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Bis(hydroperoxy)naphthaldiimid als ДPhoto-Fenton-ReagensФ sequenzspezifische photochemische DNA-Spaltung.

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Bis(hydroperoxy)naphthaldiimid als
,,Photo-Fenton-Reagens": sequenzspezifische
photochemische DNA-Spaltung
Von Seiichi Motsugo, Sliosuke Kriwcinislii, Koji Y~imamoto,
Hiroshi Siigij~nma,Teruo Matsuurn und I s m Sairo *
ProfiJssor Kurt Schcdjiilcr
XM
60. Gehurtstcig gcwidmet
Die Rolle des Hydroxylradikals HO' in biologischen
Systemen stofit auf groJ3es Interessel']. Daher wurden rnehrere Versuche unternommen. leistungsfihige Methoden fur die
Erzeugung von Hydroxylradikalen zu entwickeln. die ohne
U bergangsmetalle und Wasserstoffperoxid auskornmen['. 'I.
Unser Ziel 1st die Entwicklung eines organischen Hydroxylradikal-Vorlaufers, der nach niederenergetischer Bestrahlung, etwa im langwelligen UV- ( > 350 nm) oder irn sichtbaren Bereich. Hydroxylradikale in reiner Form liefert. Solche Verbindungen. sogenannte Photo-Fenton-Reagentien.
sind als steuerbare und mechanistisch weniger kornplizierte
H0'-Quellen fur Anwendungen in einer Reihe von biologisch wichtigen Reaktionen wie Vernetzung von Biopolymein~ e n [sowie
~ l DNA- und P r o t e i n s p a l t ~ n g e n ~besonders
~~
teressant. Der Anforderungskatalog beinhaltet einfache Synthese. Stabilitit bei Raumtemperatur, Loslichkeit in wih-igen Solventien und Fihigkeit zur Freisetzung von Hydroxylradikalen nach Bestrahlung rnit langwelligem Licht.
Erste Untersuchungen hatten gezeigt. daB man aus Hydroperoxyphthalimiden durch Bestrahlung mit 2. > 280 nm
photochemisch Hydroxylradikale erzeugen kann['I. In der
vorliegenden Arbeit wird ein Naphthaldiimid-Derivat rnit
einer symmetrischen Bis(hydroper0xy)-Gruppierung vorgestellt. das in der Hoffnung auf eine hohere H0'-Ausbeute
pro Molekiil und eine intensivere Absorption bei groJ3eren
Wellenlingen synthetisiert wurde, und seine Eignung als
photochemische HO'-Quelle sowie zur sequenzspezifischen
Spaltung von doppelstringiger DNA an der 5'-Position von
5'-GG-3'-Sequenzen belegt.
Das Bis(hydroperoxid) 1 wurde in Dichlormethan bei 0 - C
aus dem entsprechenden Diacetal 2 durch Behandlung rnit
etherischem Wasserstoffperoxid im UberschuJ3 in Gegenwart von Trifluormethansulfonsiure (1 Aquivalent) und anschlieJ3endes Urnkristallisieren hergestellt (Ausbeute: 67 %).
Das thermisch stabile Hydroperoxid I['] ist in wiBrigen organischen Solventien loslich (bis zu 0.25 mM in Acetonitril/
Wasser 8/92) und weist eine starke Absorptionsbande bei
377 nm auf (Ig c == 4.45).
Die Photolyse \.on I bei 366 nm in Acetonitril unter Stickstoff verlief zugig und lieferte quantitativ den Ester 3 (Quantenausbeute 4 = 0.18181).In Gegenwart von Adamantan
( 5 Aquivalente) als H0'-Acceptor wurden 1-Adamantanol,
2-Adarnan tanol und Adarnantanon in Ausbeuten von 30.
