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Design und Synthese eines Gerstes aus Gallensure fr die kombinatorische Chemie.

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ZUSCHRIFTEN
Einzelheiten zu den Kristallsti-ukturuntersuchungsn kiinncn beun Fachinformationsrentrum Karlsruhe, D-76344 Eggenstein-Lcopoldshafen. unter den
Hinterlegungsnummern CSD-405068 (2aj. CSD-405069 (2b). CSD-405470
( 3 ) . CSD-405070 (4) und CSD-405071 ( 5 ) aiigefordert werden.
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Design und Synthese eines Geriistes
aus Gallensaure fur die kombinatorische Chemie
Giinther Wess", Klaus Bock, Horst Kleine,
Michael Kurz, Wolfgang Guba, Horst Hemmerle,
Eloisa Lopez-Calle, Karl-Heinz Baringhaus,
Heiner Glombik, Alfons Enhsen und Werner Kramer
Die kombinatorische Chemie eroffnet der Arzneimittelforschung neue Moglichkeiten bei der Suche nach Leitstrukturen
und deren rdscher Optiinierung['I. Zwar markieren bereits viele
Peptide diesbezuglich einen ersten Meilenstein, doch ist die Optimierung einer fur die kombinatorische Chemie tauglichen Synthesesequenz noch immer weit mehr als eine rein handwerkliche
AufgabeI']. Die Synthesestrategie muI3 der Kompatibilitat und
dem Zusammenspiel von Harz und Gerust verbindenden Linker
sowie von Schutzgruppen und Derivatisierungsreaktionen
Rechnung tragen. Zahl, Diversitlt und Verfugbarkeit nichtpeptidischer Geruste sind gegenwartig noch auljerordentlich begrenzt. Das Design neuer, hinsichtlich ihrer Strukturen moglichst diverser nichtpeptidischer Geruste ist aber eine Voraussetzung, vielfaltigste Strukturen abzudecken[']]. Sowohl fur die
Herstellung von Verbindungsbibliotheken als auch zur gezielten
Leitstrukturoptimierung durch Parallelsynthese sind wir an
vielseitig verwend baren, konformativ fixierten Aminosiiurebausteinen interessiert. Insbesondere sollen diese Strukturelemente
Peptidsequenzen ersetzen und/oder pharmakophore Gruppen
oder andere Reste prii~rganisieren[~,
'I.
Wir berichten hier iiber das Aminosaureiquivalent 1, das die
cis-Dekalin-Teilstruktur (2) in einem Gallensauregerust aufweist und formal ein Tetrapeptidmimeticum 1st. Als Derivdt 3
sollte es sich fur kombinatorische Synthesen hervorragend eignen. In 1 nutzt man die beiden cis-standigen OH-Funktionen
der sc-Seite von Chenodesoxycholsaure 4, wobei, jeweils iiber
einen Spacer, C-7 die Carboxygruppe und C-3 die Aminogruppe
tragt. In bisherigen Arbeiten rnit Gallensauren['] waren die
Funktionalitlten an C-3 und C-7 gleich: Man nutzte entweder
beide OH-Gruppen in Form der Ester oder zwei Aminogruppen
als Amide. Im Unterschied dazu verwenden wir unterschiedliche, uber Spacer gebundene funktionelle Gruppen an C-3 und
C-7 sowie eine OH-Gruppe an C-24.
[*I
Dr. G . Wess, K.Bock, H. Kleine, Dr. M. Kurz, Dr. W. Guba.
Dr. H. Hemmerle. Dr. E. Lopez-Calk Dr. K.-H. Baringhaus, Dr. H. Glomhik.
Dr. A. Enhsen. Dr. W. Kramer
Zentralc Phdrma-Forschung, Hoechst AG
D-65926 Frankfurt
Teldax: Int. +69,331399
"'OH
4
In 3 liegen sowohl die Amino- als auch die Carboxygruppe
geschiitzt vor, konnen aber jederzeit selektiv unter sehr milden
Bedingungen am festen Trager freigesetzt werden. Zur Verkniipfung rnit dem polymeren Trager diente die saurelabile Tetrahydropyranyleinheit [71. Nach der Freisetzung vom Harz unter
sehr milden Bedingungen erhalt man den C-24-Alkoho1, der sich
bequem reinigen und derivatisieren lafit. Die Synthese von 3 ist
in Schema 1 dargestellt. Selektive Allylierungen an den Hydroxygruppen von Gallensauren und Gallensaureesterii waren bislang ein praparatives Problem[']. Die Verwendung von Allylbromid/Diisopropylethylamin lieferte nur in wenigen Fallen das
allylierte Produkt in befriedigender Ausbeute. Selektive Monoalkylierungen der 3-OH-Gruppe erforderten immer Schutzgruppen an 7-OH und 12-OH. Zur Allylierung von 7-OH und
12-OH waren daruber hinaus zunachst der Schutz der anderen
Funktionen und dann sehr lange Reaktionszeiten erforderlich.
