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Der Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex.

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Der Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex
Von Ferdinand Hucho[*]
Die drei Enzyme Pyruvat-Dehydrogenase, Dihydrolipoamid-Transacetylase und Dihydrolipoamid-Dehydrogeease bilden den Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex von E. coli;
beim Slugetier-Komplex treten noch eine Kinase und eine Phosphatase hinzu. Multienzymkomplexe sind strukturelle, funktionelle und regulatorische Einheiten. Sie ermoglichen es dem
Organismus, okonomischer als mit einzelnen Enzymen zu arbeiten. Moglicherweise steht der
Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex an der Schaltstelle zwischen Energiestoffwechsel
und Gluconeogenese.
1. Einleitung
Multienzymkomplexe sind Proteine, in denen mehrere Enzyme in konstanten Mengenverhaltnissen nicht-kovalent miteinander verbunden - ein stabiles, hochgeordnetes Assoziat
bilden. Haufig katalysieren die Teilenzyme der Komplexe aufeinanderfolgende Schritte einer Stoffwechselsequenz. Die Multienzymkomplexe nehmen eine Zwischenstellung em zwischen
kooperierenden, aber strukturell voneinander unabhangigen,
,,loslichen" Enzymen einerseits und membrangebundenen
unloslichen Enzymsystemen andererseits (Abb. 1). Sie konnen
daher als Modell fur beide Gruppen dienen. Typische Beispiele
fur die Gruppe der strukturell voneinander unabhangigen
loslichen Enzymsysteme sind die Enzyme der Glykolyse oder
des Citronensaurezyklus, fur die unloslichen die Atmungskettenproteine der Mitochondrien- oder die Photosyntheseproteine der Chloroplastenmembran. Beispiele fur Multienzymkomplexe sind die a-Ketosaure-Dehydrogenasen, die Fettsaure-Synthetase und die Enzymkomplexe, die sich an der
Synthese aromatischer Aminosauren beteiligen.
1. Wie werden Strukturen hoherer Ordnung aus Proteinmolekulen aufgebaut?
2. Wie kooperieren Enzyme, die aufeinanderfolgende
Schritte eines Stoffwechselweges katalysieren?
3. Wie wird die Aktivitat eines aus mehreren Enzymen
aufgebauten Systems in der Zelle reguliert?
Unter diesen Aspekten sol1 hier die Pyruvat-Dehydrogenase
besprochen werden. An der Oxidation der Brenztraubensaure
im Mitochondrion sind unmittelbar drei Enzyme beteiligt
(Abb. 2): Die Pyruvat-Dehydrogenase (E,), die Dihydrolipoamid-Transacetylase (E2)und die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase @A), ein Fla~oprotein[~]
[*I. Sie katalysieren die Reaktion
+ NAD' + HS-CoA
CH,-CO-COOH
CH3-CO-S-CoA
i
0
0
o*o
0
a1
bl
cl
Abh. 1. Multienzymkomplexe (b) als Zustand zwischen menibrangehundenen
(a) und ..loslichen" Enzymen (c).
Der Ubergang zwischen den drei Gruppen von Enzymsystemen ist moglicherweise flieBend. Wenn auch die Zahl der
bisher entdeckten Multienzymkomplexe begrenzt ist, darfman
doch vermuten, daB auch manche der ,,loslichen Enzyme"
nicht vollig ungeordnet in der Zelle vorliegen, sondern mit
anderen Enzymen Komplexe bilden". 'I. Weniger stabile
Komplexe werden wahrscheiiilich durch die klassischen
Proteinreinigungsmethoden zerstort. Umgekehrt kann nicht
ausgeschlossen werden, da6 in der Zelle getrennt vorliegende
Enzyme bei der Isolierung aggregieren und der gereinigte
Multienzymkomplex ein Artefakt ist (siehe Abschnitt 5.1).
Multienzymkomplexe sind strukturelle, funktionelle und
wahrscheinlich auch regulatorische Einheiten aus mehreren
Enzymen. Ihre Erforschung kann vor allem folgende Fragen
beantworten helfen:
[*] Univ.-Doz. Dr. b . Hucho
Fachbereich Biologie der Universitat
775 Konstanz. Postfach 733
614
(1)
die in mehreren Schritten verlauft (siehe Abschnitt 3.1-3.3)[41:
Pyruvat
+ TPP-El
+
Hydroxyathyl-TPP-El
C02
+ Hydroxyathyl-TPP,E,
(3)
S-Acetyl-dihydrolipoyl-E2+ TPP-E,
+ CoA
S-Acetyl-dihydrolipoyl-E,
+ Acetyl-CoA
Dihydrolipoyl-E,
+ FAD-E,
Reduziertes FAD-€,
(2)
+ Lipoyl-El
+
0
0
+ COz + NADH + H +
+ NAD'
+
Lipoyl-E2
NADH
i
+ Dihydrolipoyl-E2
+ reduziertes FAD-E,
+ H i + FAD-E,$
(4)
(5)
(6)
Die drei Enzyme, zu denen in hoheren Organismen noch
zwei weitere hinzutreten (siehe Abschnitt 4.5),bilden den Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex. Das Ziel dieser Ubersicht ist esdarzustellen,daB El, Ez und E3 im Multienzymkomplex gemaB den hier aufgestellten Kriterien eine strukturelle,
funktionelle und regulatorische Einheit bilden.
Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplexe sind aus zahlreichen Organismen isoliert worden, so z. B. aus Eschericliia
Azotohacter"', Streptococcus["', Neurosporu
crassa[Y.
101
Hefe[l 1 131, Kart~ffeln"~],Taubenbrustmuskeln[l '*I, Haut-Fibroblasten[19' und mehreren Saugetier1). Diese Ubersicht beschrankt sich
~ r g a n e n [ ~ ~ (Tabelle
-'~'
auf das E.-coli- und das Saugetierenzym, da diese besonders
gut untersucht wurden.
~
-
~~
[*] Abkurzungen:
E,:
E*:
E3:
TPP:
CoA:
FAD:
NAD ', N A D H :
Pyruvat-Dehydrogenase (EC 1.2.4.1)
Dihydrolipoamid-Transacetylase (EC 2.3.1.12)
Dihydrolipoamjd-Dehydrogenase (EC 1.6.4.3)
Thiaminpyrophosphat
Coenzyrn A
Flavinadenindin ucleotid
Nicotinamidadenindinucleotid,oxidierte bzw. reduzierte
Form
Angew. Chrm j 87.
Jahrg. 1975 j Nr. 17
7
Dalt0n[*~,~*1
[*I.Messungen der Rontgen-Kleinwinkelstreuung
bestatigen diesen WertLz9].Vielleicht beruht die Diskrepanz
auf der Verwendung verschiedener Bakterienstimme.
301 und E3['".
321 sind Dimere.
Die nativen Enzyme
Die Molekulargewichte der Polypeptidketten der Teilenzyme
E,, E, und E, betragen 100000, 80000 bzw. 56000 Dalton[2"-28,3",' I 1 , Der Multienzymkomplex enthalt auBer den
drei Enzymen sechs Cofaktoren : TPP, Mg2+,Liponsaure, Coenzym A, FAD und NAD' [25,341.Einer davon, die Liponslure, ist iiber die s-Aminogruppe eines Lysinrestes von E, kovalent an das Protein g e b ~ n d e n ~361.
~ "Diese Amidbindung bildet
sich enzymatisch in Gegenwart eines aus E. coli und Streptococcus isolierten Enzyms unter ATP-Verbra~ch[~'l.
Ein weiteres
Enzym, eine L i p o a r n i d a ~ e ' 391,
~ ~ .bewirkt die hydrolytische Ab-
CoA-SH
El
t
E2
3 1 3
A
(
NAP
4
NADH
1
,,
Ahb. 2, Schematische Darstellung dey Pyruvatdehydrogcnase-Multienzymkomplexes (Erklarung siehe Text). E l =Pyruvat-Dehydrogenase, E 2 = Dihydrolipoamid-Trdnsdcetylase, E,=Dihydrolipoaniid-Dehydrogenase. Formeln unter ,,Acetyl-dihydrolipoamid": Lipoamid und Dihydrolipoamid;
R =(CH2)4--CONH-.
