко выполнима и может быть
70
А.М. Николаева и соавт.
НОВЫЙ ПОДХОД К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОДЛИННОСТИ...
рекомендована для включения в нормативно-техническую документацию на комбинированные вакцины, что
позволит гармонизировать методы контроля по показателю “Подлинность” с требованиями Европейской Фармакопеи.
Ключевые слова: комбинированные адсорбированные вакцины, реакция коагглютинации, стафилококковый
реагент, содержащий белок А, диагностикумы.
Special diagnostic preparations based on a staphylococcal reagent containing protein A, and affinity-purified antibodies
have been developed for the purpose of identifying pertussis antigens, tetanus and diphtheria toxoids in the coagglutination
test. The coagglutination reaction is informative and easy to perform; it can be recommended to be included into
specifications and technical documentation on combined vaccines, which makes it possible for the vaccine producer to
harmonize verification methods of acquiring identity index to meet the European Pharmacopoeia requirements.
Key words: combined adsorbed vaccines, coagglutination test, staphylococcal reagent containing protein A, diagnosticums.
Введение
В настоящее время в России для профилактики дифтерии, столбняка и коклюша используются как отечественные (АДС-М, АКДС), так и зарубежные препараты
(Инфанрикс, Пентаксим). Одним из главных показателей
качества вакцин являются подлинность и специфическая
активность. В нормативных документах на отечественные комбинированные вакцины показатели “Подлинность” и “Специфическая активность” трактуются однозначно и определяются по иммуногенной активности в
тестах “in vivo”. В Европейской Фармакопее для контроля “Подлинности” вакцинных препаратов рекомендуется использовать тесты “in vitro” [4]. Для обеспечения качества выпускаемых отечественных вакцинных препаратов необходимо совершенствование их стандартизации
и контроля на основе международных требований. В связи с этим разработка простых экспрессных методов контроля подлинности комбинированных вакцин является
актуальной.
Одним из экспрессных и легко выполнимых в лабораторной практике методов является реакция коагглютинации (РКОА). Первые работы по РКОА были выполнены G. Kronvall в начале 70-х гг. До настоящего времени
не ослабевает интерес к этому методу. По данным литературы, коагглютинационные препараты разработаны
для идентификации большой группы микроорганизмов
в том числе легионелл, кампилобактеров, хеликобактеров [2, 3].
Цель исследования: разработка тест-набора, включающего диагностикумы для выявления дифтерийного,
столбнячного анатоксинов и коклюшных антигенов в
реакции коагглютинации (РКОА), и оценка возможности его применения для контроля подлинности вакцин.
Материал и методы
При выполнении настоящей работы использовали
стафилококковый реагент, содержащий белок А [1]. Для
получения гипериммунных сывороток кроликов иммунизировали дифтерийным анатоксином (ОКДА), столбнячным анатоксином (ОКСА), коклюшной суспензией
(КС). Определение специфической активности сывороток проводили в реакции непрямой гемагглютинации
(РНГА) с помощью эритроцитарных антигенных диагностикумов соответствующей специфичности, которые готовили глютаральдегидным методом.
Для выделения антител применяли антигенные сор-
бенты на основе цианбромированной сефарозы и геля
гидроксида алюминия. Полученные антительные препараты изучали методом гельхроматографии на сефадексе
G-200. Экспериментальные серии диагностикумов на основе стафилококкового реагента, содержащего белок А,
получали с использованием кроличьих аффиноочищенных антител соответствующей специфичности. Приготовленные диагностикумы применяли для оценки полноты сорбции и антигенной активности адсорбированных препаратов. В качестве контрольных образцов использовали очищенные концентрированные столбнячный и дифтерийный анатоксины, коклюшную суспензию,
АКДС-вакцину, отконтролированную по показателю специфической активности в тесте “in vivo”. Реакцию коагглютинации (РКОА) выполняли на стекле. Приготовленные разведения исследуемого материала переносили на
стекло по одной капле (10 мкл). Затем к этим разведениям добавляли соответствующий диагностикум в равном
объеме и перемешивали, осторожно покачивая стекло в
руках. Результаты РКОА учитывали в пределах 5–10 мин
визуально по образованию агглютинатов. Каждое исследование сопровождалось постановкой контроля на специфичность реакции.
