close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Характеристика и ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток пуповинной крови.

код для вставкиСкачать
Обзоры
21
Характеристика и ex vivo экспансия
гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток
пуповинной крови
А.И. Уфимцева, Е.В. Канов
ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург
Characterization and ex vivo expansion umbilical cord bloodhematopoietic stem and progenitor cells
Ufimtceva A.I., Kanov E.V.
«Trans-Technologies Ltd», Saint-Petersburg
Пуповинная кровь, как один из альтернативных источников гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, в
настоящее время активно применяется в клинической практике. В связи с этим необходимо четко охарактеризовать
содержащуюся в ней популяцию гемопоэтических предшественников и обнаружить среди них клетки с наибольшей
способностью к восстановлению кроветворения. Кроме
того, абсолютное количество гемопоэтических стволовых и
кроветворных клеток в пуповинной крови невелико, что заставляет искать способы их наращивания ex vivo. В настоящее время разработан ряд методов определения характеристик прогениторных клеток пуповинной крови in vitro и in
vivo и их экспансии ex vivo. В данном обзоре рассмотрены
эти методы, а также проблемы их адаптации для практики
клинической трансплантологии.
Umbilical cord blood as an alternative source of
hematopoietic stem and progenitor cells is widely used
in clinical practice. Thereby it is necessary to characterize
hematopoietic progenitors and to define among them
the most «primitive» cells with the greatest repopulating
potential. In addition absolute number of hematopoietic stem
and progenitor cells is limited, so it is important to find ways
of increasing their ex vivo. Currently several methods of in
vitro and in vivo characterize hematopoietic progenitors and
of ex vivo expansion of these cells have been developed. In this
review we describe this methods, as well as problems with
their translation to the clinical transplantation.
Ключевые слова: гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки, пуповинная кровь, методы характеризации, ex vivo экспансия.
Key words: hematopoietic stem and progenitor cells,
umbilical cord blood, methods of characterization, ex vivo
expansion.
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) – недифференцированные клетки, которые являются
предшественницами всех форменных элементов крови и поддерживают кроветворение в костном мозге
(КМ) на протяжении жизни организма. Известна их
способность восстанавливать гемопоэз летально облученного реципиента при трансплантации [1, 2]. Однако популяция ГСК неоднородна и содержит разные
по степени «зрелости» и биологическим свойствам
клетки. Наиболее примитивными из них являются
длительно репопулирующие костный мозг ГСК (т.н.
long-term repopulating hematopoietic stem cells –
LT-HSC). Также к ГСК относят и более «зрелые»
клетки – кратковременно репопулирующие костный
мозг ГСК (т.н. short-term repopulating hematopoietic
stem cells) и мультипотентные прогениторные ГСК
(т.н. multipotent progenitor hematopoietic stem cells)
[3]. В связи с этим, на наш взгляд, более корректным
названием этой неоднородной популяции является
термин «гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки» (ГСК/ГПК). По мере дифференцировки
мультипотентные прогениторные ГСК становятся либо
общими лимфоидными предшественниками, из которых образуются Т и В лимфоциты и NK клетки, либо
общими миелоидными предшественниками, которые,
проходя промежуточные стадии, дают начало эритроцитарному, гранулоцитарному, моноцитарному и
мегакариоцитарному росткам кроветворения [4].
годаря которому осуществляется поддержание пула
ГСК/ГПК во взрослом организме [5]. Способность к
самообновлению наиболее выражена у самых примитивных гемопоэтических клеток (LT-HSC) и уменьшается по мере дифференцировки [3].
Самообновление – один из вариантов судьбы
ГСК/ГПК, помимо этого возможна дифференцировка
с образованием коммитированных предшественников и, в дальнейшем, зрелых клеток крови, или
гибель клетки путем апоптоза [5, 6]. Вероятность
выбора каждого из вариантов не строго предопределена, а зависит от влияния множества внутриклеточных и внешних факторов [5]. За последние годы
открыта роль ряда транскрипционных факторов во
внутренней регуляции «поведения» ГСК/ГПК: например, в эмбриональном периоде это SCL, LMO2,
GATA2, AML1, MYB; в гемопоэзе взрослого организма принимают участие HOX (в частности, HOXB4),
Bmi1, Meis1, TEL, Gfi-1, MOZ и другие [3, 7, 8].
Также показано, что для выбора варианта развития
ГСК/ГПК имеют значение эпигенетическая регуляция
(например, модификация гистоновых белков с помощью ингибиторов деацетилаз), регуляция клеточного
цикла (с помощью ингибиторов циклинзависимых
киназ) и посттранскрипционная модификация белков
для выбора варианта развития ГСК/ГПК [4]. Кроме
того, большое количество экспериментальных данных свидетельствует о том, что в выборе судьбы
гемопоэтических предшественников важную роль
играет микроокружение [9]. Во взрослом организме
ГСК/ГПК находятся в костном мозге, где негемопоэтические клетки и внеклеточный матрикс образуют для
них так называемую нишу. Выделяют эндостальную
Свойства ГСК/ГПК
Для ГСК/ГПК, как и для всех стволовых клеток,
характерна способность к самообновлению, т.е. делению с образованием своих идентичных копий, блаe-mail: aufimtceva@alkorbio.ru
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
22
Обзоры
нишу, образованную остеобластами, и сосудистую
нишу, главную роль в которой играет эндотелий синусоидных капилляров [10, 11]. Внешняя регуляция дифференцировки и самообновления ГСК/ГПК
осуществляется с помощью продуцируемых микроокружением биологически активных веществ [10] и
непосредственных межклеточных взаимодействий
[11]. Сегодня известно несколько сигнальных путей,
задействованных в гемопоэзе, наиболее изученными из них являются пути, связанные с факторами
Hedgehog, Wnt, Notch, FGF, BMP и Tie2-Angiopoietin1
[8, 10, 12–15]. В настоящее время тщательно изучаются молекулярные механизмы выбора клеткой
одного из путей развития для фармакологического
воздействия на них in vitro и in vivo.