Tabelle I . Eigenschaften von Pyruvatdehydrogenase-Multienrymkomplexen
-~
-
Organismus
€1
Zahl
SEugetier [a]
Y
60
p 60
Hefe [b]
?
Mol.-Gew.
41 000
36000
100000
~- -___
~~
Polypeptidketten
El
Zahl
Mo1.-Gew.
Mol.-Crew. des
Komplexes
E.3
Zahl
Mol.-Gew.
Elektronenmikroskopie
Durchniesser
Geomctrie
des Koniplexes voii E,
von E 2
[A]
60
52000
10-12
55000
7.6 x 10h
400450
210
1
80000
1
61 000
5 x 10"-
350
220
7.4 x 106
Nrurosporu
cr<!\\[l [ c ]
E. c o i i [d]
16
24
96000
I00000
Azotohucter [el
-
[a]
[b]
[c]
[d]
[el
16
24
80000
78000
__
16
12
___
54 000
56000
3.75 x 106
4.6 x lo6
300 430
~-
~ _ ~ _ _
Lit.
Pentagondodekdeder
Pentagondodekaeder
Pentagondodekaeder
w urfel
[45, 46. 741
Wurfel
"1
[I21
[9. 101
[27, 281
[*61
Komplex enthiilt rusatzlich zu E l , E2, E3 eine Kinase und eine Phosphatase (Interkonvertierung).
Interkonvertierung nicht nachweisbar.
lnterkonvertierung fur Stamm L74 nachgewiesen.
Keine Interkonvertierung.
Komplex enthalt moglicherweise Phosphotransacetylase.
2. Zusammensetzung und Struktur des Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplexes
2.1. Der Multienzyrnkornplex aus Escherichia coli
Multienzymkomplexe enthalten ihrer Definition gemaR die
beteiligten Enzyme in definierten und konstanten Proportionen. Die Zahlenverhaltnisse werden durch die Geometrie des
Komplexes bestimmt. Will man umgekehrt eine Vorstellung
vom geometrischen Aufbau des Komplexes gewinnen, mu13
man den Anteil der Teilenzyme und die Anzahl der Untereinheiten bestimmen. Die vom Genom gesteuerte Synthesegeschwindigkeit der verschiedenen Polypeptidketten mu13 an die
geometrischen Erfordernisse des Komplexes angepaBt sein,
will die Zelle nicht Jiberschussige" Polypeptidketten produzieren. Fur die Frage nach der genetischen Kontrolle der Teilenzymsynthese ist die Kenntnis der Stochiometrie des Komplexes
also ebenso wichtig wie fur die Frage nach Struktur und
Funktion. Die Untersuchungsbefunde geben hier noch kein
einheitliches Bild:
Zunachst wurde postuliert, daIj der Komplex aus E. coli
die Polypeptidketten der drei Teilenzyme im Verhaltnis 1 : 1 : 1
enthalt, und m a r 24 Polypeptidketten jedes Enzyrn~['~J.
Eine
spatere Analyse ergab jedoch das Verhaltnis 1 : 1 :0.5[261,
d. h.
auf je zwei Polypeptidketten von El und Ez wurde nur eine
Polypeptidkette des Flavoproteins E3 gefunden. Das Molekulargewicht des Gesamtkomplexes wird mit 4.6 x 10" Dalton
angegeben[2"l. Andere Autoren wiederum bestatigten das Verhiltnis 1 : 1 : 1, fdnden jedoch nur je 16 Polypeptidketten und
daher als Molekulargewicht des Komplexes nur 3.75 x lo6
Anyew. Chem. 1 87. Jahrq. 1975
/ Nr. 17
spaltung der Liponsaure aus dem Protein. Die Aminos'i:uresequenz in der Nachbarschaft der L i p o n ~ i i u r eunterscheidet
'~~~
sich offenbar von der Liponslurebindungsstelle des sonst recht
lhnlichen cl-Ketoglutarsluredehydrogenase-Multienzymkomplexes.
,
. . Gly-Asp-Lys-Ala-.
I
..
Lipoyl
~s-s " " " "
HS
Li pons Bu re
COOH
SH
Dihyd roliponsaure
Biochemische und elektronenmikroskopische Untersuchungen, vor allem aus dem Arbeitskreis von Reed an der Universitat von Texas, haben gezeigt, daB der Multienzyrnkomplex
eine geordnete symmetrische Struktur besitzt. Die Information
fur diese Struktur ist in der Primarstruktur der Teilenzyme
niedergelegt, denn zerlegt man den Komplex und vereinigt
die gereinigten Enzyme El, Ez und E3, so bilden sie in vitro
spontan, d. h. ohne Mithilfe eines weiteren biologischen Faktors der Zelle, einen aktiven Komplex mit praktisch unverlnderter Struktur und Aktivitat". 33* 411. E z 15Rt sich dariiber
hinaus reversibel in seine Untereinheiten zerlegen[421.Derartige Rekonstitutionsexperimente sind wichtig fiir das Verstandnis der Vorgange bei der Bildung komplizierter Zellstrukturen
aus einfachen Bausteinen. Sie zeigen, daR nicht nur die Sekundar- und Tertiarstruktur durch die Primirstruktur des Proteins
[*I Dieser .,Kernkomplex" ist jedoch imstande, in vitro weitere Ei-Molekiile
zii hinden. Die Bindung ist miiglicherweise unspezifisch, und die so gebundenen Molekiile nehmen a n der Katalyse nicht teil [ZX].
615
determiniert werden, sondern auch die Quartarstruktur und
Strukturen hoherer Ordnung wie die Multienzymkomplexe.
El und E 3 assoziieren nicht rniteinander, beide werden jedoch von E2gebundenr5].Die Dihydrolipoamid-Transacetylase (E2)scheint auBer ihrer katalytischen auch eine strukturgebende Funktion auszuuben. Sie bildet den Kern des Komplexes, der von den Untereinheiten von E l und E 3 umgeben
ist.
Abb. 3. ElektronenrnikroskopischeAufnafimen a) dcs Pyru\,atdefiydrogenascMuftienzyinkoinplexes und b) der Dihydroiipoamid-Transacctylase (El) aus
E. cofi. Vergronerung 20OOOOfach [43].
nase-Kinase und -Phosphat'ase hinzu (siehe Abschnitt 4.5),
so kommt man auf ein Molekulargewicht von 16 x lo6 Dalton.
Es gibt jedoch noch keine Anhaltspunkte dafiir, daB diese
Annahmen realistisch sind. Die Stochiometrie des Komplexes
ist noch ungeklart. Seine Grolje ahnelt derjenigen der Ribosomen, ist also fur Zellpartikel nicht ungewohnlich. Reed schatzt,
da8 sich in jedem Mitochondrion der Riiiderniere ca. 15 Molekiile dieses Komplexes befinden. Srere hat gezeigt, daI3 die
Konzentration derartiger Molekufe in der Zelle in der GroRenordnung von
mol/l liegt["'.
Die Pyruvat-Dehydrogenase (El) hat ein Molekulargewicht
von I54000 Dalton und besteht aus je zwei Untereinheiten
mit dem Molekulargewicht 41000 und 36000 Dalton
( c *82)[4hJ.
~
Es gibt Hinweise, daI3 die beiden Untereinheiten
verschiedene Funktionen ausiiben (siehe Abschnitt 3.1). Der
Komplex enthalt wahrscheinlich 60 Molekiile vom Typ 30,
also je ein Molekul pro Untereinheit von Ez.
Das Flavoprotein E3 hat ein Molekulargewicht von 110000
Dalton und besteht aus zwei wahrscheinlich gleichen Polypeptidketten, die jede ein Molekul FAD enthalten[48.491. Der
gereinigte Komplex enthalt nur ca. 10-12 Polypeptidketten
des F l a v o p r ~ t e i n s [ ~Die
~ ! Sequenz der Polypeptidketten in
der Nachbarschaft der fur die Katalyse wichtigen SH-Gruppen
ist bekannt[4'a, 49b1.
Dieser Kern hat, wie die eindrucksvollen elektronenmikroskopischen Bilder von Reed und Oliver ~ e i g e n [ ~eine
~ ' ,kubische
Symmetrie (Abb. 3). Helming schlagt deshalb ein Modell voy,
in welchem sich die 16 E2-Untereinheiten des von ihrn isolierten Komplexes paarweise an den acht Ecken eines Wiirfels
befinde~~[~~!