Содержание компонентов в вакцинах определяли в
сравнении с контрольными образцами. Расчет содержания антигенов в препаратах проводили по следующей
формуле: Y = X x Z, где: Y – содержание определяемого
компонента; X – обратная величина последнего разведения исследуемого материала, в котором наблюдалась положительная реакция; Z – показатель чувствительности
диагностикума.
Результаты и обсуждение
Для приготовления коагглютинационных диагностикумов важным моментом является получение и подбор
иммунных сывороток, активно взаимодействующих с
белком А. Основное требование к таким сывороткам –
высокая специфическая активность, обеспеченная преимущественно иммуноглобулином класса G. Известно,
что высоким сродством к белку А обладают иммуноглобулины кроликов. В этой связи для получения гипериммунных сывороток были апробированы различные схемы иммунизации кроликов на модели дифтерийного
очищенного анатоксина. Применяли цикловую иммунизацию с предварительным грундированием, а также использовали адъюванты (полный или неполный адъювант
Фрейнда, гель гидроксида алюминия). Наши данные ох-
71
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 2, Выпуск 2
ватывают наблюдения более чем на 100 животных. Испытаны различные схемы иммунизации (табл. 1).
Лучшие показатели продукции антител были у кроликов, иммунизированных по схемам 1 и 3, причем в ряде
групп отмечалась положительная сероконверсия у 100%
животных. При иммунизации по схеме 1 после второго
цикла средняя геометрическая титра антител у 40% животных составляла 1:135353,26. При этом высокие титры
оставались в течение длительного времени на стабильном уровне, что позволяло использовать этих животных
в качестве продуцентов гипериммунных сывороток. Отдаленная реиммунизация, как правило, давала выраженный “бустер”-эффект, но дозы анатоксина при каждой
инъекции необходимо было подбирать в зависимости от
индивидуальной реактивности кроликов. Высокие титры
были получены при иммунизации кроликов по схеме 3.
Однако на последующих циклах при введении как малых,
так и больших доз анатоксина титры антител у животных стабилизировать не удавалось. У этих животных отмечался и слабый “бустер”-эффект. После окончания
иммунизации средняя геометрическая титра антител составляла 1:25600. Достоинство этой схемы заключалось
в относительно быстром нарастании титров, хотя срок
полезной эксплуатации животных этой группы был небольшим. В последующих опытах для получения противостолбнячных и противококлюшных сывороток, предназначенных для приготовления коагглютинационных
диагностикумов, брали за основу схемы 1 и 3. С помощью иммуноферментного анализа было установлено, что
выбранные схемы иммунизации обеспечивают получение гипериммунных сывороток с высоким титром специфических антител.
Последующий анализ сывороток проводили на основании оценки их истощения белком А и изучения класспринадлежности антител при фракционировании на сефадексе G-200. При заключительном отборе сывороток
использовали реакцию флокуляции. Высокоактивные
сыворотки имели максимальные титры по флокуляции
50–100 МЕ/мл, среднетитровые – 10–40 МЕ/мл. В сыворотках после реиммунизации титр антител класса IgG
превышал титр IgM-антител в 8–16 раз, а их удельная активность была выше в среднем в 5 раз. Титры антител в
гипериммунных кроличьих сыворотках снижались не
менее чем в 32 раза уже после однократной адсорбции
их стафилококковой суспензией. Десорбированные антитела при электрофорезе в полиакриламидном геле
(ПААГ) были гомогенными и соответствовали иммуноглобулину класса G. Анализируя механизм РКОА, мы пришли к выводу, что рутинная методика получения коагглютинационных диагностикумов с использованием нативных сывороток не обеспечивает полного выявления высоких потенциальных возможностей этой реакции, чувствительность которой может приближаться к ИФА и РИА.
В гипериммунной сыворотке антитела заданной специфичности составляют около 20% от общего количества
иммуноглобулинов, соответственно и на поверхности
клеток стафилококка они могут фиксироваться в эквивалентной дозе. Следовательно, информативность теста
может быть повышена при создании стафилококкового
реагента с узконаправленной специфичностью за счет
иммобилизации на клетках иммуноглобулинов только
одной (заданной) специфичности. Практически это было
возможно осуществить путем сенсибилизации стафилококка не нативной сывороткой, а очищенными антителами.