15 bzw. 6 % bezogen auf 1 erhalten; durch Zugabe eines
H0'-Fingers wie Dirnethylsulfoxid wurde die Bildung dieser
Verbindungen unterdriickt. Das Auftreten von Hydroxylradikalen bei der photochemischen Zersetzung von 1 wurde
ESR-spektroskopisch durch Spineinfang rnit 4.5-Dihydro-5.5dirnethyl-3H-pyrrol-N-oxid (DMPO) bestitigt'']. Kurze Bestrahlung einer Liisung von 1 (100 p ~ und
) DMPO (1.5 rnM)
['I
Prof. Dr. I Saito. Ilr. H . Sugiyarna. Prof. T Matsuura
Dcpartment of Synthetic Chemistry. Faculty of Engineering
Kyoto University
Kyoto 606 (Japan)
Dr. S. Matsugo
Kobe University of Mercantile Marine
Kok 658 (Japan)
D r S. Kawanishi. K . Yarnarnoto
Department of Public Health. Faculty of Medicine
Kyoto University
Kyoto 606 ( J a p a n )
in Natriurncacodylat-Puffer (Me,AsONa. pH 7.0) bei 366 nm
fiihrte zu intensiven. fur das Hydroxylradikal-DMPO-Addukt charakteristischen ESR-Signalen["] (Quartett ( 1 :2:2:1),
uN = aft= 14.8 G. g = 2.0058). Die ausschlieJ3liche Bildung
von 3 bei gleichzeitiger Erzeugung von HO-Radikalen 1st in
Einklang rnit einer Ubertragung des Acetal-H-Atoms aufdie
Carbonylgruppe des Naphthalimids und der anschlieBenden
Spaltung der labilen 0-O-Bindung des Diradikals 4['01und
kann nicht rnit einer direkten, durch intrarnolekulare Energieubertragung vorn angeregten Naphthaldiimid-Chromophor
eingeleiteten Homolyse der 0-0-Bindung erklirt ~ e r d e n ' ~ ] .
B0
0
O
R
I
N
I
0
R
2; R - CH2CH(OMe)2
3; R - CH2C02Me
5 ; R - CH&H(CH&
Me0
>O-!-OH
Me0
e0
4
Wir haben dann die Spaltung von DNA-Stringen in Gegenwart von l an circuliirer Supercoil-+X 174-RFI-DNA
(Form I ) untersucht. Die Bildung von DNA der Formen I1
und 111 belegt die Spaltung von Einzelstrang- bzw. zu einern
geringen Anteil von Doppelstrang-DNA bei hoherern Umsatz (Tabelle 1). Zugabe von Natriurnbenzoat als H0'-Finger verrninderte die DNA-Spaltung betrichtlichll'l. Die Basen- und Sequenzspezifitit der DNA-Spaltung wurde rnit
"P-endmarkierten DNA-Fragrnenten aus dem c-Ha-rm-1Hurnanprotooncogenl"' untersucht (Abb. 1 ). Das Hydroperoxid I induziert die Spaltung von DNA-Stringen durch
Tabellc 1. Spaltung von circularer Supercoil-~X-174-RFl-DNA( F o r m I ) in
gefurchte ctrculirr ( F o r m 11) und lincare D N A ( F o r m III) durch Bestrahlung
von I [a].
KonL. von I (phi)
100
10
1
0 Icl
% Form I [b]
"1" Form I I [b]
23.x
69 5
83.1
xx.0
72.4
28.4
16.5,
F'orm 111 [b]
12.0
3.x
2. I
[a] Die Reaktionsmischur.g rnit 25 phi D N A ( F o r m I ) und unterschiedlichen
Konzentrationen a n 1 in SO r n w Natriumcacodyla1-Puffer (pH 7.0) wurden
20 rnin bei 0 C bestrahlt (.4bstand von der Lichtquel1e:lO cm) und gelelektrophoretisch a n Agarose analysiert [b] Die Werte wurden durch Densitometrie
nach Anfirbung rnit Ethidiumbromid ermittelt. [c] Die verwendetc D N A enthielt eine gcringe Menge D N A der F.orm I I .
1
0.4JI
1671
I
I
I
1680
1690
1700
I
1710
n-
I
I
1720
1730
a
I
1
1740 17501758
Abb. I . Positioncsperifitat bei der DNA-Spaltung durch Bestrahlung von 1
Eine Losung mit dem '*P-S'-endmarkierten 261-bp-Fragment (Avul *1645Xhul 1905) des c-Ha-rus-I-Humanprotooncogens
[ l 2 ] und l o p # 1 in 50 mM
Natriumcacodylat-Puffer ( p H 7.0) wurde 20 min unter den in Tabelle 1 angegebenen BedingunKen bestrahlt. Nach Behandlung mil Piperidin ( I M. 90 'C.
20 min) wurdcn Jie DNA-Frdgmente gelelektrophoretisch getrennt ( 8 % Polyacrylamid,X M Harnstoff). Die durch die photochemische Reaktion und
nachfolgende Beliandlung mil Piperidin gebildeten relativen Mengen a n Oligonucleotiden wurtlen mit einem Laser-Densitometer bestimmt. ri = NucleotidZahl des DNA-Fragments (von links nach rechts: 5' 3 ' ) : A = Absorption.
-
nach der Bestrahlung zugegebenes Piperidin bevorzugt an
der 5'-Position von 5'-GG-3'-Sequenzen. An anderen Positionen. auch an einzelnen G-Resten. trat keine Spaltung auf.
Dies steht in deutlichern Gegensatz zu der durch SingulettSauerstoff induzierten DNA-Photospaltung. bei der die Spaltung nach Behandlung rnit Piperidin in gleicher Weise an allen
G-Positionen eintritt" 31. Bei Kontrollexperirnenten fuhrte die
Bestrahlung tier zu 1 venvandten Naphthaldiirnid-Derivate 2
und 5 in keinern Fall zu DNA-Spaltung, auch nach Behandlung rnit Piperidin nicht. Diese Ergebnisse zeigen die entscheidende Rolle der Hydroperoxy-Gruppierung in 1 bei der
spezifischen photochernischen DNA-Spaltung und widerlegen klar eine oxidative DNA-Spaltung rnit BUS dern angeregten Naphthaldiirnid gebildeten Singulett-Sauerstoff.
Die DNA-Spaltung wurde durch Behandlung rnit Piperidin bei 90' C etwa zehnrnal stlrker; dies spricht dafur, daI3
das Hydroxylradikal bevorzugt rnit der DNA-Base reagiert.
vor allem rnit Guanin, und nicht rnit dern KohlenhydratRuckgrat[SC.d.C.141. D oppelstringige DNA wird von Hydroxylradikalen bei Behandlung rnit Piperidin normalerweise an
jedern Nucleotid, allerdings rnit einer gewissen Bevorzugung
der G- und T-Positionen. gespalten[". 15b1. Nach unserer Meinung 1st dahcr die Spezifitat der Spaltung rnit 1 eine Folge
der selektiven Bindung von 1 an 5'-GG-3'-Sequenzen'l6I.
Diese sehr wirkungsvolle Methode zur Erzeugung von
Hydroxylradikalen bietet sich auch fur Anwendungen in einer Anzahl anderer biologischer Systerne an, bei denen Hydroxylradikale benotigt werden
Eingegangen am 5 . M i r r 1991 [Z 44721
CAS-Registry-Nummern :
1. 133803-07.8: 2. 136144-94-0: 3, 136144-95-3: 5. 136144-96-2: HO'. 335257-6
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[2] Zur Photolyse oder Radiolyse von Wasser siehe [ I ] .
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Schultz. rhfd. 112 (1990) 3249.
171 Fp = 142 145°C (Zers.): U V (CH,CN) i,,, [nm] = 340 (Ig c = 4.20).
357 (4.38). 377 (4.45). ' H - N M R (CDCI,): 6 = 3.59 (5. 6 H ) . 4.40 (dd.
J = 2.8. 14 Hr. 2 H ) . 4.67 (dd. J = 8.2. 14 HL. ?H). 4 91 (dd. J = 2.8.
8.2 Hz. 2 H ) . 8.85 (s. 4 H ) . 9 56 (s, 2H. O O H ) : MS:n i l : 446 ( M e ) .410.
[X] Die Quantenausbeute wurde mil Phenylglyoxalsaure (4 = 0.72 bei
365 n m ) als Actinomctcr hestimmt.