Uber die Anordnung von E l und E 3 auf der Oberflache
des Wiirfels geben die elektronenniikroskopischen Bilder keine
klare Auskunft. Man konnte sich jedoch vorstellen, daB jede
Untereinheit der Transacetylase (E2) je eine Polypeptidkette
von E l und E l bindet, so da13 jede Ecke des Wurfcls von
zwei Elementarkomplexen - bestehend aus je einer Untereinheit von E l , Ez und E3 - gebildet wird. Der Durchmesser
des Gesamtkomplexes wurde aufgrund der elektronenmikroskopischen Bilder auf etwa 300
geschiitzt. Die Untersuchung mit der Rontgen-Kleinwinkelstreuung ergab dagegen
einen maximalen Durchmesser von 430 A[''. 2 q a i .
2.2. Der Multienzymkomplex aus Saugetieren
Der
Saugetier-Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex, zuerst isoliert aus den1 Schweineherzmuskel'*"*"I, ist
heute in hochreiner Form in grijReren Quantitaten zugangl i ~ h [ ~Er~besteht
'.
wie das E.-coli-Enzym aus den drei Enzymen
Pyruvat-Dehydrogenase (E I), Dihydrolipoamid-Trdnsacetylase (E2) und Dihydrolipoarnid-Dehydrogenase (E3), die beim
Zusanimengeben spoiitan Zuni urspriinglichen aktiven Multienzymkomplex r e a s s ~ z i i e r e n '451.
~ ~ , Sein Molekulargewicht
betragt mindestens 7.6 x lo6 Daltonf451,wobei man berucksichtigen muR, dafi man eventuell einen Teil der Untereinheiten
bei der Isolierung und Reinigung des Enzyms verliert.
Den Kern des Komplexes bildet auch hier die Transacetylase
(Ez),die aus 60 wahrscheinlich gleichen Polypeptidketten mit
einem Molekulargewicht von 52000 Dalton bestehtr4'! Jede
dieser Untereinheiten enthalt kovalent pebunden cin Molekul
Liponsaure.
Geht man wie beim E.-coli-Komplex von einem 1 : 1 : 1 -Verhdtnis der drei Teilenzyme aus und nimmt im gleichen Verhiiltnis die beiden regulatorischen Enzyme Pyruvatdehydroge-
616
Ahh. 4 Flektronenmikroskopischr Aufnahmen a) des SBugecier-Pyruvatdeh.drogenase-Multienzymkomplexes und b). c )der Dihydrolipoamid-Transacetylase ( E 2 )1431. d ) und e ) sind Modclle. die Abb. 4b) bzw. 4c) als Pentagondodekaeder interpretieren [43] Verprokrungen ca. 2000OOfach. a) stellten freundlicherwcise Dr. E . Jrrngri- und Prof. Dr. H . R ~ 4 i o w rDiiqseldorf.
.
zur Verfigung.
Wie bereits erwahnt, enthiilt der Saugetierkomplex eine
Kinase und eine PhosphataseIso. "I, deren Funktionen in Abschnitt 4.5 diskutiert werden. Die Kinase (Molekulargewicht
100000 Dalton[241)ist relativ fest an die Transacetylase (E2)
gebunden. Die Phosphatase (Molekulargewicht ebenfalls
100000[241)steht mit dem Komplex in einem Assoziations-Dissoziationsgleichgewicht ; ihre Bindungsstelle im Komplex ist
unbekannt. Von beiden regulatorischen Enzymen kommen
nur wenige Molekule im Komplex vor, vielleicht nur etwa fiinf.
Moglicherweise enthiilt der native Koniplex mehr Kinase- und
Phosphatase-Molekiile, die bei der Reinigung verlorengehen
(siehe Abschnitt 4.5)[52,531.
Wie beim E.-coli-Enzym ubt auch beim Slugetierkomplex
die Transacetylase (E2) sowohl eine katalytische als auch eine
strukturgebende Funktion aus. Sie bildet den Kern des Komplexes, auf dessen Oberfliiche die anderen Enzyme angeordnet
sind. Elektronenmikroskopische Untersuchungcn haben gezeigt, dalj ihre Symmetrie sich wesentlich von der der E.-coliTransacetylase unterscheidet (Abb. 4b-4d). Die Bilder zeigen
nicht wie dort einen Wiirfel, sondern lassen sich eher als
Pentagondodekaeder i n t e r p r e t i e r e ~ s41.
~ l ~Der
~ ~ Durchmesser
wird mit 210A[431oder 230-240A["] angegeben. Der Durchniesser des Gesamtkomplexes betragt ca. 400G450
s41.
Die elektronenmikroskopischen Bilder des Gesamtkomplexes
weisen auf eine ikosaedrische Struktur hin (Abb. 4a)fs4l.
.,aktiven Essigsaure" (Acetylcoenzym A) als ,,aktiven Acetaldeh yd" bezeichneteLz0,O9].
Die Reaktion beruht auf der Aciditat des Wasserstoffs in
2-Position im Thiazolring von TPP[5si701. Cofaktor der enzymatischen Reaktion ist Magnesium, das auch den entsprechenden nichtenzymatischen Wasserstoffisotopenaustausch mit
Wasser be~chleunigt['~!
Der nachste Schritt ist die Oxidation der Hydroxyathylgruppe und der Transfer des entstehenden Acetylrestes auf die
Liponshure von E2. Auch diese Dehydrogenase- und Transferaseaktivitiit ist in El lokalisiert["- 681. Als Acceptor fur den
Acctylrest kann bei Abwesenheit von E2 freie Liponsaure
oder in Anwesenheit eines Elektronenacceptors wie Hexacyanoferrat(ir1) Wasser dienen. Die Reaktion verliiuft etwa
wie im Formelschema angegeben.
HS-H2C\
R
3. Mechanismus der enzymatischen Katalyse
P
2
f
TPP
C H3-C-S-CF
(CH,),-COOH
Es sol1 hier nicht die umfangreiche Literatur uber die Wirkungsweise der an der Pyruvatoxidation beteiligten Coenzyme
referiert werden; stattdessen sei auf spezielle Ubersichtsartikel
uber TPP[55,5hl FAD[57-62] NAD+ [63-651 , Coenzym A'"]
und L i p o n s a ~ r e ' ~ 'verwiesen.
]
Uber die Rolle der Proteine
mit Ausnahme von E3 bei der Katalyse der Reaktioncn
( 2 ) - ( S ) ist nur wenig bekannt. Es werden daher hier nur cinige
wichtige Gesichtspunkte erwahnt, und daruber hinaus wird
auf ungeloste Probleme aufmerksam gemacht.
-
-
3.1. Pyruvat-Dehydrogenase(El)
Die Pyruvat-Dehydrogenase (E ist nicht wie der irrefuhrende, aber weithin benutzte Name Pyruvat-Decarboxylase andeutet, nur eine Decarboxylase, sondern zahlt zu Recht zu
den Dehydrogenasen. Denn die Reaktionen (2) und (3) laufen auch mit nicht proteingebundener Liponsiiure ah["]. Auch
Hexacyanoferrdt(II1) kann als Elcktronenacceptor bei der Oxidation von Pyruvat zu Acetat durch E l , d. h. nach Abtrennung
von E 2 und EJ, dienen[68! Die Reaktionsgeschwindigkeit betriigt jedoch nur ca. 1 % von der des Gesamtkomplexes.
Die Decarboxylierung des Pyruvats wird durch seine Anlagerung an die 2-Position des Thiazolringes von TPP eingeleitet.
Die Acetylgruppe befindet sich an der sekundlren SH-Gruppe der Dihydroliponsaure[721.Der vorgeschlagene Reaktionsverlauf wird durch die Hemmbarkeit der Reaktion durch Arsenit g ~ s t i i t z t [da
~ ~Arsenit
~,
das Enzym nur in Gegenwart von
Pyruvat und Coenzym A inaktiviert. Dabei entsteht Dihydroliponsiiure, die mit Arsenit ein cyclisches Thioarsenit bildet.
Es gibt Hinweise darauf, daI3 die Decarboxylasereaktion
einerseits und die Dehydrogenase-Transferasereaktion andererseits beim Enzym aus SPugetierorganen durch verschiedene
Untereinheiten von E 1 katalysiert werde~i['~].
Beim E.-coli-Enzym sind beide katalytischen Aktivitlten wahrscheinlich auf
einer Polypeptidkette lokalisiert, die etwa doppelt so lang
ist wie die c(- oder die 0-Kette des Saugetierenzyms. Bronipyruund Q~ecksilberverbindungen['~~
inaktivieren E l .
3.2. Dihydrolipoamid-Transacetylase(E2)
Die Liponslure ist kovalent iiber eine Amidbindung mit
der Transacetylase E 2 verbunden. E2 katalysiert den niichsten
Schritt der Reaktion, den Transfer der Acctylgruppe von der
Dihydroliponsiiure auf Coenzym A.
HS-H2C
TPP
II3C
/ \
coo0
Die Abspaltung von C 0 2fuhrt ZLI Hydroxyathyl-TPP[". sbl,
einer Zwischenstufe, die Holzer isolierte und in Analogie zur
A n g m . Chein. 187. .luhrg. 1975 /I N r . 17
F:
CH3-C-S-CoA
HS-H,C,
+
p
2
€IS-CH
'(CH,),-COOI-I
Die Reaktion ist umkehrbar; die Umkehrung wurde zu
einem Test fur E2 in Abwesenheit von E l und E 3 verwendetLhJ.
Acetyl-CoA hemmt die Reaktion. Uber die Wirkungsweise
617
und iiber die katalytische Rolle des Proteins gibt es nur wenige
Untersuchungen~"].
sie durch Verdiinnung des Proteins voneinander zu trennen[871
und dabei zu inaktivieren. Diese Polypeptidketten sind inaktiv.
3.3. Dihydrolipoamid-Dehydrogenase(E3)
3.4. Kooperation der Enzyme im Multienzymkomplex
Die Funktion der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) im
Multienzymkomplex ist es, E2 zu regenerieren und dadurch
den nachsten Reaktionszyklus zu ermoglichen. Dies geschieht
durchTransfer von zwei Elektronen von der Dihydroliponsaure auf NAD +. An der Reaktion sind zwei Molekiile NAD +,
ein Molekiil FAD und eine Disulfidgruppe des Proteins beteiligt ( I ). Letztere wird intermediar reduziert und stabilisiert
das FAD in einem Redoxzustand ( 2 ) ,der eineni Flavoseniichinon entspricht[78-7q1. Die Struktur dieses Zustandes konnte
noch nicht geklart werden, jedoch scheidet das von Massey
friiher postulierte Diradikal[78"alsMoglichkeit aus. (2) besitzt
zwar eine fur Radikale charakteristische Absorption bei
530 nm, ist aber ESR-inaktiv und diamagnetisch. Die langwellige Absorption spricht gegen eine kovalente Verkniipfung des
Proteinschwefels mit der 4a-Position des Flavins[801,aber auch
eine ionische oder eine Charge-transfer-Wechselwirkung lassen sich nicht eindeutig nachweisen.
Die im folgenden formulierten Fragen konnen experimentell
praktisch noch nicht beantwortet werden. Es ist noch weitgehend ungeklart, wie die zahlreichen Komponenten eines so
komplexen Systems kooperieren. Geht man z. B. von der Liponsaure aus, so stellt sich folgendes Problem: Die Liponsaure
ist kovalent mit E2 verkniipft, also raumlich fixiert. Sie mu13
aber wahrend eines Reaktionszyklus rnit Hydroxyathyl-TPP
(El), Coenzym A (E2) und der Disulfidgruppe oder dem FAD
der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) in Wechselwirkung
treten. Mit anderen Worten: Dasselbe Lipoamidmolekiil ist
gleichzeitig
oder zumindest innerhalb einer sehr kurzen
Zeit - Cosubstrat fur drei Enzyme. Betrachtet man die beteiligten Proteine als starre Molekiile, so stellt das fast unerfiillbare
Anforderungen an die riumliche Ordnung des Systems. Die
drei aktiven Zentren der beteiligten Enzyme miiRten ein einziges groBes aktives Zentrum bilden, in dem sich sechs Cofaktoren befinden (TPP, Mg2+, Liponsaure, CoA-SH, FAD,
NAD+, von letzterem wahrscheinlich zwei Molekule pro Polypeptidkette), denn au13er Acetyl-CoA verla13t keine Zwischenstufe der Reaktionssequenz das Protein und kann daher auch
nicht von einem aktiven Zentrum zum nachsten diffundieren.
Auf der Suche nach Auswegen aus diesem Dilemma weist
Reed darauf hin, da13 die reaktive Gruppe der Liponsaure,
auch wenn das Coenzym kovalent am Enzym haftet, eine
gewisse Flexibilitat dadurch erhalt, da13 sie iiber einen Jangen
Arm" rnit dem Protein verbunden ist. Dieser ist zusammen
mit dem Lysinrest, an dessen E-Aminogruppe die Liponslure
als Amid gebunden ist, etwa 14A lang und konnte vielleicht
zwischen den prosthetischen Gruppen von El und E3 hinund herschwingen"'. Allerdings wurde der Abstand zwischen
TPP und FAD aufgrund von Fluoreszenz-Energietransfermessungen auf 30- 60A geschltzt[87"l.
LmrEunskiiXX1schlagt vor, daR die Polypeptidketten des
Komplexes ihre Konformation nach Art eines Flip-flopMechanismus andern und dadurch die funktionellen Gruppen
und die Coenzyme wahrend des Reaktionszyklus solche raumlichen Positionen einnehmen, daR sie sukzessiv miteinander
und rnit dem Substrat reagieren konnen. Derartige Konformationsanderungen sollten rnit biophysikalischen Methoden
nachzuweisen sein, so daR diese Hypothese in absehbarer
Zeit gepriift werden kann.
Eine Flexibilitat,derbeteiligten Proteine mu13 man besonders
dort postulieren, wo die Teilenzyme (und ihre Coenzyme)
nicht im Verhaltnis 1 : 1 : 1 vorliegen. So enthalt der aus Saugetierorganen isolierte Komplex nur relativ wenige Molekiile
E 3 (FAD).Jedes dieser Molekiile mu13 moglicherweise mehrere
Dihydrolipoamidmolekiile reoxidieren.
Das gleiche Problem bietet die Inaktivierung des SaugetierPyruvatdehydrogenase-Komplexes durch die Pyruvatdehydrogenase-Kinase (siehe Abschnitt 4.5). Auch dieses Enzym
ist Teil des Multienzymkomplexes, wird relativ fest von E2
gebunden und phosphoryliert von hier aus mindestens zwei
Serin-OH-Gruppen pro Polypeptidkette von El. Da sich nur
wenige - vielleicht nur fiinf - Kinasemolekule im isolierten
Komplex befinden, mu13 jedes dieser Molekiile mehrere ElKetten phosphorylieren, ohne sich z. B. durch Diffusion diesen
nacheinander nahern zu konnen. Auch hier mu13 man Konfor-
(3)
14)
Gesichert ist dagegen die Beteiligung der Disulfidgruppe.
Die Reduktion des Enzyms mit NADH erhoht die Anzahl
der SH-Gruppen pro Polypeptidkette um zwei["* '*, 601. Arsenit hemmt in Gegenwart von NADH die enzymatische Aktivitat durch Bildung der cyclischen Verbindung ( 4 ) . Die Hemmung kann durch 2,2-Dimercaptopropanol (BAL) aufgehoben
werden['*. "1.
Behandelt man das Enzym mit dem Sulfidgruppenreagens
4-(Chloromercurio)benzolsulfonat,so verschwindet die charakteristische Absorption.bei 530 nm183].Die Beteiligung einer
SH-Gruppe an der Zwischenstufe (2) ist damit bewiesen,
und es gilt auch als gesichert, da13 das Enzym nur durch
zwei Reduktinnsaquivalente reduziert wird. Die Bildung einer
durch vier Aquivalente vollstandig reduzierten Form des Enzyms ist nicht umkehrbar; diese Form ist daher katalytisch
inaktiv. Sie wird nach Ansicht von Massey durch das zweite
an das Enzym gebundene NAD+-Molekiil verhindert, denn
dieses ist essentieller Cofaktor bei der Oxidation von NADH
durch die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3)I7'I. Zu den
Details der Reaktionskinetik sei auf Spezialabhandlungen verwiesen[84.