Другим присущим ГСК/ГПК свойством является
их способность при внутривенном введении перемещаться в костномозговую нишу и восстанавливать кроветворение реципиента, т.е. способность к
хомингу. На поверхности гемопоэтических предшественников обнаружен трансмембранный рецептор
CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4, CD184)
[16], в то время как клетки стромы КМ экспрессируют его специфический лиганд – SDF-1 (stromal
cell-derived factor 1, также называемый CXCL12)
[17]. Ось SDF-1/CXCR4 играет ключевую роль в миграции ГСК/ГПК во взрослом организме [16]. Кроме
того, в процессе хоминга задействованы интегрины
VLA-4, VLA-5, LFA-1 и их лиганды VCAM-1 и ICAM-1
[18], а также рецептор СD44, который связывается
с гиалуроновой кислотой [19]. Также гемопоэтические предшественники экспрессируют фермент дипептидил-пептидазу-4 (CD26), который расщепляет
молекулу SDF-1, осуществляя негативную регуляцию
хоминга [20]. На способности ГСК/ГПК к самообновлению и хомингу основано применение этих клеток в
клинической практике.
Характеристика ГСК/ГПК
Важной задачей современных исследований является характеристика гемопоэтических предшественников, которая необходима для понимания состава и биологических свойств ГСК/ГПК, а также для
выделения примитивных субпопуляций с наибольшим пролиферативным и дифференцировочным
потенциалом. Кроме того, четкая характеристика
этих клеток важна при трансплантации для расчета
клеточной дозы. На настоящий момент охарактеризовать ГСК/ГПК можно с помощью ряда in vitro и in
vivo методов.
Одним из самых распространенных методов является фенотипирование гемопоэтических предшественников по поверхностным маркерам. Традиционно маркером человеческих ГСК/ГПК считается
CD34 [21], также эти клетки «слабо» экспрессируют
общий лейкоцитарный маркер CD45 (CD45dim). На
основе использования этих двух маркеров разработан протокол фенотипирования ГСК с помощью
проточной цитометрии ISHAGE (International Society
of Hematotherapy and Graft Engineering) для оценки
количества CD34+ клеток [22]. Гемопоэтические
предшественники также экспрессируют CD90 (Thy1)
[23] и CD133 [24] и являются негативными по
CD38 [25] и ряду маркеров, характерных для зрелых клеток крови – линейных маркеров (Lin–). Особого внимания заслуживают ГСК/ГПК, не несущие
CD34, но обладающие свойством гемопоэтических
предшественников восстанавливать кроветворение
[26, 27]. Сравнение CD34+ и CD34– клеток показало, что последние намного менее клоногенны in
vitro [28], и, кроме того, при внутривенной трансплантации CD34–/Lin– клетки практически не приводят к репопуляции КМ реципиента [29], что связано
с низким уровнем экспрессии CXCR4 и ограниченной
способностью к хомингу [30]. Однако данные клетки
способны обеспечивать длительное восстановление
всех ростков гемопоэза при внутрикостном введении
[29, 31], а также давать начало CD34+ клеткам in
vitro и in vivo [32]. Таким образом, считается, что
CD34–/Lin– ГСК/ГПК являются примитивными гемопоэтическими предшественниками с высоким пролиферативным потенциалом. В последнее время
ведется активный поиск новых позитивных маркеров
ГСК/ГПК. В экспериментах на примитивных гемопоэтических предшественниках, полученных из КМ
мышей, выявлены такие поверхностные молекулы,
как CD105 (эндоглин) [33], CD201 (рецептор эндотелиального протеина С) [34] и CD150 (рецептор
SLAM семейства) [35]. Однако для обнаружения
аналогичных маркеров на человеческих ГСК/ГПК и
определения их функций требуются дальнейшие исследования.
Помимо фенотипирования ГСК/ГПК путем определения на них поверхностных молекул, для характеристики этих клеток некоторые исследователи
применяют так называемые функциональные тесты.
Одним из таких тестов является определение способности клеток активно «выкачивать» из своей внутренней среды флюоресцентные красители, такие
как Hoechst-33342 и Rhodamine-123, с помощью
мембранных транспортеров семейства ABCG2 [36].
Клетки, способные к выраженному выведению красителя, и, как следствие, демонстрирующие низкую
интенсивность флюоресценции при исследовании
методом проточной цитометрии (Holow, Rholow), называют SP-клетками (от англ. «side-population») [36,
37]. Важно, что эта популяция содержит значительное количество LT-HSC, которые обладают высоким
пролиферативным потенциалом in vitro и in vivo [38,
39] и находятся в G0 фазе клеточного цикла [40,
41]. Ещё одним функциональным тестом является
определение активности внутриклеточной альдегиддегидрогеназы (ALDH) с использованием синтетического субстрата BODIPY®-аминоацетальдегида,
способного к флюоресценции после взаимодействия
с этим ферментом. Клетки с высокой активностью
ALDH обладают свойствами ранних гемопоэтических
предшественников [42, 43]. Кроме того, активность
этого фермента коррелирует с колониеобразующей
активностью in vitro и с приживлением при клинической трансплантации в большей степени, чем экспрессия CD34 [44, 45]. Таким образом, оценка способности клетки к «выкачиванию» флюоресцентных
красителей и определение активности альдегиддегидрогеназы позволяют охарактеризовать наиболее
примитивную субпопуляцию ГСК/ГПК, обогащенную
LT-HSC.
Кроме определения поверхностных маркеров и
постановки функциональных тестов для характеристики ГСК/ГПК существует также ряд культуральных
методов. Критериями оценки гемопоэтических предшественников являются их способность к пролиферации и дифференцировке. Наиболее широко применяется методика с использованием полутвердых
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
23
Обзоры
сред на основе метилцеллюлозы – исследование колониеобразования (colony-forming cells assay) [46].