[9] E. Finkelstern, G. M Rosen. E. J. Rauckman. Arch Biochem. Biophvs. 20
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[lo] lntramokkukire Eleklronenubertragung von der Methoxygruppe der Seitenkette wurde ern lhnliches Diradikal 4 liefern. siehe a) P. H. Mau.ochi.
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Phoi~iclimrurr~
in Organii. .SFriihe.srs. Royal Sciety of Chemistry, London
1986. S. 61.
1111 Zugabe von Natriumbenrodl ( 1 m#) in Gegenwart von 10 p~ I fuhrte LU
vollstandiger Hemmung der Bildung von D N A der Form 111 und einer
verminderten Ausbeute a n D N A der Form 11.
1121 K . Yamamoto, S . Kawanishi. J B i d . Chern. 164 (1989) 15435.
[13] a)T. F r i e d m a n , D M . B r o w n . N u c / ~ , i ~ . A c r d . ~ 5R(r1. \9 7 8 ) 6 1 5 : b ) S , K a w anishi. S . Inoue. S. Sano. J. Bfol Chern. 261 (19x6) 6090: c) W Blau. D . T.
Croke. J. M . Kelly. D J. McConnell, C . OhUigin. W J. M . Van der Putten,
J. Chcwi. Soc. Chmi. Commun. 1987. 751
I141 Die r u r direkten DNA-Spaltung fuhrende Reaktivitit von Hydroxylradikalen gegenuber Ribose-Einheiten ist bekanntlich deutlich geringer als die
gegenuber Purin- und Pyrimidin-Basen 1151
[lS] a ) S. Steeken. Chrm. RPV 89(1989) 503. b) M . Dirdaroglu. 0 . 1. Aruoma.
B. Halliwell. Bmchmiisiry 29 (1990) 8447. zit. Lit.
I161 Die durch Gleichgewichtsdialyse bestimmte Bindungskonstante von 1 a n
Kllberthymus-DNA betrug 1.50 x 10'
Erzeugung von kolloiden Ubergangsmetallen
in organischer Phase und ihre Anwendung
in der Katalyse**
Von Helmut Biinnemann *, Werner Brijoux,
Ruiner Brinkmann. Eckard Dinjus, Thomas JouJen,
Barbara Korall
Professor Kurt SchufJnu :urn 60. Geburtstag gewidmcit
Kolloide Ubergangsrnetalle rnit enger PartikelgroDenverteilung sind von groI3ern Interesse fur die Katalyse, denn sie
ermoglichen, katalytische Prozesse in hornogener und heterogener Phase an weitgehend einheitlichen Metallpartikeln zu
studieren"]. Die Erzeugung und Stabilisierung kolloider Edelrnetalle in Wasser ist gut bekanntl2I und wurde kurzlich durch
spezielle Kornplexliganden wesentlich verbes~ert[~].
Hier berichten wir uber eine allgerneine Herstellungsrnethode fur
Metallkolloide von Elernenten der Gruppen 6- 11 in organischer Phase. Die Metallsalze werden in T H F suspendiert und
rnit Tetraalkylarnrnoniurnhydrotriorganoboraten urngesetzt
['I Prof. D r . H . Bonnemann. Dr.-lng. W. Brijoux.
Dipl.-lng. R . Brinkmann. Dr. T. J o u k n . D i p L C h e m . B. Korall
Max-Planck-Institut fur Koblenforschung
Postfach 101353. W-4330 Mulheim a n der R u h r
Dr. E. Dinjus
Chemische Fakultlt, Universitat Jena
["I
Dr. G B l o d und E . Sc/iuu/(Krupp lndustrietechnik G m b H , Essen) danken wir fur TEM-Aufnahmen rnit Hitachi H 60012 bei 100 kV. Dr. B.
Teschc (Fritz-Haber-lnstitut. Berlin) danken wir fur TEM-Aufnahmen mil
dem Siemens Elmiskop 102 bei 100 kV und D E E K O 100 bei 100 kV. Drs.
R. Brund. B. M. Desp<zrwou.r. A . h-reund, U . Ohlrogge (Degussa AG. Hanau) danken wir fur die Uberlassung der Katalysator-Testvorschriften und
fur Edelmetallchemikalien.
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