В этой связи нами были выполнены эксперименты по
выделению высокоочищенных специфических иммуноглобулинов с помощью иммуносорбции из противодифтерийной, противостолбнячной и противоколюшной
кроличьих сывороток. В работе были испытаны два вида
иммуносорбентов: на основе геля гидроксида алюминия
и на основе цианбромированной сефарозы 4В. В сравнительных экспериментах иммуносорбент на основе геля
гидроксида алюминия, на котором антиген фиксирован
за счет сорбционных связей, оказался менее пригодным
для выделения антител, особенно из относительно низ-
Таблица 1
Схемы иммунизации кроликов
№ п/п
Схема иммунизации
1
Адъювант: гель гидроксида алюминия
Грундирование: 30 ЛФ – 100 ЛФ анатоксина в/м.
I цикл иммунизации (через 3–4 недели): до 6 инъекций
(подкожно) нарастающих доз анатоксина (10, 20, 30, 40, 50, 60 ЛФ), с интервалом в З–5 дней.
II–IV цикл иммунизации (через 2 недели): по 2–4 инъекции (подкожно) в дозах анатоксина
20–50 ЛФ.
Адъювант: Полный адъювант Фрейнда (ПАФ).
I иммунизация: 3 инъекции (1–2 в /м, 3 – в/бр) в дозе анатоксина 75 ЛФ.
II иммунизация (через 3–4 недели): 1 инъекция (в/м) в дозе анатоксина 150 ЛФ.
I иммунизация: 2 инъекции (в/м) в дозе 40 ЛФ анатоксина с ПАФ и гелем гидроксида алюминия.
II иммунизация (через 4 недели): 2 инъекции (в/м) в дозе анатоксина 400 ЛФ с гелем гидроксида
алюминия.
Адъювант: ПАФ
Грундирование: ПАФ в подушечку лапки.
I иммунизация (через 2–3 недели): 3 инъекций одновременно (в/м, в/бр., в подушечку лапки)
в дозе анатоксина 50 ЛФ с ПАФ.
II иммунизация (через 3 недели): 1 инъекция (в/м) в дозе анатоксина 80 ЛФ с ПАФ; 2 инъекция
20 ЛФ анатоксина (в/в).
2
3
4
Примечание: * – величина, обратная разведению сыворотки.
72
Результаты титрования сывороток (РНГА)*
135353,26
[104631,52–175095,48]
9050,97
[6971,91–11751,2]
25600
[15186,7–43153,5]
12800
[8541,81–19180,9]
А.М. Николаева и соавт.
НОВЫЙ ПОДХОД К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОДЛИННОСТИ...
котитровых сывороток. В дальнейших опытах использо- ты сорбции антигенов на геле гидроксида алюминия. Мы
вался иммуносорбент на основе цианбромированной имеем основание утверждать, что в этом случае ни один
сефарозы. Проведенными экспериментами была обосно- другой метод не может дать такой всесторонней количевана оптимальная схема иммуноаффинного выделения ственной и качественной информации так же быстро,
антител из противодифтерийных кроличьих сывороток. четко и оперативно, как РКОА.
Далее она была распространена (с некоторыми коррекДалее мы показали возможность использования РКОА
тивами) и на получение чистых антител из противостол- для анализа готовых адсорбированных препаратов по
бнячных и противококлюшных кроличьих сывороток. показателю подлинности. В эксперименте были исслеАнализ с помощью гельхроматографии на супердексе дованы как отечественные вакцинные препараты, так и
G-200 подтвердил высокую степень очистки и монофрак- зарубежные (Инфанрикс, Пентаксим), а также экспериционность выделенных антител.
