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Darstellung des aktiven Derivates von Rinder-Trypsin-Kallikrein-Inhibitor (Kunitz) mit im reaktiven Zentrum geffneter Peptidbindung.

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YO iind 101 sowie [I b]
Z USCHRIFTEN
unterliegen die Inhibitoren bei der substratanalogen Bindung
an das Enzym einer teilweisen Proteolyse. Dabei wird die
Peptidbindung --P,-P',im reaktiven Zentrum". 'I geoffnet, und es entstehen modifizierte Inhibitoren I* mit noch
voller Hemmaktivitat. Diese Modifizierungsreaktion lie13 sich
bei den Trypsin-Kallikrein-Inhibitoren (Typ Kunitz) bisher
nicht feststellen". 2,41.
Es gelang unsjetzt, auch aus einem Inhibitor vom Typ Kunitz
die modifizierte Form I* darzustellen. Dazu reduzierten wir
Darstellung des aktiven Derivates yon Rinder-TrypsinKallikrein-Inhibitor(Kunitz) mit im reaktiven Zentrum
geoffneter Peptidbindung[**I
Von Helrnirt Jrriiig und Harciltl Tschesc.he[*]
Untcr den natiirlichen, niedermolekularen Proteinase-Inhibitoren 1". nimmt die Klasse der Trypsin-Kallikrein-Inhibitoren (Typ Kunitz)"." eine Sonderstellung ein. In der Regel
p;
AlaIb- .....Fys 3
p1
- c y s 5 ...... -Cys'4-Lys'5
I nativ
"-
I
I
......- c y s 3 8 - ~ ................................................
(aktiv)
cys51-
INaf3H,
1 red r r t i u z i c r t
(aktiv)
-Cys5...... -Cvs'4-Lys'5
1 ;;
I
-cys= .......-cy
2 0
-
A1a''-
.....C y s 3
...............................................
I
cys51
...... - C y ~ ' ~ - L y COOc€f3K@--Ala'6s~
.....Cys3"-
I red
j::
r e t l u z i e r t u.
modiiiziert
( m aktiv)
1'' rnotiifiziert
(aktiv)
.....................................................
cys51-
'-
--Cys5...... -Cys14--Lys -C 00°H3N@..Ala'6- .....C y s 3
I
I
I
-cyP
cys3 8- ...................................................
cys51-
Schema I
[*I
l ' r i v . - I h ~ .Dr. H. Tscheache und Dr. H . Jering
Organisch-Cliemisches Laboratorium,
Lxhi-atuhl f i r Organischc Chemie und Biochemie der Techniachen L'niverSitit
8 Miinchen 2. A r c i s a t r a k 21
[**I
Vorgetragen
;inlhlJlich dcr 2nd International Rcscarch Conference
..Proteinasc Inhibitors"
Bayer Symposium V. Crosae Ledder. Oktoher
1973. - Tell der Dissertation von H . Jc~riiiy. Diese Arbeit wurde von
der Deutschcn Forschungsgemeinschaft unterstbtrt. Wir danken f-rhulcin
C. f r r i i i h Kir die Durchluhriing der Aminosaure-Analysen. Der Bayer AG.
Wuppei-tal. danken wir Kir die iibertassung von Trasyloi@ (Trypsln-Kallikrcin@-lnhibilori K u n i t z ) atis Rinderltinge).
702
zunachst von den drei Disulfidbriicken selektiv die dem reaktiven Zentrum benachbarte Disulfidbrucke Cys 14-Cys 38 mit
NaBH4 in wa13riger Losung'''. Der selektiv reduzierte Inhibitor wird von Trypsin durch sukzessive Spaltung der Bindungen
Lys 15-Ala 16, Arg 39-Ala 40 und Arg 17-Ile 18 abgebaut,
wobei die Spaltung der ersten Bindung den lnhibitor inaktiviert[sl. Urn hauptslchlich nur die Bindung Lys 15-Ala 16
zu spalten, wurde selektiv reduzierter Inhibitor mit 20 Mol-%
Trypsin bei pH=3.7 unter 02-Ausschlu13 (zur Vermeidung
der Reoxidation der Disulfidbrucke Cys 14-Cys 38) nur so
Angew. Chrm. J 86. Jahrg. 1974
1 N r . 19
lange inkubiert, his uberschussiger Inhibitor inaktiviert war.
AnschlieRend wurde das Trypsin durch Gelfiltration an Sephadex (3-50 vom Inhibitor abgetrennt und die Disulfidbrucke
Cys 14-Cys 38 durch 0 2 bei pH = 8.6 (0.I M Na-Borat) wieder
reoxidiert. Die Reinigung des modifizierten Inhibitors erfolgte
an CM-Sephadex durch Ionenaustauschchromatographie mit
einem NaCI-Gradienten bei pH = 8.6 (siehe Schema 1).
Die Struktur des modifizierten Rinder-Inhibitors I* (Kunitz)
ergibt sich aus folgenden Daten'"]: a) Gleiche Aminosaure-Zusammensetzung wie das Ausgdngsmaterial I ; b) einheitliche
Bande in der Disc-Elektrophorese bei pH = 9.3; wegen der
zusatzlichen negativen Ladung wandert 1* langsamer (70 Yn
der Laufstrecke) als I: c) Perameisensaure-Oxidation und Isolierung der beiden entstehenden Polypeptidketten (Aminosaurereste 1-1 5 und 16-58); d ) vollstiindige Inaktivierung von
I* durch Abspaltung von Lys IS mit 0.03 Mol-% Carboxypeptidase 8 innerhalb einer Stunde bei Raumtemperatur ; e) enzymatisch katalysierte Resynthese der Peptidbindung
Lys 15-Ala 16 unter Ruckgewinnung des Ausgangsmaterials I['].