851
Die Disulfidgruppe ist intramolekular, d. h. sie verbindet
nicht die beiden Polypeptidketten des dimeren Enzyms. Diese
werden durch hydrophobe Wechselwirkung und nicht durch
kovalente Bindung zusammengehalten[86', denn es gelingt z. B.,
618
~
Angew. Chem. J 87. J a h r g . 1975
1 N r . 17
mationsanderungen aufgrund der Flexibilitat der beteiligten
Molekule annehmen, fur die es jedoch noch keinerlei experimentelle Hinweise gibt. Die Pyruvatdehydrogenase-Phosphatase, die den Komplex durch Dephosphorylierung reaktiviert,
stellt dieses Problem nicht, da sie relativ locker in einem
Assoziations-Dissoziationsgleichgewicht mit dem Multienzymkomplex steht.
Eine wesentliche Rolle fur die Kooperation der Teilenzyme
im Komplex spielt wahrscheinlich die Dihydrolipoamid-Transacetylase (EJ. An ihrer Oberflache werden E , und E, offenbar
in sterisch gunstige Position zueinander gebracht. Es gibt
weniger aufwendige Systeme, bei denen der Acetylrest ohne
Mitwirkung der Liponsiiure direkt auf Coenzym A transferiert
wird, z. B. die Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase
aus Clostrid i m ucidi-~rici[*~l,
und auch die Pyruvat-Oxidase aus E. coli
katalysiert die oxidative Decarboxylierung des Pyruvats ohne
Beteiligung von Liponsiiure[yo.9'1,d. h. nur mit den Cofaktoren TPP, Mg2+ und FAD. Dieser Weg wird im Falle des
Multienzymkomplexes nicht beschritten, denn blockiert man
die L i p o n ~ a u r e [oder
' ~ ~ E2 als GanzesI3], so Iauft die Reaktion
nicht ab. Es liegen noch keine experimentellen Daten vor,
mit deren Hilfe man die Vorteile des beim Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex beschrittenen Weges erkennen
konnte.
2. Regulation der Enzymaktivitat durch die ,,feed back"oder ,,feed forward"-Wirkung von Metaboliten a$ Enzyme.
(Hierzu gehoren auch die einfache Produkthcniniung. Substrataktivierung und lhnliche Vorgange),
3. Regulation der Enzymaktivitlt durch enzymatisch katalysiertc Aktivierung und Inaktivierung von Enzymen (Interkonvertierung).
Alle diese Vorgiinge sind an der Regulation der Pyruvat-Dehydrogenase betciligt; iiber die extrazellulCren Faktoren ist
am wenigsten bekannt.
Die Komplexitiit der Kontrolle dcr enzymatischen Aktivitat
ergibt sich aus der Stellung der Pyruvat-Dehydrogenase im
Stoffwechsel (Abb. 5). Das Enzym befindet sich an der Kreuzung mehrerer Stoffwechselwege. Pyruvat entsteht bei der Glykolyse aus Glucose, aus Lactat sowie aus Aminosauren wie
Alanin oder Cystein. Zugleich ist es Ausgangspunkt fur zwei
wichtige Stoffwechselwege:
1. Pyruvat kann oxidativ abgebaut werden zu Acetyl-CoA,
wobei NADH und schlieRlich iiber den Citronensaurezyklus
und durch oxidative Phosphorylierung ATP gebildet wird.
2. Pyruvat kann aber auch zu Oxalacetat carboxyliert werden und somit Ausgangspunkt der Gluconeogenese sein.
Schliisselenzym fur dcn ersten Weg ist der Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex, fur den zweiten Weg die PyruvatCarbox ylase.
4. Regulation der enzymatischen Aktivitat
4.2. Regulation auf chromosomaler Ebene
4.1. Der Pyruvatstoffwechsel
Der Stoffwechsel eines Organismus kann durch intrazellulare und durch extrazellulare Vorglnge reguliert werden. Extrazelluliir ist z. B. die hormonale Rcgulation. Zur intrazellullren
Regulation zihlen folgende drei Klassen:
1. Regulation der Enzymmenge auf chromosomaler Ebene
durch Induktion und Repression der Enzymsynthese,
Die Synthese des Multienzymkomplexes in E. coli unterliegt
der genetischen Regulation'"z! Sie ist zwar von 3',5'-cyclischem
AMP unabhangig'"''. aber durch das Substrat des Komplexes,
Pyruvat, i n d ~ z i e r b a r [ ~Je~ 'nach
.
Induktor kann die synthetisierte Enzymmenge um den Faktor zehn variieren. Dariiber
hinaus gelang es, konstitutive Mutanten zu isolieren, die etwa
um den Faklor zwei mehr Pyruvatdehydrogenase-Komplex
produzieren als bei der ,,voll induzierten" Synthese gefunden
~ u r d e n [ ~Dem
~ ' . Strukturgen fur die PyruvatdehydrogenaseKomponente wird fiir die Synthese des Gesamtkomplexes
besondere Bedeutung zugeschrieben. Das Gen fiir die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3) ist bisher nicht gefunden worden, die der beiden anderen Teilenzyme des Komplexes liegen
dicht beisammen (ace-Locus)[y21.
Auch bei Saugetieren gibt es Hinweise auf eine genetische
Steuerung der E n z y m s y n t h e ~ e [ ~ ~ - ~ * ~ .
4.3. Regulation durch Hormone
I
I
/
I
Citronenssure-
I
I
I
I
I
I
I
{
-__---_----_AT P
t----------_--- I
*'
Zellbausteine
Abb. 5. Vereinfachtes Schema des Pyruvatstoffwechsels. Die gestrichelten
Pfeilegebendie Aktivierung 0 oder die Hemmung 0 der Pyruvat-CarboxyIase und des Pyruvatdehydrogenase-Multicnzymkomplexes (PDC) durch Acetyl-CoA und ATP an.
A n q i w C h m . 1 8 7 . Juhry. 1975
,' N r .
17
Inkubiert man Fettgewebe normal ernahrter Ratten in Gegenwart von Lactat mit Insulin, so beobachtet man eine deutliche Steigerung der Pyruvatdehydrogenase-Aktivitat[" '"'I.
Insulin wirkt also an mindestens zwei Punkten stimulierend
auf die Umwandlung von Glucose in Fettsaure: Es steigert
nicht nur den Glucosetransport in die Zelle, sondern auch
die Oxidation des Pyruvats. Welche chemisehen Reaktionen
dieser zweiten Wirkung zugrundeliegen, ist noch unklar, jedoch beruht zumindest ein Teil des Effektes darauf, daB das
Verhaltnis von phosphoryliertem, inaktivem zu dephosphoryliertem, aktivem Pyruvatdehydrogenase-Komplex geandert
wird1102- ' 0 5 ] . Vielleicht vermitteln Calcium-Ionen den Hormoneffekt['Ohl, da sie als Effektoren der P h o s p h a t a ~ e [ ' ~l o' *~]
deren Affinitat fur das phosphorylierte Enzym erhohen['06!
619
ren als langerkettige" 19! Alle Zwischenstufen des Citronensaurezyklus hemmen die Pyruvatoxidation[' 20 ' 22J, Citrat
z. B. durch Beeinflussung der Interkonvertierung[' 231.
ATP hemmt deh Pyruvatdehydrogenase-Komplex aus Saugetierorganen durch Umwandlung von E l in eine phosphorylierte inaktive Form (siehe Abschnitt 4.5).
Daruber hinaus fand Cuutrecasas, daR Insulin auch die Gesamtenzymkonzentration erhoht[i09!
4.4 Regulation durch ,,feed back'' und ,,feed forward".
Produkthemmung
-
Der Angriffspunkt der meisten Faktoren, die die Aktivitat
des Pyruvatdehydrogenase-Multienzyinkomplexes regulieren,
ist E l . Das erscheint logisch, da E l den ersten, praktisch
irreversiblen und wahrscheinlich auch geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktionssequenz katalysiert. Aktivierend auf das €.-cdli-Enzym wirken die Intermediarprodukte
der Glykolyse, am starksten Fructose-1,6-diphosphat,aber
auch Fructose-6-phosphat, Glycerinaldehyd-3-phosphat,
PhosphoenolpyruvatL1''l, Dihydroxyacetonphosphat und
Glucose-6-phosphat"' 'I. Acetyl-CoA inhibiertl'
mit negativer Kooperativitiit, wahrend fur das Substrat Pyruvat positive Kooperativitlt gefunden wurde" 13].GTP" 14], aber nicht
ATPI' 1 , 1 L 5 1und andere Nucleotide hemmen den Pyruvatdehydrogenase-Komplex aus €. coli" 14].
Neben der ,,feed back"-Hemmung durch Acetyl-CoA und
der ,,feed forward"-Aktivierung durch Glykolyseprodukte
wurde eine starke Produkthemmung des E.-coli-Enzyms durch
NADH beschrieben[1121.NADH hemmt EJ, und es scheint,
daB der Komplex sehr vie1 empfindlicher gegenuber NADH
als Acetyl-CoA ist.
4.5. Interkonvertierung"]
Die Aktivitat des Pyruvatdehydrogenase-Komplexes aus
Siiugetierorganen wird durch zwei Enzyme reguliert, die ebenfalls Teile des Multienzymkomplexes sind. Eine Kinase inaktiviert den Komplex durch Phosphorylierung in Gegenwart
von ATP, und die Reaktivierung wird durch eine Phosphatase
bewirkt, die das System d e p h o s p h ~ r y l i e r t [Die
~ ~ ~Pyruvat-De.
hydrogenase ziihlt somit zu den interkonvertierbaren Enzymen. Diese Interkonvertierung wurde in allen untersuchten
Saugetierorganen gefunden : in der Niere[jol, im Herzniuske1LS1,''I, in der Lebd5', 511, im Him['**, 1 2 y 1 und ini Fettgewebe[I3'. 1 3 ' ] . Bei Rind, Schwein und Ratte wurden dabei
keine prinzipiellen Unterschiede festgestellt" 291.Die Phosphatasen und Kinasen der Organe und Organismen sind austauschbar. Das E.-coii-Enzym zeigt diese Interkonvertierung
nicht, wahrend sie zumindest in einem Stamm von Neurospora
auftritt" 'I. Es ist noch unklar, ob ein Zusammenhang zwischen
der Evolutionsstufe und dem Vorhandensein dieses Regulationsmechanismus besteht.
Tabelle 2. Kinetische Parameter des Saugetier-Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplexes. Angahen iiher M g Z +
siehe Tabelle 3.
~
~~~
...
~
Substan7
.
Michaelis- odcr
Inhibitor-Konstaute [mol/l]
~
~
Bindungsstelle
~~~
~~~~~
..
Bemerkungen
~
~~
Coenzym A
Acetyl-CoA
K , = 4 x 10-'(Niere u. Herr)
K , = 9 x lo--* (Niere)
K, = 8 x
(Herz)
K,l,=3 x lo-'
K , = 5 x 10.'
NAD'
NADH
K,,=2.5~
K , = 2 x 10.''
Es
Suhstrat
hemmt die Interkonvertierung
Suhstrat
kompetitiver Inhibitor
(nicht kompetitiv gegenuher Pyruvat)
Suhstrat
kompetitiver Inhibitor
Nucleotide
K,,,,,,,=lx lo-'
K,,,,,,,=I x 1 0 '
Kinase
Kinase
Suhstrat der Kinase
kompetitiver Inhibitor
Pyruvat
7
'!
kl
EL
€3
Tabelle 3 Vergleich der Michaelis KonTtanten der M g 2 + erfordernden Fn7yme des Pyruvdtdehydrogendse-Multiei~zymkomplexes mit der physiologiachen Mg"-Konzeiitration
-~~~
Fnzym
-
~-
Phosphatase
(in Phosphdt-Puffcr)
(in Imidazol-Puffer)
Kindse
PyruvatdehydrogeiiaseMultienzymkomplex
Physiologische M g Z'Konzentrdtion (freies M g Z + )
K,
[mol/ll
Lit
2 x 10
3x10
_______~
'
2x10
'
11391
~ 0 7 1
~1071
5x10
'
1741
-
'
620
PDC-e)
inaktiv
[ I431
1x10
~ ~ _ _ _ _ _ -~
_ _ _ _ ~
Auch der Multienzymkomplex aus Saugetierorganen unterliegt der ,,feed back"- oder Produkthenimung durch zahlreiche
Metaboliten" ''- l Z 3 1 (siehe Tabelle 2 und 3). Fur die Regulation der Enzymaktivitat scheint hier jedoch anders als beim
€.-coli-Enzym der Quotient NADH/NAD von groRerer
Bedeutung zu sein als der Quotient Acetyl-CoA/CoA in der
Zelle" *I. Kurzkettige Acyl-CoA-Ester sind starkere Inhibito~
PDC
aktiv
+
Abb. 6. Schema der lnterkonvertierung des Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplexes (PDC) aus Saugetierorganen. Eine Kinase phosphoryliert und
inaktiviert das Enzym, eine Phosphatase dephosphoryliert und reaktiviert es.
[*] Unter Interkonvertierung versteht man in der Enzymologie die Modifizierung eines Enzyms, das dabei seine Aktivitat oder seine regulatorischen
Eigenschaften wesentlich veriindert. Der Begriff wird im engeren Sinne hesonders d a m verwendet, wenn die Modifizierung enzymatisch katalysiert wird
und zur Bildung oder Losung kovalenter Bindungen am Enzym fiihrt. Die
Bedeutung der enzymatisch katalysierten chemischen Modifikation von Enzymen als Regulationsmechanismus wurde erst in neuerer Zeit erkannt (Uberhlick siehe [124-1261).
Angebt. Chtm. 187. Johry. 1975
1 Nr.
17
Die Interkonvertierung wurde am gereinigten Enzym in
vitro entdecktC5', 'I, konnte jedoch auch im lebenden Organ
nachgewiesen werden[132-l3'].
Der Ort der Phosphorylierung durch die Kinase ist die
Pyruvat-Dehydrogenase
Durch tryptischen Abbau
wurde ein Tetradecapeptid isoliert, das zwei phosphorylierte
Serinreste enthalt und folgende Sequenz hat[136*
13'1:
der Kinase ausreicht. Andererseits fallen ADP und erst recht
AMP wegen ihres geringen Hemmeffekts als regulatorische
Variable fur die Kinase aus. Die genannten Nucleotide haben
auch auf die Pyruvatdehydrogenase-Phosphatase keinen nennenswerten direkten EinfluB, so daB unklar ist, auf welche
Weise die Interkonvertierung den Erfordernissen der Zelle
entsprechend zur Regulation der Pyruvatdehydrogenase-Aktivitat eingesetzt werden kann. Ohne Wechselwirkung mit
Tyr-His-Gly-His-Ser-Met-Ser-Asn-Pro-Gly-Val-Ser-Tyr-Arg metabolischen Variablen ist der Phosphorylierungs-Dephosphorylierungszyklus eine Vergeudung von ATP, da die Kinase
Von den beiden verschiedenen Polypeptidketten der Pyruund die Phosphatase zusammen die Wirkung einer ATPase
vat-Dehydrogenase (E wird nur diejenige rnit dem hoheren
ausuben. (Die auf diese Weise verbrauchte ATP-Menge ist
Molekulargewicht, die a-Kette, pho~phoryliert['~~].
Die Kinase ist fest rnit der Dihydrolipoamid-Transacetylase
allerdings nicht sehr bedeutend.)
Ein Ausweg bietet sich an, wenn man die Magnesium-Ionen
(E2) ~ e r k n u p f t c511.
~ ~ Der
.
Ort der Bindung der Phosphatase
in die Betrachtungeinbe~ieht['~~].
ist unbekannt. Sie ist vie1 lockerer gebunden als die Kinase,
Ein Vergleich der MichaelisKonstanten der Teilenzyme des Komplexes fur Mg2 (Tabelso daB sich zwischen ihr und dem Komplex ein Assoziationsle 3)[1391zeigt, da8 nur die Phosphatase im physiologischen
Dissoziationsgleichgewichtbildet[24-Io6, 381.
Konzentrationsbereich nicht rnit Magnesium-Ionen gesattigt
Es wurde noch nicht geklart, warum die Phosphorylierung
ist. Eine Variation dieser Konzentration in vivo sollte also
der Pyruvat-Dehydrogenase (El) zu ihrer Inaktivierung fuhrt.
die Phosphataseaktivitat beeinflussen.
