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Chemoenzymatische Synthese eines zweifach modifizierten Pentasaccharids als Substrat fr einen -Amylase-Assay durch Fluoreszenzlschung.

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ZUSCHRIFTEN
Tabelle 1. Ausgewahlte spektroskopische Daten der Allyl- und Butadienyl-Komplexe 8, 9, 12 und 13 (ohne 'H- und 13C-NMR-Daten fur Phosphanliganden und
Phenylgruppen; zur Bezeichnung: C' - dort H' - ist stets das substituierte C-Atom
des Allyl- oder Butadienylliganden; C2, C3, C4 dann fortlaufend; H3 in syn- und H4
in anti-Stellung zu H').
8: 'H-NMR (400 MHz, C6D6): 6 = 5.28 [ddd, J(H2H4)= 12.2, J(H'H2) = 10.7,
J(H2H3) = 6.7 Hz, H2], 3.40 [dd, J(H'H2) = 10.7, J(PH) =7.7 Hz, HI], 3.12 [ddd,
J(H2H3) = 6.7, J(PH) = 3.8 und 2.2 Hz, H 3 ] , 2.09 [dd, J(H2H4) = 12.2.
J(PH) = 5.6 Hz, H41; "C-NMR (100.6MHz, C,D,): 6 = 99.90 (m, C'), 65.03
[ddd, J(RhC) = 27.6, J(PC) = 6.9 und 2.7 Hz, C ' ] . 46.24 [ddd, J(RhC) = 21.0,
JPC) = 9.4 und 5.2 Hz, C3]; "P-NMR (162.0 MHz, C,D,): 6 = 56.51 [dd,
J(RhP) =198.0, J(PP) = 22.0 Hz], 46.20 [dd, J(RhP) = 189.5, J(PP) = 22.0 Hz]
9: 'H-NMR (400 MHz, C6D6): 6 = 4.86 [dddd, J(RhH) = 2.1, J(H2H4)= 12.6,
J(H'H2) = 8.2, J(H2H3)= 8.0 Hz, H'], 3.86 [m, im 1H{3'P} ddd, J(H'H2) = 8.2,
J(PH) = 3.6 und 3.6 Hz, H'], 2.74 [m, im 'H{31P} d, br., J(H2H3)= 8.0 Hz, H'],
2.05 [dd, br., J(H2H') = 12.6, J(PH) = 8.2 Hz, H4]; ')C-NMR (100.6 MHz,
C,D,): 6 = 95.06 [ddd, J(RhC) = 5.7, J(PC) =1.2 und 1.2 Hz, C2], 76.62 [ddd,
J(RhC) = 25.9, J(PC) =10.6 und4.4 Hz. C ' ] , 45.04 [ddd, J(RhC) = 29.9, J(PC) =
8.3 und 5.2 Hz, C'], 35.18 [dd, J(RhC) = 0.9, J(PC) = 3.3 Hz, C(CH,),], 34.40 [d,
J(PC) = 1 . 9 H ~ , C(CH3)J; 31P-NMR (162.0MH2, C,D,): S = 49.02 [dd,
J(RhP) = 206.7, J(PP) = 19.1 Hz], 47.85 [dd, J(RhP) = 21 1.8, J(PP) = 19.1 Hz]
12: 'H-NMR (400 MHz, C,D,): 6 = 6.34 (m, H I ) , 4.71 (m, H 2 ) , 3.13 [ddd,
J(H2H3) =7.4, J(PH) = 2.5 und 2.5 Hz, H3), Signal von H 4 von PCH-Signal verdeckt; l3C-NMR (100.6 MHz, C,D,): 6 =171.23 (m, C'), 111.81 (s, C ' ) , 78.74 [d,
J(RhC) = 3.9 Hz, C'], 47.94 [ddd, J(RhC) = 25.1, J(PC) = 5.9 und 4.9 Hz, C4];
"P-NMR (162.0 MHz, C6D6): 6 = 52.80 [dd, J(RhP) = 197.0, J(PP) = 21.9 Hz],
46.80 [dd, J(RhP) =160.5, J(PP) = 21.9 Hz]
13: 'H-NMR (400 MHz, C,D,): 6 = 5.14 (m, H I ) , 4.50 (m. H 2 ) , 2.98 [ddd,
J(H'H3) = 8.0, J(PH) = 2.6 und 2.6 Hz, H3], 1.93 [dd, J(H2H4) =11.7, J(PH) =
6.7 Hz, H41, 1.30 (s, C(CH,),); I3C-NMR (100.6 MHz, C,D,): 6 =160.96 [ddd,
J(RhC) = 43.8, J(PC) = 18.3 und 9.2 Hz, C'], 120.26 ( s , C ' ) , 76.99 [d. J(RhC) =
4.0 Hz. C'l, 47.55 [ddd. J(RhC) = 26.4, J(PC) = 6.9 und 5.7 Hz, C'], 34.19 [d,
J(PC) = 5.6 Hz, C(CH3),], 31.24 (s. C(CHd3); "P-NMR (162.0 MHz, C,D,):
6 = 52.24 [dd, J(RhP) = 196.8, J(PP) = 20.9 Hz], 48.03 [dd, J(RhP) = 164.6,
J(PP) = 20.9 Hz]
16
CHjCOzH
13
-
H,
c=c
H'
,H
'c=c
H'
18
Schema 4. L
=
17
iBu
17
'H
+
Pz?r3.
HC=CR, R'MgX und CH,CO,H regio- und stereoselektiv ein
Olefin RCH = C H R (R = Ph, tBu; R = Me, CH = CH,) entsteht.
trans-[RhH(C~CR)(q2-02CCH3)(PiPr3),]
I
Vorversuche weisen darauf hin, daI3 sich die ,,Metallabutatriene" K[l4] gegenuber Grignard-Reagentien ahnlich wie die
Vinylidenkomplexe 1-3 verhalten und die Vinyl-Derivate L
ebenfalls Umlagerungsreaktionen eingehen. Es ist damit zu erwarten, daI3 durch Rhodium-assistierte C-C-Verknupfung noch
hoher ungesgttigte Kohlenwasserstoffe als 18 erhaltlich sind.
truns-[RhCl( =C=C=CR,)(PiPr,),]
K
zrans-[Rh(CH = CH,)( = C = C = CR,)(PiPr,),]
L
Eingegangen am 19. Januar 1995 [Z 76421
Stichworte : Allylkomplexe . Isomerisierungen . KohlenstoffKohlenstoff-Verknupfungen . Vinylidenkomplexe
Angew. Chem. 1995, 107,Nr. 11
[I] a ) R . Mahe, Y.Sasaki, C. Bruneau, P. H. Dixneuf, J. Org. Chem. 1989, 54,
1518-1523; b) V. C. Gibson, G. Parkin, J. E. Bercaw, Organometallirs 1991,
10,220-231; c) B. M. Trost, J. A. Flygare, J. Am. Chem. Soc. 1992,1f4,54765477.
[2] a) A. G. M. Barrett, J. Mortier, M. Sabat, M. A. Sturgess, Organomelallies
1988,7,2553-2561; b) S. Feracin, H.-U. Hund, H. W. Bosch, E. Lippmann, W.
Beck, H. Berke, Helv. Cbim. Aeia 1992, 75, 1305-1312; c) B. M. Trost, J. A.
Martinez, R. J. Kulawiec, A. F. Indolese, J. Am. Chem. SOC.
1993, f15, 1040210403; d) C. Bianchini, L. Glendenning, M. Peruzzini, A. Romerosa, F. Zanobini, J. Chem. Sor. Chem. Commtm. 1994, 2219-2220.
[3] Chloro-Komplexe: a) H. Werner, F. J. Garcia Alonso, H. Otto, J. Wolf, Z .
Naturforscb. E 1988, 43, 722-726; b) H. Werner, U. Brekau, ibid. 1989, 44,
1438-1446; c) T. Rappert. 0.Nurnberg, N. Mahr, J. Wolf, H. Werner, Organometallics 1992, il, 4156-4164; d) T. Rappert, 0. Nurnberg, H. Werner, &id.
1993, f2,1359-1364; e) H. Werner, M. Baum, D. Schneider, B. Windmiiller,
ibid. 1994, 13, 1089-1097.
[4] Acetato-Komplexe: a) M. Schafm, J. Wolf, H. Werner, J. Chem. Soc. Chem.
Commun. 1991,1341-1343; b) J. Orgattomet. Chem. 1995,485.85-100; c) M.
Schlfer, Dissertation, Universitat Wiirzburg, 1994.
[5] M. Schafer, N. Mahr, J. Wolf, H. Werner, Angew. Cbem. 1993, f05.1377-1379;
Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993.32, 1315-1317.
[6] R. Wiedemann, P. Steinert, M. Schafer, H. Werner, 1 Am. Chenl. SOC.1993,
f15,9864-9865.
[7] Uber die ubertragung einer briickenbildenden Methylgruppe auf einen an
Iridium gebundenen Vinylidenliganden unter Bildung einer Allyleinheit wurde
schon friiher berichtet: M. D. Fryzuk, L. Huang, N. T. McManus, P. Paglia.
S. J. Rettig, G. S . White, Organornetallies 1992, 1 1 , 2979-2990.
[8] H. Werner, M. Schafer, 0. Niirnberg, J. Wolf, Chem. Eer. 1994, 127,27-38.
191 Zur Nomenklatur und thermodynamischen Stabilitat der synlanti-Isomere siehe: a) G. Wilke, B. Bogdanovic, P. Hardt, P. Heimbach. W. Keim, M. Kroner,
W. Oberkirch, K. Tanaka, E. Steinriicke, D. Walter, H. Zimmermann, Angew.
Cbem. 1966,78,157-172; Angew. Chem. Inl. Ed. Engl. 1966,5,151-166;b) K.
Vrieze, H. C. Volger, P. W. N. M. van Leeuwen, Inorg. Chim. Acta, Rev. 1969,
109-129; C) R. P. Hughes in Comprehensive Organometallic Chemistry, Vol. 5
(Hrsg.: G. Wilkinson, F. G. A. Stone, E. W. Abel), 1. Aufl., Pergamon, Oxford, 1982, S. 492-540.
[lo] J. Wolf, H. Werner, Organometallics 1987, 6, 1164-1169.
[Ill S. A. Benyunes, R. J. Deeth, A. Fries, M. Green, M. McPartlin, C. B. M. Nation, J. Cbem. Sor. Dalton Trans. 1992, 3453-3465, zit. Lit.
[12] Charakterisierung durch Vergleich der NMR-Daten: A. L. Segre, L. Zetta, A.
Di Corato, J. Mol. Spectrmc. 1969, 32, 296-308.
[I31 H. Werner, M. Schafer, J. Wolf, K. Peters, H. G. von Schnering, Angew. Chem.
1995,107,213-215; Angew. Cbem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 191-194.
[I41 a) H. Werner, Nachr. Cbem. Tech. Lab. 1992, 40, 435-444; b) H. Werner, T.
Rappert, R. Wiedemann, J. Wolf, N. Mahr, Organomerallics 1994. 13, 2721 2721.
Chernoenzymatische Synthese eines zweifach
modifizierten Pentasaccharids als Substrat
fur einen a-Amylase-Assay durch Fluoreszenzloschung * *
Nathalie Payre, Sylvain Cottaz und Hugues Driguez*
Die rneisten Lebewesen, z.B. Mikroorganisrnen, hohere Pflanzen und Tiere, gewinnen Energie durch Metabolisierungvon Starke. An diesem Abbau sind Endoglucanasen, wie cr-Amylase (1,4a-D-Glucanglucanohydrolase, [EC 3.2.1.I]),
sowie Exoglucanasen, wie Gluco-Amylase [EC 3.2.1.31 und /3-Amylase [EC 3.2.1.21,
mal3geblich beteiligt['l.
Der Nachweis und die Bestimmung der cr-Amylase-Aktivitat
sind nicht nur fur katalytische Studien von Bedeutung, sondern
[*] Dr. H. Driguez, N. Payre, Dr. S . Cottaz
Centre de Recherches sur les Macromolecules Vegetales (CERMAV-CNRS)
BP 53 X, F-38041 Grenoble cedex 9 (Frankreich)
Telefax: Int. f76547203
E-mail: hdriguez(a)cermav.grenet.fr
[**I Diese Arbeit wurde vom Centre National de la Recherche Scientifique (Frankreich) und vom European Biotech Program (1994- 1996) gefordert. Wir danken Prof. P. Jardon (U.J.F. Grenoble) fur seine Hilfe bei der Aufnahme der
Fluoreszenzspektren.
c>VCH Verlugsgese1"rchaft mbH, 0-69451 Weinbeim, 1995
oU44-s249195jllll-1361 $ fU.OO+ .25/0
1361
ZUSCHRIFTEN
auch fur technische und medizinische Anwendungen, beispielsDas Design von 1 war aus mehreren Grunden naheliegend:
weise fur Garungsprozesse und fur die Diagnostik von KrankMaltopentaose ist das am besten geeignete Substrat fur unser
heiten wie Parotitis (Entzundung der Ohrspeicheldruse) und
Modellenzym, die a-Amylase aus Schweinepankreas (porcine
akuter Pankreatitis (Entziindung der Bauchspeicheldruse) . Im
pancreatic a-amylase, PPA)['], der Emissionsbereich des Fluoroallgemeinen sind spezifische Substrate erforderlich, um die Enphors 3-(2-Hydroxyethyl)indol (Indolethanol) im angeregten Zudo- und Exoglucanasen zu unterscheiden, die gleichermaoen die
stand (,I,,,
=
,,345 nm) und der Absorptionsbereich von 5-(2-Amia-(1 + 4)-glycosidische Bindung in ~-Glc-a-(I+ 4 ) - ~ - G k - noethylamin0)-I -naphthalinsulfonat (EDANS) (A,, = 340 nm)
Einheiten angreifen. Ein Uberblick uber die Veroffentlichungen
uberlappen ausgezeichnet. Trotz der relativ geringen Lebensdauer
seit Mitte der achtziger Jahre verdeutlicht den betrachtlivon angeregtem Indolethanol(2 ns) ist die Effizienz der Fluoreschen Arbeitsaufwand, der notig war, um dieses Ziel zu erreizenzloschung ~ufriedenstellend[~].
Das EDANS/Indolethanolchenr2].
Paar wurde auch aufgrund von Uberlegungen zur Synthese geDie spezifischen Substrate konnen in zwei Gruppen unterteilt
wahlt : Unsere Strategie erfordert einen Fluorophor mit einer
werden: sofche rnit einem Chroinophor oder einem Fluorophor,
Aminofunktion, die rnit dem Oligosaccharid eine Aminobindie in den meisten kommerziell erhaltlichen Diagnostik-Kits
dung eingeht, und einen anderen Fluorophor rnit einer aliphativerwendet werden, und solche rnit einer fluoreszenzloschenden
schen Hydroxygruppe fur eine Etherbindung. Diese beiden BinGruppe. Die chromophortragenden Substrate sind im allgemeidungen sind unter den Bedingungen der enzymatischen Assays
nen Nitrophenylmaltooligosaccharide, die an ihrem nichtwesentlich stabiler als Esterbindungen['].
reduzierenden Ende blockierende Gruppen tragen, um einen
Verbindung 1 wurde chemoenzymatisch hergestellt (ScheAngriff der Exoenzyme zu verhindern. Der Nitrophenyl- und
ma 2 ) ; diese Methode ist fur die Synthese von regiospezifisch
der blockierende Substituent werden durch anspruchsvolle
modifizierten Oligosacchariden sehr nutzlich['O1.Die Schlusselmehrstufige Reaktionen und/oder Verfahren, die zu den Prostufen der Synthese von 1 sind die a-Amylase-katalysierte Verdukten in niedrigen Ausbeuten fuhren, eingefuhrt. Dies geknupfung des modifizierten a-Maltosylfluorid-Donors 7 mit
schieht entweder durch chemische Synthese ausgehend von
dem Indolylethylmaltotriosid 10 und die Oxidation des PentaMaltodextrinen rnit geeignetem Polymerisati~nsgrad[~l
oder
saccharids 11 durch Galactose-Oxidase [EC 1.1.3.91, so darj
durch chemoenzymatische Methoden ausgehend von modifizierten linearen oder cyclischen DextrinenL4I.Da diese Substrate
enzymatisch nicht an der reduzierenden Einheit hydrolysieren,
miissen a- oder P-Glucosidase und Gluco-Amylase beim Assay
zugegeben werden, um Nitrophenol aus den zuruckbleibenden
Nitrophenylmaltooligosacchariden abzuspalten. Nicht nur diese
nNachteile sind kostspielig; Schwierigkeiten sind auch wegen der
2, R = H
4, R' = OAC ; R' = H ; R3 = AC ; R4 = BZ
Vielzahl moglicher Nebenreaktionen zu envarten.