Wir stellten nun fest, dalj in Allylbromid/DMF ( l / l ) rnit gepulvertem Kaliumhydroxid und unter Temperaturkontrolle (1020 "C, 8 h) selektiv 3-Allylchenodesoxycholsaureallylestergebildet wird. Dessen Reduktion rnit Lithiumaluminiumhydrid
liefert den Alkohol5, der mit Benzylbromid/DMF/KOH selektiv benzyliert werden kann. Danach wurde entsprechend an
7-OH allyliert.
Da die Phthalimidgruppe als Aminschutzgruppe stabil gegenuber vielen Reagentien ist, wahlten wir die Gabriel-Synthese"]
zur Einfuhrung der Aminfunktion. Die Verknupfung von 10 mit
dem polymeren Trlger gelang nach dem von Ellman beschriebenen Verfahren"]. Zur Verkniipfung in Dichlorethan mit Pyridinium-p-toluolsulfonat (PPTS; 18 h RuckfluB) wurden 1.5 g polymerer Triger eingesetzt ( < 2.25 mmol) und daraus 2.65 g
Verknupfungsprodukt erhalten. Der Chlorgehalt lag nach AufschluB und argentometrischer Bestimmung unter 0.76%.
Bei der Untersuchung der sauren Bedingungen fur die Abspaltung vom polymeren Trager erwies sich die Trimethylsilylethylgruppe als sehr empfindlich. Uberraschenderweise gelingt
die Abspaltung glatt und zersetzungsfrei in T H F rnit SalzsBure
in Diethylether (4h, Raumtemperatur; Schema 2). Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen wurden die Produkte vom
ZUSCHRIFTEN
a, b
\"
H o m o "K
"'OH
#OH=-
HO
"'OH
B
n
'
H
5
6
1
7
0
Schema 1. Synthese von 10 und Anbindung an die Festphase. a) AllylbromidiDMF ( l / l ) , KOH pulv., 10-20"C, 8 h (81%); b) LiAIH,, T H F 50-C, I h (98%):
c ) PhCH,Br/DM (175). KOH pulv., -1O'C - 0 ' C 3h (85%); d ) OsO,/NaIO,, Et,O/H,O (Ill), Raumtemperatur, 4h (roh, quant.); e ) NaBH,, Et,O/EtOH (3/1).
Raumtemperatur. 1 h (83%): f ) /BuMe,SiCI, 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP). CH,CI,. Raumtemperatur. 4 h (95%); g) AllylbromidlDMF ( l / l ) ,KOH pulv., O"C, 3 h
(94%); h) Bu,NF, THF. Raumtemperatur, 3 h (roh. quant.); i) CH,SO,CI. Pyridin, O'C + Raumtemperatur, 2 h (95 %o);J) Phthalimid-Kaliumsalz, DMF, 70 T,3 h (97%);
k) OsO,/NaIO,, Et,O/H,O (111). Raumtemperatur, 8 h (roh, quant); I) Pyridiniumdichromat, DMF, Raumtemperatur, 5 h (79%); m) HOBT, DCC. DMAP, CH,CI,.
n) H,. Pd/C l o % , Essig~~ureethylester.
Normaldruck und Raumtemperatur, 4 h (87%);
Raumtcinperatur. 15 min. d a m Me,SiCH,CH,OH, Raumtemperatur, 2h (91 YO);
0 ) Spacer-Polymer [7 b]. PPTS. CICH,CH,CI, Riickfluli, 18h.