Оценка осуществляется путем идентификации и подсчёта колоний с учетом их морфологии и времени
появления. Этот метод характеристики ГСК/ГПК является обязательным для банков пуповинной крови
[47]. Однако культуральные методы не позволяют
судить о способности ГСК/ГПК к репопуляции КМ
[15].
Более полную информацию о субпопуляциях ГСК/
ГПК дают результаты исследований in vivo, при которых оценивается способность гемопоэтических предшественников заселять КМ облученного организма (marrow repopulating ability, MRA). Критериями
оценки ГСК/ГПК являются длительность восстановления гемопоэза и его мультилинейность. Наиболее распространенная на настоящий момент методика – определение концентрации человеческих клеток, способных к заселению КМ NOD/SCID мышей
(SCID-repopulating cells, SRC), методом предельных
разведений [48–50]. Для этого кратные количества
ГСК/ГПК вводят летально облученным животным и
через 5–8 нед. после трансплантации определяют
процент человеческих CD45+ клеток или специфической ДНК в КМ реципиента. Но и по результатам этих исследований на лабораторных животных
можно лишь косвенно судить о процессах восстановления гемопоэза у человека при трансплантации
ГСК/ГПК.
Таким образом, характеристика гемопоэтических
предшественников с помощью in vitro и in vivo методов чрезвычайно важна для изучения и применения
этих клеток. Однако полную и достоверную информацию о поведении ГСК/ГПК в организме человека
дают только результаты клинических исследований.
Использование ГСК/ГПК в клинике
Благодаря открытию способности ГСК/ГПК восстанавливать кроветворение летально облученного
реципиента при трансплантации стало возможным
лечение состояний, связанных с подавлением собственного гемопоэза. Традиционным источником
ГСК/ГПК является костный мозг, также гемопоэтические предшественники можно получить из пуповинной крови (ПК) и из крови взрослого человека
после мобилизации. Однако ПК как источник ГСК/
ГПК имеет ряд преимуществ: 1) ГСК/ГПК из ПК обладают большим пролиферативным потенциалом
по сравнению с ГСК/ГПК из КМ [14, 51], что, вероятно, связано с большей длиной теломер [52]; 2)
Т лимфоциты ПК функционально незрелые, что снижает вероятность и тяжесть реакции «трансплантат
против хозяина» (РТПХ) [53]; 3) подбор и получение необходимого для трансплантации образца происходит гораздо быстрее, чем подбор донора КМ;
4) при неродственной трансплантации менее строгие
требования к совместимости по HLA; 5) процедура
сбора ПК безболезненна и безопасна для донора;
6) низкая вероятность контаминации латентными вирусами, такими как цитомегаловирус и вирус
Эпштейна – Барр [54–56].
Наиболее активно ПК используется в качестве
альтернативного источника ГСК/ГПК при отсутствии
донора КМ, совместимого по HLA. Было проведено сравнение исходов трансплантации несовместимых по 1–2 аллелям HLA образцов ПК (n = 150)
и КМ (n = 83) взрослым пациентам [57]. Количе-
ство введенных ядросодержащих клеток составляло
0,22×108/кг для ПК и 2,2×108/кг для КМ. Восстановление количества нейтрофилов после трансплантации ГСК/ГПК ПК в среднем наблюдалось к 27 дню,
восстановление тромбоцитопоэза – к 60 дню; у пациентов после трансплантации КМ – к 20 и 29 дню
соответственно. Была отмечена схожая трехлетняя
выживаемость в обеих группах (26% для ПК и 20%
для КМ), однако частота острой РТПХ II-IV степени в
первой группе была достоверно ниже (40% для ПК
и 58% для КМ). Похожие результаты представлены и другими исследователями [51, 54, 56]. Таким
образом, трансплантация ПК может заменить трансплантацию КМ при отсутствии совместимого донора.
Критически значимыми для клинического использования параметрами образца ПК являются количество ядросодержащих клеток (не менее
2,5×107/кг веса реципиента), количество CD34+
клеток (не менее 2×105/кг) и число несоответствий
HLA между донором и реципиентом (не более чем
по 2 аллелям) [56]. Основным недостатком ПК является ограниченный объем получаемых образцов и
небольшое абсолютное количество ГСК/ГПК [14, 15,
54]. С этим связаны более медленное по сравнению
с трансплантацией КМ восстановление гемопоэза у
реципиента и, как следствие, риск развития инфекционных и геморрагических осложнений [54, 57]. Для
решения этой проблемы применяют одновременную
трансплантацию двух образцов ПК; внутрикостное
введение трансплантата; совместное введение ГСК/
ГПК с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК), способствующими их хомингу; однако радикальным подходом является ex
vivo экспансия гемопоэтических предшественников,
то есть увеличение количества этих клеток в культуре с сохранением их исходных свойств [14, 56].
Ex vivo экспансия ГСК/ГПК ПК:
существующие подходы
Необходимый этап всех методов экспансии – выделение популяции ГСК/ГПК. Для этого большинство
исследователей применяют позитивную или негативную сортировку клеток с помощью моноклональных
антител к специфическим маркерам с магнитными
или флюоресцентными метками. В большинстве работ осуществляется позитивная сортировка CD34+
и(или) CD133+ клеток [55], однако при таком подходе из экспансии исключается популяция клеток,
негативных по этим маркерам, но обладающих способностью к самообновлению и дифференцировке.
Кроме того, есть данные, что связывание антител
с поверхностными молекулами при позитивной сортировке может изменить функциональное состояние
клетки [58], поэтому предпочтительной является негативная сортировка.