ментальные серии, разрабатываемого нами комбинироВ дальнейших исследованиях была проведена отра- ванного препарата с бесклеточным коклюшным компоботка условий приготовления специфических коагглю- нентом (АаКДС). Всего изучено более 50 серий адсорбитинационных препаратов, а также их оценка и стандар- рованных препаратов. В этих опытах в качестве контротизация. При получении активного специфического ди- ля ставили реакцию с суспензией несенсибилизированагностикума на основе дифтерийных, столбнячных, кок- ного стафилококка. Реакция была отрицательной, т.е. не
люшных антител было установлено, что в зависимости отмечалось неспецифических взаимодействий за счет
от удельной активности их оптимальная концентрация самого стафилококка и геля гидроксида алюминия. Иссоставляла 0,5–1,2 мг по белку на 1 мл 10% суспензии. пользование РКОА как полуколичественного метода для
Важно отметить, что установленные оптимальные кон- анализа комбинированных вакцин позволило ориентицентрации антител обеспечивали достаточно полное ровочно определять активность компонентов в составе
насыщение рецепторного аппарата клеток стафилокок- препаратов. При определении подлинности адсорбирока при однократном истощении раствора антител, бла- ванной вакцины достаточно выбрать ее рабочее развегодаря чему ограничивались потери высокоочищенного дение, дающее четко выраженную положительную реакантитоксина при получении диагносттикумов – специ- цию с гомологичным диагностикумом. Достоверность
фически направленных стафилококковых реагентов. результатов РКОА должна подтверждаться отрицательныПолученные диагностикумы обладали гомогенностью и ми контролями: на специфичность (диагностикум с гене давали спонтанной агглютинации. При взаимодей- терологичным адсорбированным препаратом) и спонствии с гомологичными антигенами в реакции коагглю- танную агглютинацию (диагностикум с фосфатным бутинации наблюдалось быстрое формирование агглюти- ферным раствором). По результатам оценки адсорбиронатов. Для контроля специфичности диагностикумов ис- ванных препаратов в РКОА было показано, что антигенпользовали контрольные положительные образцы диф- ная активность дифтерийного, столбнячного и коклюштерийного и столбнячного анатоксинов (несорбирован- ных компонентов в исследованных комбинированных
ных) в рабочем разведении 1 Lf/мл и 1 ЕС/мл, коклюш- препаратах (АКДС, АКДС-геп В) была равнозначной вакную суспензию в концентрации 30 МОЕ. Диагностикумы цинам Инфанрикс, Пентаксим и АаКДС. Отличия по аквыявляли искомые антигены и не давали перекрестных тивности препаратов АД-М и АКДС, АКДС-ГепВ; АС и
реакций с гетерологичными антигенами, что свидетель- АДС-М, выявленные в РКОА, соответствовали различноствовало о специфичности метода. При определении чув- му содержанию компонентов в изученных препаратах
ствительности РКОА показано, что минимально выявля- (табл. 2).
емая концентрация для дифтерийного анатоксина составРеакция коагглютинации оказалась весьма удобной
ляла 0,052 Lf/мл, для столбнячного анатоксина – для проверки полноты сорбции и подлинности сорби0,052 ЕС/мл, коклюшного компонента – 0,32 МОЕ.
рованных препаратов. С одной стороны, – это экстренНа следующем этапе работы в реакции
коагглютинации с разработанными диагностикумами нами были исследованы Таблица 2
моно- и комбинированные препараты по Оценка комбинированных вакцин по показателю “Подлинность”
показателю полноты сорбции. Чувствитель- в реакции коагглютинации
ность РКОА гарантировала выявление неКол;во серий
Дифтерийный
Столбнячный
Коклюшный
адсорбированных анатоксинов, содержа- Наименование
компонент,
компонент,
компонент,
ние которых по нормативной документа- препарата
Lf/мл
ЕС/мл
УЕ/мл**
ции (ФСП) должно быть для дифтерийно11
9,67±0,15
9,63±0,12
–
го – не более 1 Lf и для столбнячного – не АДС;М
АКДС
15
29,97±0,33
9,68±0,16
19,73±0,39
более 0,1 ЕС в 1 мл надосадочной жидко- АКДС;ГепВ
11
29,93±0,38
9,67±0,15
19,78±0,37
сти. С помощью РКОА была подтверждена АД;М
5
9,68±0,17
–
–
полнота сорбции антигенов непосред- АС
5
–
19,52±0,44
–
10
–
–
59,53±0,66
ственно в процессе производства при по- КС
10
29,99±0,49
9,63±0,09
19,84±0,32
лучении 40 серий сорбированных вакцин АаКДС*
Инфанрикс*
5
29,77±0,55
9,68±0,15
19,64±0,49
(АКДС-Геп В, АДС-Геп В, АДС-М, АС, АД-М). Пентаксим*
5
29,80±0,56
9,83±0,21
19,52±0,44
Данная реакция оказалась достаточно инПримечание: * – вакцины с бесклеточным коклюшным компонентом; ** – условные коагглюти;
формативным методом при оценке полно- национные единицы.