Die Inaktivierung und Reaktivierung durch PyruvatdehyModell-Experimente in vitro haben gezeigt, daB eine solche
drogenase-Kinase und -Phosphatase steht unter metabolischer
Variation durch Schwankungen in der Zusammensetzung des
Kontrolle. Besonders zwei Stoffklassen sollen in diesem ZuAdeninnucleotidpools erzeugt werden konnte. Etwa 90 yi des
sammenhang diskutiert werden: Die a-Ketosauren als SubMagnesiums der Zelle ist durch Zellbausteine komplex gebunstrate oder Substratanaloga der Pyruvat-Dehydrogena~e~~~~~
den, ein Drittel davon allein durch die Adeninnucleotide[l431.
und die Adeninnucleotide, z. B. ATP, als Endprodukt der durch
ATP wiederum komplexiert Mg2+ etwa zehnmal starker als
den Multienzymkomplex
eingeleiteten StoffwechselseADP, so daB die Zusammensetzung des Adeninnucleotidpools
q~enz['~~!
- das Verhaltnis der Konzentrationen von ATP, ADP und
a-Krtosiiuren: Brenztraubensaure und in schwacherem MaAMP-die Konzentration an freien, d. h. nicht komplex gebunBe a-Oxobuttersaure sowie Phenylbrenztraubensaure schutzen
denen Magnesium-Ionen in der Zelle beeinflussen kann[1441.
die Pyruvat-Dehydrogenase vor Phosphorylierung und InaktiBei hohem Energie-Potential (,,energy charge"'14''), d. h. wenn
vierung durch die Pyruvatdehydrogena~e-Kinase[~ . Diesehr viel mehr ATP als AMP vorliegt, ist mehr Magnesium
ser Schutzeffekt des Pyruvats ist beim Herzenzym erheblich
gebunden als bei niedrigem. Die Konzentration an freien Mastarker (Ki= 0.08 mmol/l) als beim Nierenenzym (Ki= 0.9
gnesium-Ionen in der Zelle beeinflufit aber, wie oben gezeigt,
mmol/l)[1071.Kinetische Untersuchungen haben ergeben, daB
die Phosphataseaktivitat und damit die Aktivitat des gesamten
es eine regulatorische Bindungsstelle fur u-Ketosauren gibt,
Multienzymkomplexes. Das Energie-Potential der Zelle
die wahrscheinlich weder rnit der Substratbindungsstelle von
schwankt nur innerhalb relativ enger Grenzen ;diese SchwanE I noch mit der ATP-Bindungsstelle der Pyruvatdehydrogenakungen reichen aber
urn die Aktivitat des Pyruvatdese-Kinase iibereinstimmt O 7 , 1401.
hydrogenase-Multienzymkomplexes uber den hier skizzierten
Der Schutzeffekt des Pyruvats kann physiologisch sinnvoll
Mechanismus erheblich zu variieren (Abb. 7). Analoge Uberlesein: Krrbs hat gezeigt, dalJ die Reduktionsaquivalente, die
fur die Gluconeogenese erforderlich sind, durch Oxidation
von Pyruvat in den Mitochondrien erzeugt werden mussen,
wenn nicht Lactat die Ausgangssubstanz fur die Gluconeogenese i ~ t [ ' ~1421.
' , Nach Belastung des Organismus kann die
Pyruvatkonzentration in vivo bis zu 0.5 mmol/l ansteigen.
Unter diesen Bedingungen ist die Gluconeogenese uber Oxalacetat nur moglich, wenn ein Teil des Pyruvats oxidiert wird,
um den Organismus rnit dem hierzu notigen NADH zu versorgen. Pyruvat selbst ermoglicht dies, indem es die Pyruvat-Dehydrogenase vor Inaktivierung durch die Kinase schutzt.
0
Im Herzen andererseits ist ohnehin jeder Faktor willkom0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Energe-Potentialmen, der die Zellatmung begunstigt. Hier ist der Schutzeffekt
Abb. 7 . Abhdngigkeit der A k t i v i t i t des Sliugctier-Pvrtivatdchydrogenase-Miitdes Pyruvats noch viel ausgepragter als in der Niere, so daB
tienzymkomplexes voni Energie-Potential (,,energy charge") und der M g 2 + die Oxidation des Pyruvats nicht durch entstehendes ATP
Konzentration. Die Kurven beschreiben Experimente bei einer Gesamtkonzentration an Mg'+ von 3, 4 und 5 mmolil. Die punktierte Kurve zeigt
blockiert werden kann.
die Konzentration an freiem, d. h. nicht komplex gebundenem Mg2 be1
Adeninnucleotide: ATP als Substrat der Kinase ist fur die
einer Gesamtkonzentration von 4mmol/l. Beim Energie-Potential I enthlilt
Interkonvertierung essentiell. ADP ist ein relativ schwacher
der Adeninnucleotidpool nur ATP, beim Energie-Potential 0 nur AMP. ATP
bindet M g 2 + ca. zehnnial starker als AMP. Die Aktivitiit des Enzyms sinkt
kompetitiver Inhibitor der Kinase, wahrend AMP, cyclisches
mit steigendem Energie-Potential, weil die fur die Reaktivierung durch die
AMP und zahlreiche andere Nucleotide keinen signifikanten
Phosphatase notwendigen Mg2+-Ioncn durch ATP komplexiert werden. Das
EinfluB auf die Regulation besitZen[' 07]. Die Michaelis-KonEnergie-Potential ist definiert als
stante fur ATP ist niedrig, so daB in allen metabolischen
1 ____
[ADP]~
+ 2[ATP]
____
Zustanden der Zelle die ATP-Konzentration zur Sattigung
2 ([AMP] + [ADP] + [ATP])
?
?
+
'
' 9
+
~
Angrw. Chrm. 1 87. Jahug. 1975
N r . 17
62 1
gungen gelten vielleicht auch fur Calcium, dem rniiglicherweise
eine zentrale Rolle zukoninit.
Atkirison hat gezeigt, daB weitere rnetabolische Effektoren
die Energiepotential-Abhlngigkeit eines Enzyms erheblich
verstiirken konnen['4s1.Wiihrend Versuche rnit intakten Mitochondrien die Bedeutung des Energie-Potentials (des ATP/
ADP-Quotienten) fur die Aktivitiit des Komplexes bestiitigen, wurden Zweifel daran geauBert, daR in vivo tatsachlich
zweiwertige Ionen diesen Effekt vermitteln[1461.
Versuche von
Scli~t.st~r
und Olson und kurzlich auch von C l k n g und Sucktor
mit Herzmitochondrien bestiitigen jedoch unser Mode1111a7 layl
~
4.6. Zusarnmenfassungder Regulationsrnechanismen
Die bisherigen Untersuchungen der Regulation durch Interkonvertierung lassen den SchluR zu, daR sie bei einem energieverbrauchenden Organ wie dem Herzen stiirker in Richtung
auf cine Aktivierung der Pyruvat-Dehydrogenase wirkt, bei
einem gluconeogenetischen Organ wie der Niere dagegen eher
in Richtung auf eine Inaktivierung["! Daraufweist die hohere
Phosphatase- und die niedrigere Kinaseaktivitat des gereinigten Herzcnzyms ebenso hin wie die Tatsache, daR der Schutzeffckt des Pyruvats gegen Inaktivierung hier wesentlich starker
1st als bei der Niere[lo7'. Allerdings ist noch vollig unklar,
ob es sich hierbei um einen quantitativen oder eineii qualitativen Unterschied handelt, d. h. ob der Herz-Multienzymkomplex inehr oder aktivere Kinasemolekule enthiilt.