3
11
12
13
14
Schema 2. Festphasenreaktionen und Freisetrung. a) MeNHNHJTHF:EtOH (l/6/1),
Raumtemperatur. 18 h: b) (CH,CO),O, Pyridin. CH,CI,. Raumtemperatur, 1 2 h :
@ = polymerer
Ti-Gger.
c) HCI,'Et,O, THF. 4 H : d ) Bu,NF. DMF. Raumtemperatur. 12h: e ) HOBT, DCC, CH,CI,, Raumtcmperatur. 1 h, dann PhCH,NH,. Raumtempcratur, 4h.
ZUSCHRIFTEN
Harz abgespalten (THF; HCI/Et,O,
Raumtemperatur), chromatographiert
und spektroskopisch analysiert. Die
Freisetzung des Amins aus 3 zu 11 unter den klassischen Gabriel- Bedingungen (Hydrazinolyse)['] gelingt nicht;
eine Nebenreaktion ist die Bildung des
Carbonsiiurehydrazids aus dem Trimethylsilylethyl-ester. Verbindung l l
bildet sich allerdings glatt bei der Umsetzung mit Methylhydrazin in T H F /
Ethanol bei Raumtemperatur. Sie 1iiDt
sich miihelos zu 13 acylieren. Die Carbonsiiure 12 wurde aus 3 mit Tetrabutylammoniumfluorid in D M F freigesetzt. Die Derivatisierung zu Amid'
gelin@ m i t DicyclohexylcarAhh. 1 . Vcrgleich dci- 3 IXjtruktitren voii 16 (I-edits) itnd cyclo-(o-Pr[~-Al~i-Ala)i
(links) [13]. Die cingerahni~cn
bodiimidil -Hydroxy-1 H-benzotriazol
Bereiche cntsprrchen icweils eincm /{-Turn.
(DCC/HOBT)['OI in Dichlormethan.
Aus je 250 mg 3 wurden nach chromaHexapeptids rnit zwei P-II'-Turns verglichen. Es wird crsichtlich.
tographischer Reinigung SO mg 13 und 65 mg 14 erhalten.
da13 das Gallensiuretemplat die Positionen i his i + 3 des oberen
Auf der Basis dieser methodischen Vorarbciten wurde eine
Bibliotek aus 40 Verbindungen des Typs 15 aufgebaut["'. Um
/$Turns des Hexapeptids cinnimmt. Im Unterschied zu den bisher bekannten Turnmimetica, die ublicherweise die Positionen
die Eignung von 1 als P-Turnmimeticum ZLI verifizieren, wurde
die D-Pro-Ala enthaltende cyclische Verbindung 16[12]synthetii + 1 und i + 2 einer [Mchleife ersetzen, liegt hier ein Turnmimeticum vor, das einem vollstiindigen /I-Turn entspricht und eine
Kettenverliingerung rnit eindeutiger Laufrichtung i n N- und
C-terminaler Richtung ermiiglicht. Damit steht mit 1 ein neuartiger Baustein fur das Design kombinatorischer Verbindungsbibliotheken zur Verfugung, der andere Strukturen abdeckt als
die bisher eingesetzten Turnmimetica. Dariiber hinaus weist das
Gallensiiuretemplat 1 eine kompakte hydrophobe Oberfliiche
auf, die sich beim Einbau in Peptid-Wirkstoffe gunstig aufderen
pharmakokinetische Eigenschaften auswirken kiinnte. Gegenc)+",
wartig synthetisieren wir weitere Modellverbindungen. um die
R'
/j-Faltblatt-induzierende Wirkung von 1 zu untersuchen. VerR' = Leu, Ala, Phe, Tyr, Asp
bindungsbibliotheken ausgehend von 1 werden derzeit hinsicht15
R2 I Phe, Pro
lich unterschiedlicher Targets biologisch gepriift.
R3 = Trp, Ala, Ser, Pro
tingegangen an1 30 Jiinuar.
vcrindcrte Fassung iitn 7 . Juni 1996 [Z 876x1
Stichworte: Festphasensynthesen
torische Chemie * Peptidmimetica
16
siert. Diese ihnelt einem cyclischen Hexapeptid, bei dem vier
Aminosiiuren durch das Gerust 1 ersetzt sind. Protonenabstiinde fur 16 wurden aus ROESY-NMR-Spektren in CDCI,
und DMSO ermittelt. In DMSO liegen zwei Konformere in1
Gleichgewicht vor. die sich in der Konformation der Peptidbindung zwischen dein Gerust und D-Pro unterscheiden, wiihrend
in CDCI, ausschliefilich das tram-Konformer vorliegt. Die experimentell bestimmten Abstiinde wurden fur eine 3 D-Strukturverfeinerung durch Distanzgeometrie und MolekuldynamikSimulationen in DMSO sowie Chloroform verwendet. In
Abbildung 1 wird die Struktur von 16 rnit der eines cyclischen
. Gallensiuren
Kombina-
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[lo] W. Konig, R. Geiger, Cl~em.Eer. 1970, 103, 788.
[I I] Aus 3 wurde die Carbonsiurefunktion freigesetzt und mit jeweils einer von fiinf
unterschiedlichen tevr-Butyl-geschutzten Aminosiuren verkniipft (HOBT,
DCC, CH,CI,). Nach Freisetzung der Aminogruppe aus dem Phthalimid
(MeNHNH,) wurde mit 9-Fluorenylmethoxycarhonyl(FMOC)-geschiitzten
Aminosiuren [O-[(Ethoxycarhonyl)cyanmethylenamino)-N.~-tetramethyluroniumtetrafluorohordt (TOTU). DMF] gekuppelt. SchlieRlich wurde
die Fmoc-Gruppe abgespalten (Piperidin) und mit weitereii Aminosiuren
umgesetzt (Fmoc-Derivate, TOTU). Man erhielt nach Freisetrung vom Harz
und Entschutzen (Trifluoressigsaure (TFA), CH,CI,, Et,SiH) die Produkte in
Form der Trifluoracetate. Filtration durch Aluminiumoxid (EtOAc, MeOH.
H,O, HOAc) lieferte die freien Verbindungen 15 in Ausbeuten von 50 ~ 9 0 %
init Reinheiten von 50-90% (HPLC).
[I21 Verhindung 9 wurde init o-Prolin-rerr-butylester-Hydrochlorid
(HOBT, DCC,
EtNiPrJ umgesetzt und anschliefiend mit Trifluoressigs~ureiwasser(9812)
entschiitzt. Umsctmng der freien Sailre mit L-Alanin-ii,i.r-hutylester-Hydrochlorid (HOBT. DCC. EtNiPr,), Frci5etzung der Siiure init Trifluoressig<iure;W;isser (9832). Phthalimid-Spaltuiig init M e O N H,NNH, und anschliefiende Cyclisierung mit Pentatluorphenol. (DCC, CH,CI,. hohe
Verdiinnung) lieferten 16 i n sehr gutcr Aushcute ( 9 2 % ) .
[13] M. Kurz. Dissertation, Technische Universitit Munchen. 1991.
Aldolasen werden nach Art der Donor-Aktivierung in zwei
Klassen unterteilt['I: Aldolasen der Klasse I bewirken eine
stereospezifische Deprotonierung des Substrats nach dessen
kovalenter Bindung an Lysinreste des aktiven Zentrums (Imin/
Enamin-Bildung), wiihrend Aldolasen der Klasse I1 Ubergangsmetalle (gewohnlich Zn2 +) als essentielle Lewis-SaureCofaktoren verwenden, um die Deprotonierung zu erleichtern
(Abb. 1 ) . Fur die FruA['] der Klasse I entwickelt sich trotz An-
B
A
,ope$-
d
Zum Mechanismus der metallabhangigen
Aldolasen der Klasse Il**
Wolf-Dieter Fessner*, A c h i m Schneider, H e i k e H e l d ,
Gudrun Sinerius, Christiane Walter, Mark Hixon und
John V. Schloss*
C
Ahh. I . Hypothesen zuin Mcchanisinus der Katalyse durch Aldolasen der Klasse 11. A: Enolat-Stabilisier~lngdurch Protonen-Relais [9] und Aldehydakii\,ierung
durch Zn' + [lo]. 6: Enolat-Stabilisierung durch Koordination von Carhonyl- und
Phosphatgruppc an Zn" [8]. C : Eiidiolat-Stahilisicrung durch Chelatkoordination
an Z n 2 + .
Professor Horst Prinzhacli zurn 65. Gehurtstag gewidmet
Die vier Dihydroxyacetonphosphat(DHAP)-abhangigen Aldolasen", 21 erfreuen sich eines wachsenden Interesses in der
praparativen asymmetrischen Synthese wegen ihrer Flhigkeit,
zwei neue Stereozentren mit hoher chiraler Induktion aufzubauenf3].Wahrend alle DHAP-Aldolasen eine sehr breite Substrattoleranz fur die Aldol-Acceptorsubstrate aufweisen, scheinen sie eine hohe Substratspezifitiit fur D H A P als Aldol-Donor
zu haben, wobei nur ein isosterer Ersatz der Phosphatestergruppe in engen Grenzen tolerierbar i ~ t [ ~In] .manchen Fallen kann
die Diastereoselektivitiit durch mangelhafte Kontrolle uber das
Stereozentrum an C-4 eingeschrankt sein, was auf eine gelegentliche inverse Bindung der Aldehyd-Carbonylgruppe hinweist[2'1.
U m die Ergebnisse der Methode noch besser prognostizieren zu
konnen, ware ein detailliertes Verstandnis der individuellen Beitriige von Aminosiiureresten des aktiven Zentrums zur Substraterkennung und zum Katalyseverlauf wunschenswert.
[*I
Prof. Dr. W-D. Fessner. Dr. A. Schneider. Dipl.-Chem. H. Held,
Dr. G . Sinerius, Dr. C . Walter
Institut fur Organische Chemie der Technischen Hochschule
Professor-Pirlet-Strafie I . D-52056 Aachen
Telefax: Int. + 24118888 385
E-mail: fessnerh rwth-aachen.de
Prof. Dr. J. V. Schloss, M . Hixoii
Department of Medicinal Chemistry, University of Kansa5
Lawrence. KS 66045 (USA)
Telefax: Int. 913/864 4503
E-mail: schloss((t kuhub.cc.ukans.edu
Enzyme in der Organicchen Synthese. 12. Mitteiluiig. Diese Arbeit wurde
durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Fe 24416-1 und SFB3801B25.
W. D. E) und durch die National Institutes of Health (Grants GM48568 uiid
GM07775. J. V. S.) gefordert. Wir danken Prof. Dr. G E. Schulz und Dr. M.
Dreyer (Universitat Freihurg) fur unpublizierte Daten aus Rontgenstrukluranalysea (siehe Lit. [11 b]). - 1 1 . Mitteilung: [4b].
+
["*I
wendung moderner Methoden der Enzymologie, der ortsgerichteten Mutagenese und der Proteinkristallographie[6f nur sehr
langsam ein schlussiges Modell, das die Funktion von Resten
des aktiven Zentrums individuellen Katalyseschritten zuordnetr71. Bisher ist hier noch keine Proteinstruktur mit gebundenen Substraten oder Inhibitoren bekannt.
Auf der Basis von Untersuchungen an der FruA aus Hefe
(Klasse 11) wurden Hypothesen zum Mechanismus Zn-abhingiger Aldolasen aufgestellt. Aus ESR-Messungen und NMR-Relaxationszeitbestimmungen am Mn2'-substituierten Holoenzym wurde abgeleitet, daB DHAP iiber seine Phosphatgruppe
bindet['] und eine Polarisierung der Carbonylgruppe durch
zn2t uber einen Imidazolring ubertragen wird (Abb. 1 , A)r91.
Die Ergebnisse spaterer FT-IR- und Deuteriumaustausch-studien mit nativer Hefe-Aldolase[lo~
zeigten, daB eine Aktivierung
des Aldehyds durch zusiitzliche direkte Koordination der Carbonylgruppe an Z n 2 + bewirkt wird (Abb. l , B). Vor kurzem
gelang Dreyer und Schulz[l'"] die Rontgenstrukturanalyse der
FucA (mit 2.13 A Auflosung) als der ersten Aldolase der Klasse 11. Danach ist das katalytisch aktive Zn2+-Ion im aktiven
Zentrum, das an der Grenzflache zweier Untereinheiten des
Homotetramers lokalisiert ist, fest durch drei N'-Atome von
Histidinresten (His92, His94 und His1 5 5 ) koordiniert (Abb. 1,
C). Unter Berucksichtigung der sterischen Gegebenheiten am
Zn2+-Ion inussen damit alle bisherigen mechanistischen Hypothesen verworfen werden, da die Koordination von mehr als
einem Substrat unmoglich ist und die Histidinliganden nicht als
Protonen-Relais zwischen gebundenen Substraten fungieren
konnen.
Unter den leicht alkalischen Bedingungen, die fur die Kristallisation der FucA notig sind, kann zur Rontgenstrukturanalyse
des Enzyms mit einem gebundenen Liganden nicht das natiir"
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