Der modifizierte Inhibitor I* hemmt die Enzyme Trypsin
und Chymotrypsin (vom Rind), wobei sich aus Enzym und
modifiziertem Inhibitor der gleiche Komplex bildet wie aus
Enzym und nativem (unmodifiziertem) Inhibitor[x1.Die Quotienten der Geschwindigkeitskonstanten der Komplexbildung
von nativem (k) und modifiziertem (k*) Inhibitor sind jedoch
fur .x-Chymotrypsin (kjk*= 2.2 x lo4) und P-Trypsin
(k/k*= SO) verschieden18!
15, Ala 16)[" laRt sich rnit Trypsin, Chymotrypsin oder Plasmin
resynthetisieren. Zur Abkurzung der durch die langsame Dissoziation des Enzym-inhibitor-Komplexes bedingten langen
Reaktionszeiten (Halbwertszeit 17 Woehen[']) wurden aquimolare Mengen Trypsin (Schwein) oder Chymotrypsin (Rind)
bei pH = 7.8 ( 0 . 2 ~Tris(2-hydroxyathyl)ammoniumchlorid/
NaOH. 0.01 M CaCI,) bei Raumtemperatur verwendet. Nach
1 h (Trypsin) bzw. 48 h (Chymotrypsin) wurden die Komplexe
bei pH= 1.7 dissoziiert und Enzym und inhibitor an Sephadex
G-50 bei gleichem pH-Wert getrennt. in beiden Fallen isolierten wir nebendem Enzym ausschlienlich nativen Inhibitor I niit
intakter Peptidbindung -P,-Pi(kinetisch kontrollierte
Komplex-Di~soziation['~).
Eine vollstandige Resynthese gelang auch rnit katalytischen Mengen (20 Mol-Yn) f3-Trypsin
(Rind)bei Raumtemperatur und pH = 3.7 innerhalb 24 h (thermodynamisch kontrollierte Resynthese).
P1
-Cys-Lys<OOo
Pi
H3N@-Ala-Arg
I
L
S
-
S
L
r
I ,:
modifiziert
p1
p;
-C y s-Ly s -A la-A rg
Trypsin
L-ingegangen a m I X . Juni 1974.
crgiinzt am 16 Juli 1974 [Z hXa]
oder
Chyrnotrypsin
oder
I
Plasmin
nativ
~
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Proteinase-katalysierte Resynthese der Peptidbindung
Lys 15-Ala 16 im Derivat des Trypsin-KallikreinInhibitors (Kunitz) mit geoffneter Peptidbindung[**]
Von Helmirt Jeriny und Harald Tschescher"1
Die im modifizierten Trypsin-Kallikrein-Inhibitor I* (Kunitz)
aus Rinderorganen geoffnete Peptidbindung -P,--Pi(Lys
[*] Priv.-Dor. Dr. H. Tschcsche u. Dr H. Jering
Organisch-Chemisches Laboratoriiim.
Lehrstuhl fiir Organische Chemic iind Biochemie der Technischen IJnivcrsitit
X Mtinchen 2. Arcisstralle 21
[**I Vorgetregen
anliilllich der 2nd International Rcseirrch Conference
..Protelnase Inhibitors" - Bayer Symposium V, Groabe Lcdder. Oktober
1973. Tell der Dissertation von H . J~r iny. Dicse Arbeit %iirde von
der Deutschcn Forschvngsgemeinschaft untersliitrt Wir danken Frdulein
C . Frunh fur die Durchfiihrung der Aminodtirc-Analysen. Der Bayer AG,
Wuppertal, danken wir fiir dic Uberlassung yon Trasylola (Trypsin-Kallihrein - I nhibitor ( K irnitz) it ti& R iiidei lunge)
~
Angrw. Chrm. j 86. Juhrq. 1974 J N r . 19
Die Struktur des Inhibitors mit resynthetisierter Peptidbindung geht daraus hervor, daR er in folgenden Daten mit
dem nativen Inhibitor ubereinstimmt : a) Aminosaure-Zusammensetzung; b) Wanderungsstrecke des homogenen Inhibitors
bei der Disc-Elektrophorese bei pH = 9.3; c) PerameisensaureOxidation und Gelfiltration an Sephadex G-50 ergeben nur
eine Polypeptidkette (Aminosauren 1-58); d ) kinetische
Konstanten der Komplexbildung rnit Enzym (Hemmkurve)l4I;
e) Differenzspektren der Komplexe von Enzym mit I sowie
I*[41 ; g) Resistenz gegen Inaktivierung rnit Carboxypeptidase
B (2 Mol-Od in 0 . 0 2 5 ~Tris-HC1-Puffer, pH =7.2, 24h, 25°C).
Die Resynthese zeigt, daR unter thermodynamisch kontrollierten Bedingungen die Lage des enzymatisch katalysierten Proteolysegleichgewichtes fur die Peptidbindung -Pi-Piganz
auf der Seite des nativen Inhibitors ist. Dies erklart die
erfolglosen Bemuhungen zur Darstellung des modifizierten
Inhibitors durch direkte Partialproteolyse des nativen Proteins
Die Resynthese der Peptidbindung Lys 15-Ala 16 rnit katalytischen Mengen Trypsin, Chymotrypsin oder Plasmin beweist
ferner, daR das reaktive Zentrum des Inhibitors fur diese
drei Enzyme gleich ist. Damit ist der Trypsin-Kallikrein-Inhibit or (K unitz) als ,,single-headed" zu klassifizieren1'. ('I.
Eingegangcn am 18. Juni 1974.
erginrt a m 16. Juli 1974 [ Z 6X b]
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703
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