Для экспансии ГСК/ГПК необходимо создать условия для реализации их способности к самообновлению. Наиболее изученный подход – применение
жидких бессывороточных сред с добавлением рекомбинантных человеческих цитокинов. Минимально необходимый набор цитокинов включает в себя
фактор стволовых клеток, тромбопоэтин и лиганд
Fms-подобной тирозинкиназы 3 (Fms-related tyrosine
kinase 3 ligand, Flt3L) [15, 59, 60]. Кроме того, показано значение интерлейкинов 3 и 6 (IL3, IL6) для
ex vivo экспансии ГСК/ГПК [25, 61]. Однако разные исследователи используют разные комбинации
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
24
Обзоры
этих цитокинов, дополнительно добавляя в культуру
гранулоцитарный колониестимулирующий фактор,
гранулоцитарно-макрофагальный
колоние-стимулирующий фактор, фактор роста и развития мегакариоцитов, эритропоэтин в различных сочетаниях
[62–67]. Но для всех методик с использованием
только цитокинов характерно лишь незначительное
увеличение количества CD34+ клеток, в основном за счет более зрелых гемопоэтических предшественников. С этим связано более быстрое, но
менее длительное восстановление гемопоэза при
трансплантации ГСК/ГПК, полученных с помощью
этих методик [15]. Кроме того, культивирование с
цитокинами приводит к индукции апоптоза и снижению способности к хомингу [15].
На основании данных о роли негемопоэтических клеток КМ в самообновлении ГСК/ГПК in vivo
многие авторы считают необходимым для их экспансии наличие фидерного слоя, состоящего из
культуры стромальных клеток. С этой целью применяются клеточные линии, полученные из взрослых
и эмбриональных кроветворных органов, таких как
аорта-гонадо-мезонефрос, желточный мешок, фетальная печень и КМ [10]. Также ряд исследователей использует в качестве фидерного слоя ММСК
[68-70] или полученные из них путем направленной
дифференцировки остеобласты [71], создавая таким образом подобие эндостальной ниши in vitro.
В настоящее время ведутся работы с целью выделения ММСК из ПК и использования их для экспансии гемопоэтических предшественниц [72]. Для
моделирования сосудистой ниши ГСК/ГПК возможно использование культуры эндотелиальных клеток
пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells,
HUVEC) [73]. Одним из перспективных направлений
ex vivo экспансии гемопоэтических предшественников является использование трехмерных матриц
(например, из покрытого танталом пористого биоматериала Cytomatrix® [74] или полиэтилентерефталата с иммобилизованным фибронектином [75]).
Некоторые исследователи комбинируют применение
трехмерных структур, состоящих из нетканого пористого носителя и фидерного слоя клеток для более точного моделирования костномозговой ниши
ГСК/ГПК [76, 77]. Однако использование фидерного
слоя является дорогостоящим и трудоемким; кроме
того, применение ксеногенных клеток нежелательно
при экспансии гемопоэтических предшественников
для последующего клинического применения.
Исходя из накопленных данных о внутренней и
внешней регуляции функций ГСК/ГПК in vivo, были
разработаны новые подходы к наращиванию этих
клеток в культуре. Такими подходами являются
экспансия ГСК/ГПК с использованием ретиноевой
кислоты [78], тетраэтиленпентамина – хелатора
внутриклеточной меди [79], StemRegenin 1 – антагониста рецептора ароматических углеводородов
[80], активация сигнального пути Notch с помощью
лиганда Delta1 [81], применение рекомбинантных
ангиопоэтин-подобных белков (в частности, Angptl5)
[82]. Кроме того, к самообновлению и увеличению
количества ГСК/ГПК приводит модификация гистоновых белков, которая достигается добавлением в
культуру клеток ингибитора гистондеацетилаз никотинамида [83], вальпроевой кислоты – ингибитора
GSK3β (гликоген синтазы киназы 3β) [84] или комбинации 5’аза-2’дезоксицитидина и трихостатина А
[85]. Также для наращивания популяции гемопоэтических предшественников описано использование
серотонина [86], плейотрофина [87] и паратиреоидного гормона [88]. Необходимо отметить, что все
эти методики требуют, тем не менее, добавления
цитокинов в питательную среду.
По сравнению с использованием только цитокинов, все вышеперечисленные методики приводят к более выраженной экспансии ГСК/ГПК. Так,
например, добавление в культуру Angptl5 позволяет увеличить количество CD34+ клеток в 22 раза за
10 дней [82], использование иммобилизованного лиганда Delta1 – в среднем в 163 раза за 17–21 день
[81], а применение StemRegenin1 – практически в
17000 раз за 35 дней [80]. Трансплантация полученных клеток NOD/SCID мышам также показывает
увеличение количества SRC, но не столь значительное (в 20 раз при использовании Angptl5 [82],
в 6,2 раз при применении Delta1 [81] и в 17,6 раз
при экспансии со StemRegenin1 [80]). Однако сравнение этих результатов между собой затруднено
из-за различий в постановке экспериментов и в методах оценки. Кроме того, разница между количеством CD34+ клеток и SRC указывает на необходимость использования дополнительных методов для
характеристики ГСК/ГПС.
Ex vivo экспансия ГСК/ГПК ПК
для клинического использования
При выборе методики экспансии ГСК/ГПК с целью последующей клинической трансплантации
необходимо учитывать не только кратность увеличения числа гемопоэтических предшественников в
эксперименте in vitro и их способность восстанавливать костномозговое кроветворение в эксперименте
in vivo. Также требуется адаптировать протоколы экспансии для клинических масштабов и определить их
безопасность для реципиента.
Для экспансии ГСК/ГПК в условиях эксперимента
используют культуральные планшеты, флаконы или
чашки Петри. Однако при культивировании больших
объемов клеточной суспензии в статичных условиях
встает проблема доставки питательных веществ и
кислорода ко всем клеткам в культуре. Кроме того,
необходим постоянный контроль концентрации кислорода и pH среды, так как эти показатели влияют на
пролиферацию и дифференцировку ГСК/ГПК [89].
В связи с этим, для экспансии гемопоэтических
предшественников с целью клинической трансплантации предложено применение биореакторов
[89, 90]. В этих устройствах обеспечены постоянное перемешивание и оксигенирование питательной среды, а также возможен контроль ее pH и
содержания кислорода. Помимо этого, использование биореакторов избавляет от необходимости
манипуляций с многочисленными культуральными
сосудами, что снижает риск контаминации культуры. Однако применение таких систем является
очень дорогостоящим, требует больших объемов
сред, высокой квалификации персонала и очень
точного подбора условий культивирования. Поэтому
более простой и распространенный метод экспансии ГСК/ГПК в клинических масштабах – использование газопроницаемых культуральных мешков
[55, 66, 81, 91]. Такие мешки обеспечивают постоянный газообмен по всей поверхности и являются
закрытой системой.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
25
Обзоры
При экспансии ГСК/ГПК для клинического использования желательно избегать использования ксеногенных клеток и реагентов животного происхождения
(в первую очередь, сывороток), так как это может
привести к иммунному ответу со стороны реципиента. В связи с этим применяют бессывороточные
питательные среды или среды на основе сыворотки
крови человека, а также отказываются от фидерного
слоя из ксеногенных клеточных линий или используют аутогенные клетки.
На настоящий момент проходят клинические испытания препаратов ГСК/ГПК ПК, полученных при
экспансии с помощью некоторых из методик, перечисленных в разделе «Ex vivo экспансия ГСК/ГПК пуповинной крови: существующие подходы» [81, 91].
Так, например, компания Gamida Cell опубликовала
результаты I/II фазы клинических исследований препарата StemEx®, представляющего собой продукт
экспансии ГСК/ГПК пуповинной крови с добавлением
TEPA [91]. Образец ПК был разделен на две фракции, при этом из меньшей выделили CD133+ клетки
с помощью магнитного сортера. Гемопоэтические
предшественники культивировали в питательной
среде αMEM с добавлением 10% фетальной бычьей
сыворотки, цитокинов TPO, IL-6, Flt3L и SCF и TEPA.
Экспансия проводилась в тефлоновых культуральных
мешках в течение 21 сут. Полученные при экспансии клетки вводили через 24 ч после трансплантации большей некультивированной фракции того
же образца. Количество ядросодержащих клеток в
большинстве образцов составляло менее 2×107/кг.
В исследовании участвовало 10 пациентов с онкогематологическими заболеваниями, донорские образцы ПК имели несоответствия с реципиентами по
1–2 аллелям HLA. Среднее время восстановления
количества нейтрофилов и тромбоцитов составило
30 и 48 дней соответственно, РТПХ III-IV степени выявлено не было, общая выживаемость на 100 день
составила 90%. Все пациенты перенесли трансплантацию без осложнений.
Таким образом, экспансия ГСК/ГПК ПК может
быть использована для увеличения количества гемопоэтических предшественников с целью клиниче-
Изучение свойств гемопоэтических стволовых
и прогениторных клеток, а также возможностей их
использования в клинике в настоящее время является актуальной и перспективной научной задачей.
В качестве источника ГСК/ГПК на данный момент
активно применяется пуповинная кровь. Она имеет
ряд преимуществ перед другими источниками при
наличии в образце необходимого количества гемопоэтических предшественников, способных к хомингу и заселению КМ. Для определения количества
и свойств этих клеток существует ряд in vitro и in
vivo методов, позволяющих охарактеризовать ГСК/
ГПК и выделить среди этой неоднородной популяции
клетки с наибольшим пролиферативным потенциалом, способностью мигрировать в КМ и длительно
восстанавливать кроветворение реципиента. С этой
целью активно изучается связь между фенотипом
и функциональной активностью гемопоэтических
предшественников in vitro и их поведением при экспериментальной и клинической трансплантации.
Основным недостатком ПК является небольшое
абсолютное количество гемопоэтических предшественников. Для решения этой проблемы на основе
накопленных знаний о механизмах самообновления
и дифференцировки этих клеток разработан ряд
методик для увеличения количества ГСК/ГПК без
потери их биологических свойств. Однако необходимо проведение дальнейших исследований с целью
адаптации этих методик для клинического применения, определения их эффективности и безопасности
для пациентов.
Разработка методик характеристики и экспансии
ГСК/ГПК является одной из приоритетных задач для
банков ПК персонального хранения, так как это позволяет широко использовать криоконсервированный образец в клинической практике.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Thomas E.D., Lochte H.L., Lu W.C. et al. Intravenous infusion
of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy.
N. Engl. J. Med. 1957; 257(11): 491–6.
2. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation
sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res. 1961;
14: 213–22.
3. Forsberg E.C., Prohaska S.S., Katzman S. et al. Differential
expression of novel potential regulators in hematopoietic stem cells.
PLoS Genet. 2005; 1(3): e28.
4. Schoemans H., Verfaillie C. Cellular biology of hematopoiesis.
In: Hoffman R., Benz E.J., Shattil S.J. et al., editors. Hematology:
Basic Principles and Practice. 5th edn. Part III. Philadelphia: Elsevier
Churchill Livingston; 2008: 358–71.
5. Alenzi F.Q., Alenazi B.Q., Ahmad S.Y. et al. The haemopoietic
stem cell: between apoptosis and self renewal. Yale J. Biol. Med.
2009; 82(1): 7–18.
6. Zhu J., Emerson S.G. Hematopoietic cytokines, transcription
factors and lineage commitment. Oncogene 2002; 21(21):
3295–313.
7. Dahl R., Hromas R. Transcription factors in normal and
malignant hematopoiesis. In: Hoffman R., Benz E.J. Jr., Shattil S.J.
et al., editors. Hematology: Basic Principles and Practice. 5th edn.
Part III. Philadelphia: Elsevier Churchill Livingston; 2008: 372–95.
8. Lessard J., Faubert A., Sauvageau G. Genetic programs
regulating HSC specification, maintenance and expansion. Oncogene
2004; 23(43): 7199–209.
9. Haylock D.N., Nilsson S.K. Stem cell regulation by the
hematopoietic stem cell niche. Cell Cycle 2005; 4: 1353–5.
10. Zhang C.C., Lodish H.F. Cytokines regulating hematopoietic
stem cell function. Curr. Opin. Hematol. 2008; 15(4): 307–11.
11. Oh I.H., Kwon K.R. Concise review: multiple niches
for hematopoietic stem cell regulations. Stem Cells 2010; 28(7):
1243–9.
12. Arai F., Hirao A., Ohmura M. et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling
regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow
niche. Cell 2004; 118(2): 149–61.
13. Cerdan C., Bhatia M. Novel roles for Notch, Wnt and Hedgehog
in hematopoesis derived from human pluripotent stem cells. Int. J.
Dev. Biol. 2010; 54(6-7): 955–63.
14. Delaney C., Ratajczak M.Z., Laughlin M.J. Strategies to
enhance umbilical cord blood stem cell engraftment in adult patients.
Expert. Rev. Hematol. 2010; 3(3): 273–83.
15. Hofmeister C.C., Zhang J., Knight K.L. et al. Ex vivo expansion
of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing
knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplant.
2007; 39(1): 11–23.
16. Peled A., Petit I., Kollet O. et al. Dependence of human stem
cell engraftment and repopulation of NOD/SCID mice on CXCR4.
Science 1999; 283(5403): 845–8.
17. Aiuti A., Webb I.J., Bleul C. et al. The chemokine SDF-1 is a
chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells
and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+
progenitors to peripheral blood. J. Exp. Med. 1997; 185(1): 111–20.
18. Peled A., Kollet O., Ponomaryov T. et al. The chemokine
SDF-1 activates the integrins LFA-1, VLA-4, and VLA-5 on immature
human CD34(+) cells: role in transendothelial/stromal migration and
engraftment of NOD/SCID mice. Blood 2000; 95(11): 3289–96.
ского применения. Однако необходимо решить целый
ряд технических задач для культивирования клеток
в объемах, которые требуются для трансплантации.
Кроме того, важен строгий контроль применяемых
методик для обеспечения безопасности пациентов.
Заключение
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
26
Обзоры
19. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. et al. CD44 and hyaluronic
acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34+ stem/
progenitor cells to bone marrow. Blood 2004; 103(8): 2981–9.
20. Christopherson K.W., Hangoc G., Broxmeyer H.E. Cell surface
peptidase CD26/dipeptidylpeptidase IV regulates CXCL12/stromal
cell-derived factor-1 alpha-mediated chemotaxis of human cord blood
CD34+ progenitor cells. J. Immunol. 2002; 169(12): 7000–8.
21. Krause D.S., Fackler M.J., Civin C.I. et al. CD34: structure,
biology, and clinical utility. Blood 1996; 87(1): 1–13.
22. Sutherland D.R., Anderson L., Keeney M. et al. The ISHAGE
guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry.
International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J.
Hematother. 1996; 5(3): 213–26.
23. Craig W., Kay R., Cutler R.L. et al. Expression of Thy-1 on
human hematopoietic progenitor cells. J. Exp. Med. 1993; 177(5):
1331–42.
24. Yin A.H., Miraglia S., Zanjani E.D. et al. AC133, a novel marker
for human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood 1997;
90(12): 5002–12.
25. Encabo A., Mateu E., Carbonell-Uberos F. et al. CD34+CD38is a good predictive marker of cloning ability and expansion potential of
CD34+ cord blood cells. Transfusion 2003; 43(3): 383–9.
26. Zanjani E.D., Almeida-Porada G., Livingston A.G. et al. Human
bone marrow CD34– cells engraft in vivo and undergo multilineage
expression that includes giving rise to CD34+ cells. Exp. Hematol.
1998; 26(4): 353–60.
27. Bhatia M., Bonnet D., Murdoch B. et al. A newly discovered
class of human hematopoietic cells with SCID-repopulating activity.
Nat. Med. 1998; 4(9): 1038–45.
28. Goodell M.A., Rosenzweig M., Kim H. et al. Dye efflux studies
suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable
levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat. Med. 1997;
3(12): 1337–45.
29. Wang J., Kimura T., Asada R. et al. SCID-repopulating cell
activity of human cord blood-derived CD34- cells assured by intra-bone
marrow injection. Blood 2003; 101(8): 2924–31.
30. Sonoda Y. Immunophenotype and functional characteristics
of human primitive CD34-negative hematopoietic stem cells: the
significance of the intra-bone marrow injection. J. Autoimmun. 2008;
30(3): 136–44.
31. Yahata T., Ando K., Sato T. et al. A highly sensitive strategy
for SCID-repopulating cell assay by direct injection of primitive human
hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood 2003;
101(8): 2905–13.
32. Kimura T., Asada R., Wang J. et al. Identification of long-term
repopulating potential of human cord blood-derived CD34-flt3- severe
combined immunodeficiency-repopulating cells by intra-bone marrow
injection. Stem Cells 2007; 25(6): 1348–55.
33. Chen C.Z., Li M., de Graaf D. et al. Identification of endoglin as
a functional marker that defines long-term repopulating hematopoietic
stem cells. PNAS USA 2002; 99(24): 15468–73.
34. Balazs A.B., Fabian A.J., Esmon C.T. et al. Endothelial protein
C receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in
murine bone marrow. Blood 2006; 107(6): 2317–21.
35. Wagers A.J. Stem cell grand SLAM. Cell 2005; 121(7): 967–70.
36. Challen G.A., Little M.H. A side order of stem cells: the SP
phenotype. Stem Cells 2006; 24: 3.
37. Goodell M.A., Brose K., Paradis G. et al. Isolation and functional
properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in
vivo. J. Exp. Med. 1996; 183(4): 1797–806.
38. Liu H., Verfaillie C.M. Myeloid-lymphoid initiating cells (ML-IC)
are highly enriched in the rhodamine-c-kit(+)CD33(-)CD38(-) fraction
of umbilical cord CD34(+) cells. Exp. Hematol. 2002; 30: 582.
39. McKenzie J.L., Takenaka K., Gan O.I. et al. Low rhodamine 123
retention identifies long-term human hematopoietic stem cells within
the Lin-CD34+CD38- population. Blood 2007; 109: 543.