73
Сибирский медицинский журнал, 2011, Том 26, № 2, Выпуск 2
ная, практически моментальная регистрация полноты
сорбции (или возможности десорбции) анатоксинов –
одного из важнейших критериев качества моно- и комбинированных препаратов. Здесь РКОА может стать основным методом контроля, исключив трудоемкий и инертный в данном случае биологический тест. С другой стороны, нами впервые показана возможность оценки антигенной активности непосредственно сорбированного
препарата. По-видимому, эта уникальная возможность
РКОА обеспечивается тем, что иммобилизат антител на
стафилококке по своим размерным характеристикам
хорошо может сочетаться в “иммунологической сети” с
иммобилизатом антигена на геле гидроксида алюминия.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали перспективность использования РКОА для
контроля адсорбированых вакцин по показателю полноты сорбции и подлинности. Особо следует подчеркнуть
возможность применения этой реакции для контроля
вакцин без предварительной десорбции компонентов, что
в значительной степени сокращает сроки проведения
анализа. В то же время для оценки подлинности комбинированных вакцин методы, рекомендованные Европейской Фармакопеей, предусматривают предварительную
десорбцию компонентов [4, 5]. При этом следует отметить, что последующие после десорбции преципитационные методы (радиальная иммунодифузия, встречный
иммуноэлектрофорез, двойная иммунодиффузия), используемые для оценки подлинности, требуют значительного времени как на подготовительные работы, так и на
осуществление самого анализа (табл. 3).
Заключение
В заключение следует отметить, что реакция коагглютинации информативна, легко выполнима и может быть
рекомендована для включения в нормативно-техническую документацию на вакцинные препараты, что позволит гармонизировать методы контроля по показателю
Таблица 3
Продолжительность методов анализа для оценки
подлинности адсорбированных вакцинных препаратов
Тесты, используемые для оценки
подлинности
Продолжительность анализа с учетом
десорбции компонентов вакцин
Биопроба (ФСП, Россия)
Преципитационные методы
(Европейская Фармакопея)
Предлагаемая реакция коагглюти;
нации
28–37 дней
36–48 ч
5–10 мин
“Подлинность” с требованиями Европейской Фармакопеи. Кроме того, разработанный тест-набор может быть
использован для контроля подлинности зарубежных адсорбированных вакцин, поступающих на отечественный
рынок.
Литература
1. Грязнова Д.В., Сперанская В.Н., Курочкина О.М. К разработке технологии получения стафилококкового бактериально-клеточного реагента // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов:
материалы конференции / под ред. А.В. Катлинского. –
Пермь, 2008. – С. 59–61.
2. Карбышев Г.Л. Совершенствование серологической диагностики легионеллеза : автореф. дис. … докт. мед. наук. – Ростов н/Д, 2007. – 38 с.
3. Пагнуева Л.Ю. Сперанская В.Н., Авдеева Н.С. и др. Реакция
коагглютинации и иммуноферментный анализ в комплексной диагностики кампилобактериоза // Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических
препаратов: материалы конференции / под ред. А.В. Катлинского. – Пермь, 2008. – С. 65–66.
4. Diphtheria and Tetanus vaccine (adsorbed). European
Pharmacopeia, 6th Edition, 2007. – P. 763–764.
5. Pertussis vaccine (acellular, co-purified, adsorbed). European
Pharmacopeia, 6th Edition, 2007. – P. 822–824.
Поступила 06.04.2011
74
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
8
Размер файла
127 Кб
Теги
вакцин, подход, определение, подлинности, столбняка, профилактика, новый, комбинированного, коклюш, дифтерия
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа