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Chromatographie an Carboxyl-Papier.

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Chromatographie an Carboxyl-Papier
Von T H E O D O R W I E L A N D und A . B E R G 1 )
Aus dem Organisch-Chemischen Institut der Universitat Mainz
Chromatographische Untersuchungen rnit Filtrierpapieren rnit einern Carboxyl-Gehalt von 1 bis 4%
gaben sowohl bei Arninosauren als auch bei Aminen und anorganischen lonen aussichtsreiche Ergebnisse.
Nach E. C . Yackel und 0. Kenyon2)IaBt sich ein Teil der
Glucose-Reste der Cellulose rnit Distickstofftetroxyd zu
Uronsauren oyxdieren. Die Makromolekel erhalt dadurch
den Charakter einer polyvalenten Carbonsaure, die als
Yationenaustauscher reagieren kann3). Wird die Oxydation uber einen Gehalt von 5% COOH (etwa jeder 5 .
Glukan-Baustein am Kohlenstoff 6 oxydiert) hinausgetrieben, so resultieren Praparate, die schon bei einem pFI
von 8-9 als Alkalisalze inwasser Ioslich sind und sich deshalb nur im saueren Gebiet zur Chromatographie eignen.
In Zusammenarbeit mit der Zellstoff-Fabrik Waldhof wurden deshalb Filtrierpapiere entwickelt, deren CarboxylGehalt I-4% betrug. Die vergleichende Carboxyl-Bestimmung geschah durch Titration der von 0,3-0,5 g Papier aus 50 cm3 einer waBrigen 4proz. Calciumacetat-Liisung nach 30 min in Freiheit gesetzten Essigsaure4). Auf
solchen Papierbogen konnten einige Substanzgemische erfolgreich chromatographisch getrennt werden.
Ami nosau ren
Im Wasser als Ldsungsmittel bleiben die basischen
Aminosauren fast vollig a m Auftragungspunkt zuruck,
wahrend die neutralen und sauren rnit der Losungsmittelfront wandern. Verwendet man an Stelle von Wasser waBrige Pufferlosungen von p H 8 oder basische, so wandern
auch hierbei die saueren und neutralen rnit Rf
1 , aber
die basischen setzen sich mit verschiedener Geschwindigkeit in Bewegung. Dabei zeigt H i s t i d i n als schwachstbasische Aminosaure ( P I 7,59) den grofiten, L y s i n ( p l 9,74)
den mittleren und A r g i n i n (PI 10,76) den kleinsten RfWert. In Bild 1 sind diese Werte bei Verwendung von
m/20 Ammoniumformiat als Entwicklungsflussigkeit a m
1 % COOH-haltigen Papier fur die drei Aminosauren in
Abhangigkeit von pH dargestellt.
-
“1
49
anders zu erwarten ist, von der Ionenstarke des Puffers
und dem Gehalt des Papiers an austauschenden Gruppen
beeinflufit. In Bild 2 ist diese Abhangigkeit des Rf-Wertes
beim Arginin von der Konzentration des Puffers und dern
Carboxyl-Gehalt des Papiers aufgezeichnet.
PH
% COOHBild 2
Rf-Wert des Arginins in Abhangigkeit vom COOH-Gehalt des Papiers
und d e r Molaritlt des Puffers (Ammoniumformiat, p~ 9 )
Fur die Praxis eignet sich als Entwicklungsflussigkeit
am besten eine m/20 Ammoniumformiat-Losung vom p11 9.
Ein damit aufsteigend ausgefuhrtes Papierchromatogramm
der basischen Aminosauren im Vergleich mit Asparaginsaure und Leucin auf 1 yo-COOH-haltigem Papier ist nach
Sichtbarmachen der Flecken mit Ninhydrin in Bild 3
wiedergegeben.
m/20 HCOONH~
7% COOH
”
‘
t
O7
9
8
PH
Bild I .
70
----).
Abhangigkeit d e r Rf.Werte vom p~
Wie man sieht, erweist sich das pH von 9 als optimal zur
Trennung. AuBer vom pH werden die Rf-Werte, wie das
beim Vorliegen eines Ionenaustauschmechanismus nicht
I)
2,
3,
4,
Teii d e r Dissert. A. Berz, Mainz, 1952.
J. Amer. Chem. SOC. 6 4 , 121 119421; U.S.-Pat. 2232990, vorn
25. 2. 1941.
0.F. Douidson, J. Text.-Inst. 39, 187 [1948]; 41, 361 [1950].
M. L u d t k e , Biochem. Z. 269, 372 119341.
4 18
Bild 3
Papierchromatogramm verschiedener Aminosauren auf 1 yo COOHhaltigem Papier m i t Ammoniumformiat-Losung (m/20, pH 9 ) als
Entwicklungsflussigkeit
Angew. Chem. I 64. Jahrg. 1952
N?.15
Zuni Beweis dafur, dall die Trennung auf einer Wirkung von
Carboxyl-Gruppen bcruht, haben wir das Papier einige Stunden
mit Diazomethan in Ather behandelt, wonach die Carboxyl-Bestimmung negativ ausfiel und alle Aminosauren sioh mit der unregelmaWig wandernden Flussigkeitsfront fortbewegten.
Die Ubertragung der Befunde von Davidson (loc. cit.)
bei synthetischen Farbstoffen IaBt auch am CarboxylPapier bei dieser Stoffklasse gewisse Erfolge erwarten.
Ebenso erscheint seine Verwendung fur die Trennung von
Amine
Die papierchromatographische Trennung von Aminen
ist auf Carboxyl-Papier ebenfalls moglich. Wie in einigen
orientierenden Versuchen festgestellt wurde, lN3t sich
C y s t e a m i n vom H i s t a m i n glatt in der bei den basischen
Aminosauren bewahrten Salzlosung vorn gleichen PH abtrennen. Histamin zeigte hierbei Rf 0,16, Cysteamin Rf
0,45. Auch die Trennung einiger A l k a l o i d e aus Calebassen-Curare konnte ahnlich ausgefiihrt werden.
Anorganische lonen
Auch hier wurden nur eine Reihe orientierender Versuche ausgefiihrt, die die prinzipielle Anwendbarkeit des
Carboxyl-Papiers zeigen. Wie aus Bild 4 ersichtlich, lassen
sich z. B. Blei, Wismut und Quecksilber in m/10 Ammonacetat-Losung von PH 3 auf 1 ~o-COOH-haltigemPapier
scharf trennen. Das entwickelte, noch feuchte Chromatograrnm wurde in eine Atmosphare von H,S gebracht.
Silber hat sich bei dieser Pufferkonzentration vorn Blei
schlecht getrennt, kann jedoch im m/20 Puffer vom gleichen PH vom Blei abgetrennt werden, das dann fast am
Ausgangspunkt zuriickbleibt. Ein zweidimensionales Vorgehen fiihrt also hier leicht zum Ziel. Auch die Trennung
von Arsen, Antimon und Zinn ist bei PH 5 mit m/20 Ammonacetat-Losung gut moglich, worin Antimon als Antimonyl-Ion nahe dem Startpunkt bleibt und Arsen als
Arseniat etwa mit Rf 0,8, Zinn als Zinn(I1)-Ion mit Rf
1
wandein. Die systematische Durchpriifung weiterer Puffer- oder Salzlosungen, u. U. unter Zuhilfenahme komplexbildender Yomponenten wird sicherlich weitere Anwendungsmoglichkeiten des Carboxyl-Papiers bringen.
-
Bild 4
Papjerchromatogramm einiger Kationen auf 1 % COOH-haltigem
Papier m i t Ammomumacetat-Losung ( m / l O , p~ 3) entwickelt und
m i t H,S sichtbar gemacht
Peptiden mit verschiedenem Gehalt a n basischen Aminosauren aussichtsreich. Neben der Erleichterung gewisser
analytischer Aufgaben liegt der Wert des neuen Papiers
in der einfachen Ausfiihrung von Vorproben, da eine Ubertragung solcher Ergebnisse auf die praparative Chromatographie am Pulver aus demselben Material moglich ist.
Eingeg. am 5. Juli 1952
[ A 4421
Zuschriften
Kristallisation von Diphosphopyridinnucleotid
(Cozymase)
Vow Priv.-Doz. Dr. X U R T W A L L E N F E L S
und W A L T E R C H R I S T I A N
A us dent biochemisehen Laboratorium Tutzing der C. F . Boehritzger
& Soehne G. m . b. H . , Mannheini-Waldhol
Die Reinigung roher Cozymase-Praparate zu solchen hohen
Reinheitsgrades, wie sie fur gewisse enzymchemische Untersuchungen benotigt werden, ist eine muhsame u n d langwierige Laboratoriumsarbeit, bei welcher man von der fraktionierten Fallung
als Metallsalz, der Adsorption an Aktivkohlel), der Gegenstromverteilungz), der fraktionierten Elution aus I o n e n a u ~ t a u s c h e r n4,~ ~
bzw. von der Kombination mehrerer derartiger Schritte Gebrauoh
macht. Die Reinheitsbestimmung der so erhaltenen Praparate beruht auf der Bestimmung des Extinktionskoeffizicnten der hydrierten Verbindung ( D P N red) bei der Wellenlange 340 mp, den
man nach Reduktion rnit Natriumdithionit oder einem geeigneten
Enzym in Gegenwart eines entsprechenden Wasserstoff-Donators
messen kann. Der diesen Bestimmungen zugrunde liegende Extinktionskoeffizient e von reinem D P N red wird von versohiedenen Autoren verschieden hoch angegeben und schwankt zwisohen
6.3 und 9.4 cm%/mgs).Diese Differenzen beruhen offenbar darauf,
daO alle benutzteu Cozymase-Praparate amorph waren, so daW sich
d w wahre e-Wert bisher noch nicht sicher festlegen lielJ.
.I. biol. Chemistry 168, 623 [1947]; Biochemical
Preparation; New York. 1949 S. 28.
biol. Chemistry 176. 935 [1948].
3, J. B. Nrilands u. A k e Akeson, ebenda 1 8 8 , 307 [1951].
4, K. Wallenfels u . W . Christian, unveroffentlicht.
&) F . Schlenk, in Sumner-Myrbuck: The Enzymes, Vol. 11, P a r t 1
New York 1951, S . 263.
I )
Durch Anwendung geeigneter Bedingungen6) ist F S uns ge!ungen,
aus einem 75 %igen D P N des Handels7) den Wirkstoff als k r i s t a l l i s i e r t e s C h i n i n s a l z n a h e z u q u a n t i t a t i v abznscheiden. Hierbei bleiben das uberschussige Chinin, die das D P N hartnackig begleitenden anderen Nuklcotide und etwa 1 0 yo der DPNAktivitat in der Mutterlauge zuruck.
Das Chininsalz des D P N kristallisiert in feinen, meist zu facherund kugelformigen Buscheln angeordneten Nadpln (Bild 1). Es
weist einenDPN-Gehaltvon57
entsprechend cinemDPN : Ghinin-Verhaltnis vou 2 : 3, auf und scbmilzt zwischen 162 und 170° C
unter Zersetzung.
.Ox,
G. A. LePage,
Bild 1
Chininsalz des D P N
*) G. H . Hogebobm u. G. T . Barry, J.
Angeu. Chem.
1 64. Jahrg. 1952 1 N i . 16
6,
7)
Die ausfiihrliche Beschreibung erfolgt a. a. 0.
P r a p a r a t d e r Fa. C. F. Boehringer & Soehne G . m. b. H., Mannheirn-Waldhof.
419
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