Reed hat darauf hingewie~en[~~',
dal!, zwischen der PyruvatDehydrogenase und der Pyruvat-Carboxylase eine interessante
reziproke Beziehung besteht : Die Inhibitoren des einen EnLyms ATP und Coenzym A sind essentielle Cofaktoren
des anderen. Es ist durchaus dcnkbar, daB die Konzentration
dieser Metaboliten einen EinfluB darauf ausubt, ob Pyruvat
uber den Citronensaurezyklus fur den Energiestoffwechsel
oder uber Oxalacetat fur die Gluconeogenese verwendet wird
(siehe Abb. 5). Allerdings reichen die vorliegenden Daten bei
weitem nicht aus, um die zahlreichen auf den Pyruvatdehydrogenase-Multienzymkomplex
einwirkenden
Regulationsmechanismen quantitativ zu erfassen und ihre Bedeutung fur
die Aktivitit des Enzyms in vivo abzuschatzen. Vide der
hier geschilderten Experimente sind rnit dem gereinigten Enzym im Reagensglas durchgefuhrt worden und warten noch
auf ihre Bestatigung durch Versuche rnit lebenden Organismen. Die Interpretation, daB hier die Schaltstelle zwischen
Energiestoffwechsel und Gluconcogenese vorliegt, bleibt bis
auf weiteres Spekulation. Auch die Beziehung zum Fettsiiurestoffwechsel ist noch weitgehend unklar. Diese Ubersicht sol1
daher iiber eine Zusammenfassung der wichtigsten kinetischen
Daten (Tabelle 2 und 3) und die Andeutungen in Abb. 5
nicht hinausgehen.
Man konnte weiterhin spekulieren, ob durch die drei hier
beschriebenen Ebenen der Regulation (Abschnitt 4.1) eine Arbeitsteilung angestrebt wird, etwa in dem Sinne, daR jede
Ebene fur eine bestimmte Zeitskala verantwortlich ist. Die
chromosomale Ebene reguliert die Enzymaktivitat langsam,
irn Zeitraum von Stunden und Tagen; die Regulation durch
feed-back erfolgt schnell, innerhalb von Sekunden oder gar
Millisekunden. Die Interkonvertierung fullt die Lucke im Minutenbereich, so daB die Geschwindigkeit der Pyruvdtoxidation sowohl an kurzfristige als auch an langfristige Anderungen
der Anforderungen an den Stoffwechsel angepaBt werden kann.
~
622
~
5. SchluRbemerkungen
5.1. Der Multienzymkornplex - ein Artefakt?
In der Einleitung wurde auf die Moglichkeit hingewiesen,
daR sich bei der Isolierung des Enzyms mehrere Proteine
zu einem Multienzymkomplex zusammenlagern konnten, d. h.
daB der Multienzymkornplex vielleicht ein Praparationsartefakt ist. Dafur spricht, daR es bis heute trotz seiner GroBe
nicht gelungen ist, den Pyruvatdehydrogenase-Komplex elektronenmikroskopisch im Mitochondrion nachzuweisen. Folgende Argumente sprechen jedoch gegen diese Hypothese:
1 . Die Assoziation der beteiligten Enzyme ist hochspezifisch. Es konnen z. B. keine Hybridkomplexe rnit den Teilenzymen des ansonsten sehr ahnlichen 3-Ketoglutarsiure-Komplexes gebildet werden (wenn man einmal von E3, dem Flavoprotein, absieht, das in beiden Komplexen gleich ist).
2. Die elektronenmikroskopischen Bilder des gereinigten
Komplexes und der Teilenzyme zeigen, daB die Geometrie
der Komplexe organlsmus-spezifisch ist. (Da die aus ihnen
gewonnenen Daten rnit Messungen der Rontgen-Kleinwinkelstreuung ubereinstimmen, reprisentieren sie auch keine Artefakte der Fixierung oder Farbung.) Hybride aus Komplexen
verschiedener Organismen werden nicht gebildet.
3. Die Aktivitat der Enzyme im Komplex 1st grofler als
im isolierten Zustand. So stimuliert z. B. E2 die Phosphorylierung von E l durch die Pyruvatdehydrogenase-Kinase erhebl i ~ h [ ' ~ ' ]Die
. Kinase ist ferner mit E2 assoziiert, ihr Substrat
aber ist E l . Beides macht die Komplexbildung auch in vivo
wahrscheinlich.
Der endgultige Beweis fur das Vorhandensein des Komplexes in vivo steht jedoch noch B U S .
5.2. Biologische Bedeutung eines Multienzymkomplexes
Bringt es Vorteile fur den Stoffwechsel mit sich, wenn sich
mehrere Enzyme zu Multienzymkomplexen zusammenlagern?
Diese Frage kann hier nur unter zwei Gesichtspunkten gestreift
werden.
1. Ein Multienzymkomplex katalysiert mehrere Reaktionsschritte, ohne daB Zwischenstufen das Enzym verlassen und
zurn nachsten Enzym der Stoffwechselsequenz diffundieren
mussen. Das kann kinetisch ein Vorteil sein, verhindert aber
auch, daR andere Enzyme um eine der Zwischenstufen konkurrieren und sie ,,abzweigen". Der Komplex ,,kanalisiert" das
Substrat in eine bestimmte Richtung.
2. Das Zusammenlagern gleicher Polypeptidketten zu oligomeren Enzymen ist ein weitverbreitetes Prinzip. Fast alle allosterisch regulierbaren Enzyme sind aus mehreren Polypeptidketten aufgebaut. Der Multienzymkornplex ist vielleicht nur
eine Weiterentwicklung dieses Prinzips. Die Bedeutung von
,,Protein-Protein-Wechselwirkungen" fur die Regulation von
Enzymaktivitaten IZBt sich an vielen Beispielen belegen. und
auch beim Pyruvatdehydrogenase-Komplex finden sich erste
Hinweise dafur (siehe Abschnitt 5.1, Absatz 3).
LaRt man sich durch diese beiden Gesichtspunkte moglicherweise vom Sinn des Multienzymkomplexes uberzeugen,
so bleibt doch die G r M e des Gebildes vorerst noch ein Riitsel.
Warum sind anstatt je einer gleich 18 ( E . coli) oder gar
bis zu 60 (Sauger) Polypeptidketten der Teilenzyme in einem
Komplex enthalten? Bringt die daraus resultierende Geometrie die aktiven Zentren der Enzyme in eine besonders gunstige
Anyew. Chcm. 1 8 7 . Juhry. 1975
N r . 17
sterische Anordnung? Fur die Beantwortung dieser Fragen
reichen die vorliegenden experimentellen Daten nicht aus.
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Z U S C H RIFTEN
berichten. Diese Verbindungen werden u. a. in der Molekularbiologie herangezogen, um z. B. den Erkennungsbereich von tRNA-Synthetasen abzugrenzenl51.
Zur Synthese wird an die P-substituierten x-Isocyan-acryldureathylester
ein Grignard-Reagens (2) angelagert. Nach
Hydrolyse erhalt man a-tert.-alkyl-substituierte x-lsocyan-essigsaureathylester ( 3 ) , die sich (hier wie sonstr4]) in guten
Ausbeuten in Aminosaure-Derivate ( 4 ) umwandeln lassen.
Soweit bisher gepriift, sind beim Additionsschritt (1) ( 3 )
die Ausbeuten mit Methylmagnesiumhalogenid [R3= CH3 in
(2)] unbefriedigend vermutlich deshalb, weil dieses relativ
kleine Reagens bevorzugt a n die Estercarbonylgruppe addiert.
-
~
R3NHCHO
I
hOll/rll I r V l l
+
I
R'-C-CH-CO~H
I
RZ
(4)
Synthese von tert.-alkyl-substituierten Glycinen"]
Von Ulrich Schollkopf und Rolf M e y e r ~ ' ~
Die x-metallierten Isocyanide[21haben bereits viele neuartige
Zugange zu Aminoduren eroffnet[3.41.Wir mochten nun iiber
eine Synthese von tert.-alkyl-substituierten Glycinen [Typ ( 4 / ]
[*] Prof. Dr. U. Schollkopf und Dipl.-Chem. R. Meyer
Orgdnisch-Chemisches Institut der Universitat
34 Gottingen, Windausweg 2
624
Allgrmeine Arbeitsvorschrift
Alle Versuche wurden unter Stickstoff durchgefuhrt. Zur Losung von 40mmol (2) (dargestellt in situ aus Alkylbromid
und Magnesium) in 50 ml Ather (nicht aber Tetrahydrofuran"')
tropfte man unter Ruhren (Magnetruhrer) in 30 min bei - 5 ' C
die Losung von 20 mmol (Z)[hl in 20 ml Petrolather und 20 ml
Ather. Das Additionsprodukt fie1 dabei als brauner ,,Teer" aus
und durfte nicht durch Zugabe von weiterem Losungsmittel in
Losung gebracht werden, weil sich sonst kein (3) isolieren lieB.
Angew. Chem. i 87. Jahrg. 197s J N r . 17
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