40. Arai F., Hirao A., Suda T. Regulation of hematopoietic stem
cells by the niche. Trends Cardiovasc. Med. 2005; 15(2): 75–9.
41. Pierre-Louis O., Clay D., Brunet de la Grange P. et al.
Dual SP/ALDH functionalities refine the human hematopoietic LinCD34+CD38– stem/progenitor cell compartment. Stem Cells 2009;
27(10): 2552–62.
42. Hess D.A., Meyerrose T.E., Wirthlin L. et al. Functional
characterization of highly purified human hematopoietic repopulating
cells isolated according to aldehyde dehydrogenase activity. Blood
2004; 104(6): 1648–55.
43. Christ O., Lucke K., Imren S. et al. Improved purification
of hematopoietic stem cells based on their elevated aldehyde
dehydrogenase activity. Haematologica 2007; 92(9): 1165–72.
44. Lioznov M.V., Freiberger P., Kröger N. et al. Aldehyde
dehydrogenase activity as a marker for the quality of hematopoietic
stem cell transplants. Bone Marrow Transplant. 2005; 35(9): 909–14.
45. Fallon P., Gentry T., Balber A.E. et al. Mobilized peripheral
blood SSCloALDHbr cells have the phenotypic and functional properties
of primitive haematopoietic cells and their number correlates with
engraftment following autologous transplantation. Br. J. Haematol.
2003; 122: 99–108.
46. Yang H., Acker J.P., Cabuhat M. et al. Association of postthaw viable CD34+ cells and CFU-GM with time to hematopoietic
engraftment. Bone Marrow Transplant. 2005; 35(9): 881–7.
47. International standards for cord blood collection, processing,
testing, banking, selection, and release. 3rd Edn; 2006.
48. Nadali G., de Wynter E.A., Perandin F. et al. Regulation of
the proliferative potential of cord blood long-term culture-initiating
cells (LTC-IC) by different stromal cell lines: implications for LTC-IC
measurement. Haematologica 1998; 83(12): 1059–65.
49. Denning-Kendall P., Singha S., Bradley B. et al. Cobblestone
area-forming cells in human cord blood are heterogeneous and differ
from long-term culture-initiating cells. Stem Cells 2003; 21(6):
694–701.
50. Bhatia M., Wang J.C., Kapp U. et al. Purification of primitive
human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient
mice. PNAS USA 1997; 94(10): 5320–5.
51. Chao N.J., Emerson S.G., Weinberg K.I. Stem cell
transplantation (cord blood transplants). Hematology Am. Soc.
Hematol. Educ. Program. 2004; 354–71.
52. Gammaitoni L., Weisel K.C., Gunetti M. et al. Elevated
telomerase activity and minimal telomere loss in cord blood long-term
cultures with extensive stem cell replication. Blood 2004; 103(12):
4440–8.
53. Harris D.T., Schumacher M.J., Locascio J. et al. Phenotypic
and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes.
PNAS USA 1992; 89(21): 10006–10.
54. Rocha V., Gluckman E. Eurocord-Netcord registry and
European Blood and Marrow Transplant group. Improving outcomes
of cord blood transplantation: HLA matching, cell dose and other
graft- and transplantation-related factors. Br. J. Haematol. 2009;
147(2): 262–74.
55. Koestenbauer S., Zisch A., Dohr G. et al. Protocols for
hematopoietic stem cell expansion from umbilical cord blood. Cell
Transplant. 2009; 18(10): 1059–68.
56. Gluckman E., Rocha V. Cord blood transplantation: state of the
art. Haematologica 2009; 94(4): 451–4.
57. Laughlin M.J., Eapen M., Rubinstein P. et al. Outcomes after
transplantation of cord blood or bone marrow from unrelated donors
in adults with leukemia. N. Engl. J. Med. 2004; 351(22): 2265–75.
58. Gilner J.B., Walton W.G., Gush K. et al. Antibodies to stem
cell marker antigens reduce engraftment of hematopoietic stem cells.
Stem Cells 2007; 25(2): 279–88.
59. Kobayashi M., Laver J.H., Lyman S.D. et al. Thrombopoietin,
steel factor and the ligand for flt3/flk2 interact to stimulate the
proliferation of human hematopoietic progenitors in culture. Int. J.
Hematol. 1997; 66(4): 423–34.
60. Herrera C., Sánchez J., Torres A. et al. Early-acting cytokinedriven ex vivo expansion of mobilized peripheral blood CD34+ cells
generates post-mitotic offspring with preserved engraftment ability
in non-obese diabetic/severe combined immunodeficient mice. Br. J.
Haematol. 2001; 114(4): 920–30.
61. Zandstra P.W., Conneally E., Petzer A.L. et al. Cytokine
manipulation of primitive human hematopoietic cell self-renewal. PNAS
USA 1997; 94(9): 4698–703.
62. Berger M., Fagioli F., Piacibello W. et al. Role of different
medium and growth factors on placental blood stem cell expansion:
an in vitro and in vivo study. Bone Marrow Transplant. 2002; 29(5):
443–8.
63. Henschler R., Brugger W., Luft T. et al. Maintenance of
transplantation potential in ex vivo expanded CD34(+)-selected human
peripheral blood progenitor cells. Blood 1994; 84(9): 2898–903.
64. Kobari L., Pflumio F., Giarratana M. et al. In vitro and in
vivo evidence for the long-term multilineage (myeloid, B, NK, and T)
reconstitution capacity of ex vivo expanded human CD34+ cord blood
cells. Exp. Hematol. 2000; 28(12): 1470–80.
65. Donaldson C., Denning-Kendall P., Bradley B. et al. The
CD34(+) CD38(neg) population is significantly increased in
haemopoietic cell expansion cultures in serum-free compared to
serum-replete conditions: dissociation of phenotype and function.
Bone Marrow Transplant. 2001; 27(4): 365–71.
66. Shpall E.J., Quinones R., Giller R. et al. Transplantation of ex
vivo expanded cord blood. Biol. Blood Marrow Transplant. 2002; 8(7):
368–76.