a
3. R = SQCH3
Diese Schwierigkeiten sollten bei spezifischen Substraten mit
5, R' = H ; R2 = F ; R3=Ac; R4 = Bz
einer fluoreszenzloschenden Grume.
- _ bei denen die Anderunn
d
R1=H;P=F;R3.@=Ac
der Fluoreszenz zwischen einem Fluorophor/Quencher-Paar im AcO
%cA
gleichen
Molekul
anhand
des
intramolekularen
resonanten
Ener7, R1 = H ; R2 = F ; R 3 , @ =H
gietransfers verfolgt werden kannL5],nicht auftreten. Diese StraAcO
tegie ist analog zu der, die fur den spezifischen Assay von Proteasen entwickelt wurdet6],und wurde erstmals von Omishi und
I
Br
Ikenaka verfolgt, die ein zweifach substituiertes Maltopentaosid
durch eine komplexe chemoenzymatische Synthese herstellten"]. In einer kurzlich erschienenen Veroffentlichung beschrieben Bock et al. die Herstellung acylierter Maltotrioside['], die
pH-empfindlich und schlechte Substrate fur a-Amylasen sind.
3
Der Wert von Substraten mit intramolekularer Fluoreszenzloschung wird hier durch die Fahigkeit bestatigt, a-Amylase-Aktivitaten durch Fluoreszenzspektroskopie spezifisch nachzuweiHO
sen. Dabei wird als Substrat das Indolylethyl- sowie 5-(2-Aminoethy1amino)-I-naphthalinsulfonat-substituierteMaltopentaosid 1
in mikromolaren Konzentrationen eingesetzt (Schema 1).
,
Emission
(Amax = 490 nm)
~
intramolekularer
Energietransfer
i
k 1 2 , R=CHO
Anregung
(Amax= 290 nm)
1
H
Schema 1 , Fluoreszenzlaschung und intramolekularer Energietransfer bei Verbin
dung 1. Nach Anregung bei 290 nrn tritt eine Fluoreszenz bei 490 nm auf.
1362
0 VCH
Verlngsgesellschrrft mbH. 0-69451 Weinheim, 1995
1, R = CH2NHCbCHzNH
-w
Schema 2. Synthese des Pentasaccharids 1. a) MeSO,CI, Pyridin, 0°C + Raumtemperatur, 94%; b) Natriumbenzoat, Hexamethylphosphorsluretriarnid, 110 "C,
52 % : c) HF/Pyridin, 0 "C, 86 % ; d) NaOMe/MeOH, dann Ac,O, Pyridin, 90 % ;
e) NaOMe/MeOH, quant.; f ) 3-(2-Hydroxyethyl)indol, Hg(CN), , HgBr,, Toluol/
MeNO,, 44%; g) NaOMe/MeOH, quant.; h) a-Amylase (Aspergillus oryzae).
MeOH/Phosphatpuffer, 59 % ; i) Galactose-Oxidase (Duclylium dendroides), Katalase (Rinderleber), Phosphatpuffer, 37 " C ; j) EDANS, MeOH, RiickfluO, dann
NaBH,CN, i)-j) 54 % Gesamtausbeute.
0044-8249/95/ffff-f362
$ fO.OO+ .25/0
Angen,. Chem. 1995, 107, N r . 1f
ZUSCHRIFTEN
EDANS am nichtreduzierenden Ende des Oligosaccharids regiospezifisch eingefiihrt werden kann. cc-D-Galactosyl-(1 + 4)a-D-ghcosylfluorid 7 und Indolylethylmaltotriosid 10 werden
durch konventionelle Umsetzungen aus Hexd-0-acetylmakose
2["] und Maltotriosylbromid 8 erhalten1121(Tabelle 1).
Tabelle 1. Physikalische und spektroskopische Daten von 1, 3-6, 9 und 11.
NBA = 3-Nitrobenzylalkohol.
3: Schmp. 197-399°C; [a]? = f 5 0 (c = 0.5 in CHC1,); 'H-NMR (300 MHz,
CDCI,): 6 = 5.80 (d, 'J(H-l',H-2') = 8.04Hz, 1 H; H-1'), 5.36 (d, 'J(H-l',H2') = 4.02 Hz, 1 H; H-12), 3.00 (s, 6 H; 2 x CH,SO,), 2.00 (m, 18H; 6 x CH,CO);
I3C-NMR (75.4 MHz, CDCI,): S = 95.50 (C-I'), 91.00 (C-l'), 38.50 und 37.50
(2xCH,SO,); C,,H,80z,S, (750.5): her.: 41.61, H 5.10, S 8.54; gef.: C 41.46, H
5.08, S X.4X.
4: Schmp. 165-166°C; [a];' = +62 (c = 0.49 in CHCI,); IH-NMR (300MHz,
CDCI,): 6 = 8.05-7.50 (m, 10H; Ph), 5.83 (dd, 3J(H-3z,H-42)= 3.2 Hz, 'J(H4',H-5') cl Hz, I H ; H-42),5.73 (d, 3J(H-11,H-21)= 8.1 Hz, 1 H ; H-I]), 5.55 (d,
'J(H-I2,H-2') = 3.7 Hz, I H ; H-I*), 5.40 (dd, I H ; H-32), 5.30 (t, 'J(H-Z1,H3l) = 3J(H-3',H-41) = 9.5 HZ, 1 H ; H-3'), 5.23 (dd, 'J(H-2',H-3') =7.3 Hz, 1H;
H-22), 4.95 (dd, 1 H; H-2'). 4.53 (dd, *J(H-6a1,H-6b') =12.3 Hz, 'J(H-5I,H6b') = 2.5 Hz, 1 H; H-6b1), 4.48 (dd, 'J(H-6a2,H-6b2) = 9.3 Hz, 1 H; H-6b2),4.42
(ddd, 1 H; H-5'), 4.26 (dd, 'J(H-5',H-6a2) = 4.0 Hz, 1 H ; H-6aZ),4.20 (dd, ,J(H5',H-6a1) = 4.6 Hz, 1 H; H-6a1), 4.05 (t, 3J(H-41,H-5') = 9.5 Hz, I H ; H-4'), 3.80
(ddd, 1 H; H-5'). 2.07-1.93 (In, 18H; CH,CO); C,,H,,O,, (802.7): ber.: C 56.86,
H 5.27; gef: C 56.65, H 5.25.
5 : Schmp. 113-114°C; [.I;'
= +91 ( c = 0.5 in CHCI,); ' T - NM R (75.4MHz,
CDCI,): 6 =170.62, 169.93, 169.76, 169.56 (5 x CO, Acetate), 165.52, 165.26
( 2 x C 0 , Benzoate), 103.4 (d, 'J(C-l',F) = 229 Hz; G I 1 ) , 96.0 (C-I*), 20.66,
Die intramolekulare Fluoreszenzloschung in 1 wurde in ersten Experimenten nachgewiesen: Nach Anregung bei 290 nm
ist die bei 490 nm emittierte Fluoreszenz von EDANS in 1 12mal
intensiver als die von freiem EDANS. Die Konzentrationen betrugen jeweils 10 PM. Dariiber hinaus stellten wir eine Abnahme
der Emissionsintensitat von Indolylethyl bei 345 nm um den
Faktor fiinf fest. Bei dieser Konzentration konnen wir davon
ausgehen, darj die Anderung der Fluoreszenzintensitat infolge
von Loschung durch Kollision zu vernachlassigen ist. Tatsachlich nimmt die Intensitat der Fluoreszenz von freiem EDANS
bei 490 nm in Gegenwart des Indolylethylpentasaccharids 11
urn 2% zu, wenn die EDANS-Konzentration von 10 auf 20 VM
erhoht wird.
Inkubiert man eine S ~ Losung
M
von 1 rnit PPA, nimmt die
Intensitat der Fluoreszenz bei 490 nm schnell ab. Nach 6 min ist
das Substrat vollstandig hydrolysiert (Abb. 1). Eine HPLCAnalyse zu diesem Zeitpunkt bestatigt die vollstandige Umwandlung von 1 in zwei kiirzere Oligosaccharide (EDANS-Galactosyl-a-(I 4)-maltose und Indolylethylmaltosid; Vergleich
der Retentionszeiten mit denen authentischer, unabhangig hergestellter Standards).
--f
80
-
Abb. 1. Zeitlicher Verlauf der PPA-katalysier20.45,20.39,20.29,20.18(5xCH,CO);C,,H,,F0,,(762.7):ber.:C56.69,H5.15,ten Hydrolyse von 1, verfolgt anhand der relativen
F 2.49; gef.: C 56.39, H 5.10, F 2.50.
Fluoreszenzintensitat Z,,,
6 : Schmp. 117°C; [&' = +I09 ( c = 0.5 in CHCI,); "C-NMR (75.4MHz,
bei 490 nm durch Steadyrei 40 :
CDCI,): 6 =170.64-169.51 ( 7 x C 0 , Acetate), 103.4 (d, lJ(C-ll, F ) = 229 Hz;
,-.,. ., .**
State-Fluoreszenz. Eine
C-l'), 95.9 (C-1'). 20.61-20.21 (7x CH,CO): C,,H,,FO,, (638.6): her.: C 48.91,
",
S U M Losune von 1 in
H 5.52, F 2.98; gef.: C 48.77, H 5.52, F 2.91.
Phosphatpufjer
(0.02
M,
20
9: [a]? = +58.5 (c = 0.9 in CHCI,); "C-NMR (75.4 MHz, CDCI,): 6 = 170.33pH =7) wurde rnit PPA
0
2
4
6
169.19 (IOxCO, Acetate). 135.94, 122.04, 121.66, 119.06, 118.43, 112.12, 110.88
(Sigma, 100 UL-') bei
(Indol), 99.97 (C-1'). 95.46 (C-l', C-1'1, 62.84, 62.15, 61.19 (C-6', C-6', C-6'),
30 "C inkubiert [16].
t/rnin
25.32 (OCH,CH,), 20.61-20.19 (10 x CH,CO); FAB-MS (NBA + KCI, positiv):
mjz: 1067[M+];C,,H,,NO2, (1068.0): her.: '253.98, H5.76, N 1.3l;gef.: C 53.90,
H 6.04, N 1.45.
Wird das gleiche Experiment rnit unterschiedlichen Konzen11: [.It5
= +99 ( c = 0.54 in H,O); 'H-NMR (500 MHz, D'O): 6 =7.63-7.08 (m,
5H ; Indol), 5.27, 5.25, 5.24, 5.22 (Jeweilsd, 4 H ; H-l', H-i3, H-14, H-15), 4.26 (d,
trationen an a-Amylase durchgefiihrt, wird ein h e a r e r Zusam'J(H-11,H-2') = 8.04 Hz, 1 H ; H-1'); FAB-MS (NBA KCI, positiv): mjz: 972
,I_.
-
+
W+I.
1: [a12 = +87 (c = 0.42 in DMSO); 'H-NMR (500 MHz, D20): 6 = 8.20-6.75
(m, 11H; H Arom.), 5.20 (d, 'J(H-l',H-2') = 3.83 Hz, 1 H ; H-l'), 5.16 (d, 3J(HI"H-2,) = 3.83 Hz, 1 H ; H-13)),5.05(d, 3J(H-14,H-24)= 3.97 Hz, 1 H ; H-14), 4.94
(d, 'J(H-I5,H-2') = 3.28 Hz, 1 H; H-15), 4.73 (d, J = 2.25 Hz, 1 H; H-4'), 4.10 (d,
'J(H-l1,H-2') =7.95 Hz, I H ; H-1'); FAB-MS (positiv): mjz: 1246.364, her. fur
C,,H,,N,NdO,,S [ M - H,O Nat]: 1246.371.
+
Die Glycosylierung von 10 rnit 7 wird unter Bedingungen
durchgefiihrt, die ursprunglich von Kobayashi et a]. fur die enzymatische Polymerisation von a-Maltosylfluorid mit a-Amylase als Katalysator beschrieben ~ u r d e n ~ 'Unter
~ ] . diesen Reaktionsbedingungen wurde 11 in 78 % Ausbeute erhalten
(bestimmt durch HPLC, 59 % isolierte Ausbeute; Tabelle 1).
Die Epimerisierung an der 4'-Position bei der Bildung von 4 ist
aus zwei Griinden von Vorteil: Erstens wird 7 von der a-Amylaseals Donor akzeptiert, aber weder 7 noch 11 als Acceptoren, da
sich am nichtreduzierenden Ende jeweils eine axiale 4-OHGruppe befindet. Daher wird nur ein Disaccharidbaustein addiert und man erhalt 11 in guter Ausbeute. Zweitens kann 11 an
C-6 des nichtreduzierenden Galactosylrestes durch GalactoseOxidase/Katalase regiospezifisch zum Aldehyd 12 oxidiert werso daD die EDANS-Gruppe im letzten Schritt durch
reduktive Aminierung unter Bildung von 1 in 54% isolierter
Ausbeute eingefiihrt werden kann (Tabelle 1).
Angew. Chem. 1995, 107, N r . 1 1
0 VCH
menhang zwischen der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse
von 1 und der Enzymkonzentration erhalten. Dagegen waren
a-Galactosidase, /&Amylase,a-Glucosidase und Gluco-Amylase unter optimalen Bedingungen inaktiv" 'I.
Verbindung 1 ist also das erste spezifische, empfindliche und
leicht erhaltliche Substrat fur den In-vitro-Assay der a-Amylasen im Speichel und im Pankreas des Menschen. Weiterfiihrende
Untersuchungen mit 1 sowie zur Herstellung von Substraten mit
verbesserten Eigenschaften werden derzeit durchgefiihrt.
Eingegangen am 28. Dezember 1994 [Z 75911
Stichworte :a-Amylase-Assay . Chemoenzymatische Synthesen .
Enzyme . Fluoreszenz . Oligosaccharide
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Verlagsgesellschaft mbH, 0-69451 Weinheim, 1995
0044-8249/95/1111-1363$10.00+ .25/0
1363
ZUSCHRIFTEN
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Res. 1968, 7 , 193-199.
1364
(-3
1151 Fur die verwendete Gluco-Amylase (Sigma) wurde eine geringe hydrolytische
Aktivitlt festgestellt, die einer Verunreinigung mit a-Amylase zuzuschreiben
ist.
[I61 Die Aktivitat der &-Amylase ist kiirzlich mit dem Amylase-Diagnostic-Kit
als Substrat bestimmt
(Sigma) und Nitrophenyl-4,6-ethylidenmaltoheptaosid
warden.
Berichtigung
In der Zuschrift ,,Bildung und Struktur neuer Metallo- und
Metallapolysulfane [MS,]+ (J = 2-16)" von I. Dance, K.
Fisher und G. Willett (Angew. Chem. 1995,107,215)mu13 in der
Legende zu Abbildung 1 der Nebensatz ,,d. h. nach der volligen
Umsetzung von Mn'" gestrichen werden. Die Struktur rechts
oben in Abbildung 4 entspricht dem [CuS,,]+-Isomer 3d und
nicht 3b.
VCH VerlagsgeselischafimbH, 0-69451 Weinheim, 1995
0044-8249/95/111i-1364$ iO.OO+ ,2510
Angew. Chem. 1995, 107, N r . 11
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