67. Mohamed A.A., Ibrahim A.M., El-Masry M.W. et al. Ex vivo
expansion of stem cells: defining optimum conditions using various
cytokines. Lab. Hematol. 2006; 12(2): 86–93
68. Robinson S.N., Ng J., Niu T. et al. Superior ex vivo cord blood
expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal
stem cell. Bone Marrow Transplant. 2006; 37(4): 359–66.
69. Wagner W., Roderburg C., Wein F. et al. Molecular and
secretory profiles of human mesenchymal stromal cells and their
abilities to maintain primitive hematopoietic progenitors. Stem Cells
2007; 25(10): 2638–47.
70. Kadereit S., Deeds L.S., Haynesworth S.E. et al. Expansion of
LTC-ICs and maintenance of p21 and BCL-2 expression in cord blood
CD34+/CD38– early progenitors cultured over human mscs as a feeder
layer. Stem Cells 2002; 20(6): 573–82.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
Обзоры
71. Mishima S., Nagai A., Abdullah S. et al. Effective ex vivo
expansion of hematopoietic stem cells using osteoblast-differentiated
mesenchymal stem cells is CXCL12 dependent. Eur. J. Haematol.
2010; 84(6): 538–46.
72. Jang Y.K., Jung D.H., Jung M.H. et al. Mesenchymal stem
cells feeder layer from human umbilical cord blood for ex vivo expanded
growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells. Ann.
Hematol. 2006; 85(4): 212–25.
73. Yildirim S., Boehmler A.M., Kanz L. et al. Expansion of cord blood
CD34+ hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous
umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is superior to cytokine-supplemented liquid culture. Bone Marrow Transplant. 2005; 36(1): 71–9.
74. Ehring B., Biber T.M., Upton T.M. et al. Expansion of HPCs from
cord blood in a novel 3D matrix. Cytotherapy 2003; 5: 490–9.
75. Feng Q., Chai C., Jiang X.S. et al. Expansion of engrafting
human hematopoietic stem/progenitor cells in three-dimensional
scaffolds with surfaceimmobilized fibronectin. J. Biomed. Mater. Res.
2006; 78: 781–91.
76. Takagi M., Iemoto N., Yoshida T. Effect of concentrations of
murine stromal and hematopoietic cells on the progenitors expansion
in their three-dimensional coculture in nonwoven fabrics. J. Biosci.
Bioeng. 2002; 94(4): 365–7.
77. Okamoto T., Takagi M., Soma T. et al. Effect of heparin addition
on expansion of cord blood hematopoietic progenitor cells in threedimensional coculture with stromal cells in nonwoven fabrics. J. Artif.
Organs. 2004; 7(4): 194–202.
78. Purton L.E., Bernstein I.D., Collins S.J. All-trans retinoic
acid delays the differentiation of primitive hematopoietic precursors
(lin-c-kit+Sca-1(+)) while enhancing the terminal maturation of
committed granulocyte/monocyte progenitors. Blood 1999; 94(2):
483–95.
79. Peled T., Landau E., Prus E. et al. Cellular copper content
modulates differentiation and self-renewal in cultures of cord bloodderived CD34+ cells. Br. J. Haematol. 2002; 116(3): 655–61.
80. Boitano A.E., Wang J., Romeo R. et al. Cooke M.P. aryl
hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human
hematopoietic stem cells. Science 2010; 329(5997): 1345–8.
27
81. Delaney C., Heimfeld S., Brashem-Stein C. et al. Notchmediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of
rapid myeloid reconstitution. Nat. Med. 2010; 16(2): 232–6.
82. Drake A.C., Khoury M., Leskov I. et al. Human CD34+ CD133+
hematopoietic stem cells cultured with growth factors including
angptl5 efficiently engraft adult NOD-SCID Il2rc2/2 (NSG) mice. PLoS
One 2011; 6(4): e18382.
83. Trevis A., Peled T., Rosen O., inventors; Gamida-Cell Ltd.,
assignee. Ex-vivo expansion of hematopoietic stem cell populations
in mononuclear cell cultures. AU patent 2005200679. 2005
Feb16.
84. De Felice L., Tatarelli C., Mascolo M.G. et al. Histone
deacetylase inhibitor valproic acid enhances the cytokine-induced
expansion of human hematopoietic stem cells. Cancer Res. 2005;
65(4): 1505–13.
85. Milhem M., Mahmud N., Lavelle D. et al. Modification of
hematopoietic stem cell fate by 5aza 2’deoxycytidine and trichostatin
A. Blood 2004; 103(11): 4102–10.
86. Yang M., Li K., Ng P.C. et al. Promoting effects of serotonin on
hematopoiesis: ex vivo expansion of cord blood CD34+ stem/progenitor
cells, proliferation of bone marrow stromal cells, and antiapoptosis.
Stem Cells 2007; 25(7): 1800–6.
87. Himburg H.A., Muramoto G.G., Daher P. et al. Pleiotrophin
regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.
Nat. Med. 2010; 16(4): 475–82.
88. Pirih F.Q., Michalski M.N., Cho S.W. et al. Parathyroid
hormone mediates hematopoietic cell expansion through interleukin-6.
PLoS One 2010; 5(10): e13657.
89. Kowalczyk M., Waldron K., Kresnowati P. Process challenges
relating to hematopoietic stem cell cultivation in bioreactors. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 2011; 38(7): 761–7.
90. Nielsen L.K. Bioreactors for hematopoietic cell culture. Annu.
Rev. Biomed. Eng. 1999; 1: 129–52
91. de Lima M., McMannis J., Gee A. et al. Transplantation
of ex vivo expanded cord blood cells using the copper chelator
tetraethylenepentamine: a phase I/II clinical trial. Bone Marrow
Transplant. 2008; 41(9): 771–8.
Поступила 18.07.2012
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 4, 2012
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
11
Размер файла
619 Кб
Теги
кровь, клеток, прогениторных, стволовые, пуповинной, гемопоэтических, характеристика, vivo, экспансии
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа