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Die Chemie der Inositlipid-vermittelten zellulren Signalbertragung.

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AUFSATZE
Die Chemie der Inositlipid-vermittelten zellularen Signalubertragung**
Barry V. L. Potter* und Dethard Lampe
Vor etwas mehr als einem Jahrzehnt be- dem Gebiet der Signalvermittlung eingerichteten Michael Berridge und seine leitet und eine Renaissance der InositMitarbeiter in Nature: ,,. . . micromolar und Inositphosphatchemie stimuliert.
concentrations of Ins(l,4,5)P3 ( ~ D - w z ~ o - Die Synthese von Inositpolyphosphaten
inositol 1,4,5-trisphosphate) release bringt mehrere Probleme mit sich: die
Ca2+ from a non-mitochondria1 intra- regiospezifische Einfuhrung von Schutzcellular Ca2 store in pancreatic acinar gruppen am Inositring, die Racematcells. Our results strongly suggest that spaltung der resultierenden Zwischenthis is the same Ca2+ store that is produkte, die Phosphorylierung des
released by acetylcholine". Mit der Ent- Polyols, die Entfernung aller Phosphatdeckung eines niedermolekularen se- Schutzgruppen unter Vermeidung einer
kundiiren Botenstoffs, der die raumlich gleichzeitigen Wanderung von Phosgetrennten Ereignisse der Aktivierung phatgruppen sowie die Reinigung des
von Rezeptoren an der Zelloberflache wasserloslichen Ziel-Polyanions. Mit
und der intrazellularen Ca2+-Mobilisie- der Losung dieser Probleme in den letzrung verbindet, wurde eine neue Ara auf ten Jahren ist es jetzt moglich, iiber die
+
1. Transmembrane Signaliibertragung
Um zusammenarbeiten zu konnen, miissen Zellen in mehrzelligen Organismen miteinander kommunizieren. Sie vermitteln
Signale durch Substanzen wie Hormone oder Neurotransmitter
(Abb. 1). Lipophile Hormone wie Steroide konnen die Zellmembran passieren und sich an ihre Rezeptoren im Zellinneren
anlagern. Viele chemische Botenstoffe sind jedoch zu hydrophil,
um Membranen passieren zu konnen. Zur Uberbringung ihrer
[*I
Prof. Dr. B. V. L. Potter, Dr. D. Lampe
School of Pharmacy and Pharmacology, University of Bath
Bath BA27AY (Grofibritannien)
Telefax: Int. 1225/826-I14
E-mail: B. V.L. Potter(Zbath.ac.uk
In diesem Beitrag verwendete Abkiirzungen: All = Allyl. Bn = Benzyl,
Bz = Benzoyl, Cb = (R)-1-Phenylethylcarbamoyl,
Cbz = Benzyloxycarbonyl,
Gro = Glycero. MEM = Methoxyethoxymethyl, MOM = Methoxymethyl,
Ms = Methylsulfouyl, Piv = Pivaloyl. PMB = p-Methoxybenzyl, Prop =
Prop-I-enyl, Ptd = Phosphatidyl, Tf = Trifluormethansulfonyl, TBDMS =
ten-Butyldimethylsilyl. Alle Vemeise auf Inosit beziehen sich auf das myo-Isomer, es sei denn, es wird ein anderes Prifix verwendet. Inositphosphate werden
als Ins, InsP, InsP,, InsP,, InsP,, InsP, und InsP, abgekurzt (Inosit, Inositmono-, -his-, -tris-, -tetrakis-, -pentakis- bzw. hexakisphosphat, mit einer Anordnung der isomeren Phosphatgruppen wie in Klammern angegehen. Desoxyfluor-Analoga sind durch ein Prafix gekennzeichnet, das sich aus einer Nummer fur die Position, in der die Substitution dnrch Flnor stattgefunden hat,
sowie dem Buchstaben F zusammensetzt, z. B. 2-F-Ins(1,4,5)P3 = 2-Desoxy-2-fluorinosit-l,4,5-trisphosphat,und Phosphorothioat-Analoga sind
durch ein Suffix, das den Buchstaben S enthilt, gekennzeichnet, z. B.
Ins(1,4,5)P3-5-S= Inosit-l,4-bisphosphat-5-phosphorothioat.
Synthese von natiirlichen Inositphosphaten hinaus (von denen standig mehr
gefunden werden) zur Entwicklung von
chemisch modifizierten InositphosphatAnaloga uberzugehen, mit der Aussicht,
Enzyminhibitoren, zweckmal3ig modifizierte Rezeptorliganden und -antagonisten sowie vielleicht sogar Therapeutica
fur den pharmakologischen Eingriff in
Signalubertragungsbahnen zu entwikkeln.
Stichworte: Inositphosphate . Sekundare Botenstoffe . Signaliibertragung
Botschaft lagern sie sich an spezifische Rezeptoren an der AuBenseite der Zellmembran an und aktivieren dadurch Mechanismen, die das Signal in die Zelle weitervermitteln - ein \'organg,
der als transmembrane Signaliibertragung bezeichnet wird. Diverse Arten von Rezeptoren sind an der Signaliibertragung beteiligt: 1st der Rezeptor mit einem Ionenkanal verbunden, kann
das Offnen dieses Kanals zum Ein- oder Ausstrom von lonen in
+
[**I
Angew. Chem. 1995, 107,2085-2125
C)
Abb. 1. Getting the message across: Signaliibertragungsmechanismen.
V C H Verlagsgesehchaji mhH, 0-69451 Weinheim,iYY5
0044-s249~YSjIO7iX-2085$ 10.00i,2510
208 5
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
bzw. aus der Zelle fiihren. Eine Anderung der Ionenkonzentration im Cytosol aktiviert zelleigene Enzyme und bewirkt so eine
Antwort. Eine andere Rezeptorklasse sind die Rezeptor-Tyrosinkinasen, die selbst Enzyme sind. Sie sind in die Zellmembran
eingebettet und haben Bindungstellen fur Agonisten an der AuIjenseite und aktive Zentren an der Membraninnenseite. Durch
Andocken von Agonisten wird das Enzym aktiviert, was die
Phosphorylierung von Tyrosinresten in Zielproteinen in der Zelle
zu Folge hat. Diese Art der Signaliibertragung wird von vielen
Wachstumsfaktoren und Hormonen einschlieRlich Insulin benutzt[’]. Die Rolle von spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Vermittlung des Informationsflusses von Rezeptor-Tyrosinkinasen zu ras-Proteinen ist inzwischen aufgeklart[’I.
Viele wasserlosliche Hormone bedienen sich eines Signaliibertragungssystems, bei dem der Rezeptor iiber einen intrazellularen Effektor mit der Produktion eines internen Signalmolekiils gekoppelt ist. Nach Anlagerung an ihr Rezeptorprotein an der Zelloberflache wird ein membranstandiges GTP-bindendes Protein (G-Protein)I3-.51 aktiviert, das mit dem Rezeptor
assoziiert ist. Die Gruppe der G-Proteine umfal3t mehrere Mitglieder, die unterschiedliche intrazellulare Prozesse regulieren.
G-Proteine bestehen aus drei Untereinheiten, die nach abnehmender Masse als a-, /I- und puntereinheiten bezeichnet werden. Nach der Aktivierung wird an die a-Untereinheit gebundenes GDP durch GTP ersetzt, wobei die P.y-Untereinheit von der
aktivierten a-GTP-Untereinheit dissoziiert. Die freigesetzten
Unterehheiten konnen nun andere membranstlndige Enzyme,
die als Signalverstarker fungieren, stimulieren oder hemmen
(z. B. K + - und Ca2+-Kanale,Adenylat-Cyclase (AC), Guany-
lat-Cyclase (GC) , PtdIns(4.S) P,-spezifische Phospholipase C
(PtdIns-PLC)) und ihrerseits sekundlre Botenstoffe an der cytosolischen Seite der Zellinembran bilden. Die der cr-Untereinheit
eigene GTPase-Aktivitat hydrolysiert dann GTP zu GDP. die
a-GDP-Untereinheit und die jt’,p-Untereinheit assoziieren wieder und das G-Protein kehrt Zuni Grundzustand zuriick.
1.1. Sekundare Botenstoffe
Als sekundare Botenstoffe wurden bisher cyclisches Adenosin-3’,5’-monophosphat (CAMP),cyclisches Guanosin-3’,S’-monophosphat (cGMP), Diacylglycerin (DAG), Ins( 1,4,5)P3 und
naturlich Ca2+-Ionen identifiziert. Gegenwartig zieht auch
Phosphatidylinosit-3,4,S-trisphosphatals potentieller sekundarer Botenstoff betrachtliches Interesse auf sich (siehe Abschnitt 2). Neuere Studien legen nahe, daR cADP-Ribose, ein
NAD +-Metabolit. ebenfalls Ca2+-mobilisierende Eigenschaften aufweisen konnter‘~‘I, und das Sphingolipid-Stoffwechselprodukt Sphingosin-I-phosphat konnte als potentieller sekundarer Botenstoff an Signaliibertragungen beteiligt sein, die von
einigen Mitogenen aktiviert werden[’].
1.2. Die Rolle von C a Z + in der Signaliibertragung
Der erste Hinweis darauf, dal3 CaZ+eine Rolle in der Regulierung zellularer Ereignisse spielt, war eine Beobachtung von Ringer im Jahre 1883[’01.Bei der Untersuchung von Muskelgewebe
Barry V. L. Potter, gehoren 1953 in Brighton (GroJbritannien), studierte Chemie an der University of Oxford als Stipendiat des Worcester
College, graduierte mit Auszeichnung und erhielt den Part-II- ThesisPreis in Organischer Chemie. Er promovierte 1981 in Oxford in Bioorganischer Chemie bei Prof: Gordon Lowe uher enzymkatalysierte
Phosphoryltrunsferrealztionen mit chiralen [ I 60,’7
0,”OIPhosphatestern als Graduate Scholar und als Junior Research Fellow des
Woljson College. Nach einem Po.stdoktorandenaufentha1t als European Exchunge Fellow der Royal Society bei Prof. Fritz Eckstein am
Max-Planck-Ii~stitutfur Experimentelk Medizin in Gottingen, wo er
.rich mit Nucleinsuurcchemie und ~olel~ularhiologiebeschafiigte,
nahm er 2984 eine Stclle als Dozent in Biologischer Chernie an der
University of Leicessier an. 1987 rrhielt er ein Lister Institute Research
D. Lainpe
B. v. L. potter
Fellowship, IYYOfolgte er at‘s Lister Institute Research Professor einem
Rujauf den Lehrstuh1,fur Medizinische Chemie an der School qf Pharmacy und Pharmacology an der University of Bath, und
1993 erhielt er srinen DSc \ion der University of Oxford. Seine Forschunginteressen liegen in Biologischer und Medizinischer
Chemie auf‘den Gehieten Enzymmeclianismen. Nucleinsuure- und Pliosphorchemie. Besondere Schwerpunkte sind die Chemie
von sekundaren Batenstoffen und die Synthese von Rezeptorliganden und Enzyminhibitoren.
I
Dethard Lampe, gehoren 1963 in Delmenhorst, studierte Chemie in Hamburg und Gottingen, wo er 1989 bei Prof. H.-D. Siiling
in Klinischer Biochemie sein Diplom erhielt. Im gleichen Jahr schloJ er sich als Wellconie-Trust-Prize-Stipendiatder Arbeitsgruppe von Dr. B. V. L. Potter in Leirester (Groflbritannien) an und ging 1990 an die School of Pharmacy und Pharmacology
an der University of Bath. Dort promovierte er 1993 iiher die Synthese von newartigen Inositphosphat-Analoga. AnschlieJend
war er an Prqjekten aufdem Gebiet der Inasitpolyphosphate beteiligt. Seit Anfang 1995 ist er am Instituto de Quimica Orgdnica
General, CSIC (Prof: M . Martin-Lomas) in Madrid tiitig, wo er sich mit Synthesen von bioaktiven Oligosucchariden bescliiiftigt.
<
2086
Angm
Clzcrn 1995, 107. 2085 2125
AUFSATZE
Inositlipide
stellte er fest, daB er nach dem Austausch des Leitungswassers
in seinem Medium durch destilliertes Wasser keine Kontraktionen mehr herbeifuhren konnte. Als fehlende Komponente wurde Ca2+ identifiziert.
Heute wissen wir, daB viele zellulare Ablaufe durch Proteinphosphorylierungen kontrolliert werden, die durch Anderungen
der intrazellularen Ca2+-Konzentrdtion beeinflufit werden, und
die Freisetzung von Ca2+gilt als primare Wirkung vieler Agonisten. Die cytosolische Ca2+-Konzentrationkann auf zwei Arten
reguliert werden :
1. Viele Agonisten induzieren eine Anderung der Membranpotentialdifferenz, was die Offnung spannungsabhangiger
Ca2+-Kan2le in der Membran zur Folge hat. Da die meisten
Ca2+-Ionen innerhalb der Zelle an Membranen oder Proteine
gebuiiden sind, ist der intrazellulare Ca2+-Spiegel niedrig und es
besteht deshalb ein groBer Konzentrationsgradient, so daB der
Einstrom von Ionen in die Zelle begiinstigt und dadurch die
cytosolische Ca2+-Konzentration erhoht wird.
2. Andere Agonisten sind in der Lage, Ca2+aus intrazellularen Speichern zu mobilisieren, so daB die intrazellulare Ca2+Konzentration erhoht und Ca2+-abhangige Enzyme aktiviert
werden. Die Antwort der Zelle hangt sowohl vom Zelltyp als
auch vom Agonisten ab.
Phospholipase C
(fur Ptdlns(4,5)P2)
HC-0-C
0
PMlns:
R1 = R2 = R3= H;
PMlns(4)P:
R1= PO:-,
R2 = R3 = H;
Ptdlffi(4,5)P~: R' = R2 = PO$-, R3- H;
PMlns(3)P:
R1 = R2 = H. R3 = PO$-
PMlns(3,4)P~: R' = R3 = PO;-,
R2 * H;
PMhs(3,4,5)P3:R1 = R2 = R3 = PO$
Abb. 2. Angriffsort der PhospholipaseC bei einigen Inositphospholipiden
GroBbritannien, und Frankfurt[lgl der gesuchte seknndare Botenstoff als ein myo-Inositpolyphosphat identifiziert, das sich
von dem nur in geringer Menge vorkommendem Phospholipid PtdIns(4,5)P2 ableitet: ,,micromolar concentrations of
2. Inosit-1,4,5-trisphosphat: ein sekundarer
Ins( 1,4,5)P3
(1 D-myO-inOSitOl 1,4,5-trisphosphate) release Ca2
Botenstoff
from a non-mitochondria1 intracellular Ca2+store in pancreatic
acinar cells. Our results strongly suggest that this is the same
Im Jahre 1850 isolierte Scherer ein optisch inaktives CycloCa2+ store that is released by acetylcholine".
hexanhexol-Isomer aus Muskelfleisch, das er Inosit nannte" 'I.
Mit diesen Entdeckungen wurde ein neues Kapitel in der SiEin gutes Jahrhundert spater und einige Jahre vor der Entdekgnaliibertragung anfgeschlagen, und seitdem waren die Fortkung des mittlerweile etdblierten sekundaren Botenstoffes 3'3'schritte auf diesem Gebiet spektakular, wie folgender Kommencyclisches AMP durch Rall und Sutherland[''. 13] zeigten Lotar von Hokin zeigtc2O1:,,the phosphoinositide field is currently
well und Mabel Hokin, daB Acetylcholin die Metabolisierung
the number one field in biochemistry in the number of citations
von inosithaltigen Phospholipiden in der Banchspeicheldriise
(excluding molecular biology)". Die Forschungsaktivitaten
und im Cortex stimuliert [141. Inosithaltige Phospholipide waren
wurden durch Auffndewines iiberaus komplexen Inositphosungefahr zehn Jahre zuvor von Folch in Gehirngewebe nachgephat-Stoffwechsels[21'221 unter Beteiligung von hoheren Inositwiesen worden['51. Spater wurde der von den Hokins beschriephosphaten wie InsP, und sogar pyrophosphathaltigem InsP,
bene Phospholipid-Effekt auch in anderen Systemen nach Stiund I ~ s P , [ ~weiter
~ ] angeregt. Noch faszinierender ist die
Charakterisierung der neuen inosithaltigen Phospholipide
mulierung durch Agonisten festgestellt, was auf eine Rolle dieser
Lipide in der Kopplung von Stimulus und Antwort hindeutete.
PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2 und PtdIns(3,4,5)P3 (Abb. 2 ) , die
Neue analytische Methoden halfen Ende der fiinfziger Jahre bei
nach der Stimulierung einer 3'-Kinase durch Wachstumsfaktoder Trennung der inosithaltigen Phospholipide in Phosphatidyren in Zellen gebildet ~ e r d e n ~Besonders
~ ~ ] . das letztgenannte
linosit (PtdIns), Phosphatidylinosit-4-phosphat [Ptdlns(4)P]
Phospholipid konnte selbst ein sekundarer Botenstoff sein. Dieund Phosphatidylinosit-4,5-bisphosphat [PtdIn~(4,5)P,]['~] ses Gebiet wird derzeit eingehend untersucht und scheint ein
vollig neuer Zweig der Polyphosphoinositid-vermittelten Si(Abb. 2 ) , und die chemischen Strukturen dieser Verbindungen
wurden bald darauf durch Ballou et al. a~fgeklart~"~.
Trotz diegnalubertragung zu sein. Dariiber hinaus wurde festgestellt, daB
ser Fortschritte kam man in den darauf folgenden Jahren im
der Zellkern einen eigenen autonomen Phosphoinositid-SignalVerstandnis der physiologischen Bedeutung der stimulierten
apparat zu haben ~cheint['~,
261.Einige dieser neueren Aspekte
Phospholipid-Umsetzung nur wenig voran, vor allem, weil
der Polyphosphoinositid-Signaliibertragung sind zusammengePtdIns als iiberwiegend vorkommenden Phospholipid zu vie1
faBt w ~ r d e n [ ~Obwohl
~].
ein diskretes Molekiil noch identifiAufmerksamkeit gewidmet wurde.
ziert werden muI3, hat unlangst die Entdeckung eines CaZ+-EinDer Durchbruch kam 1975, als Michell['*l die Verbindung
strom-Faktors (Ca2+ influx factor, CIF)[28,291 fur vie1 Aufrezwischen dem Agonisten-stimulierten Phospholipid-Stoffwechgung gesorgt. CIF scheint ein diffundierender Botenstoff zu
sel und erhohten intrazellullren Ca2+-Konzentrationen erkannsein, der in angeregten Zellen aus aktivierten intrazellularen
te, die im Hinblick auf die Regulierung vieler zellularer Prozesse
Bereichen freigesetzt wird und den Einstrom von Ca2 durch
schon verstarkt untersucht wurden. Es fehlte aber immer noch
die Plasmamembran ~ t i r n u l i e r t [311.
~ ~ Es
, sol1 hier auch auf vor
das chemische Bindeglied zwischen diesen Ereignissen. Ende
kurzem erschienene Berichte aufmerksam gemacht werden, in
denen gezeigt wird, daB die Bindungsaftinitat der PeniciIlium1983 wurde dann schlieBlich von Berridge etal. in Cambridge,
+
+
Angew. Chrm. 1995, 107, 2085- 2125
2087
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
huevicompuctum - Stoffwechselprodukte Adenophostin A und
2-02P
B zum Ins(l,4,5)P3-Rezeptor
'-o2p0
- :O
P: *
5HO
1
hoher als die von Ins(l,4,5)P3
iSt[32-341(Abb. 3).
Abb 3. Dersekundire Botenstoff
1)-mi~o-Inosit-l,4,5-trisphospliiit.
Wiihrend die rapiden Fortschritte in den letzten zehn Jahren vorwiegend auf biologischem Gebiet waren, ist klar, daB
gegenwartige und zukunftige Anstrengungen auf pharmakologische Eingriffe in das Polyphosphoinositid-Signalsystem gerichtet sein werden. Die ersten Synthesen von Ins(1,4,5)P3 wurden 1986-1987 veroffentlicht, und in der Folge wurden
bedeutende Fortschritte in der Synthese gemacht, so daB heute
die Schwierigkeiten bei der Herstellung von Inositphosphaten
im wesentlichen ausgeriumt sind. Der koniplexe, immer noch
iiicht vollstandig aufgekliirte Inositphosphatmetabolismus bietet allerdings stindig neue Syntheseziele. Daruber hinaus sind
Rezeptoren, die sekundare Botenstoffe binden, Enzyme, die
diese abbauen und die Wege. auf denen sie gebildet werden,
naturgemiiB potentielle Ziele fur das rationale Wirkstoffdesign t 3 5 -371. Der Schwerpunkt der Syntheseaktivitaten verlagert
sich daher in Richtung auf strukturmodifizierte Inositphosphate mit neuartigen biologischen Eigenschaften.
Im Mittelpunkt dieses Beitrags stehen neuere chemische Fortschritte auf diesem Gebiet. Obwohl versucht werden soll, die
wesentlichen biologischen Zusammenhiinge zu umreiRen, wurde eine vollstandige Darstellung der Biologie der letzten zehn
Jahre den Rahmen dieses Artikels sprengen. Der Leser sei auf
-'~
die]
die vielen Uhersichtsai-tike1122 3 8 - 4 7 1 und B i i ~ h e r [ ~ ~zu
sem Thema verwiesen. Mehrere Aufsiitze und Biicher iiber neu- 561. Zu fru'.
ere Aspekte von Inositsynthesen sind er~chienen['~
heren synthetischen Ansatzen sei der Leser auf zwei weitere
Veroffentlichungen hingewiesen I' ', '*I.
0
8
8
3. Konfiguration und Nomenklatur
von Tnositderivaten
3.1. Konfiguration und Nomenklatur
Nach Scherers Entdeckung von ,,Inosit"["] wurde in der englischsprachigen Literatur die Nachsilbe -01 hinzugefugt, und
weitere entdeckte oder synthetisierte Isomere erhielten ebenfalls
den Namen Inosit. Es gibt neun isomere Inosite einschlieBlich
eines Enanti~merenpaars['~]mit den Prafixen : scvllo-, myo-,
nro-, rpi-, cis-, ~?iuco-,uilo-, n-chiro-( +)- und ~-clzivo-(-)(Abb. 4). Die groRe Zahl von Inositen und ihren Derivaten hat
zu Problemen in der Nomenklatur gefuhrt, von denen noch
nicht alle vollstandigt gekliirt wurden. Die ,,1967 IUPAC Tentative Rules for Cyclitols"[h"l haben die Standardisierung einen
betrichtlichen Schritt vorwiirts gebracht, aber einige Schwierigkeiten bestehen immer noch. Einige Aspekte dieser Regeln sind
in Abschnitt 3.2. fur my-Inosit dargelegt. Es wurde angeregt,
die stereospezifische Numerierung fur Inositderivate zu iibernehmen[611, doch ist dieser Vorschlag noch nicht allgemein akzeptiert. Eine Notiz zu Versuchen, Nomenklatur und Abkiirzungen zu vereinfachen, ist erschienen["]. F u r eine vereinfachte
Diskussion dieses Themas sei der Leser auf einen ausgezeichneten A ~ i f s a t z [aufmerksam
~~]
gemacht.
2088
OH
scykxhosit
myehosit
epi-hosit
ciehosit
n-hosit
4
mucohosit
Abb. 4. Die neun lnositisomere
3.2. myo-lnosit
myo-Inosit ist ein meso-Cyclohexanhexol oder Cyclitol, und
weist dementsprechend eine Symmetrieebene mit funf aquatorialen und einer axialen Hydroxygruppe auf. Das Kohlenstoffatom, das die axiale Hydroxygruppe triigt, wird als C-2 bezeichnet, und die anderen Ringkohlenstoffe werden von C-1 bis C-6
im oder gegen den Uhrzeigersinn durchnummeriert, wobei sich
C-1 auf einer der beiden Seiten von C-2 befindet. Vereinbarungsgemllj fuhrt eine Numerierung gegen den Uhrzeigersinn
bei einem asymmetrisch substituierten Inosit zur D- und eine
Nummerierung im Uhrzeigersinn zur L-Konfiguration. Es wird
normalerweise dem Prifix Vorzug gegeben, das zu niedrigeren
Ziffern in der Nummerierung der Substituenten fuhrt. Die Symmetrieebene in myo-Inosit verlauft demzufolge durch C-2 und
C-5.
Die Substitution an einem der symmetrie-verwandten Kohlenstoffatompaare C-l, C-3 und C-4, C-6 fiihrt zu D- oder L-Enantiomeren. Die Substitution an C-2 und/oder C-5 resultiert in
einem meso-Produkt und ein Prafix ist hier unangebracht. In
Abbildung 5 sind die Enantiomere von Ins( 1 ,4)P2 dargestellt.
n
n
HO
OH
HO
D-lflS(1 ,4)P2
L-k(1,4)P2
Abb. 5. Die Enantiomere von m,.o-Inosit-1.4-bisphosphat.
D-Ins(1 ,4)P2ist ein durch Phosphatase aus Ins(1 ,4,5)P3 gebildetes Stoffwechselprodukt, und L-Ins(1 ,4)P2ist das synthetische
Enantiomer. Die Numerierung wird so gewahlt, weil die Alternative, ~-Ins(3,6)P,bzw. ~-Ins(3,6)P,,zu groljeren Bezifferungen fiihrt. Striktes Einhalten der IUPAC-Regeln kann jedoch
problematisch sein, besonders beim Verfolgen von MetabolisA n g m . Cht3m 1995, 107. 2085-2225
AUFSATZE
Inositlipide
muswegen, wo sich verwirrende Nomenklaturanderungen ergeben konnen. So wird ~-myo-Inosit-3,4-bisphosphat
(Name nach
der IUPAC-Konvention: L-myo-Inosit-l,6-bisphosphat)
durch
Phosphatasen zum Monophosphat L-myo-Inosit-I-phosphat
abgebant, obwohl der nichtkonventionelle Name D-myo-InOSit3-phosphat ein schnelleres Nachvollziehen dieser Reaktion ermoglicht. In einer IUPAC-Empfehlung wurde vorgeschlagen,
alle biologisch relevanten Verbindungen als D-Derivate zu kenn~ e i c h n e n ' ~ Diese
~ ] . Konvention wird, wo moglich, in diesem
Beitrag befolgt.
4. Biosynthese und Metabolismus
von myo-Inositphosphaten
4.1. Biosynthese von myo-Inosit
Der grol3te Teil des von Menschen aufgenominenen myo-Inosits stammt aus Pflanzen, nur ein Bruchteil wird biosynthetisiert. Die De-novo-Synthese ist sowohl in Pflanzen als auch
Tieren durch die von L-myo-Inosit-I -phosphat-Synthase (Dmyo-Inosit-3-phosphat-Synthase) katalysierte Isomerisierung
von r~-Glucose-6-phosphatmoglich. Dieses Enzym wurde aus
Hefer651,Saugetierhodenr66,671 und GehirngewebeL6'] zur Homogenitat gereinigt. Der B i o s y n t h e s e ~ e g [701
~ ~und
% stereochemische Aspekte sind diskutiert ~ o r d e n ' ~Das
~ ] . ~-Glucose-6phosphat-Analogon ~-Glucose-6-phosphorothioatist uberraschenderweise kein Substrat fur L-myo-Inosit-l-phosphat-Synthetase["].
myo-Inosit wird dann durch Inosit-Monophosphatase aus Lmyo-Inosit-1-phosphat gebildet. Die Monophosphatase ist ein
Schlusselenzym im Phosphatidylinosit-Cyclus, da es beide
Ins(1)P-Isomere hydrolysiert, das auf obigem Weg entstandene
L-Isomer und das durch die Hydrolyse von PhosphatidylinositPhospholipiden gebildete D-ISOmer. Es wurde gezeigt, dalj dieses Enzyrn auch D- und ~-Ins(4)Pund in vitro Ins(5)P dephoswurde aus Gep h ~ r y l i e r t [ ~myo-Inosit-Monophosphatase
~].
hirngewebe i ~ o l i e r t-[751
~ ~und eine Kristallstrukturanalyse des
Enzyms ist inzwischen veroffentlicht ~ o r d e n [ ~ ~ J .
Groljes Interesse wird diesem Enzym auch deswegen beigemessen, weil es durch Lithium-Kationen gehemmt werden
kann. 1971 wurde bemerkt, daB die Konzentration von freiem
myo-Inosit im Gehirn von mit Li behandelten Ratten betrachtlich erniedrigt i ~ t [ ~Gegenwartig
~].
wird aktiv nach Bindegliedern zwischen den bekannten therapeutischen Wirkungen von
Li' bei der Behandlung von manischen Depressionen und seiner Hemmung von myo-Inosit-Monophosphatase gesucht. Da
mit der Nahrung aufgenommenes myo-Inosit die Blut-HirnSchranke nicht passieren und somit das Gehirn nicht erreichen
kann, mulj es hier de novo aus ~-Glucose-6-phosphatbiosynthetisiert werden. Wird der letzte Schritt auf diesem Weg, die
Dephosphorylierung von L-Ins(l)P, durch Li' blockiert, kann
das Gehirn seine Vorrate an Phosphatidylinosit-Lipiden nicht
wieder auffullen. Das auf diesen Lipiden basierende BotenstoffSystem (siehe Abschnitt 4.2), das von Neurotransmittern in
der zellularen Signalvermittlung zur Anderung der elektrischen
Aktivitlt benutzt wird, ist dann nicht funktionsfahig. Es wird
vermutet, daD dies besonders hyperaktive Zellen, wie sie in
einigen Fiillen von Manie vorkommen, betrifftf7*.791. Diese
+
Angew. Chem. 1995, 107, 2085-2125
wichtigen Aspekte sind in U bersichtsartikeln zusammengefaljt
worden[80-821.
Die Inhibierung von Inosit-I-phosphatase durch Li+-10nenLS3]ist ungewohnlich, da sie nichtkompetetiv ist. Es wird
angenommen, dalj Li' den zweiten Schritt der Dephosphorylierung, den Zerfall der Phosphoryl-Enzym-Zwischenstufe,
hemmt, moglicherweise indem es durch ein im aktiven Zentrum
angreifendes Wassermolekiil koordiniert wird, wodurch die Nucleophilie dieses Wassermolekiils abnimmtLs33841. Ein besseres
Verstandnis des Mechanismus der Inhibierung durch Li' auf
molekularer Ebene wird zusammen mit der Kristallstrukturanalyse des Enzyms und den umfassenden gegenwartigen Anstrengungen in medizinischer Chemie wesentlich zur rationellen Entwicklung von Mimetica mit potentiellen antimanischen Eigenschaften beitragen. Mehrere wirksame, allerdings kompetitive
Enzyminhibitoren sind inzwischen synthetisiert worden (siehe
Abschnitt 9).
4.2. Der Phosphatidylinosit-Cyclus
Inosithaltige Phosphatide (Abb. 2) machen weniger als 10 %
des gesamten Phospholipidgehaltes in Tierzellen aus. PtdIns ist
das haufigste (> 90%) und kommt vorwiegend im endoplasmatischen Reticulum (ER) vor. Die Polyphosphoinositide
PtdIns(4)P und PtdIns(4,5)P2 sowie eine kleine Menge an PtdIns
befinden sich an der Innenseite der Plasrnamembran.
Pflanzliches PtdIns hat eine andere Struktur als PtdTns aus
tierischen Quellen. (Eine Beschreibung der Phosphoinositidvermittelten Signalubertragung in Pflanzen, die bereits von
Drerbak zusammengefaljt w ~ r d e [ ~ist~auoerhalb
],
des Rahmens
dieses Beitrags.) In Pflanzen ist das sn-2-Glycerin-Kohlenstoffatom mit der C,,-Fettsaure Linolsaure (18:2) und die sn-1-Position mit (16:O)-, (18:O)- oder (18:2)-Fettsauren verkniipft, wahrend in Tieren an C-2 vorwiegend Arachidonsaure (20:4) und
an C-1 Stearinsaure (18: 0) vorkommen. PtdIns wird durch
eine spezifische Kinase (Ptdlns-4-Kinase) zum 4-Phosphat
PtdIns(4)P und dieses durch eine andere Kinase (PtdInsP-5-Kinase) zum Schliissel-Lipid PtdIns(4,5)P2 phosphoryliert. Dariiber hinaus konnen spezifische Phosphomonoesterasen
PtdIns(4)P nnd PtdIns(4,S)P2 d e p h o s p h ~ r y l i e r e n [Nach
~ ~ ~ .Aktivierung des Rezeptors aktiviert das assoziierte G-Protein die
membranstandige Phosphodiesterase (Phosphoinositidase)
Phospholipase CL871.Diese spaltet PtdIns(4,5)P2 in die beiden sekundaren Botenstoffe D-myO-hOSit-l,4,5-trisphosphdt
(Abb. 3) und 1,2-Di-O-acylglycerin(DAG), wodurch eine Gabelung des Signaliibertragungsweges erreicht wird. Das hydrophile Ins(l,4,5)P3 diffundiert ins Cytosol und aktiviert dort einen
an der Oberflache des ERs befindlichen Rezeptor eines C a Z f Kanals, wodurch Ca2 aus einem internen Speicher freigesetzt
wird (siehe Abschnitt 5). Nishizuka et al. zeigten, daD DAG
ProteinkinaseC (PKC) aktiviert[''. "I. PKC wurde als der Pange gesuchte ,,Rezeptor" fur turnorfordernde Phorbolester identifiziert["]. Urspriinglich wurde angenommen, dalj es sich bei
PKC nur um eine Verbindung handelt, doch ist inzwischen klar,
daD es eine grolje Familie von Proteinkinase C-Isozymen
gibt[" -931.DAG ist hydrophob, bleibt in der Membranebene
und kann auf zwei Wegen - durch eine Kinase oder eine Lipase
- metabolisiert werden. Im ersten Fall bleiben die Fettsiiurereste
+
2089
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
erhalteii und DAG wird zu Phosphatidsaure phosphoryliert, die
rnit Cytidin-5'-monophosphat (CMP) CMP-Phosphatidat bildet. Mit einem Inositmolekiil kann daraus wieder Ptdlns entstehen. Diese Reaktion wird durch Ptdlns-Synthetase katalysiert.
Im zweiten Fall wird DAG durch eine Lipase unter Freisetzung
der in der Prostaglandin-Synthese benotigten Eicosanoid-Vorstufe A r a c h i d ~ n s a u r ezum
~ ~ ~Monoacylglycerin
~
hydrolysiert.
Der DAG-Signalubertragungsweg wurde unter Strukturaspekten rnit DAG-Analoga ~ n t e r s u c h t [ ~961.
" Die Strukturvoraussetzungen fur die PKC-Aktivierung durch Lipide wurden in
einem Ubersichtsartikel zusammengefaBt[971.
Abgesehen von den genannten, etablierten Phosphatidylinositlipiden, deren Beteiligung an der Signalvermittlung heute unbestritten ist, wurde vor kurzem ein weiteres groRes Feld durch
die Entdeckung von drei Phospholipiden mit einer Phosphatgruppe in der D-3-Position des Inositringes eroffnet. Diese Lipide sind PtdIns(3)P, Ptdlns(3,4)P2 und PtdIns(3,4,5)P3 (Abb. 2).
Ihre Herkunft wurde zuniichst heftig diskutiert["], doch wird
jetzt allgemein akzeptiert, dal3 die direkte Phosphorylierung von
PtdIns(4,5)P2 durch eine 3-Kinase ( P t d I n ~ - 3 K ) [der
~ ~ ]Hauptbildungsweg von PtdIns(3,4,5)P3 in stiniulierten Zellen ist.
PtdTns(3)P und Ptdlns(3,4)P2 werden aus der Stammverbindung PtdIns(3,4,5)P3 durch Phosphatase gebildet[24, 'Ool. Die
3-phosphorylierten Lipide sind anders als Ptdlns(4,5)P2 keine
Substrate fur Phospholipase C und konnen deshalb nicht als
Vorstufen fur Inositphosphat-Signalverbindungendienen["'].
Die Ptdlns-3K-Aktivierung ist der mitogenen Signalvermittlung
durch Rezeptor-Tyrosinkinasen eigen['n21, die durch Wachstumsfaktoren stiniuliert werden, und ist auch a n der Vermittlung von Signalen durch viele Rezeptor- und NichtrezeptorProtein-Tyrosinkinasen beteiligt[103%04]. Noch ist eine
eigenstandige Rolle von PtdIns(3,4,5)P3 als sekundarer Botenstoff nicht offensichtlich, und die Suche nach einem intrazellul5ren Effektor halt an. Moglicherweise wechselwirkt Ptdlns(3,4.5)P3 wie P t d I 1 i s ( 4 S ) P , " ~rnit
~ ~ dem Cytoskelett.
4.3. Der myo-Inosit-1,4,5-trisphosphat-Metabolismus
Einmal in der Zelle freigesetzt, muB ein sekundarer Botenstoff
zur Beendigung seiner Wirkung und zur Herstellung des Grundzustands der Zelle als Vorbereitung fur einen neuen Stimulus
effizient desaktiviert werden. Allerdings konnen die Metaboliten des sekundaren Botenstoffs in der Zelle ebenfalls physiologisch aktiv sein. Ins(1 ,4,5)P3 wurde unter diesen Gesichtspunkten in den letzten Jahren eingehend untersucht. Dabei wurde
klar, daB sein Abbau zu freiem Inosit, das zur Lipidsynthese
wiederverwendet wird, sehr komplex ist und viele, oft schwer
voneinander trennbare Inositphosphate entstehen. Dieser
Ptdlns-Kreislaufs sol1 hier n u r grob umrissen werden, Einzelheiten sind in ausfiihrlichen Ubersichtsartikeln zusammengefaljt[21. 2 2 . 1061. D'ie Grundziige des Ins(l,4,5)P3-Stoffwechsels
sind in Abbildung 6 dargestellt.
Die durch PLC bewirkte Spaltung von PtdIns(4,5)Pz wird
durch die Tatsache kompliziert, daD Ins(1,4,5)P3 nicht das einzige hydrophile Produkt ist. Der Angriff von H,O auf die Phosphodiesterbindung von Ptdlns(4,5)P2 liefert lns(1 ,4,5)P3 und
DAG, aber die Spaltung kann auch - z. B. in thrombinstimulierten Blutplattche~i~' -~ durch den Angriff der 2-Hydroxygruppe
2090
U
lnosit
I
Abb. 6. Der Inositphosphat-Stoffwechsel.
a m Phosphoratom herbeigefuhrt werden, was zu cyclischem
Inosit-I :2,4,5-trisphosphat [cyclischem lns(1: 2,4,5)P3] fiihrt.
Erste Berichte fuhrten zu der Annahme, dal3 cyclisches
Ins(1: 2,4,5)P, ein sekundarer Botenstoff sei["'*l, aber diese friihen Resultate konnten nicht bestatigt ~ e r d e n [ ' ~Auch
~ ] . ist die
lange Halbwertszeit von cyclischem Ins(1 :2,4,5)P3 in Ohrspeicheldrusen-Zellen mit einer physiologischen Funktion bei der
Ausschiittung von Ca2+ nicht vereinbar" ''I, und seine niedrige
Konzentration in einigen stimulierten Zellen spricht gegen eine
wichtige Botenrolle fur diese Verbindung" ' I 1 . Die Produktion
von cyclischem Ins(1: 2,4,5)P3 ist nach dem gegenwartigen
Kenntnisstand lediglich eine unvermeidbare, nichtfunktionelle
Konsequenz der Wirkung von Phospholipase C[1121.
Die Rolle von Ins(l,4,5)P3 als sekundarer Botenstoff ist mittlerweile akzeptiert. Zwei Hauptabbauwege sind entdeckt worden: Es war schon langer bekannt, daD Ins(1,4,5)P3 durch eine
5-Phosphatase abgebaut wird, wie zuerst in Erythrocyten[i'31
und spater in vielen anderen Zellen gezeigt wurde[211.Es scheint
mehrere Typen dieses Enzyms zu geben, und es existieren sowohl losliche, cytosolische Formen als auch partikelartige,
membrangebundene Formen. Menschliches Blutplattchencytosol enthalt z. B. zwei als Typl und TypIl bezeichnete 5-Phosphatasen, und die partikelartige TypI-5-Phosphatase aus humanen Placentamembranen ist gereinigt und charakterisiert
worden" 141. D a fur das Produkt der 5-Phosphatase-Einwirkung, lns(1 ,4)P2, keine physiologische Rolle in diesem Signalubertragungsweg bekannt ist (es gibt allerdings Berichte,
nach denen lns(1 ,4)Pz als Aktivator von DNA-Polymerase cxc1 und 6-Phosphofructo-1 -Kinasef' wirkt), scheint es
klar, daD durch dieses Enzym nur das Signal zur Ca2+-Mobilisierung abgeschaltet wird. Ins(1 ,4)P2 wird uber Ins(4)Pzu Inosit
abgebaut, das wieder in den Kreislauf eintritt.
1985 wurde das hohere Polyphosphat Ins(1,3,4,5)P4 entdeckt["'I, und wenig spater wurde das 3-Kinase-Enzymf' '*I isoliert" 99 IZo1, sequenziert und geklontriZ1.1 2 2 1 . Dies fiihrte zu
einer weiteren Komplikation des Stoffwechselweges und loste
A?i,qru.Chern. 1995. 107. 2085 2125
Inosi tlipide
AUFSATZE
Spekulationen uber die Funktion von lns(1,3,4,5)P4 aus, die
trotz heftiger Diskussion noch nicht eindeutig geklart werden
konnte['23-'261 . E'ine beachtliche Kontroverse wurde durch den
droxylradikalbildung v ~ r g e s c h l a g e n ~ 'InsP,
~ ~ ~ . kann uberraschenderweise weiter phosphoryliert werden: Es gibt Hinweise
fur die Existenz der pyrophosphathaltigen hoheren Polyphosphate InsP, und I ~ s P , [ ' ~ ]deren
,
Strukturen bisher noch nicht
eindeutig charakterisiert worden sind. Diese Verbindungen
koinmen im Schleimpilz Dictyosteliuwr vor. Daruber hinaus
konnen Inositpolyphosphat-Pyrophosphate auch durch Lyophilisierung von Inositpolyphosphaten in Gegenwart eines
Phosphoryl-Donors gebildet werden[231.
Zur Untersuchung des Inositpolyphosphat-Stoffwechselsin
unterschiedlichen Geweben wurden zwei wichtige instrurnentelle analytische Methoden entwickelt : Zum einen die Anionena u s t a u s ~ h - H P L C [ rnit
' ~ ~enzymatischer
~
On-line-Hydrolyse der
Phosphate durch alkalische Phosphatase, die in einem der Siule
nachgeschalteten Reaktor immobilisiert ist, und Detektion des
anorganischen Phosphats rnit M ~ l y b d a t [ ' sowie
~ ~ ' zum anderen
ein Metall-Farbstoff-Nachweissystem, bei dem eine Dephosphorylierung nicht erforderlich ist und dreiwertige Ubergangsmetall-Ionen mit groljer Affinitat sowohl den Farbstoff 4-(2-Pyridy1azo)resorcin als auch Inositphosphat-Polyanionen binDiese Methode erlaubt den Nachweis von Inositphosphaten im pmol-Bereich.
Die Inositphosphate wurden auch NMR-spektrokopisch untersucht. Durch Multikern-NMR-Spektroskopie wurden die
Strukturen und die Konformationen von I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [ ',]'4~
1 ~,
In~(1,3,4,5)P,['~~.
' Ins(1,4,5,6)P4['5'l, I ~ S P , [ ' und
~ ~ ]vielen
niedrigeren I n o s i t p h ~ s p h a t e n [ 'aufgeklart.
~~~
Die Daten von
Phytinsaure deuten darauf hin, daI3 sich dessen Konformation
rnit dem Protonierungsgrad andert. Bei hohem pH liegt das
Molekul in einer Konformation mit einer axialen und funf aquatorialen Phosphatgruppen vor und zwischen pH 2 und 5 in einer
Konformation rnit einem aquatorialen und fiinf axialen Phosphatresten, die durch intramolekulare Wasserstoffbriickenbindungen stabilisiert wird.
Vorschlag herbeigefuhrt, lns(1,3,4,5)P4 agiere selbst als sekundarer Botenstoff und wurde den Einstrom von extrazellularem
Ca2 durch Phsmamembran-Ionenkanale vermitteln[' "1. Ein
Ende dieser Debatte ist noch nicht in Sicht.
Welche Funktion Ins(1 ,3,4,5)P4 auch immer hat, es scheint
von derselben 5-Phosphatase wie Ins(1 ,4,5)P3
abgebaut zu werden. Erschwert wird die Aufklarung des Sachverhalts allerdings dadurch, daI3 es mehrere losliche Subtypen sowie partikulCre Formen des Enzyms gibt['2si. Beide Substrate werden
durch das partikulare und das losliche Enzym Typ I gespalten,
wobei Ins(1,3,4,5)P4 das bessere Substrat ist. Das Typ-11-Enzym
weist eine sehr geringe Affinitat fur das Tetrakisphosphat
auf[21, 128, 1291 F"
. ur das Produkt Ins(1 ,3,4)P3 wurde auf Grundlage des Befundes, dalj es intrazellulires Ca2+ in geringem
Mane mobilisiert, ebenfalls eine physiologische Funktion vorg e ~ c h l a g e n [ ' ~Dies
~ ] . wurde jedoch nicht b e ~ t a t i g t " ~und
~ ] , derzeit gibt es keine Anhaltspunkte fur eine physiologische Rolle
dieser Verbindung. Der Metabolismus von Ins(1,3,4)P3 ist je
nach Gewebe unterschiedlich. Die Produkte Ins( 1,3)P2 und/
oder Ins(3,4)P2 werden anschlieBend in die Monophosphate
Ins( l ) P bzw. Ins(3)P uingewandelt, und diese werden schlieI3lich durch Inosit-Monophosphatase zu Inosit dephosphoryliert.
Untersuchungen zur Aktivitat von Ins( 1,3,4,5)P4 werden
durch die Tatsache kompliziert, dalj es in vielen Geweben durch
eine 3-Phosphatase in Ins(1,4,5)P3 umgewandelt ~ i r d [ ' ~ ' 331.
,
Es wird jetzt angenommen, daB InsP, und InsP, die physiologischen Substrate dieses Enzyms sind, da diese Verbindungen mit
sehr vie1 grolkrer Affinitat als Ins( 1,3,4,5)P4 angegriffen werden['341. Ins(1 ,3,4,5)P4-3-Phosphatase wurde aus Hepatocyten
i ~ o l i e r t [ ' ~in~ ]denen
,
es im ER ~ o r k o m m t [ ~ ~ ~ I .
Weitere Stoffwechselwege wurden entdeckt: So kann
Ins(1,3,4)P3 durch eine 5/6-Kinase zu Ins(1,3,4,6)P4 phosphoryliert ~ e r d e n [ ' ~371,
~ . das eine geringe Ca2+-mobilisierende Ei5. Der Inosit-l,4,5-trisphosphat-Rezeptor
genaktivitiit a u f w e i ~ t [1391
' ~ ~. ~D'ie 5/6-Kinase setzt daruber
hinaus Ins(1,3,4)P3 zu Ins(1,3,4,5)P4 um. In Tierzellen wird
Der Inosit-I ,4,5-trisphosphat-Rezeptor (InsP,R) ist ein hganIns( 1,3,4,5)P4 durch die 5/6-Kinase zu Ins(1,3,4,5,6)P5 phosdenregulierter Ionenkanal, der durch die Anlagerung von
phoryliert, das zu drei Verbindungen, InsP, (Phytinsaure)
Ins( 1 ,4,5)P3 aktiviert wird und als Ca2+-Schranke fungiert
und dem normalerweise nicht trennbaren Enantiomeren(Abb. 7). In den letzten funf Jahren sind viele Informationen zur
paar 1ns(3,4,5,6)P4 und Ins(1,4,5,6)P4, metabolisiert wird.
Molekiilstruktur von InsP,R, seiner Verteilung im Geuebe und
Ins(1,4,5)P3-5/6-Kinasewurde aus Leber rnit einer
InsP,-AffinitatssZule gereinigt['401.
no
I opo:
Das Vorkommen dieser hoheren Inositpolyphosphate in Pflanzen und den Erythrocyten von
Vogeln, wo sie als Phosphat-Speicher und Modulatoren der Sauerstoffaffinitat von Hamoglobin
fungieren, war schon langer bekannt[s7,701. Der
Nachweis von hoheren Inositpolyphosphaten in
Slugetierzellen sowie Befunde, nach denen diese
Verbindungen intra- und extrazellulare Signale im
Gehirn ubertragen kOn~~ten['~'.
,]'4l
sind fur dieses Gebiet sehr vielverspre~hend['~~].
Es ist allerendoplasrnatischesRetic
dings unwahrscheinlich, daI3 diese hoheren
Polyphosphate direkt an der Signalubertragung
CaZ+
beteiligt sind. Fur InsP, wurde eine physiologische
Rolle als Inhibitor der Eisen-katalysierten HyAbb. 7. Schematische Darstellung des Ins(l,4,S)P3-Rezeptors(Querschnitt)
+
'
'
Angew. Cliern. 1995, 107, 2085-212s
2091
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
in der Zelle sowie seiner Regulierung zusammengetragen worden['53-1s81.Im Gehirn werden Ins(1 ,4,S)P3-Rezeptoren vor
allem in Purkinje-Zellen, im Hippocampus, im Striatum und in
der Hirnrinde exprimiert. Daruber hinaus kommen sie in der
glatten Muskulatur von Arterien, des Uterus und von Eileitern
sowie in der kontraktilen glatten Muskulatur von Eingeweiden
und der Speiserohre vor. Durch Elektronenmikroskopie wurde
gezeigt, dalJ der Rezeptor in Purkinje-Zellen meist rnit dem glatten E R assoziiert ist, aber auch im rduhen E R und in der auBeren Kernmembran vorkonimt.
InsP,R wurde 1988 in Form von zwei immunologisch identischen Polypeptiden, einem Ins(l,4,5)P3-bindenden Protein[' 591
und dem in Purkinje-Zellen angereicherten Protein P40011
601,
isoliert. Seitdem ist durch Klonen der Rezeptor-cDNAs von
Maus[161. 1621 Ratte[163, 1641, D rosophilu['6slund Mensch['641
gezeigt worden. daR die allgemeine Rezeptorstruktur, die zuerst
aus Miiuse-cDNA abgeleitet wurde, hochkonserviert ist. Das
Rezeptorprotein bindet Ins(1 ,4,S)P3 und aktiviert Ca2+-Kanale, und durch Rekonstitution in Lipidvesikeln konnte der
Ins( 1,4,S)P3-regulierte Ca2 -Transport nachgewiesen werDer Rezeptor ist ein Homotetramer, wie durch Elektronenmikr~skopie['~'.'*I und Vernetzungsexperimente nachgewiesen wurde" 681. Untersuchungen mit Deletionsmutanergaben, daB jede Untereinheit ein Ins(l,4,5)P3ten[169.'I
Molekul und InsP3R vermutlich vier Ins(1,4,S)P3-Molekule
nichtkooperativ bindet" 5 y l ; allerdings wurden auch anderslautende Befunde erhalten['7'1.
Zwischen der Primiirsequenz von InsP3R und Ca2+-Kanalen
in der Plasmamembran gibt es keine Hornologie['", 1721.
, es
besteht allerdings eine betriichtliche teilweise Homologie mit
dem Ryanodin-Rezeptor des sarkoplasmatischen Retikulums
1741. InsP3R hat eine
von Skelett- und Herzmuskulatur['61*
transmembrane Domane am C-Terminus rnit langen N-terminalen und kurzen C-terminalen Abschnitten, die in das Cytoplasma ragen. Untersuchungen des Hydrophilieprofils der
hochkonservierten Aminosauresequenz legen nahe, daB die
transmembrane Domane sechs['6s1 oder a ~ h t [ ' ~membran~]
durchspannende Regionen aufweist. Die groBe N-terminale Region besteht aus ungefiihr 650 Aminosaureresten, die zwischen
den Spezies hochkonserviert sind[l6'% '701. Es wird vermutet, dal3 sie die kritische Sequenz enthalten, die die dreidimensionale Ins(l,4,5)P3-Bindungstelle bildet1I6'. 'I,
d a nach Entfernen von Sequenzen aus dieser Region keine Ins(1 ,4,S)P3-bindende Aktivitat mehr vorliegt. Die Region enthalt viele positiv geladene Arginin- und Lysinreste. die fur die Bindung der Phosphatgruppen von Ins(1,4,S)P3 wesentlich sein konnten. Ein mit
einem Ins( 1.4,S)P3-Photoaffnitats~igdndenmarkiertes Peptid
wurde isoliert, dessen Sequenz mit dem N-terminalen Fiinftel
der Sequenz von InsP,R u b e r e i n s t i ~ i i r n t [ ' ~Die
~ ~ .Anlagerung
von Ins(1 ,4,5)P3
mu8 eine betrlchtliche Konformationsiinderung im Rezeptor verursachen, der zwischen der Tns(l ,4,5)P3Bindungsstelle am N-Terminus und dem Ca2+-Kanal am
C-Terminus fast 1400 Aininosaurereste aufweist['s31.Die Kopplungsregion zwischcn der Ins( 1 ,4,5)P3-Bindungsstelle und dem
Ca'+-Kanal enthalt Stellen, die die Wirkung von Ins(1 ,4,S)P3
auf das Offnen des Kanals modulieren. Zwei in dieser Region
vorhandene Serinreste konnen von einer CAMP-abhangigen
Proteinkinase phosphoryliert werden['53, 1 6 ' , 1761,wodurch im
Rezeptor des Kleinhirns die Bindung von Ins(l.4,S)P3 von der
+
2092
Offnung des CaZf-Kanalsabgekoppelt wird. Der Rezeptor bindet auBerdem aquimolare Mengen an ATP[1681.In niedriger
Konzentrdtion hat ATP einen potenzierenden EinfluB auf die
Ins(l,4,5)P3-stimulierteCa2+-Freisetzung. Auch Ca2' selbst
kann das Offnen des Kanals beeinflussen, der Mechanismus ist
allerdings unklad' 771.
Es ist bekannt, daR InsP3R infolge alternativen mRNASpleiBens eine betrichtliche Heterogenitat aufweist, was zu Rezeptoren fuhrt, die sich in der Kopplungsregion und vielleicht
auch in der Ligandenbindungsdomane unterscheiden. Der
Kleinhirnrezeptor wird heute als Typl-Rezeptor bezeichnet.
Neue Rezeptortypen, die von separaten Genen kodiert werden,
wurden b e ~ c h r i e b e n l ' ~ 781.
~ . So weist Typ2-InsP3R eine signifikante Homologie rnit dem Typl-Rezeptor auf, hat dabei allerdings eine groBere Affinitat fur Ins(1,4,S)P3 und ist 48 Aminosauren k i i r ~ e r [ ' ~ Ein
~ ] . Typ3-InsP3R, der zu 63 und 6 4 % mit
dem Typl- bzw. Typ2-Rezeptor identisch ist, wurde bei Ratten['791 und vor kurzem auch beim Menschen['801 charakterisiert. Er wird in Nieren, im Verdauungstrakt und im Gehirn
exprimiert und bindet auRer Ins(1 ,4,S)P3 auch Ins(1 ,3,4,5)P4
und TnsP, , Eine Teilsequenz der C-terminalen Domiine eines
. M"ogliTyp4-Rezeptors wurde ebenfalls beschrieben" 5 6 .
cherweise sind die bisher identifizierten InsP3Rs nur die ersten
Beispiele einer groReren Rezeptorfamilie. Sollten sich diese Rezeptoren in ihren Ligandenbindungsaffinitaten und ihrer Spezifizitiit unterscheiden, konnten modifizierte Analoga moglicherweise als Wirkstoffe gezielt eingesetzt werden.
'
6. Synthese und Aktivitat von Inosit-Analoga
Inosit wird von vielen Zellen aufgenommen[lsl und
durch PtdIns-Synthetase in PtdIns eingebaut. Der Einbau von
synthetischen Analoga in Phosphatidylinositlipide bietet einen
attraktiven Weg, pharmakologisch in die Signaliibertragung
einzugreifen. Da mittlerweile bekannt ist, daB viele Wachstumsfaktoren die Hydrolyse von Inositlipiden s t i r n ~ l i e r e n [ ~ ~ ~ ] ,
konnte man, indem man der Zelle ,,fakche", insbesondere nicht
weiter phosphorylierbare Phospholipide anbietet, Phospholipase C hemmen oder die Verfiigbarkeit von PtdIns(4,S)P2 verringern und somit unter anderem die Zellfortpflanzung beeinflussen. Dieser Ansatz hat den Vorteil, daB die mit dein Einbringen
von hochgeladenen, phosphathaltigen Verbindungen in die Zelle verbundenen Probleme umgangen werden. Vor allem fluorierte Inosit-Analoga hdben sich in dieser Beziehung als attraktiv
erwiesen.
Kozikowski et al. stellten 1 ~ --Desoxy-1
1
-fluor-myo-inosit 1
(Abb. 8) aus 1~-3-O-Methyl-chiro-inositin funf Stufen uber die
3,2 : S,6-Di-O-isopropylidenverbindung unter Fluorierung mit
Diethylaminoschwefeltrifluorid (DAST) her. Die direkte regioselektive Fluorierung von 1~-3-O-Methyl-chiro-inosit rnit
DAST gefolgt von Demethylierung lieferte 1D-1 ,5-Didesoxy1,S-difluor-neo-inositc' ssl. In
zehn Stufen gelang die Synthese
der beiden Enantiomere von 1Desoxy-I -fluor-myo-inosit[' 86],
1
H&OH
wobei ein geeignet geschutztes
OH
F
nzyo-lnosit an C-2 mit DAST
fluoriert und das erhaltene race-
Abb. 8 . I-Desoxy.l-n"or-m),oinosit.
Angnr Chem. 1995, f07. 2085- 2125
AUFSATZE
Inosi tlipide
mische Fluor-scyllo-inosit in die Enantiomere getrennt wurde.
Die my-Inosit-Konfiguration wurde durch Swern-Oxidation
der I-Hydroxygruppe und stereospezifische Reduktion der
Keto-Carbonylgruppe mit L-Selectride wiederhergestellt ; durch
Entschutzen der enantiomeren Zwischenstufen wurden ID- und
IL-I -Desoxy-1-fluor-myo-inosit erhalten.
Synthesen von ID- und 1 ~ - -Desoxy-I
1
-fluor-myo-inosit wurde auch von Offer et al.[ls7.
beschrieben. Hier wurden die
Probleme der Wiederherstellung der myo-Inosit-Konfiguration
und Racematspaltung effektiv in einem Schritt durch Substitution der Tosylatgruppe eines fluorierten scyllo-Inosits rnit
(S)-(-)-Caesiumcamphanat gelost. Die resultierenden Diastereomere wurden getrennt und zu den D- und L-1-Fluor-Analoga
von myo-Inosit entschiitzt. Die entsprechenden 2-3H-markierten Analoga wurden durch Inosit-Dehydrogenase-katalysierten
Austausch des Tritium-Radiomarkers von [2-3H]-myo-Inosit
h e r g e ~ t e l l t [ ' ~1-Desoxy-I-fluor-scyllo-inosit
~~.
2 (Abb. 9) war
&;
H
OH
-. .
Die Synthese des 2-Sulfanyl-Analogons 9 von my)-Inosit
wurde be~chrieben['~~]:
Die selektive Iodierung von racemischem 1,4,5,6-Tetra-O-benzyl-myo-inosit
in der 2-Position rnit
Triphenylphosphan/Imidazol/Iodverlief unter Konfigurationsumkehr. Nach Silylierung der freien 3-Hydroxygruppe wurde
das aquatoriale Iodatom rnit Natriumbenzylsulfid unter Wiederherstellung der myo-Inosit-Konfiguration substituiert. Fluoridinduzierte Desilylierung, Debenzylierung, Acetylierung des
Rohprodukts, Reinigung und Methanolyse lieferte das ThioAnalogon 9.
Kozikowski et al. synthetisierten enantiomerenreine. an C-3
modifizierte Inosit-Analoga 18-25 (Abb. I O)1196-2001. ID-3Desoxy-3-fluor-myo-inosit 18 wurde in zwei Stufen erhalten:
durch direkte selektive Fluorierung von L-Quebrachit (1 ~ - 2 - 0 Methyl-chiro-inosit) 10 rnit DAST unter Inversion der Konfiguration an C-1 zum myo-konfigurierten Inosit 11 und dessen
2: X = H, Y= F:
3:X = F,Y=H:
4: X =3H,Y= F:
5:
B:X=Y=F:
X = F, Y = JH:
7: X = F. Y = C Y O H
8: X = OH, Y= C Y F
9: X = SH, Y= H:
Ahb. 9. C-2-modifizierte Inosit-Analoga
das erste fluorierte Inosit-Analogon['gol;es wurde aus 1-0-Benzoyl-3,4,5,6-tetra-O-benzyl-myo-inosit
durch Umsetzung mit
DAST bei erhohter Temperatur und Abspaltung der Schutzgruppen erhalten. Die Herstellung von 2 wurde spater auch von
l3
18:X-F
einer anderen Gruppe be~chrieben"~'].
Lowe und M ~ P h e e ~ ' ~ ~ ]
19:X-H
beschrieben die Synthesen von 2 und 2-Desoxy-2-fluor-myo2o:x-CI
21:X Br
inosit 3 sowie der 2-3H-markierten Derivate 4 und 5. Die FluoHO
22:x-l
rierung von 1,3,4,5,6-Penta-O-benzyl-myo-inosit
mit DAST lie23:X-&
ferte unter Inversion der Konfiguration an C-2 das fluorierte
24: X N& CIscyllo-Inosit, das rnit wasserfreiem HBr zu 2 debenzyliert wurde.
25: X = SH
Bei der Synthese von 3 wurde zunachst die Konfiguration an C-2
Ahb. 10. C-3-modifizierte o-myo-Inosite aus L-Quehrachit (Kozikowski et al.),
durch Umsetzung zum Triflat und Substitution des Triflatrestes
mit Natriumtrifluoracetat invertiert. Esterhydrolyse, Umsetzung des Produkts mit DAST und Abspaltung der SchutzgrupDemethyIier~ng['~~].
D-3-Desoxy-myo-inosit 19 wurde iiber
pen lieferte dann 3. Durch Oxidation von 1,3,4,5,6-Penta-O~ - 3 , :45,6-Di-O-isopropyliden-2-O-methyl-chiro-inosit
12 durch
benzyl-myo-inosit rnit Jones-Reagens und Reduktion der
Umsetzung mit 1,l'-Thiocarbonyldiimidazol,Tributylzinnhyresultierenden Inosose mit t3H]NaBH, wurde vorwiegend das
drid und schliel3lich Bortribromid h e r g e ~ t e l l t [ ' ~Das
~ ~ . Zwitritiierte scyllo-Inosit und etwas 1,3,4,5,6-Penta-O-benzyI-[2- schenprodukt 12 wurde auch in der Synthese der D-3-Halogeno3H]-myo-inositerhalten. Reaktion rnit DAST und Entschiitzen
Analoga 20-22 eingesetzt. Die freie Hydroxygruppe in 12
Eine lhnliche Synthese von 3 und
wie zuvor lieferte 4 und 5[1921.
wurde rnit Triphenylphosphan aktiviert und rnit CCI,. Br, oder
5 wurde auch von einer anderen Gruppe bes~hrieben['~~].
I, als elektrophilen Halogenquellen unter Konfigurationsum2-Desoxy-2,2-difluor-myo-inosit 6 wurde durch Oxidation
kehr substituiert. Entschiitzen von 13 (X = C1, Br, I) rnit Bortrivon l-O-Ailyl-3,6-di-O-benzyl-4,5-O-isopropyliden-myo-inositbromid lieferte die entsprechenden D-3-Halogenino~ite~'~'~.
Die
zur entsprechenden 2-Inosose, deren Fluorierung rnit DAST zur
Verbindungen 23-25 wurden aus 12 iiber 14 und das Mesylat 15
gem-Difluorverbindung, Abspaltung der Allyl- und der Isoerhalten['981. Die Einfiihrung der Azidogruppe unter Konfigupropylidengruppe sowie anschlieliende Hydrogenolyse hergerationsumkehr wurde durch Substitution der Mesylatgruppe in
~ t e l l t [ ' ~ ~Yang
] . et al. synthetisierten 2-Desoxy-2,,-fluor-2,,15 (R = Ethoxyethyl) rnit Natriumazid/Hexamethylphosphorhydroxyrnethyl-myo-in~sit~~~~]
7 und 2-Desoxy-2-C-fluormesaureamid (HMPA) erreicht. Die saure Hydrolyse Iieferte D-3thyl-myo-inosit 8'' 941 ausgehend von l-O-BenzoyI-3,4,5,6-tetra- Azido-3-desoxy-myo-inosit 23, das durch katalytische Reduktion in verdiinnter HCI in D-3-Amino-3-desoxy-rnyu-Inosit-hy0-benzyl-2-oxiranyl-myo-inosit.
J
-
A n g m Chem. 1W5,107,2085-2125
2093
B. V. L. Potter und D . Lampe
AUFSATZEdrochlorid 24 iiberfiihrt wurde. Das 3-Sulfanylinosit 25 wurde
aus 15 (R = Ac) durch Umsetzung rnit (CH,),NC(S)SNa/
HMPA, Reduktion rnit LiAIH, und Entfernung der Schutzgruppen erhalten. Oxidation der Hydroxygruppe in 12 und Alkylierung des erhaltenen Ketons 16 in axialer Position mit
MeMgBr fiihrten zum geschutzten 3-C-Methylderivat, das zu
17 entschiitzt ~ u r d e ~ l ~ ~ ] .
Die wachstumshemmenden Eigenschaften dieser Inosit-Analoga wurden an Wildtyp-NIH-3T3-Zellen und a n v-sis-transformierten Zellen untersucht. v-sis-Transformierte Zellen weisen
eine erh6hte PtdIns-3'-Kinase-Aktivitiit auf, weshalb sie gegeniiber lnhibitoren des PtdIns-3'-Kinase-Signaliibertragungsweges empfindlicher seiii sollten als nichttransformierte Zellen.
Erste Experimenter' 851 ergaben. daO D-3-Desoxy-3-fluor-myoinosit 18 ein wirksamer und selektiver Zellwachstumsinhibitor
ist; in Gegenwart von myo-Inosit im Wachstumsmedium ist 18
allerdings etwa eine GroBenordnung weniger wirksam. Das
Fluor-Analogon ist ebenfalls ein starker kompetitiver Inhibitor
bei der Aufnahme von [3H]-m~o-Inosit,was nahelegt, daB diese
Verbindung in Inositphospholipide eingebaut wird. In weiteren
Studien mit an (2-3 inodifizierten u-ml.o-Inosit-Analoga wurde
festgestelltr'97.
dal3 u-3-Azido-i?zvo-inosit 23 uberaus wirksam ist (1C5" = 0.04 mM) und in inositfreiem Medium eine hohe
Selektivitiit fur v-sis-transformierte Zellen aufweist (mehr als
1200fach im Vergleich zum Wildtyp). Durch Zugabe von myoInosit wurde die in hibierenden Eigenschaften dieser Verbindung
allerdings betriichtlich verringert, wiihrend die Wachstumshemmung durch D-3-Amino-3-desoxy-myo-inosit 24 nur maMig
beeintrachtigt wurde. ~-3-Desoxy-3-methylen-,-3-hydroxymethyl-, -3-iodmethyl- und -3-phosphonomethyl-nqv-inosit sowie
dessen Dimethylester weisen keine signifikante hemmende Aktivitiit auf""9'.
Sowohl D- als auch L-4-Desoxy-4-fluor-myo-inosit wurden
aus DL-I ,3,4,5-Tetra-O-benzyl-/~~~~~-inosit
hergestellt : Dazu
wurde zuniichst die 6-OH-Gruppe selektiv tosyliert und das
Produkt mit DAST an C-2 zum scyllo-Derivat fluoriert. Durch
Umsetzung mit ( S ) - (- )-Caesiumcarnphanat wurde unter Inversion der Konfiguration an C-6 (C-2 im Produkt) die m y Inosit-Konfiguration wiederhergestellt. Das entstandene Diastereomerengemisch konnte durch HPLC oder durch Kristallisation getrennt und nach Abspaltung der Schutzgruppen D- und
~-4-Desoxy-4-fluor-n?~,~-inosit
isoliert werden" 891. Wiihrend in
die 2-Position des [.-Isomers eine 3H-Radiomarkierung rnit Inosit-Dehydrogenase und [3H]-nz~~o-Inositeingefuhrt werden
konnte, ist das D-Isomer kein Substrat fur dieses Enzym. und
das radiomarkierte Analogon wurde durch Oxidation von D1,3,5,6-Tetra-0-benzyl-4-desoxy-4-tluor-~~~~~~-inosit,
Reduktion
der erhaltenen 2-Inosose mit \3H]NaBH, und Abspaltung der
Schutzgruppen hergestellt. Synthesen von racemischem 4-Desoxy-, 4-Desoxy-4-fluor- und 4-Desoxy-4-methyl-nzyo-inosit
ausgehend von einer aus Benzol durch mikrobielle Oxidation
gewonnenen Vorstufe wurden ebenfalls beschriebenr2"'].
6-0-Benzyl-1.2 : 3.4-di-0-cyclohexyliden-myo-inosit wurde
von zwei Arbeitsgruppen zur Herstellung von 5-Desoxy-5-fluormyo-inosit 26 eingesetzt (Abb. 11). Die Fluorierung rnit DAST
lieferte neben dem Produkt mit invertierter Konfiguration auch
das Retentionsprodukt, das zu 26 entschiitzt wurderZo2].Die
niedrige Ausbeute wurde spiiter durch eine der DAST-Fluorierung vorausgehende Inversion der Konfiguration an C-5 verbes2094
H*y"
X
Y
26:X = F,Y=H:
27: X = Y = F:
28: X = CI,Y= H
29: X = Br, Y = H
30: X = H, Y = CI
31: X H,Y = Br
-
33: X = H,
32:
Y =YH= I
OH
34: X = OCH3, Y = H:
Abh. 11. C-5-modifizierte Inoait-Analogd
~ e r t ~1 8'8 ,~'03].
~ , So lieferte die Tosylierung"*'* 1881 oder Trif l i e r ~ n g [ ~der
~ ~5-Hydroxygruppe
l
gefolgt von nucleophiler
Verdriingung rnit Caesiumpropionat das neo-Inositderivat.
Nach Verseifung und Fluorierung mit DAST lag wieder die
myo-Inosit-Konfiguration vor, und die Entfernung der Schutzgruppen gab 26.
Deuterierungs-Studien ergaben, daB das iquatoriale Proton
H-2 in 26 a m schiiellsten ausgetauscht ~ i r d ' ~ ' Tnkubation
~].
von
26 mit Inosit-Dehydrogenase und [2-3H]-nzvo-Inosit fiihrte zu
einem Austausch des Radioisotops, das somit wiederum in die
2-Position des fluorierten Analogons eingebaut wurde['891.Das
5-Desoxy-5,5-difluor-Analogon
27['03] wurde aus dem Oxoderivat von 1,4,6-Tri-0-benzyl-2,3-~-cyclohexyliden-~eo-inosit,
einein Zwischenprodukt in der Synthese von 26, hergestellt.
AuBer den Synthesen von 26 und 27 sowie von nqv-InositAnaloga, die an der I-, 4- und 5-Stellung desoxygeniert sind,
beschrieben Baker et al. auch die Herstellung von weiteren
5-Desoxyhalogen-m.yo- (28, 29) und epimeren -neo-Inositen
(30-32) r2021 sowie von racemischem 4-Desoxy-4-fluor-nzj:oinosit. DAST-Fluorierungen verlaufen normalerweise unter
Konfiguration~umkehr~~~~~,
aber bei der Fluorierung der Zwischenstufe 3-0-Benzyl-1 ,2 : 5,6-di-O-cyclohexyliden-mj~o-inosit
entstaiid iiberraschenderweise vorwiegend das Produkt unter
Retention der Konfiguration. Dies wurde auf eine sterische Hinderung des riickseitigen Fluorid-Ionen-Angriffs auf das intermediare Addukt mit DAST zuriickgefiihrt12021.
Diese Inosit-Analoga[2051wie auch einige C-3-modifizierte
D-myo-Inosite[2061
wurden anschlieBend als Substrate und Inhibitoren von PtdIns-Synthetase getestet. Das Enzym stellt sehr
hohe Anforderungen an das Cyclitol-Substrat. Alle untersuchten Verbindungen waren weniger effektiv als myo-Inosit; das
beste Analogon war 5-Desoxy-5-fluor-m,~o-inosit26, das rnit
26 % der Einbaugeschwindigkeit von myo-Tnosit ins zelluliire
Phospholipid inkorporiert wird. Das Analogon 26 wurde zum
entsprechenden 5-Fluor-PtdIns(4)P-Derivat phosphoryliert, ein
Lipidbisphosphat konnte dabei wie erwartet nicht nachgewiesen
werden. Andere 5-Desoxy-5-halogen-Verbindungenwaren sehr
schlechte oder inaktive Substrate. Das 5-Desoxy-Analogon 33
wurde hingegen gut erkannt. Unter den getesteten C-3-moditizierten Derivaten waren ~ - 3 - A m i n o -(24), D-3-Fluor- (18) und
1>-3-Desoxy-myo-inosit (19) sowie das 3-0x0-Analogon Substrate fur PtdIns-Synthetaser2"], sie werden aber im Vergleich
zum natiirlichen Substrat mehr als zehnmal schlechter akzeptiert. Als allgemeine SchluRfolgerung scheint sich aus diesen
Befunden ableiten zu lassen, daB die Substrataktivitat mit zunehmenden sterischen Anforderungen der Substituenten abnimmt. Im Inhibierungsassay entsprach die Rangfolge der Analoga der Abstufung hinsichtlich ihrer Effektivitiit als Substrate.
Angcw. Chew 1995. 107. 2085-2125
AUFSATZE
Inosithpide
Davon ausgenommen ist 5-Desoxy-5,s-difluor-myo-inosit
27,
das kein PtdIns-Synthase-Substrat, aber ein wirksamer Inhibitor dieses Enzyms ist.
In einer anderen S t ~ d i e [ ~ wurde
' ~ ] die Inhibierung des Einbaus von [3H]Ins in PtdIns durch Inosit-Analoga untersucht,
die in der I-, 2-, 3-, 4- oder 5-Position modifiziert sind. I-Desoxy-1 -fluor-scyllo-inosit 2 und 5-0-Methyl-myo-inosit 34 waren die effektivsten kompetitiven Inhibitoren von PtdIns-Synthase und einem nucleotidunabhlngigen PtdIns/Ins-Austauschenzym. Viele andere Analoga wiesen ebenfalls betrachtliche inhibitorische Eigenschaften vor allem beziiglich der Austauschenzym-Aktivitat auf. Sowohl [l-3H]-l-Desoxy-l-fluor-scylloinosit 4 als auch [2-3H]-2-Desoxy-2-fluor-myo-inosit 5 waren
sehr schlechte Substrate fur die beiden Enzyme. Sofern 5 aber
ins Phospholipid aufgenommen wurde, konnten auch die entsprechenden Analoga von PtdIns(4)P und PtdIns(4,5)P2 nachgewiesen werden.
Offer et al. untersuchten die Aufnahme von 3H-n~arkierten
Monodesoxyfluor-nip-inositen" 891 in Thymocyten und ihren
Einbau in das Phospholipid[2081.Allein D - 3 - F - h 18,5-F-Ins 26
und in geringerem Man auch D-6-F-Ins sind Substrate der
Ptdlns-Synthase. und nur 18 wurde aktiv in die Zellen aufgenommen und in das Phospholipid eingebaut. Allerdings nahm
man an, dao Monodesoxyfluor-Analoga - sofern sie nicht durch
die Zellmembran dringen konnen - wegen der Selektivitat fur
mJJo-Inosit bei der Aufnahme und der von Ptdlns-Synthase, in
intakten Zellen wahrscheinlich nicht als Inhibitoren der
PtdIns(4,5)P2-Bildung oder des -Abbaus fungieren konnen.
Die Synthese von selektiv geschiitzten 3-Desoxy-epi-inositen
und I-Desoxy-scyllo-inositen gelang chemoenzymatisch mit
Candida-cylindracea-lipase, die (R)-konfigurierte Ester selektiv
spaltet [2091.
7. Synthese von spezifischen myo-Inositphosphaten
Die Entdeckung des sekundzren Botenstoffs Ins( 1 ,4,S)P3 hat
ein erneutes Interesse a n der Inositphosphat-Chemie geweckt.
Viele Inositphosphate wurden schon vor dieser Renaissance
s ~ n t h e t i s i e r t [581,
~ ~ Einige
,
der Llteren Syntheseverfahren waren
allerdings nicht sehr zufriedenstellend. Dies galt besonders fur
die Phosphorylierung von Polyolen, in denen gleichzeitige Polyphosphorylierungen durch das Vorhandensein von vicinalen
Diolen erschwert und die Bildung von funfgliedrigen cyclischen
Phosphaten begiinstigt werden. (Zu Ausnahmen siehe Lit.[2101.)
Dennoch wurde Ins(4,5)P2 urspriinglich schon 1961 hergestellt[2111.Neuere Arbeiten zu diesem Thema wurden zusammengefaot LS61.
Abb. 12. Stufen in der Synthese von lnositphosphaten
um die mit der Bildung von cyclischen Phosphaten zusammenhangenden Probleme zu vermeiden. 4. Das phosphorylierte
Zwischenprodukt mu13 unter Bedingungen entschiitzt werden,
unter denen die Phosphatgruppen nicht zu benachbarten Hydroxygruppen wandern konnen. 5. Das anionische Polyphosphat muB effektiv gereinigt und von geringen, moglicherweise
regioisomeren Verunreinigungen getrennt werden, die eine Aktivitat aufweisen konnten.
7.1.I . Schutzgruppenchemie
Die Entwicklung von Schutzgruppenstrategien bei Inositpolyphosphat-Synthesen begann schon sehr friih15', 581 und wird
auch heute noch vorangetrieben, wie neuere Ansltze zeig e n t 2 1 2 - 2 1 8 1 . D as Gebiet wurde in zwei Ubersichtsartikeln umfassend diskutiert[s3s "I. Die popularsten temporaren und permanenten Hydroxyschutzgruppen sind Acetyl, Benzoyl. Benzyl,
p-Methoxybenzyl, Allyl, Isopropyliden, Cyclohexyliden und
Orthoformiat. Dies wird bei der Beschreibung von einigen Synthesen deutlich werden.
7.1.2. Synthesen von optisch aktiven Verbindungen
Wird Benzol oder die meso-Verbindung niyo-Inosit ~ilsAusgangsmaterial zur Synthese von Inositphosphaten verwendet,
ist eine Racematspaltung zur Trennung der D- und L-lsomere
der Inositphosphat-Vorstufen notwendig. Die meisten Enantiomerentrennungen in Inositphosphat-Synthesen beruhen auf der
Urnwandlung eines racemischen Inosits in ein Diastereomerenpaar, das durch Kristallisation oder chromatographisch getrennt
wird. Die Verfahren von S h v e t ~ [ " ~2201,
> bei denen D-MannoseOrthoester wie 35 (Abb. 13) verwendet werden, waren bis vor
7.1. Allgemeine Betrachtungen zur Synthese
Inositpolyphosphat-Synthesen miissen funf Anforderungen
erfullen (Abb. 12): 1. U m die spatere Einfiihrung von Phosphatgruppen in ausgewahlte Positionen zu erleichtern, miissen
geeignet geschiitzte Derivate hergestellt werden. 2. D a das
D-Enantiomer von Ins( 1,4,S)P3 der naturliche Botenstoff ist,
miissen auch die Derivate enantiomerenrein hergestellt werden.
3. Eine effiziente Phosphorylierungsstrategie ist erforderlich.
Aqcw
Cheiii
1995, 107 2085 -2125
Abb. 13. In Inositphosphat-Synthesen verwendete chirale Hilfsreagentien
2095
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
kurzem die einzigen verfiigbaren Methoden. In neueren Arbeiten wurden die Vorteile einiger anderer Reagentien, z. B. ( S ) (+)-0-Acetylmandelsaure 36, (R)-(+)-Campherdimethylacetal 37 und seinem (S)-Isomer, L-Menthylchlorformiat 38,
L-Menthyloxyacetylchlorid 39 sowie (R)-(+)-I -PhenylethyIisocyanat 40, demonstriert. Die Racematspaltung durch Bildung
von Camphansaureestern scheint gegenwbtig die allgemein
brauchbarste Methode zu sein, und sowohl mit (S)-(-)-Cam+)-Isomer wurden
phansaurechlorid 41 als auch mit dem (R)-(
optisch aktive Inositderivate erhalten. Mit chiralen HPLCSaulen wurden Zwischenprodukte in Ins(1 ,3,4)P3-[2211und
Ins( 1,3,4,5)P4-Synthesen[2221in ihre Enantiomeren getrennt.
In mehreren Studien wurden Enzyme wie Esterasen, Lipasen
und Proteasen auf ihre Fahigkeit untersucht, racemische oder
meso-Carboxylester von m ~ ~ o - I n o s i t ,[ ~3-Desoxy-epi~~-~~~]
inosit und 1- D e s o x y - s c y l l o - i n ~ s i t [enantio~ ~ ~ ~ und regioselektiv
zu hydrolysieren. Eine neue Methode ist die selektive enzymatische Veresterung, die bereits zur Enantiomerentrennung von
racemischem 1,2: $6- und 1,2 :3,4-Di-O-cyclohexyliden-niyoi n o ~ i t [ ~zz81
~ ' . sowie zur Synthese von enantiomerenreinem IDl-O-Butyryl-4,6-di-O-benzoyl-my0-inosit~~~~~
eingesetzt wurde.
Das Problem der Racematspaltung kann durch die Verwendung von chiralen Ausgangsverbindungen, z. B. von Naturstoffen wie L-Quebrachit 10, 1~-3-O-Methyl-chiro-inosit 42,
( - )-Chinasawe 43, ~-Glucurono-6,3-lacton44 und das Galactosid 45 (Abb. 14), ganz urngangen werden. Durch die Ferrier-
10
42
43
45
46
U
44
Abb. 14. Chirale Ausgangsverbindungen zur Synthese von Inositphosphaten
ReaktionrZ3'I wurden myo-Inositderivate aus ~-GaIactose,['~
und in einem biomimetischen Ansatz aus
Methyl-a-D-glucopyranosid 46r235,
2361 hergestellt. Enantiomerenreine myo-Inositderivate wurden durch die Samariumdiiodid-vermittelte reduktive Carbocyclisierung einer von DMannit abgeleiteten Zwischenstufe erhalten[2371.
7.I .3. PhosphorylierunRsreaentien
Zur Phosphorylierung von freien Hydroxygruppen in einem
geeignet geschiitzten Inosit werden hauptsachlich zwei Methoden angewendet : a) Phosphorylierung rnit einem PV-Reagens,in
dem das Phosphoratom schon in der korrekten Oxidationsstufe
vorliegt, und b) Phosphitylierung der Hydroxygruppe mit einem
P"'-Reagens und anschlieljende Oxidation des Phosphitesters
zum geschiitzten Phosphatester (Abb. 15).
2096
Ro>-CI
RO
--
52: R Me
53: R Et
54: R NCCH2CH2
R' 0,
55: R'
P-NF?,
R' 0
56: A'
57: R'
58: Ri
RO-P:
-
-- ~ n . - -- - NCCH.$H,
W' Pr
Pr
NCCH$y, Fp Et
Fp
Bn, FP Et
-
NiPr,
61: R C&CH$N
CI
62:R-Me
59: R Et
60: R- Me
iPr,N
>-OBfl
iPr,
63
Abb. 15. Phosphorylierungs- und Phosphitylierungsreagentien.
Die Vorteile von Pv-Reagentien fur Phosphorylierungen sind
die relative Stabilitat von Reagens und Produkt. Probleme haben sich jedoch wegen der geringen Reaktivitat der sekundaren
Hydroxygruppen von Inositen ergeben. Daruber hinaus ist die
Phosphorylierung von vicinalen Diolen besonders schwierig:
Die durch Phosphorylierung der ersten freien Hydroxygruppe
gebildete Phosphattriestergruppe kann durch die benachbarte,
zweite Hydroxygruppe angegriffen werden. Durch die Sperrigkeit der meisten PV-Reagentien kann der Angriff eines
zweiten Reagensmolekiils auf die zweite Hydroxygruppe im
AnschluB an die Monosubstitution sterisch erschwert sein. Cyclisierungen konnen deshalb erfolgreich rnit der Substitution an
der zweiten Hydroxygruppe konkurrieren, was zu 5-gliedrigen cyclischen Phosphaten statt zu den gewiinschten Bisphosphaten fiihrt.
Phosphor(v)-oxidchlorid wurde erstmals 1857 als Phosphorylierungreagens v e r ~ e n d e t [ ~ ~In* ]neuerer
.
Zeit wurde es zur
schrittweisen Phosphorylierung des vicinalen 4,5-Diols in myoInositen rnit zwei PV-Reagentien e i n g e s e t ~ t [Die
~ ~ ~Phospho~.
rylierung mit Bis(2,2,2-trichlorethyl)phosphorsaurechlorid 47
lieferte, vermutlich infolge sterischer Hinderung, nur eine
Mischung aus 4- und 5-monophosphorylierten Inositen, nicht
aber das Bisphosphat. Mit POCI, konnte die Mischung allerdings zu den gemischten 4,5-Bisphosphattriestern umgesetzt
werden. Mit 47 wurden auch Ins(l,4,5)P3 und dessen 5-Phosphorothioat-Analogon h e r g e ~ t e l l t-[2421.
~ ~ ~Dianilidophosphorochloridat 48 wurde in der ersten beschriebenen Synthese von
D - h ( 1,4,5)P3 benutzt [2431; diese Phosphorylierungsmethode
und die Abspaltung der Schutzgruppen mit Isoamylnitrit in Pyridin/Essigsiiure/EssigsHureanhydridwar jedoch nicht zufriedenstellend. Diphenylphosphorsaurechlorid 49 wurde in vielen
Synthesen von Phosphatestern verwendet, unter anderem in einer friihen Synthese von Ins(2)P[2441sowie in der Synthese von
~-Ins(l)P~~].
Phosphorsauredichloride konnen rnit zwei unterschiedlichen
Partnern unter Bildung einer Phosphatbriicke zwischen diesen
Einheiten reagieren. Da Phosphodiesterbindungen in vielen Naturstoffen, z. B. in Oligonucleotiden und Phospholipiden, vorkommen, wurde einige Phosphorsauredichloride fur die Synthese dieser Substanzen entwickelt. N-Methylpyridinium-phosAngew. Chem. 1995, 107.2085-2125
Inositlipide
AU FSATZ E
phorodichloridat 50 wurde zur Synthese von cyclischem
Das vergleichsweise unkonventionelle Aminobicyclophosphan
Ins(l:2)P v e r ~ e n d e t [ ’ ~ ~ ] .
64 schlierjlich wurde zur Synthese von Inositmonophosphaten
Polyphosphate und gemischte Anhydride werden trotz ihrer
genutzt [2681.
unspezifischen Reaktionsweise, die haufig zur Bildung von cyDie Effizienz der unterschiedlichen Methoden zur Oxidation
clischen Phosphaten oder anderen Nebenprodukten fuhrt, vielvon Phosphittriestern wurde u n t e r s ~ c h t [ ’ ~in~der
~ ; Inositphosfach eingesetzt. Phosphorsaure, Kaliumhydrogenphosphat und
phatchemie wird diese Transformation normalerweise mit tertPyrophosphorsaure wurden fur Kohlenhydratphosphat-synButylhydroperoxid (tBuOOH) oder m-Chlorperbenzoesaure
thesen genutzt; Pyrophosphorsaure wurde auch zur Phosphory(m-CPBA) durchgefiihrt.
lierung von epi- und muco-Inositen v e r ~ e n d e t [ ’ ~ ~ I .
Tetrabenzylpyrophosphat (TBPP) 51 [2481 ist ein kommerziell
7.1.4. Entfernung dev Schutzgruppen und Reinigung
erhaltlicher kristalliner Feststoff, der durch Kondensation von
zwei Aquivalenten Dibenzylphosphat rnit DicyclohexylcarbodiUrn die Wanderung von geschiitzten Phosphatgruppen zu beimid (DCC) gebildet wird. Es ist das einzige PV-Reagens,das in
nachbarten freien Hydroxygruppen zu vermeiden, miissen die
der Inositphosphatchemie rnit Erfolg zur Phosphorylierung von
Phosphatgruppen vor den Alkoholen entschiitzt werden. Wervicinalen Diolen angewendet ~ ~ r d e [Um
~ eine
~ effektive
~ - ~ ~ ~den~ Benzylschutzgruppen
.
sowohl fur die Hydroxy- als auch fur
Phosphorylierung mit TBPP zu erreichen, ist es erforderlich, die
die Phosphatgruppen verwendet, ist die Abspaltung der Schutzfreien Hydroxygruppen in Alkoxygruppen umzuwandeln. Die
gruppen in einem Schritt moglich, da die Benzylphosphatester
stark basischen Bedingungen konnen allerdings bei einigen Verwesentlich schneller gespalten ~erden[’~’].Nach der Entferbindungen zur Zersetzung fuhren.
nung der Schutzgruppen rnit Natrium in fliissigem Ammoniak
PI1’-Reagentien sind reaktiver als die meisten PV-Reagentien.
miissen die Produkte gewohnlich durch Anionaustausch-ChroDurch Phosphitylierung und anschlieBende Oxidation wurden
matographie gereinigt werden. Es ist allerdings auch moglich,
gute Resultate auch in solchen Fallen erzielt, in denen Pvdas Endprodukt durch katalytische Hydrogenolyse und ohne
Reagentien nicht das gewiinschte Produkt lieferten, z. B. bei der
weitere Reinigung zu erhalten.
Phosphorylierung von vicinalen Diolen als Vorstufen von
Ins(1,4,5)P3. Die Bildung von unerwunschten cyclischen Phosphodiestern wird dabei vermieden. Ein weiterer Vorteil der P”’1.2. Inositmonophosphate
Reagentien ist, darj die Phosphittriester durch elernentaren
Schwefel in Pyridin[2s2] oder durch Phenacetyldis~lfid[~~~] Es gibt vier myo-Inositmonophosphate: die symmetrischen 2sulfoxidiert werden konnen. Die entstehenden Phosphoround 5-Phosphate und die beiden Enantiomerenpaare Inositthioate sind als niitzliche nichthydrolysierbare Analoga von Nu4(6)-phosphat und Inosit-l(3)-phosphat. Bevor und nachdem
c l e ~ t i d e n [und
~ ~ ~Inositphosphaten
]
bekannt (siehe Abschnitt
entdeckt wurde, daR die Hydrolyse von Gehirn-Phosphoinositi8.4).
den D-Ins(1)P liefertr27 2 7 2 1 , wurden viele Synthesen von raceTrotz ihrer Instabilitat gegenuber Feuchtigkeit werden Phosmischen und enantiomerenreinen myo- und anderen Inositmophorochloridite haufig in Inositphosphat-Synthesen eingesetzt.
nophosphaten beschrieben[s3. 571.
So wurden mit Dimethoxychlorphosphan 52 Ins(1,4,5)P3,
D-[273’ 2741 und ~ - I n s ( l ) Pwurden
[ ~ ~ ~ ~aus 1L-Quebrachit 10
Ins(1,3,4,5)P4 und Ins(1,4,5,6)P4[2551,rnit Diethoxychlorphosiiber 1 ~ - 3 ,:45,6-Di-O-cyclohexyliden-2-O-rnethyl-chiro-inosit
phan 53 Ins( 1,2,4,5)P4[256]und mit Di(2-cyanethoxy)chlorhergestellt. Zur Synthese von D - h ( l)P wurde diese Verbindung
phosphan 54 I n ~ ( 1 , 3 , 4 ) P , [ ’synthetisiert.
~~~
zur Inosose oxidiert, die dann stereoselektiv zu D-1,2: 5,6-Di-0Die stabileren Phosphoramidite werden unter katalytischer
cyclohexyliden-4-0-methyl-myo-inosit
reduziert wurde. In einer
Aktivierung durch eine schwache Saure (I H-Tetrazol) eingesechsstufigen Sequenz wurde dieses Zwischenprodukt in das 1 setzt. Beispiele fur verwendete Phosphoramidite sind die VerbinSilylpentabenzoylinosit iiberfiihrt. Desilylierung, Phosphoryliedungen 55-57. Di(benzyloxy)(diethylamino)phosphan 58 ist irn
rung und schrittweises Entfernen der Schutzgruppen lieferte DVergleich zu 56 weniger gunstig, da 56 leicht durch SaulenchroIns(1)P. Dariiber hinaus wurde L-Ins(1)P [ = D-InS(3)PI iiber
matographie gereinigt werden k a n r ~ [ ’ ~ ~ ] .
das 1-Tosylat erhalten. Ein eleganter Zugang zu D-Ins(1)3-Diethylamino-2,4,3-benzodioxaphosphepan59[2591,das
P [ 2 7 s2761
, beinhaltete die Enantiomerentrennung iiber das 2,3aus Hexaethylphosphorsauretriamid und 1,2-Bis(hydroxymemyo-Inosit-D-campheracetal und die selektive Phosphoryliethy1)benzol hergestellt wurde, und die entsprechende Dimethylrung der I-OH-Gruppe rnit Dibenzylphosphorsaurechlorid. Laminoverbindung 60 kommen immer haufiger in InositphosIns(1)P war iiber das L-Carnpherdimethylacetal zugangli~h[’~~].
phat-Synthesen zum Einsatz. 2-Cyanethoxy(diisopropylamiOptisch aktives Ins(1)P wurde auch aus 1,2,4,5,6-Penta-O-benno)chlorphosphan 61 und die entsprechende Methoxyverbin- )-Camzyl-myo-inosit (Enantiomerentrennung iiber das (R)-(
dung 62 fanden ebenfalls ausgedehnte Anwendung, 61 unter
~hanat)[’~’]und dem entsprechenden Pentaacetat (Enantioanderem in Synthesen von Ins(l,4,5)P3 und I n ~ ( 4 , 5 ) P , [ ’ ~ ’ - ~ ~ ~ merentrennung
~.
iiber das saure O ~ a l a t ) [ ’ ~hergestellt,
~]
das auch
Die zunachst erhaltenen Phosphoramidite werden vor der Oxizur Synthese von racemischem Ins( 1)P[2781
verwendet wurde.
dation normalerweise in Phosphittriester umgewandelt. Als biDie beiden Ins(1)P-Enantiomere wurden nach Persilplierung
funktionelle PI1’-Reagentiensind 61 und 62 auch zur Herstellung
auf einer chiralen GC-Saule getrennt[2791.
von Phosphorothioat-Analoga von Inositphospholipiden geeigIns(2)P wurde zuerst unter Nutzung der hochselektiven Oxinet[263-2651.
Dies gilt auch fur 63, das von vanBoom et al. in
dation von myo-Inosit zu scyllo-Inosose durch Acetobacier subund eines inositoxydans ~ynthesiert~’~~].
Ein neuerer Ansatz beruht auf der seSynthesen eines PtdIns(4,5)P,-Anal0gons~~~~~
haltigen mycobakteriellen Phospholipids [2671 eingesetzt wurde.
lektiven Dibenzylierung der 4- sowie der 6-OH-Gruppe von
‘1
Angew. Chem. 1995, 107.2085-2125
2091
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
myo-Inositorthoformiat und der Phosphorylierung der freien
zylverbindungen wurde uber deren Mono-( - )-camphansaure2-OH-Gruppe mit TBPP[280].
ester erreicht. ~ ~ - I n s ( 4 , 5 ) Pwurde
,
aus 1,2,3,4-Tetra-U-benzylDie Synthese von Ins(4)P gelang durch selektive Benzoyliemyo-inosit mit einem PI1'-Reagens h e r g e ~ t e l l t [2901.
~ ~ ~Aus
* Benrung der 3-OH-Gruppe von 1.2 :4,5-Di-U-cyclohexyliden-myo- zol erhaltene Condurit B-Derivate sind ebenfalls verwendet
inosit, Phosphorylierung der verbliebenen freien Hydroxygrupw~rden[~~'~.
pe und Abspaltung der Schutzgruppen['", 220].Aus der entsprechenden 3-0-Benzylverbindung wurde ebenfalls racemisches und nach Racematspaltung uber das Camphanat auch
7.4. Inosittrisphosphate
optisch aktives Ins(4)P erhalten[2701.Eine kurze DL-InS(4)PSynthese durch chelatkontrollierte selektive Phosphorylierung
7.4.1. Inosit-1,4,5-tvisphosphai
des Monoanions von nzyo-Inositorthoformiatt2811mit TBPP
Es iiberrascht kaum, dal3 sich das Interesse hauptsachlich auf
wurde beschrieben[280s2821. Die Reaktion von 1,2-U-Cyclohexydie Synthese von Ins(1,4,5)P3, dem biologisch immer noch bei
liden-myo-inosit rnit 1,3-Dichlor-l ,I ,3,3-tetraisopropyldisiloweitem wichtigsten Inositphosphat, konzentriert. Die erste Synxan lieferte selektiv das entsprechende 3,4-U-Disiloxan-Inosit,
these von D-InS(1,4,5)P3 wurde 1986 von Ozaki et al. beschriedessen 6-OH-Gruppe selektiv benzoyliert wurde. Mit TBPP
ben (Abb. 16)r2431.DL-1,2 :4,5-Di-U-cyclohexyliden-myo-inosit
wurde infolge der Wanderung des Benzoylrestes die 6-Position
phosphoryliert, so da0 nach Entfernung der Schutzgruppen
racemisches Ins(4)P erhalten wurde. Die Phosphitylierung mit
PCI, und Benzylalkohol gefolgt von Oxidation und Entschutzen
lieferte dagegen lns(S)P[28311,
das erstmals aus durch Hydrolyse
Q
O
OH
p65
H
von Hygromycin A erhaltlichem 2-Amino-2-desoxy-neo-inosit
hergesteltt wurde" 'I.
c
Cyclisches D-InS( 1 :2)P wurde aus ~-3,4,5,6-Tetra-O-benzylmyo-inosit mit 50 s y n t h e t i ~ i e r t [ ~Durch
~ ~ ] . direkte Phosphorylierung von Inosit mit dem bicyclischen Aminophosphan 64,
All
All
OBn
OBn
Oxidation des resultierenden bicyclischen Phosphorans mit
69
funffach koordiniertem P-Atom und saure Hydrolyse wurde
67:R-H
68:
R L-Menthyloqaceiyi
eine Mischung aus Ins(l)P, Ins(2)P und cyclischem Ins(l:2)P
erhalten'2681,die durch HPLC getrennt wurden.
-
I
'
-
3
7.3. Inositbisphosphate
1
Synthesen von racemischen Inosit-1,4-, -1,6- und -4,s-bisphosphaten iiber Phosphorsiiurechlorid-Phosphorylierungvon
Di-0-cyclohexylideninositen wurden bereits 1961 erstmals beschriebenL2''], Enantiomerenreine Bisphosphate wurden aus
den optisch aktiven Diacetalen hergestellt, die durch Racematspaltung rnit D-Mannose-Orthoestern erhalten ~ u r d e n ' ~ ~ ~ ] .
O-hS{l.45)P3
Ins(1 ,3)P2 wurde durch regioselektive Phosphorylierung von
Abb. 16 Die erste ~-Ins(l,4,5)P,-Synthese(Ozaki et al.).
2.4,6-Tri-0-benzyl-m~~o-inosit
rnit dem Phosphorsaurechlorid
49 hergestellt ["O. 2801. Das 1,3-bisphosphorylierte Produkt kristallisiert aus der Mischung aus 1,3- und 1.5-bisphosphoryliertem Produkt aus. Die Abspaltung der Schutzgruppen rnit Li65 wurde benzyliert und das trans-4,5-Acetal unter Bildung von
thium in flussigem Ammoniak lieferte Ins( 1,3)P2. Racemisches
66 selektiv gespalten. Allylierung und saure Hydrolyse des ver1ns(l,4)P2 wurde durch Phosphitylierung von 1,2:4,5-Di-U-isobliebenen cis-Acetals lieferte das 1,2-Diol 67, das uber die diapropyliden-myo-inosit mit dern Chlorphosphan 61, Umwandstereomeren Ester 68 in die Enantiomeren getrennt wurde. D-67
lung des Produktes in einen Bisphosphitester, Oxidation und
wurde regioselektiv zu 69 allyliert, das benzyliert und zu 70
Entschutzen erhalten[2851.
Alternativ zur Racematspaltung von
desallyliert wurde. Phosphorylierung mit 48 lieferte 71, und
1.2 :4,s-Di-0-cyclohexyliden-myo-inosit
iiber OrthoacetateF2861
durch Entschiitzen der Phosphat- und Hydroxygruppen mit
sind die Enantiomeren von Ins(l,4)P2 durch die Bildung der
Isoamylnitrit bzw. Hz/5 %Pd-C erhielt man D-Ins(1,4,S)P3. Mit
chromatographisch trennbaren Dicamphanate z u g a n g l i ~ h [ ~ ~ TBPP
~ ~ . 51 oder dem Phosphoramidit 59 konnte diese Synthese
D - h ( 1,4)P2 kann in einer kurzen Synthese aus myo-Inosit-Dbetrachtlich verbessert werden[2921.Racemisches Ins( 1,4,S)P3
wurde spater uber modifizierte Routen zum Trio1 70[*13*'I4]
campher-2,3-acetal [ 2 7 6 . 28'1 oder auch halbsynthetisch durch
Periodat-Behandlung von desacylierten Phosphoinositiden
und durch dessen Umsetzung rnit einem P"'-Reagens synthetierhalten werden[2881.Die beiden Ins(1 , S ) P , - E n a n t i ~ m e r e [ ~ ~ ~ siert[2603
I
2 6 1 1 (Abb. 17): Dabei wurde zunachst 72 dibenzyliert
wurden aus D- bzw. ~-1,2,4,6-Tetra-U-benzyl-myo-inosit
und 57
und die Acetalschutzgruppen entfernt. Das Zwischenprodukt
synthetisiert. Die Racematspaltung der durch selektive Benzy73 wurde durch zinnvermittelte Allylierung der I-OH-Gruppe,
lierung von 2,4,6-Tri-U-benzyl-rnyo-inosit erhaltenen TetrabenBildung des 4S-Acetals und Benzylierung der 2-OH-Gruppe zur
2098
Angeii Chem. 1995. 107. 2U85-2125
Inositlipide
AUFSATZE
OBn 73
OH
72
I
f
selektiv zu 82 phosphoryliert. Die N-Phenyl- und Benzylschutzgruppen wurden unter Bildung der jeweiligen Ins( 1 ,4,5)P3Enantiomere schrittweise abge~palten['~~].
Mittlerweile werden
allerdings andere Phosphorylierungsmethoden b e v o r ~ u g t [ ~ ~ ~ 1 .
Das aus 83 zugangliche Cyclopentylidenacetal 84 (Abb. 19)
wurde bei einem anderen Ansatz verwendet. Durch Silylierung
n
I
OBn
74
70
6
OBn
"
79
80
OH
84
n
Ahb. 17. Synthesen von Ins(1,4.5)P, und Ins(1,4,5)PS3 rnit P"'-Reagentien:
R=CH,CH,CN (Cooke et a].).
vollstandig geschiitzten Verbindung 74 umgesetzt. Isomerisierung der Allylgruppe in 74 zur Prop-I-enylgruppe und Hydrolyse der saurelabilen Schutzgruppen lieferte das Triol 70, das mit
61 phosphityliert, in 75 umgewandelt und zu 76 oxidiert wurde.
Die Schutzgruppen wurden anschlierjend mit Natrium in flussigem Ammoniak in einem Schritt unter Bildung von DLIns(1 ,4,5)P3 entfernt. ~ - I n s ( 1 , 4 , 5 ) P , [ und
~ ~ ~D-InS(l,4,5)P3[2931
]
wurden analog aus enantiomerenreinem D-["~] und L-I,2,4-Tri0-benzyl-myo-inosit gewonnen. D- und L-Ins(l ,4,5)P3 wurden
auch aus 79 (Abb. 18) durch Phosphorylierung rnit 48 zu 80,
Spaltung des Acetals und Racematspaltung des resultierenden
Zwischenproduktes iiber 81 hergestellt. Die 1-Hydroxygruppe
des so erhaltenen enantiomeren 1,ZDiols wurde dann mit 48
83
R IN C C y C y
B
OBn
88
Abb. 19. Synthese von D-InS(1,4,5)P3unter Verwendung einer Xanthenylschutzgruppe (Reese und Ward).
der 1- und der 4-OH-Gruppe unter Bildung von 85 und dessen
Umsetzung mit 2,7-Dibrom-9-phenyl-9-xanthenylchlorid
wurde nach Desilylierung das Triol 86 erhalten. Phosphitylierung
mit dem Phosphan 57, Oxidation und Entschutzen lieferten
~ ~ - I n s,4,5)P3[2961.
(l
Dieser Weg wurde auch zur Synthese von
~ - I n s ( l , 4 , 5 ) P ,genutzt,
~ ~ ~ ~ ~wobei das Diol 83 iiber die Glucopyranosylverbindung 88 in die Enantiomeren getrennt wurdeIZE6].Ausgehend von den diastereomeren Camphansaurederivaten von 6-0-Benzyl-2,3 :4,5-di-O-cyclohexyliden-myoinosit, das durch selektive Benzylierung des entsprechenden
racemischen 1,6-Diob erhalten wurde'2 i61, wurden D- und
~-6-0-Benzyl-2,3-0-cyclohexyliden-myo-inosit
hergestellt. Die
Trikaliumsalze dieser Zwischenstufen wurden mit TBPP
51
270, 2801 phosphoryliert und zu den Ins(l,4,5)P3-Enantiomeren e n t s c h i i t ~ t [2971.
~~*~
Eine kurze Synthese von racemischem Ins( 1 ,4,5)P3 aus 3,6Di-0-benzoyl-myo-inosit wurde b e s ~ h r i e b e n [ ~ ~Partielle
~].
Phosphitylierung mit dem Chlorphosphan 52, Acetylierung der
2-OH-Gruppe und Oxidation lieferten das 1,4,5-Tris(dimethylphosphat) als Hauptprodukt, das durch Demethylierung und
[z499
R=C,H,NH
82
Ahh. 18. Synthese von ~-Ins(1,4,5)P,durch Racematspaltung der Mannoseorthoester (Shvets et al.).
Angew. Chem. 1995,107,2085-2125
2099
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
Acetals lieferten nach Phosphorylierung und Hydrogenolyse
Verseifung zu Ins(l,4,5)P3 umgesetzt wurde. Das Phosphan 56
wurde zur Synthese von Inositphosphaten v o r g e s ~ h l a g e n [ ~ ~D-Ins(l,4,5)P3.
~~
Eine elegante kurze Synthese von D-Ins(1 ,4,5)P3[2x71
gelang
und ebenfalls zur Herstellung von DL-Ins(l ,4,5)P3 aus dem Trio1
iiber 2,3-0-(~-1,7,7-Trimethyl[2.2.l]bicyclohept-2-yliden)-~~~~o70 verwendet. Die Phosphitester-Zwischenstufen wurden dabei
inosit 89 (Abb. 20)[30'1, das aus Inosit und D-Campherdirnit m-CPBA oxidiert.
~ - I n s (,4,5)P3
l
wurde aus 3,6-Di-O-alIyl-1,2-O-cyclohexy- methylacetal durch eine durch Ausfallung getriebene Gleichgeliden-myo-inosit synthetisiert, das dazu an der 4-OH-Gruppe
wichtsreaktion erhalten ~ u r d e [ ~ 'Die
~ ] .Umsetzung von 89 mit
benzyliert und an der 5-OH-Gruppe allyliert wurde, was
fiinf Aquivalenten Pivaloylchlorid lieferte 90, das zu 91 benzy3,5,6-Tri-0-allyl-4-O-benzyl-l,2-O-cyclohexyliden-rnyo-inositliert wurde. Der Pivaloylester wurde anschlieaend verseift, das
Produkt rnit dem Phosphepan 60 phosphoryliert und dann zu 92
gab. Hydrolyse des 1,2-Acetals, Racematspaltung der Monomenthyloxyacetylderivate, Entfernung der chiralen Hilfsoxidiert, das zu D - h ( 1,4,5)P3 entschiitzt wurde.
gruppe, Dibenzylierung und Desallylierung lieferten enantiomerenreines 70. Dieses wurde mit dem Phosphan 58 und tBuOOH
umgesetzt und anschlielJend zu D-hS(l ,4,5)P3hydrogenoly~iert[~~'].
Ins(1 ,4,5)P3wurde auch uber einen gemischten P"'/PV-Ansatz
s y n t h e t i ~ i e r t [L421.
~ ~ ~Durch
.
Phosphorylierung von 2,3,6-Tri-Oben~yl-4,S-O-isopropyliden-myo-inosit[~'
31 mit 47, AcetalspalPi
Piv
tung und Phosphorylierung des freigelegten vicinalen Diols
OH
89
OH 90
wurden eine Mischung aus 1.4- und 1,5-Bisphosphaten erhalten.
Das 1,4-Produkt kristallisierte aus der Reaktionsmischung aus
und wurde rnit dem Chlorphosphan 61 phosphoryliert; das dabei gebildete Phosphoramidit wurde zum Phosphattriester umgesetzt[2h01
und dieser zu Tns(l,4,S)P3 entschiitzt.
0
Ausgehend von 3,6-Di-O-benzyl-4,S-bis(dibenzylphosphoo-lns(1,4,5)Pa
OBn
R
ry1)-myo-inosit wurde I,-lns( 1,4,5)P3 h e r g e ~ t e l l t l ~Die
~ ~Enan].
tiomeren wurden dabei entweder durch Racematspaltung iiber
91: R = Piv
die 1-0-Monomenthyloxyacetylverbindungen oder an einer chiralen HPLC-Siiule getrennt. Regioselektive Silylierung der
aquatorialen OH-Gruppe, Benzoylierung der 2-OH-Gruppe
und Desilylierung legten die I-OH-Gruppe frei, die mit PCl,/
Abb. 20. Eine kurze Route zu ~-Ins(1,4,5)P, iiber das Campheracetal 90 (SalaBenzylalkohol phosphityliert wurde. Oxidation, Hydrogenolyse
monczyk und Pietrunewicz).
und Behandlung rnit Base lieferten D-InS(l ,4,5)P3. In einer weiteren Synthese von D-Insjl ,4,5)P3[224, wurde das Zwischenprodukt 1,2: 5,6-Di-O-cyclohexyliden-myo-inosit
iiber die diaEin konzeptionell ganz anderer Ansatz wurde von Ley et al.
stereomeren Di(L-menthy1oxyessigsiiure)ester oder durch Umentwickelt[201x3021. S'ie nutzten die Tatsache, daa Benzol durch
setzung zum Diacetat oder Dibutyrat und regio- sowie enantioPseudomonas putida mikrobiell zu cis-I ,2-Dihydroxycyclohexaspezifische enzymatische Desacylierung enantiomerenrein er3,s-dien 93 oxidiert wird (Abb. 21 a)[3031.
Das aus diesem Diol
halten.
abgeleitete cyclische Carbonat 94 wurde stereoselektiv zum
Die selektive Blockierung der 1-OH-Gruppe von 2,3-0-Cya-Epoxid 95 oxidiert. Die regioselektive Ringoffnung von 95 mit
clohexyliden-myo-inosit rnit 2-(tert-Butyldimethylsilyloxy)pheBenzylalkohol lieferte 96, das zu 97 benzyliert wurde. Das 1,2nylacetylchlorid war der entscheidende Schritt in einer weiteren
Carbonat wurde hydrolysiert, die Doppelbindung epoxidiert
Synthese von enantiomerenreinem Ins(1 ,4,5)P3[2991.Die resulund die cis-I ,2-Diolgruppe als Isopropylidenacetal erneut getierende Mischung aus den diastereomeren Estern wurde dabei
schiitzt. Die P-Epoxidgruppe im so erhaltenen 98 wurde mit 99
mit 1,3-Dichlor-l ,1,3,3-tetraisopropyldisiloxanzur 4,5-O-silylzum geschiitzten Inosit 100 geoffnet. Debenzylierung und Phosgeschutzten Verbindung umgesetzt. Methoxymethylierung der
phorylierung rnit TBPP lieferten 101, das zu racemischen
freien 6-OH-Gruppe, chromatographische Trennung der vollIns(1,4,5)P3 entschiitzt wurde. Zur Synthese von D- und Lstandig geschiitzten Diastereomere, Entfernung der Acyl- und
I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [wurde
~ ~ ~ ] die Epoxidgruppe in 95 mit (R)-( +)-secSilylgruppen der jeweiligen Isomere sowie Phosphorylierung
Phenylethylalkohol geoffnet, wodurch die HPLC-trennbaren
rnit 56/m-CPBA und Hydrogenolyse lieferten D- bzw. LDiastereomere 102 a und 102 b entstanden (Abb. 23 b). Auch in
Ins( 1,4,5)P3.
einer anderen Synthese von racemischein Ins(1 ,4,5)P3 wurde
Die regioselektive 1 -0-Acylierung von Inosit wurde durch
Benzol als Ausgangsmaterial verwendet (Abb. 22)[2911.transPerborylierung, Transmetallierung mit Bis(acety1acetonato)-di1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien103 wurde in 40 % Gesamtn-butylzinn und Umsetzung der Dibutylzinn-Zwischenstufe mit
ausbeute durch Birch-Reduktion, Bromierung, trans-H ydroxy(-)-Menthylchlorformiat e r ~ i e l t [ ~Die
~ ~Diastereomere
].
wurlierung, Acetylierung und Dehydrobromierung hergestellt.
den durch Kristallisation getrennt und das D-Isomer rnit 2,2-DiBlockierung der Hydroxygruppen als Methoxyethoxymethylmethoxypropan zu D-1-0-Menthyloxycarbonyl-2,3:4,5-di-0(MEM)-Ether und [4 21-Addition von Singulettsauerstoff lieisopropyliden-myo-inosit umgesetzt. Benzylierung der 6-OHferten das Endoperoxid 104, das stereospezifisch zu 105 reduGruppe, Verseifung des Esters und selektive Spaltung des 4 3 ziert w ~ r d e [ ~Inversion
~ ~ ] . der Konfiguration an C-I durch eine
3
+
2100
AUFSATZE
Inositlipide
9
-
43
Y?:
110
9.
"6""
L97:R = Bn
B
I
OH
115
Abb. 23. Enantiospeaifische Synthese von D-InS(1,4,5)P3 aus (-)-Chinaslure
(Falck und Yddagiri).
102a
102b
Stufen wurde der Ester 110 erhalten, der durch Schiitzen der
1-OH-Gruppe als P-(Trimethylsilyl)ethoxymethyl(SEM)-Ether,
Reduktion der Esterfunktion und Selenylierung des so erhaltenen primlren Alkohols zu 111 umgesetzt wurde. Aus dem von
111 abgeleiteten Allyl-Selenoxid wurde durch eine stereoselektive [2,3]-sigmatrope Umlagerung und Benzylierung 112 als einziges Stereoisomer erhalten. Dieses wurde durch Ozonolyse und
Umsetzung mit TBDMS-Triflat mit nahezu vollstandiger Regiospezifitat in den Silylenolether 113 iiberfiihrt. Hydroborierung des Enolethers und Oxidation lieferten den Alkohol 114,
der zu 115 desilyliert wurde. TBPP-Phosphorylierung und Hydrogenolyse gaben D-hS(l,4,5)P3. Tegge und Ballou setzten Dund L-chiro-Inosit, die aus 1~-3-O-Methyl-chiro-inosit42 bzw.
L-Quebrachit 10 durch Demethylierung erhalten wurden, ein,
um beide Ins(1,4,5)P3-Enantiomere herzustellen (Abb. 24)1306].
Dazu synthetisierten sie das &,cis-Dicyclohexylidenacetal 116
Abb. 21. Zugang zu D-Ins(1,4,5)P3durch mikrobielle Oxidation von Benzol (Ley
et al.): a) Synthese von Ins(1,4,5)P3, b) Umsetzung des Zwischenprodukts 95 zu
HPLC-trennbaren Diastereomeren.
'
0- a::GYoMEMaoMEM
OMEM
103
104
OMEM
&I
105
- PEM
0 ""QMEM
OH
OBn
108
I
M E M ?Bn
O T E M
-
HOQ,~~98"
__c
HO
""'OMEM
106
107
Bno
OBn
n
WlfMP,
I
OBn
109
OH
OH
70
116
Abb. 22. Synthese von Ins(1,4,5)P3 aus Benzol. Sie beinhaltet die Photooxidation
von 103 sowie das ConduritB-Derivat 107 als Zwischenprodukt (Carless und Busia) .
Oxidations-Reduktions-Sequenz lieferte das Condurit B-Derivat 107, das benzyliert, unter Bildung von 108 cis-hydroxyliert
und regioselektiv zu 109 methoxyethoxymethyliert wurde. Benzylierung und Abspaltung der MEM-Gruppen gab 70, das mit
TBPP phosphoryliert und anschlieBend zu Ins(1 ,4,5)P3
hydrogenolysiert wurde. Falck und Yadagiri verwendeten zur Synthese von ~-Ins(l,4,5)P,(-)-Chinasame 43 (Abb. 23)[3051.In vier
Angew. Chem. 1995, 107,2085-2125
I
\
O-hS(1
Abb. 24. Synthese von D-InS(l,4,5)P3aus lo-3-O-Methyl-chiro-inosit (Tegge und
Ballou) .
2101
AUFSATZE
aus D-chiro-lnosit. Durch Benzylierung, Hydrolyse und Benzoylierung von 116 entstand vorwiegend 117. Die Inversion der
Konfiguration an C-I gelang iiber das entsprechende Triflat.
Das Produkt 118 wurde Z U 119 debenzyliert. das dann mit dem
Phosphan 56 zu D-InS( 1 .4.S)P3 phosphoryliert wurde. Das
L-Isomer wurde iihnlich ausgehend von L-cliiro-Inosit synthetisiert. Weitere Synthesen von optisch aktivem Ins(1,4,5)P3 sind
veroffentlicht worden[3"7. 3n8], einschlieBlich der Herstellung
von 'H-markiertein 1)- und L-Ins(1 ,4,5)P3 durch Reduktion einer geschiitzten Inosose rnit [3H]NaBH,["O"1.
7.4.2. Weitere Inositfvi,~phosphate
B V. L. Potter und D Lampe
ler OH-Gruppe als Hauptprodukt reduziert wurde. Durch
Phosphorylierung mit TBPP und Entschutzen wurde D[1-3H]Ins(1,3,4)P3 erhalten. Trotz der Verfiigbarkeit von
Ins( 1 ,3,4)P3 ist seine Ca2 +-freisetzendenAktivitat noch umstritten. Eine eindeutige Synthese der Enantiomere dieser Verbindung ist jetzt publiziert worden[3141.
Die Synthese von Ins(1 ,4,6)P,I3' gelang durch Diallylierung
von 1,2 :4.5-Di-O-isopropyliden-m~~o-inosit,
Spaltung des trrinsAcetals und zinnvermittelte p-Methoxybenzylierung des 4,5Diols, die vorwiegend die gewiinschte 6-Alkylverbindung lieferte. Benzylierung der 5-OH-Gruppe, saure Hydrolyse des cisAcetals, Benzylierung der 1- und der 2-OH-Gruppe, Isomerisierung der Allylether und Entfernen der resultierenden Prop1-enyl- sowie der p-Methoxybenzylgruppe lieferten das 1.4,6Triol, das mit 56/tBuOOH phosphoryliert wurde. Von einer weiteren Gruppe wurde Ins(1 ,4.6)P3sowohl als Racemat als auch in
optisch aktiver Form hergestellt[' "1.
Cyclisches n-Ins( 1 :2.4,5)P3 wurde durch Phosphorylierung
von o-3,6-Di-O-benzyl-4,5-bis(dibenzylphospho)-nz~~-inositmit
50[2463
und (in niedriger Ausbeute) aus ~-Ins(1,4,5)P, mit
1-Ethyl-3-(3-dimethyla1ninopropyl)carbodiImid~~~~~
synthetisiert. In dieser Reaktioii wurde das Produkt durch HPLC isoliert und gezeigt, dal3 es init Shure zu Ins(1,4,5)P3 umgesetzt
7.5. Inositietrakisphosphate
wird.
Racemisches Ins(2,4,5)P3 wurde aus 4,5-Di-O-allyl-3,6-di-Obenzyl-nz~winosit hergestellt. das selektiv in der 1-Stellung
7.5.1. Inosit-I,3,4,5-tetrakisphosphat
benzyliert, desallyliert und init TBPP phosphoryliert wurIns(1.3,4,5)P4 wurde zuerst in racemischer Form BUS dem
de[2s0. 2 5 1 1 . ~ ~ - I n s ( 2 , 4 . 5 )wurde
P ~ auch aus Benzol iiber Consymmetrischen Inositorthoformiat 120 synthetisiert (Abb. 2 5 ) .
durit B-Derivate erhaltenr'"'l. Die Synthese einer vollstandig
Chelatkontrollierte Monoallylierung von 120 gab 121. das zu
geschiitzten, phosphorylierten und enantiomerenreinen DIns(2,4,5)P3-Vorstufe wurde beschrieben, der letzte Schritt zur
Entschiizung wurde allerdings nicht v e r ~ i r k l i c h t ['I.~ ' Denselhen Autoren gelang jedoch die Synthese von ~-Ins(2,4,5)P':
Dazu wurde 3,6-Di-0-benzyl-I ,2-0-cyclohexyliden-myo-inosit
init TBPP phosphoryliert. d a s Acetal gespalten und die Enantiomere iiber die diastereomeren 1-Menthyloxyessigsaureester
getrennt. Die aquatoriale H ydroxygruppe wurde regiospezifisch
silyliert und die 2-OH-Gruppe mit PCIJBenzylalkohol und
durch tBu00H-Oxidation p h o s p l ~ o r y l i e r t ~Sowohl
~ ~ ~ ~ .D- als
hs(1,3,4,5)Pd
(BnO)ZP
cauch ~-Ins(2,4,5)P~
wurden aus L- bzw. D-1,3,4-Tri-O-benzoyI(Ba)ze
p),
myo-inosit hergestellt[31 die aus 13- bzw. L-chiro-Inosit erhalOBn
0
0
123
ten w ~ r d e n ~ ~ " ~ ~ .
124
Racemisches Ins( 1,3.4)P,, wurde durch Phosphitylierung mit
Abb. 25. Synthcse von Ins(1 ,3.4,5)P4uber die chelatkontrollierte Monoallylierung
von n?vo-Jnositorthoformiat 120 (Billington et al.).
dem Chlorphosphan 54, Oxidation und Entschiitzen ausgehend
von 2,4,5-Tri-O-benzyl-niio-inosit
syntheti~iert[~"~,
das aus der
en tsprechenden 1.2 :4.5-Di-0-cyclohexylidenverbindunggebil122 benzyliert wurde. Nach Abspaltung der Allyl- und Orthodet wurde. Dariiber hinaus ist es aus derselben Vorstufe auch
init TBPP 51'2". 2 5 ' 1 und detn Phosphan 56[2s*1zuglnglich.
formiatgruppen wurde das Tetraol 123 erhalten, das mit TBPP
D-Ins(l ,3,4)P3 wurde durch Trennung der 5,6-Di-O-benzyI-3,4zu 124 phosphoryliert wurde. Die katalytische Hydrogenierung
di-0-p-inethoxybenzyl-myo-inosit-Enantiomere
an einer chiravon 124 lieferte I n ~ ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P , [ ~ *Ein
~ ~ .ahnlicher Weg wurde
len HPLC-Saule oder durch deren Racematspaltung iiber die
von einer anderen Gruppe eingeschlagen[2sn1,wobei im ersten
diastereomeren 1 -Menthyloxyacetate hergestellt[22'I. EnzymaSchritt statt der Allyl- die Benzyloxymethylschutzgruppe eingetisch oder durch Racematspaltung iiber die Di(L-menthylcarbofiihrt wurde[2801.2,6-Di-O-benzyl-myo-inosit
123 wurde auch in
nate) erhaltenes optisch aktives 1,2: 5,6-Di-O-cyclohexyzwei Synthesen von Ins(1 ,3,4,5)P4 mit den Phosphitylierungsreagentien 60[3'71
liden-nzy~-inosit['~~]
war die Ausgangsverbindung in einer
bzw. 56[2581
verwendet.
weiteren Synthese von n-Ins(1 ,3.4)P3 iiber ~-2,5,6-Tri-ODie Orthoformiatester-Blockierungvon myo-Inosit war auch
henzyl-mjwinosit [ 2", 2h1. Boehm und Prestwich synthesierin einer Synthese der beiden Ins(l.3,4,5)P4-Enantiomere von
Vasella et al. ein entscheidender Schritt (Abb. 26)[2231.Dazu
ten beide Ins(l,3,4)P3-Enantiomeresowie radiomarkiertes
[I -3H]Ins(1.3,4)P3 l3' 31: 2.4,5-Tri-O-benzylinositwurde dabei
wurde zunachst der silylierte Orthoester 125[28'I zur racemischen Monobenzylverbindung 126 benzyliert. Diese wurde mit
zum Isopropylidenacetal umgesetzt und dieses uber die diastereomeren ( - )-Camphansiiureester in die Enantiomere getrennt.
(R)-(+ )-I -Phenylethylisocyanat zu den entsprechenden diasteVerseifung des Esters und Oxidation des Alkohols lieferten die
reomeren Carbamaten umgesetzt, die nach Entfernen der SilylI-Inosose, die init ['HINaBH, zum Alkohol init iiquatoriagruppe als 127a und b getrennt wurden. Die Diastereomere
*&
I'"
2102
Inositlipide
--a
a
TBDMS
I
OCOPr
OH
125
12*
J
OBn
126
127a
+ + bH
OCb
1
lZ9
\
I
2222
I
H
OBn
D-123
1
1
131
Abb. 26. Chemoenzymahsche Route zu den Ins(1 .3,4.5)P4-Enantiorneren(Vasella
el al.).
wurden jeweils benzyliert, und nach der Entfernung der Carbamat- und der Orthoformiatgruppe wurden die Enantiomere von
123 erhalten, die rnit 56Im-CPBA phosphoryliert und zu D- bzw.
L-Ins(1 ,3.4,5)P4 hydrogenolysiert wurden. Die enantiomeren
Dibenzylinosite 123 konnten auch durch enantioselektive Monodesacylierung des durch Acylierung und Desilylierung aus
125 gebildeten symmetrischen Dibutyrats 128 gewonnen werden. So gab die Inkubation von 128 mit Schweineleber-Esterase
(PLE) das Monobutyrat 129 rnit > 95 % Enantiomereniiberschulj. Dibenzylierung, Desacylierung und Spaltung des Orthoesters gab die L-Ins(l,3,4,5)P4-VorstufeL-123. Das D-Isomer
konnte durch eine Blockierungs-Deblockierungs-Sequenz aus
129 iiber 130 und 131 erhalten werden. Uberraschenderweise ist
L-Ins(1,3,4,5)P4 im Vergleich zu D-InS(1 ,3,4,5)P4ein Ligand mit
hoherer Affinitat zu Ins( 1,3,4.5)P4-Bindungsstellen in Schweinekleinhirn, wobei dieser Affinitatsunterschied groljer ist als der
zwischen L- und ~-Ins(l,4,5)P, hinsichtlich des Ins(1 ,4,5)P3RezeptorsL3"I.
Meek et al.[2551 nutzten die basenkatalysierte Wanderung der
1-Benzoylgruppe im leicht zuganglichen myo-Inosit-I ,4-dibenzoat, um unter anderem das 2,4-Dibenzoat zu erhalten. Phosphitylierung rnit dem Chlorphosphan 52, Oxidation, Demethylierung und alkalische Hydrolyse lieferten racemisches
Ins(1,3,4,5)P4.
D-InS(1,3,4,5)P4 wurde durch Racematspaltung von 3,4,5-Tri0-benzoyl-6-0-benzyl-myo-inosit
synthetisiert, das aus der entsprechenden 1.2: 4,5-Di-O-cyclohexylidenverbindungdurch selektive Benzoylierung der 3-OH-Gruppe, Benzylierung der
6-OH-Gruppe, Spaltung des trans-Acetals, Benzoylierung der 4sowie der 5-OH-Gruppe und Hydrolyse des cis-l,2-Acetals hergestellt wurde. Racematspaltung iiber die Monomenthyloxyacetylverbindungen, Benzylierung des gewiinschten Diastereomers und Desacylierung gab D-123, das rnit TBPP phosAiiRew. Chem. 1995, l07. 2085--2125
AUFSATZE
phoryliert und zu D-InS( 1,3,4,5)P4 entschiitzt w ~ r d e [ ~ ' ~ l .
~-Ins(1,3,4,5)P, wurde auch aus 1.4,5-Tri-O-alIyl-6-0benzyl-myo-inosit hergestellt, das durch Racematspaltung
enantiomerenrein erhalten wurde. Chemoselektive zinnvermittelte Allylierung der iiquatorialen Hydroxygruppe, Benzylierung der 2-OH-Gruppe und Desallylierung lieferten das
Tetraol 123, das mit dem Phosphan 58 phosphityliert wurde[2981.Auf chemoenzymatischem Wege erhaltenes D-1 .2: 5,6Di-0-cyclohexyliden-myo-inosit diente als Ausgangsmaterial
in einer weiteren Synthese von ~-Ins(1,3,4,5)P, iiber n123[225,2261
Eine kurze, von Ozaki et al.[2221entwickelte Route zu
Ins( 1 ,3,4,5)P4 beruht auf der selektiven Benzoylierung von Inosit zum 1,3,4.5-Tetrabenzoat, das als Hauptprodukt in 34 %
Ausbeute isoliert wurde. Benzylierung rnit Benzyltrichloracetimidat und Debenzoylierung lieferte das 2,6-geschiitzte Inosit,
das rnit dem Phosphoramidit 59 phosphityliert wurde. Enantiomerenreines Ins( 1 ,3,4,5)P4 ist durch chromatographische Trennung des Tetrabenzoat-Racemates an einer chiralen S i d e zuganglich. Die gleiche Gruppe beschrieb die enantioselektive
So wurAcylierung von Inositen mit Weinsluremon~ester[~~~~.
de 1,3,5-Tri-O-benzoyl-myo-inosit,
das durch direkte Benzoylierung von Inosit erhalten wurde, enantioselektiv Zuni 4-Tartrat
umgesetzt und die 2- und die 6-OH-Gruppe silyliert. Trennung
der vollstiindig geschiitzten Diastereomere, Desacylierung rnit
Ethylmagnesiumbromid, Phosphorylierung und Hydrogenolyse lieferten D - h ( 1 ,3,4,5)P,r3O81.
7.5.2. Weitere Znosittetrakisphosphate
Racemisches Ins(1 ,4,5,6)P4 wurde aus dem 1,2-0-Isopropylidenacetal von myo-Inosit durch Phosphitylierung mit 52 und
Wasserstoffperoxid-Oxidation synthetisiert. Die erforderliche
Demethylierung wurde mit Bromtrimethylsilan durchgefiihrt,
da HBr in Essigsaure zur vorzeitigen Hydrolyse des Acetals
und zur Wanderung der Phosphatgruppe fiihrteLZ5'1. DLIns( 1,4,5,6)P4 wurde dariiber hinaus durch Phosphitylierung
des entsprechenden 1,2-Acetals rnit dem Chlorphosphan 61 herg e ~ t e l l t [ ~ ' ~o-Ins(1,4,5,6)P4
].
wurde durch Racematspaltung
iiber die 0-Camphanyliden-myo-inosit-cis-Monoacetale
erhalten [2761.
Zur Synthese von Ins(1,3,4,6)P4 wurde Inosit rnit 1,3-Dichlor-l,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan
regioselektiv zum symmetrischen 1,6:3,4-O-Bis(disiloxanyliden)inosit umgesetzt. Benzoylierung und Entfernung der Siloxane mit HF lieferten das
2,5-Dibenzoat, das rnit dem Phosphoramidit 59 phosphityliert
w~rde[~~~].
D L - h S ( l ,2,4,5)P4 wurde zuerst durch Benzoylierung von
1,2:4,5-Di-O-cyclohexyliden-myo-inosit,
Acetalhydrolyse. Phosphorylierung mit 52/Wasserstoffperoxid und stufenweises Entschiitzen syntheti~iert[~~'].
Ahnlich wurden in einer neueren
Synthese das entsprechende Isopropylidenacetal und 53 als
Phosphitylierungsmittel v e r ~ e n d e t [ ~Auch
~ ~ l . ausgehend von
Benzol zugiingliche Conduri t B-Derivate wurden zur Herstellung von Ins(1,2,4,5)P4 g e n ~ t z t ' ~und
~ ' ~ L-Quebrachit
,
wurde
als Ausgangsverbindung in einer Synthese von L-chiroIns( 1,2,3,5)P4 e i n g e s e t ~ t [ ~ ~ ~ ] .
2103
B. V. L. Potter und D. Lampe
8. Inositphosphat-Analoga
Nachdem Ins( 1.4,5)P3 heute allgemein als sekundarer Botenstoff akzeptiert ist, hat man sich der Synthese von Inositphosphat-Analoga zugewendet, von denen man sich neuartige biologische Eigenschaften verspricht. Es besteht gegenwartig betrlchtliches Interesse an Konzepten fur pharmakologische Eingriffe in zellulare Signaliibertragungswege. Erst wenn geeignete
Rezeptorantagonisten und Enzyminhibitoren, die die Zellmembran passieren konnen, auch synthetisch zuganglich sind, kann
in umfassenden Untersuchungen festgestellt werden, ob diese
Verbindungen therapeutischen Nutzen haben.
8.1. Desoxy-Analoga
98
-
132: X H
134:X-F
136: X Me
138: X = OMe
133:X -H
135:X-F
137: X Me
139: X - O M
-
Abb. 27. Zugang zu C-6-modifinerten Ins(l,4.5)P3-Analoga uber das Epoxid 98
(Ley et 4.).
dings noch nicht veroffentlicht. Die Wechselwirkungen von D-6Desoxy-Tns(1 ,4,5)P3rnit dem Ins( 1,4,5)P,-Rezeptor sowie metabolischen Enzymen wurden bereits untersuchtIz3l].
Die Synthesen von 1~-2,3-Didesoxy-und 1~-2,3,6-TridesoxyIns( 1,4,5)P3 aus 1D-1,4,5-Tri-O-benzoyl-6-O-benzyl-3-desoxymyo-inosit, einem Zwischenprodukt bei der Herstellung von ID3-Desoxy-Ins(l,4,5)P3, sind beschrieben w ~ r d e n [ ~ ' ~RaceI.
misches 2,3,6-Tridesoxy-Ins( 1,4,5)P3 ( = DL-Cyclohexan-l,2,4trisphosphat) war zuvor von einer anderen Gruppe hergestellt
w~rden[~~~].
Auf der Suche nach Inosit-Monophosphatase-Inhibitoren[3231(siehe Abschnitt 9) wurden die racemischen 2- und 6Desoxy-Analoga von Ins( l)P synthetisiert. ~-2-Desoxy-Ins(l)P
wurde ausgehend von ~-3,4,5,6-Tetra-O-benzyI-myo-inosit
hergestellt, das in den entsprechenden 1-Tetrahydropyranyl(THP)Ether iiberfiihrt und nach der Barton-McCombie-Methode an
C-2 desoxygeniert wurde. Spaltung des THP-Ethers, Phosphorylierung und Hydrogenolyse lieferten ~-2-Desoxy-Ins(l)P[~'~~.
~~-2-Desoxy-Ins(l,4,5)P~
wurde aus 4,5-Di-O-benzoyI-3,68.2. Fluorierte Inositphosphat-Analoga
di-O-benzyl-1,2-O-cyclohexyliden-n~yo-inosith e r g e ~ t e l l t [ ~ ~ ~ ] .
Der Acetalhydrolyse folgte die zinnvermittelte Monomethoxy2-F-scyllo-Ins(l ,4,5)P3 und 2,2-F,-Ins(l,4,5)P3 wurden ausgehend von 1-0-AIlyl-3,6-di-0-benzyl-4,5-O-isopropylidenmethylierung der 1-OH-Gruppe. Die Desoxygenierung an C-2
myo-inosit synthetisiert. Diese Verbindung wurde mit DAST
wurde in vier Stufen erreicht : Zunachst wurde die 2-Hydroxygruppe oxidiert ; die entstandene Inosose wurde zum Tosylhyunter Inversion der Konfiguration an C-2 monofluoriert, und
drazon umgesetzt, das zum Hydrazin reduziert wurde. Die Hydie gem-Difluorverbindung wurde nach Oxidation zur 2-Inosodrazingruppe wurde init Natriumacetat entfernt. Abspaltung
se erhalten. Entschiitzen der I-, 4- und SOH-Gruppen, Phosder MOM- und Benzoylschutzgruppen lieferte das 1,4,5-Triol,
phorylierung rnit TBPP und Hydrogenolyse lieferten 2-F-scyllodas mit TBPP phosphoryliert und anschlieljend entschiitzt
Ins(1 ,4,5)P3 bzw. 2,2-F2-Ins(1,4,5)P3[3291.Weitere, ahnliche
Synthesen dieser Verbindungen sind veroffentlicht worwurde.
den[' 91, 3301.Die Enantiomere von 3,6-Di-O-benzyl-2-desoxySowohl ~-3-Desoxy-Ins(1,4,5)P3 als auch D-3-DesoxyIn~(1,5,6)P,["~.32h1 wurden aus D-3-Desoxy-myo-inosit
2,2-difluor-4,5-isopropyliden-myo-inosit
wurden durch Race(Viburnit) hergestellt. Diese Verbindung wurde aus O-Diisopromatspaltung der entsprechenden Camphansaureester erhalpyliden-L-quebrachit durch Barton-Desoxygenierung der freien
ten, wodurch 1)- und ~-2,2-F,-Ins(1 ,4,5)P, zuganglich
sind[191,331, 3321
Hydroxygruppe und Entfernung aller Schutzgruppen mit Bortribromid erhalten und mit 2-Methoxypropen/Saure zu einer
2-F-Ins(l ,4,5)P, 146 wurde aus dem geschiitzten scyllo-Inosit
Mischuug aus den entsprechenden 1,2 :4,5- und 1,2: 5,6-Di-0140 hergestellt (Abb. 28)13331:
Die Allylgruppe in 140 wurde zur
isopropylidenverbindungen umgesetzt. Diese wurden benzyProp-I -enylgruppe isomerisiert (141) und die freie 2-Hydroxyliert, unter Spaltung der trcms-Acetale hydrolysiert und nach
gruppe unter Bildung von 142 trifliert. Substitution des SulfoBenzoylierung die gebildeten beiden Regioisomere chromatonatrestes mit Tetrabutylammoniumfluorid lieferte das Fluorgraphisch getrennt. Spaltung des Acetals von 4,5-Di-O-benzoylinosit 143. Die saurelabilen Schutzgruppen wurden abgespalten
6-O-benzyl-3-desoxy-1,2-O-isopropyliden-myo-inosit,
Benzoyund das resultierende Trio1 144 mit 56/tBuOOH zu 145 phoslierung der I-OH-Gruppe, Schiitzen der axialen OH-Gruppe als
phoryliert, das nach Entschutzen 146 gab. Ein friiherer Versuch,
Ethoxyethylether und Spaltung des Benzoesaureesters gab das
2-F-Ins(l ,4,5)P3 aus 140 mit DAST zu synthetisieren, scheiterte,
1,4,5-Triol, das mit TBPP phosphoryliert und zu ~-3-Desoxy- da die Reaktion unerwarteterweise unter Retention der KonfiIns(1 ,4,5)P3 entschutzt wurde. ~-3-Desoxy-Ins(l,5,6)P,wurde
guration ~ e r I i e f [ ~ ~ ' ] ] .
analog aus dein zweiteii Regioisomer hergestellt.
Die Umsetzung von ~-3-Desoxy-3-fluor-myo-inosit
18 (das
~ ~ - 6 - D e s o x y - I n1,4.5)P3
s(
133 (Abb. 27) wurde aus Vorstufen
wie bereits beschrieben aus L-Quebrachit hergestellt wurde) mit
synthetisiert, die durch mikrobielle Oxidation von Benzol zu2-Methoxypropen in Gegenwart einer katalytischen Menge an
ganglich sind[zO1.3 2 7 1. Der entscheidende Schritt war die selekCamphersulfonsaure lieferte eine Mischung aus der 1,2:$6- und
tive Ringoffnung der Epoxy-Zwischenstufe 98 rnit LiAIH,, die
der gewunschten 1,2 :4,5-Di-O-isopropylidenverbindung 147
vorwiegend das 6-Desoxy-nz,vo-inosit 132 lieferte. D-6-Desoxy(Abb. 29). Dieses wurde zu 148 benzyliert, das trans-Acetal geIns( 1 ,4,5)P3wurde aus D-Galactose durch die Ferrier-Reaktion
spalten und das entstandene Diol zu 149 benzoyliert. Hydrolyse
hergestellt ; Einzelheiten dieser Synthese wurde bisiang allerdes verbliebenen Acetals, selektive Benzoylierung der aquato2104
AUFSATZE
Inositlipide
OAll
OProp
OBn 140
c
8.3. Ringmodifizierte Inositphosphat-Analoga
I
Das vielseitige, aus Benzol gewonnene Epoxid 98 (Abb. 27)
wurde zur Synthese s o n racemischem 6-Desoxy-6-methylIns(1 ,4,5)P3 137 und 6-O-Methyl-Ins(l ,4,5)P3139 verwendet[201. 302, 3271. W"
ahrend die Ringoffnung rnit Natriumniethylat/Methanol vonviegend 136, die Vorstufe fur 137, lieferte, gab
die Reaktion von 98 rnit Lithium-cyano(dimethyl)cuprat(r) die
Methoxyverbindung 138, aus der 139 hergestellt werden kann.
~~-6-O-Methyl-Ins(l
,4,5)P3 139 wurde auch von einer anderen
Arbeitsgruppe synthetisiert und charakteri~iert'~~~!
Ein Ins(1,4,5)P3-Analogon rnit einer aquatorialen 2-Hydroxygruppe, DL-Scyl~O-InS(1
,2,4)P3, wurde aus l-O-Allyl-3,6-di-Oben~yl-4,5-O-isopropyliden-nzyo-inosit[~~~]
durch Triflierung
der 2-Hydroxygruppe und Substitution der Triflatgruppe mit
Caesiumacetat erhalten.
Synthesen von chiro-Ins(2,3,5)P3 159, einem Ins(l ,4,5)P3Analogon rnit invertierter Konfiguration an C-3, wurden von
zwei Gruppen beschrieben: racemisches 159 (Abb. 30) wurde
aus dem Condurit F-Derivat 105 (erhaltlich aus Benzol, siehe
Abb. 22) hergestellt, das zu 153 benzyliert und dann zum chiroInosit 154 cis-hydroxyliert wurde. Durch selektives Schutzen
der aquatorialen Hydroxygruppe als Methoxymethylether (155)
Abb. 28. Synthese von 2-F-Ins(1.4,5)P3 (Lampe und Potter)
18
148
Aus 1,3,4-Tri-0-allyl-5,6-di-O-benzyl-myo-inosit
wurden 2F-scy120-Ins(l,3,4)P3 und 2,2-F2-Ins(l,3,4)P3 s y n t h e t i s ~ e r t ' ~ ' ~ ~ .
Die Umsetzung rnit DAST verlief dabei unter Konfigurationsumkehr, so darj das Fluoratom in aquatorialer Position eingefuhrt wurde. Desallylierung, TBPP-Phosphorylierung und Hydrogenolyse lieferten 2-F-scyZlo-Ins( 1,3,4)P3. Die Difluorverbindung wurde entsprechend durch Fluorierung der 2-Inosose
gewonnen. Durch Inversion der Konfiguration an C-3 vor der
Fluorierung wurde versucht, auch das myo-Inositderivat zu synthetisieren; die fluorierte myo-Inosit-Zwischenstufe konnte dabei allerdings nicht selektiv desallyliert werden[jl 4.
147
149
152
Abb. 29. Synthese yon optisch aktivem 3-F-lns(1,4,5)P3 (Kozikowski eta].).
rialen Hydroxygruppe und Schutz der freien axialen Hydroxygruppe rnit dem Ethoxyethylrest lieferten 150. Die Benzoylgruppen wurden abgespalten und das so gebildete Trio1 mit TBPP zu
151 phosphoryliert, das dann schrittweise zu ~-3-F-Ins(l,4,5)P3
152 entschutzt ~ u r d e ~Die
~ ~Synthese
~ ] . von D-3-C-(Trifluormethyl)-Ins(1,4,5)P3 wurde vor kurzem von derselben Arbeitsgruppe beschrieben t 3 'I.
Rdcemisches 6-F-Ins(l ,4,5)P3 135 ist durch mikrobielle
Oxidation son Benzol iiber das Epoxid 98 zuganglich
(Abb. 27)[201,3271. Die Ringoffnung rnit LiAlH, lieferte dabei
vonviegend 134. Debenzylierung, Phosphorylierung rnit TBPP
und Entfernen der Schutzgruppen rnit Trimethylsilylbromid lieferten 135.
Anxew. Chem. 1995,107, 2085-2125
158
DL-159
Abb. 30. Photooxidationsansatz zur Herstellung von ~~-chiro-Inosit-2,3,5-trisphosphat (Carless und Busla).
2105
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
und Benzylierung wurde das vollstandjg geschiitzte 156 erhalten. Dessen saure Hydrolyse lieferte 157, das rnit TBPP zu 158
phosphoryliert wurde. Die anschlieRende Hydrogenolyse gab
DL-1s9[3"41.
~ - ~ h i r o - I n s ( 2 , 3 , 5 ) P , 3361
[ ~ ~wurde
'.
ausgehend von
L-chiro-Inosit synthetisiert (Abb. 31). Die selektive zinnvermittelte Benzylierung lieferte die Schliisselzwischenstufe 160 als
H
HEQd:"
HO
OH
-d
-d
i
/
L-Quebrachit
H
H
B&Bn
Ho OH
160
HO OH
L-cbimlnosit
BzO
OBz
161
Abb. 31. Synthese m i 1 i.-I-hiro-lns(l.4.6)P, und 1.-~/2iro-Ins(2,3.5)P, sowie rhrer
Trisphosphorothioat-Analopa :IUS L-Quchrachit (Liu und Potter).
8.4. Phosphorothioate
Phosphorothioat-Analoga von Nucleotiden haben sich als
sehr wertvoll fur Untersuchungen von enzymologischen und
inoleku~drbiologischenM e ~ h a n i s m e n [sowie
~ ~ ~ ]von enzyniatischen Phosphoryltransferreaktionen erwie~en[~".3411 , und
Phosphorothioat-Analoga der etablierten sekundaren Botenstoffe CAMP und c G M P sind schon seit geraumer Zeit verfiigbar. Die einzigen bekannten kompetetiven CAMP-Antagonisten
(aus vielen hundert CAMP-Analoga), cyclisches (R,)-Adenosin3',5'-monophosphorothioat und das entsprechende Phosphorodithioat, wurden bemerkenswerterweise durch Substitution mit
dein Phosphorothioatrest erhalten. Solche Analoga sind deshalb so niitzlich, weil sie nicht durch Phosphatasen abgebaut
werden[28s1. Inositphosphorothioate werden bereits als erste
partielle Agonisten des Tns( 1 .4,5)P,-Rezeptors diskutiert (siehe
Abschnitt 11 .I). Durch die Synthese von PhosphorothioatAnaloga konnen dariiber hinaus 3'S-Radiomarkierungen ausgezeichnet eingefiihrt werden. Da die Sulfoxidation gewohnlich der letzte Syntheseschritt vor der Entfernung der Schutzgruppen ist und mit elementarem Schwefel durchgefiihrt werden
kann, kann die Zahl der Syntheseschritte mit radioaktivem
Material auf ein Minimum beschrankt werden. So wurde 1)[3sS]Ins(l.4,5)PS, synthetisiert und in E n ~ y m - [und
~ ~ Rezep~]
t o r b i n d ~ n g s s t u d i e nuntersucht.
~ ~ ~ ~ ~ Dabei wurde festgestellt,
daO es zwei Bindungsstellen markiert: die Ins(I,4,5)P3-Bindungsstelle sowie eine Bindungsstelle des moglicherweise in einer anderen Konformation vorliegenden Rezeptors. Dariiber
hinaus ist Schwefel ein besseres Nucleophil als Sauerstoff, weshalb die selektive Markierungen von Phosphorothioaten in Gegenwart von Phosphaten z. B. rnit Fluoreszenzmarkern moglich
ist 13441,
8.4.1. Phosphorothioat-Analoga von tnositmonoHauptprodukt. Nach Perbenzoylierung und Spaltung der Benund -bisphosphaten
zylether wurde 161 erhalten, das rnit dem Chlorphosphan 53
oder rnit dem Phosphan 55 phosphityliert und nach Oxidation
DL-myo-Inosit-I-phosphorothioat[Ins(l)PS] wurde erstmals
zu 162 unter Bildung von 159 entschiitzt wurde. Das entspredurch Umsetzung von Inosit-I ,2,4.5,6-pentaacetat mit Thiochende Thiophosphat 164 wurde durch Sulfoxidation des Trisphosphorylchlorid und nachfolgenden Esterhydrolyse erhalphosphitesters von 161 zu 163 und Entschiitzen hergestellt.
ten[27s1.Zur Synthese von racemischem sowie enantiomerenreiPhosphitylierung der Zwischenstufe 160 und Oxidation oder
nem Ins(l)PSr7'. 3451 wird das entsprechende Penta-O-benzylSulfoxidation des resultierenden Trisphosphitesters lieferten 165
inosit, das durch Racematspaltung iiber die Camphanate in die
bzw. 166. die zu ~-c/iiro-Ins(1,4,6)P, 167 bzw. seinem TrisphosEnantiomeren getrennt werden konnte, mit dem Phosphoramiphorothioat-Analogon L-c/?iro-Ins( 1 ,4,6)PS3 168 entschiitzt
dit 61 phosphityliert und anschlieBend sulfoxidiert. Eine Synwurden [3 'I.
these von L-Ins(1)PS wurde auch von einer anderen Arbeitsgruppe b e ~ c h r i e b e n ~ ~ ~ ~ ] .
Carless und Busia ["'I beschrieben die Synthese von D L - ~ F-cl?iro-Ins(2.3,5)P, ausgehend vom cis-I ,4-Diol 105 (siehe
Die direkte Thiophosphorylierung beispielsweise von DLAbb. 21). Benzylierung und ck-Hydroxylierung lieferten 1,41,4,5,6-Tetra-O-acetyl-myo-inosit
rnit Thiophosphorylchlorid
Di-O-benzyl-2,3-di-O-methoxymethyl-chiro-inosit.Selektive
fiihrte zu einer 1 :I-Mischung aus dem endo- und dem em-DiaMethoxymethylierung der aquatorialen Hydroxygruppe utid
stereomer des geschiitzten cyclischen 1:2-Phosphorothioates,
DAST-Fluorierung unter Retention der Konfiguration fiihrten
die durch Umkehrphasen-Flash-Chromatographie getrennt
zum vollstandig geschiitzten. fluorierten chiro-Inosit. Hydrolyse
wurde. Desacylierung und Ausfallung rnit Kaliumchlorid lieferder MOM-Ether, TBPP-Phosphorylierung und Hydrogenolyse
te cyclisches endo- und exo-DL-nzyo-Inosit-l : 2-phosphorolieferten ~~-6-F-chiro-Ins(2,3,5)P,.
t h i ~ a t [ ~ ~In
' ] .einem anderen Ansatz wurde die 1- oder die
Weitere an C-3 modifizierte Analoga, wie ~-3-Chlor-,0-32-OH-Gruppe von 1,4,5.6-Tetra-O-benzyl-myo-inosit
rnit 61
Brom-, und ~-3-O-Methyl-Ins(l.4,5)P3, wurden b e s ~ h r i e b e n [ ~ ~ ~ ]phosphityliert
.
und die gebildeten Monophosphoramidite rnit
Vor kurzem wurde iiber die erste Synthese eines Amino-AnaloTetrazol zum e m - und endo-Methoxyphosphit cyclisiert. Diese
1,4,5)P3, begons von Ins( 1 .4,5)P3. ~-3-Amino-3-desoxy-Ins(
wurden unter Bildung einer Mischung der entsprechenden geri~htet~~~~],
schiitzten diastereomeren Phosphorothioate sulfoxidiert, die
2106
Anjiriv
Cliern 1995. 107, 2085-2125
Inosi tlipide
chromatographisch getrennt und entschiitzt ~ u r d e n [ ~ ~
Ins(1 ,4)PS2[2851und Ins(4,5)PS2['6'1 wurden aus ~ ~ - 1 , 2 : 4 , 5 Di-0-isopropyliden- bzw. I ,2,3,4-Tetra-O-benzyl-myo-inosit
erhalten.
8.4.2. Phosphorothioat-Analoga von Znosittrisphosphaten
AUFSATZE
~ist] hervorragend
.
zur Synthese der iiberaus begehrenswerten entsprechenden j5S-markiertenVerbindungen geeignet. So lieferte
die Inkubation von [35S]ATPySrnit Erythrocytengeisterzellen
35S-markierte PtdIns(4,5)P2-Analoga mit dem 35S-Isotopentweder in der 4- und der 5-Position oder nur in der 5-Position.
Phospholipase C spaltete dieses modifizierte Lipid nach Aktivierung rnit Ca2+ in eine Mischung aus Inosit-I ,4-bisphosphat-5[35S]phosphorothioat und Ino~it-l-phosphat-4,5-[~~S]bisphosphorothioat, die gegeniiber 5-Phosphatase resistent sind.
myo-Inosit-l,4,5-trisphosphorothioat [Ins(l ,4,5)PS3] 78
(Abb. 17)[3481war das erste beschriebene Ins(l,4,5)P3-Analogon und hat sich als wertvolles Hilfsmittel bei der Aufillrung
der biochemischen Rolle von Ins(1,4,5)P3 erwiesen (siehe Ab8.4.3. Phosphorothioat-Analoga von Inosittetrakisphosphaten
schnitt 12). Ins(l,4,5)PS3 wurde aus dem Triol 70 hergestellt,
das mit dem Chlorphosphan 55 zum Trisphosphoramidit und
Ins(1 ,3,4,5)P4-5-S wurde durch Phosphitylierung von 2,6-DiO-benzyl-l,3,4-tris[(dibenzoxy)phospho]-myo-inosit mit 56 und
weiter mit Tetrazol und 2-Cyanethanol zum Phosphan 75 umgesetzt wurde. Sulfoxidation zu 77 und Entschiitzen lieferten das
In-situ-Sulfurisierung zum vollstandig geschiitzten Ins( 1 .3,4,5)P4Trisphosphorothioat 78. Eine zweite S y n t h e ~ e ~ ausgehend
'~~]
5-S-Analogon erhalten, das zum entsprechenden 5-Phosphorothioat debenzyliert ~ u r d e [ ~ ' ~ ] .
vom Triol 70 beinhaltet die Phosphitylierung mit 56 zum Trisphosphittriester-Zwischenprodukt und die Sulfurisierung mit
Ins(1 ,3,4,5)P4-3-S 176 (Abb. 32) wurde aus 169 hergestellt.
Phenacetyldisulfid zum Phosphorothioat, das zu Ins( 1,4,5)PS3
Acetalhydrolyse und zinnvermittelte para-Methoxq benzylieentschiitzt wurde.
rung der I-OH-Gruppe lieferten 170, das durch gleichzeitige
2,3,6-Tri-O-benzyl-4,5-O-isopropyliden-m~o-inosit wurde in
Synthesen der 5-Phosphorothioat- und der 4,5-Bisphosphorothioat-Analoga von Ins(1 ,4,5)P3, Ins(1 ,4,5)P3-5-S[240,2421 und
Ins(1 ,4,S)P3-4,5-S2verwendet. Mit 47 wurde die I-OH-Gruppe
ti
dieser Zwischenstufe phosphoryliert. Nach Acetalspahmg wurOBn
OBn
de mit 47 phosphoryliert, wobei eine Mischung aus dem 1,4- und
169
170
dem 1,5-Bisphosphattriester erhalten wurde, aus der das 1,4Produkt auskristallisierte. Phosphitylierung der freien 5-Hydroxygruppe rnit dem Chlorphosphan 61, Sulfoxidation und
Prop0
Entschiitzen lieferten Ins(1 ,4,5)P3-5-S. Alternativ konnte das
H
OBn
nach der Acetalhydrolyse erhaltene 4,5-Diol rnit 55 oder 56
OBn
172
171
phosphityliert, anschlieDend sulfoxidiert und zu Ins(1 ,4,5)P343-S, entschiitzt werden. Aus dem 4,5-Bisphosphorothioat
wurde das cyclische 4,5-Pyrophosphat durch Desulfurierung
mit N-Bromsuccinimid (NBS) erhalten[3491.In einer weiteren
Synthese von Ins( 1,4,5)P3-5-S wurde ein benzylgeschiitztes
Inosit-1,4-bisphosphat mit freier 5-Hydroxygruppe rnit 56
173
phosphityliert und anschlieDend rnit Phenacetyldisulfid umgeset~t['~~].
Ins( 1,4,5)P3-1-S wurde aus I-O-Allyl-2,3,6-tri-O-benzyl-myoinosit durch Isomerisierung der Allylgruppe zur entsprechenden Prop-1 -enylverbindung und deren 4,5-Bisphosphorylierung
tnit einetn P"'-Reagens synthetisiert. Entfernen der Prop-l-enyl176
175
gruppe, Phosphitylierung der 1-Hydroxygruppe und SulfAbb. 32. Synthese von Ins(l,3,4,5)P4-3-S
(Liu und Potter).
oxidation lieferten nach Entfernung der Schutzgruppen
Ins( 1,4,5)P3-1-S[350].Tns(1,4,5)P3-1-S,das zur Herstellung eines
Ins( 1,4,5)P3-Analogons mit einem Fluoreszenzmarker verwendet wurde, wurde aus 1~-1-0-Allyl-2,3,6-tri-O-benzyl-myo-inoBlockierung der 4- und 5-OH-Gruppe als Isopropylidenacetal
sit in optisch aktiver Form erhalten[3441.Dariiber hinaus wurde
und Benzylierung der 2-OH-Gruppe in 171 umgewandelt wurde. Die siurelabilen Schutzgruppen wurden abgespalten und die
DL-hS(l ,4,S)P3-1-Sdurch Phosphitylierung rnit 56 und SulfoxiAllylgruppe unter Bildung von 172 isomerisiert. Der 1.4.5-Trisdation mit Phenacetyldisulfid hergestellt[' 'I.
phosphat-Triester 173 wurde d a m durch Phosphorylierung erAuch die Trisphosphorothioate ~-6-Desoxy-Ins(
I ,4,5)PS,
und ~-chiro-Ins(2,3,5)PS,"~~~
halten. Der Prop-1 -enylether wurde hydrolysiert (+ 174) und
3 5 2 1 sowie lns(1,3,5)PS3, Ldie freie 3-OH-Gruppe thiophosphoryliert (+ 175). EntschiitIns(l,4,5)PS3 und L-chiro-Ins(1,4,6)PS3[3531
wurden beschrieben.
zen mit Natrium in fliissigem Ammoniak lieferte Ins(1,3,4,5)P43-S 176[3551,
einen wirksamen Inhibitor der Ins(1,3,4.5)P4-3Ein anderer Weg zur Herstellung von Phosphorothioat-Analoga von Ins( 1,4,5)P3wurde mit der Thiophosphorylierung von
P h ~ s p h a t a s e I ~ ~Die
~ ] . Synthese von enantiomerenreinem
D-hS(1,3,4,5)P4-3s aus L-Quebrachit wurde ebenfalls beschriePtdIns und PtdIns(4)P durch Kinasen in menschlichen Erythrocytengeisterzellen und ATPyS b e ~ c h r i t t e n ~Diese
~ ~ ~ Methode
].
ben13 'I.
,
do:
-
I
Angew. Cheni 199.5. 107, 2085-2125
2107
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
8.5. Phosphonat-Analoga
Ausgehend von dem Monoammmoniumsalz der Benzylphossynphonslure wurde Inosit-l,4,5-tris(hydrogenphosphonat)
thetisiert. So wurde durch Phosphonylierung von 70 rnit dem
Salz der aktivierten Slure und Debenzylierung des Produkts rnit
Base das racemische 1,4,5-Tris(hydrogenphosphonat)erhalten[3581.
Das 5-Methylenphosphonat-Analogon von Ins( 1 ,4,5)P3, 180,
wurde ebenfalls hergestellt (Abb. 33)[3591.
Verbindung 112, ein
9
=--
-
9
dBn
OH
182
181
_
.
)
(
B
r
-
0
PMB
OBn
)
$(OWz
-
OBn
183
184
\
/
CF3
F3C
Abb. 34. Herstellung des 5-Methylphosphonat-Analogons von Ins(1,4.5)P3 mit
dem Phosphonylierungsreagens 185 (van Boom et al.).
179
Abb. 33. Synthese des 5-Methylenphosphonat-Analogons von lns(1,4,5)P3 aus
Chinasiure (Falck et d).
nat-Analogous von ~ - I n s ( l ) P [und
~ ~ zu
~ ]der von DL-myo-Inoverwendet.
sit- 1-0-rnethylphosphonat-4.5-bi~phosphat~~~~~
Racemisches myo-Inosit-5-methylphosphonat,-4,5-bis(methylphosphonat) und -1,4,5-tris(methylphosphonat)wurden
mit P"'-Reagentien uber die entsprechenden Phosphinate synthetisiert L3
'I.
9
Zwischenprodukt in der Synthese von Ins(l,4,5)P3 aus (-)-Chinasaure (siehe Abb. 23), wurde dazu desilyliert, und die kinetisch kontrollierte Addition von Phenylselenylbromid an die
exocyclische Doppelbindung lieferten uberwiegend das antiMarkownikow-Addukt. Durch oxidative Ehminierung wurde
das Allylbromid 177 erhalten, das durch Michaelis-BeckerPhosphorylierung und Hydroborierung rnit oxidativer Aufarbeitung zu 178 uingesetzt wurde. Die 1 - und die 4-Hydroxygruppe wurde unter Bildung von 179 phosphoryliert, das zu 180
entschutzt wurde.
Gleichfalls synthetisiert wurden die 5-Methylphosphonatund die 5-(Difluormethyl)phosphonat-Analoga von Ins(? ,4,5)P3
(Abb. 34) und Ins(1,3,4,5)P4. Dazu wurde die neuen bifunktionellen Phosphonylierungsreagentien Bis[6-(trifluormethyl)benzotriazol-I -yl]methylphosphonat 185 bzw. Bis(l,2,4-triazoly1)difluormethylphosphonat verwendet["'- 3611.So wurde 181
regioselektiv zum 6-Benzylether als Hauptprodukt benzyliert
und die freie 5-Hydroxygruppe durch p-Methoxybenzylierung
geschiitzt. Spaltung des cis-Acetals lieferte 182, das benzyliert
und weiter zu 183 desallyliert wurde. Die 1- und die 4-OH-Gruppe wurden rnit 56 phosphoryliert und die p-Methoxybenzylgruppe unter sauren Bedingungen abgespalten (+ 184). Die
OH-Gruppe in 184 wurde rnit 185 und Benzylalkohol phosphonyliert, und die Hydrogenolyse von 186 lieferte das 5-Methylphosphonat-Analogon 187. Synthesen von racemischen
3-Methylphosphonat-Analoga von Ins(3,4)P2 und Ins(1 ,3,4)P3
wurden ebenfalls bes~hrieben[~~'I.
Das Phosphonylierungsreagens 185 wurde auch zur Herstellung des Methylphospho2108
8.6. ,,Maskierte" Analoga
Die photochemisch induzierte Freisetzung von aktiven, physiologisch interessanten Verbindungen wie ATP, GTP und sekundaren Botenstoffen sowie sogar von Ionen aus einer inaktiven Vorstufe ist fur zellphysiologische Untersuchungen au0erordentlich interessant, besonders in kinetischer Hinsicht, da die
Aufnahme von Agentien ins Gewebe haufig durch langsame
Diffusion begrenzt wird. Inaktive Vorstufen, die bei Bestrahlung z. B. einen freien sekundaren Botenstoff geben, werden als
,,maskierte" Verbindungen[367,3681 bezeichnet. Mit ihnen sind
zeitabhangige Messungen moglich. Durch Veresterung der
drei Phosphatmonoestergruppen in Ins(1 ,4,5)P3 mit l(2-Nitrop h e n y l ) d i a ~ o e t h a n [wurde
~ ~ ~ ~ das maskierte Inosit-l,4,5-trisp h o ~ p h a t [ ~als
' ~ ]Mischung aus ein- und mehrfach maskierten
Verbindungen erhalten. Die einfach maskierten Verbindungen
wurde durch HPLC in die P-I-, P-4- und P-5-Isomeren 188,189
und 190 (Abb. 35) getrennt. Aus allen drei Verbindungen lie8
sich durch Bestrahlung Ins(1 ,4,5)P3 freisetzen. Anders als 188,
das Ca2+ effizient freisetzt und ein 5-Phosphatase-Substrat
ist, sind 189 und 190 inaktiv hinsichtlich einer Ca2+-Freisetzung und 5-Phosphatase-resistent. 190 ist dariiber hinaus ein
3-Kinase-Inhibitor. Mit den Analoga 189 und 190 wurde die
Rolle von Ins(l,4,5)P3 in der Kopplung von Anregung und Kontraktion in Muskeln unter~ucht[~".3721. Die Ergebnisse deuten
auf eine essentielle Rolle dieser Verbindung in der phdrmakoAIZJSPW.
Clwm. 1995, 107. 2085-2125
Inositlipide
AUFSgTZE
Abb. 35. Regioisomere des maskierten Ins(1,4,5)P, (Trenthdm et al.)
mechanischen Kopplung in glatter, nicht aber gestreifter Muskulatur. Studien mit Stoma-Wachterzellen haben ergeben, daU
K+-Kanale nach Photolyse von maskiertem Ins(1,4,5)P3 190
reversibel inaktiviert werden[3731.
( k)-(lR,3R,4R)-trans-N-(2-Aminoethyl)-3,4-bis@hosphonyl0xy)cyclohexan-I -carboxamid wurde zur Herstellung einer Affinitatsmatrix und eines Photoaffinitatsmarkers v e r ~ e n d e t [ ~ ~ ' ] ,
ein Beweis der Niitzlichkeit solcher Derivate steht allerdings
noch aus. 6-0-Substitutierte ~-Ins(1,4,5)P,-Analoga wurden
hingegen rnit Erfolg zur Bildung und Reinigung von Antikorpern gegen Ins(1 ,4,5)P3
eingesetzt, indem auf Ins(1 ,4,5)P3basierende Tmmunogene sowie eine Affinitatsmatrix hergestellt wurden c3 '1.
Reaktive, an der I-Phosphatgruppe w-Aminoalkyl-substituierte Ins(1 ,4,5)P3[3821,
Ins(1 ,3,4,5)P4[3831
und InsP6[3841
wurden zur Herstellung von Affinitatsmatrizen fur die Reinigung
von Bindung~proteinen[~~',
3851 sowie [1251]-markierten Photoaffinitats-Analoga verwendet" 7 5 , 3 8 6 , 3871. So wurde mit
['251](Azidosalicyl)aminopropyl-Ins(l ,4,5)P3 194 (Abb. 37) das
8.7. Photoaffnitats-Analoga und Aftinitatsmatrizen
X
OH
Photoaffinitats-Analoga von Ins(1 ,4,5)P3 sind begehrte Verbindungen fur Lokalisierungstudien und zur Reinigung von
Ins( 1,4,5)P3-Rezeptoren. Zunachst wurde ein Arylazidderivat
von Ins(1,4,5)P3 h e r g e ~ t e l l t [ ~Dazu
~ ~ I : wurde Ins(l,4,5)P3 mit
N,N'-Carbonyldiimidazol an p-Azidobenzoesaure gebunden,
wobei allerdings die Ankniipfungsstelle der p-Azidobenzoesauregruppe nicht bestimmt und Hydroxygruppen-Substitution angenommen wurde. Mit der so erhaltenen Mischung aus den
Arylaziden konnte eine irreversible Inhibierung der Ins(l,4,5)PJnduzierten Ca2 -Freisetzung in Saponin-permeabilisierten,
lichtbestrahlten Makrophagen festgestellt werden, die in Gegenwart eines grol3en Ins(l,4,5)P3-Uberschusses verhindert wurde.
Es wurde gezeigt, da13 dieser Photoaffinitatsmarker drei Proteine in den Makrophagen markiert[375].
Die Acylierung der 2-OH-Gruppe von Ins(1 ,4,5)P3 lieferte
A n a l ~ g a ~rnit
~ ~denen
~ ] , Affinitatsmatrizen durch Immobilisierung der Derivate auf Sepharose prlpariert ~ u r d e n [ ~Aus
~~].
2-O-p-Aminobenzoyl-Ins(l ,4,5)P3 wurde die Photoaffinitatssonde 191 synthetisiert, die einen Biotinrest als nichtradioaktive
Markierung trlgt (Abb. 36). Diese Verbindung wurde erfolgreich zur Markierung der Ins(1 ,4,5)P3-5-Phosphatase in Erythrocytengeisterzellen eingesetzt["']. Vor kurzem wurde iiber
die Herstellung von Affinitatssaulen rnit 2-substitutierten
Ins(1,3,4,5)P4- und Ins(l,3,4,5,6)P5-Analogaund iiber deren
Anwendung zur Isolierung von Ins(1 ,3,4,5)P4-bindenden Proteinen b e r i ~ h t e t ' ~ ~ ~ ] .
+
Abb. 36. An C-2 biotinyliertes Ins(1,4,5)P3(Ozaki eta].)
Angew. Chem. 1995, 107. 2085-2125
192:X-H
193:X-l
194: X = '25l
OH
195:Y = H
196: Y = 3H
Abb. 37. Photoaffinitatsrnarker
1ns(1,4,5)P3(Prestwich et a].).
durch
Modifikation
der
I-Position
von
bedeutendste Ins( 1,4,5)P,-Bindungsprotein in olfaktorischen
Cilien identifi~iert'~'~].
Mit dem neuen Photoaffinitatsmarker
[3H](Benzoyldihydrocinnamyl)aminopropyl-Ins(l,4,5)P, 196,
der wesentlich besser als 194 in den Kleinhirnrezeptor von Ratten inkorporiert wird, gelang es, ein Peptid zu reinigen und zu
sequenzieren, das spezifischen Sequenzen der N-terminalen Region des Ins(l,4,5)P3-Rezeptors entspricht" 751,die wahrscheinlich die Ins(1 ,4,5)P3-Erkennungsstelleenthalt. Ein auf diese
Weise isolierter InsP,-Rezeptor wurde spater als das ClathrinAssembly-Protein AP-2 i d e n t i f i ~ i e r t [ ~Synthesen
~~].
von reaktiven Ins(1 ,3,4)P3- und Ins(2,4,5)P3-Verbindungen sowie deren
Verwendung zur Herstellung von Bioaffinitatsmatrizen sind
ebenfalls beschrieben ~ o r d e n ~ ~ ~ ~ ] .
Reaktives D-InS(1,3,4,5)P,[235'2361 wurde in einer biomimetischen Synthese uber die Ferrier-Umlagerung einer geeignet geschiitzten D-Glucose hergestellt (Abb. 38). Dabei wurde die
primare Hydroxygruppe in 46 trityliert, die sekunddren Hydroxygruppen wurden p-methoxybenzyliert und die Tritylgruppe unter Bildung von 197 entfernt. Swern-Oxidation und Umsetzung des erhaltenen Aldehyds rnit Essigsaureanhydrid und
Base lieferten das (Z)-Enolacetat 198, das in einer Ferrier-Umlagerung zur Inosose 199 umgesetzt wurde. Die Keto-Carbonylgruppe wurde mit Natriumtriacetoxyborhydrid unter Bildung
des Inosits 200 stereoselektivreduziert. Die 6- und die 2-Hydroxy2109
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE8.9. Verschiedenes
Mehrere C-1 -modifizierte Ins( 1,4,5)P3-Analoga wurden durch
chemische Modifikation des desacylierten Lipids 1-(sn-Glycero-3phospho)-~-w2yo-inosit-4,5-bisphosphat
erhaltenr393].Synthesen
von racemischen Sulfonamid-, Sulfat- und CarboxymethylAnalogs["', 3941,des enantiomerenreinen Hexadesoxy-l,4,5tris(methy1ensulfonsaure)-Analogonsvon Ins( 1,4,S)P3[3951 sowie des 3-Methylencarboxylat-Analogons von Ins(l ,3,4,5)P413961
wurden ebenfalls beschrieben.
OH
PMBO I
PMRn
OBOM
I
9. Inosit-Monophosphatase-Inhibitoren
200
201
202: R = PMB
203:R = P(O)(OBn),
*-
Bemiihungen in Richtung auf die Synthese von Inosit-Monophosphatase-Inhibitoren durch Forscher bei Merck, Sharpe and
~ ~ h ~ ~ [397-4041
3 2 3 ,h aben ermutigende Resultate geliefert. Einige aktive Verbindungen sind hergestellt worden. die allerdings
anders als Lithium aufkompetitive Art wechselwirken (Abb. 39).
b"OH
w""
W""
& OH
F
-
w""
OH
OH
205
Abb. 3X. Biominietische Synthesc emer Voratufe eines Ins( 1,3,4,5)P,-AffinitBrsmarkers (Estevei und Prestwich).
gruppe wurden dann schrittweise als Benzyloxymethylether geschutzt, um eine Acetylwanderung ZLI verhindern. Das Produkt
der anschIieUenden basischen Methanolyse, 201, wurde mit
Benzyloxy j[3-(~-carbobenzy~oxyamino)propy~]oxy)
(diisopropy1amino)phosphaiiiTetrazol zum Phosphat kondensiert, das
zu 202 oxidiert wurde. Durch Spaltung der PMB-Ether und
Phosphorylierung wurde 203 erhalten, das zum an der I-Phosphatgruppe substituierten reaktiven D-Ins(l ,3,4,5)P4 204 hydrogenolysiert wurde. Aus 204 wurde ein '251-markierter, zu 192
analoger Affnititsmarker hergestellt.
206
Cy) = 50pM
207
Cy) = 3pM
C a = 0.07pM
@
C
CI
208
ICy) = 6.3pM
209
Cm = 0.61 PM
210
Icy) = 0.08pM
8.8. Lipophile Analoga
DaB zellpermeable Inositphosphat-Analogs fiir viele Anwendungen wichtig werden wiirden, war offensichtlich. Deshalb
wurde die Synthese von racemischem 2,3,6-Tributyryl-Ins(1,4,5)P3durch Phosphorylierung von 1,2,4-Tri-O-butyryl-n?~.oinosit mit Dianilidophosphorochloridat und Entfernung der
Phosphatschutzgruppen a n g e g a n g e ~ ~ ~ Die
~ ~ ' ]Brauchbarkeit
.
dieses Tributyrylinosits mu15 sich allerdings erst noch erweisen.
Die Maskierung der negativen Ladungen von anionischen
Biomolekiilen ist eine andere Strategie und wurde schon erfolgreich in der Synthese eines lipophilen CAMP-Analogons angewendet["". I n diesem Fall wurden die Phosphatgruppen mit
Acetoxymethylbr-omid verestert. Die Acetoxymethylester werden in der Zelle schnell uriter Freisetzung des sekundaren Botenstoffs gespalten. Uber die Synthese von membrandurchgangigen Ins(1.4,5)P3- und Ins(l,3,4,5)P4-Analoga wurde berichtet'3"'l,
21 I U
Abb. 39. Inhibitoren der Inosit-Monophosphatnse.
Die beiden x-Hydroxygruppen in der 2- und der 6-Position spielen bei der Hydrolyse von Ins( l ) P durch Inosit-Monophosphatase sehr unterschiedliche Rollen: Wlhrend die 2-Hydroxygruppe wichtig fur die Substraterkennung durch das Enzym ist 2-Desoxy-lns(l)P ist nur ein schwaches Substrat -, ist die 6-Hydroxygruppe an der Phosphathydrolyse beteiligt (demzufolge
haben 6-Desoxyverbindungen wie 205 inhibierende Eigenschaften). Der erste Ansatz zur Herstellung von Inhibitoren basierte
auf diesem Befund, und in einer HydroxygruppeneliminierungsStrategie wurde ~-3,5,6-Tridesoxy-Ins(
l ) P 206 synihesiert und
als wirksamer Inhibitor identif~ziert'~~'],
was darauf hindeutet,
Inositlipide
AUFSATZE
daB die 3- und die 5-Hydroxygruppe fur eine Erkennung durch
das Enzym nicht notig sind.
Inosit-Monophosphatase ist sehr unspezifisch, und das Enzym kann auner Inositmonophosphaten auch 2'-Nucleotide wie
Adenosin-2'-monophosphat (2'-AMP)[741hydrolysieren. Durch
Uberlagerung der Molekiilstrukturen von 2'-AMP und ~ - 3 , 5 , 6 Tridesoxy-Ins(1)P 206 kam man zu dern SchluB, daB Substituenten in der 6-Position (der Purin-Heterocyclus in 2'-AMP)
vom Enzym toleriert werden wiirden. Dies fiihrte zur Synthese
von 6-substituierten 3,5-Didesoxy-Ins(l)P-Derivatenwie 207,
dem bis heute wirksamsten bekannten Monophosphatase-Inhibit~r[~"~.
Phosphatester sind allerdings biologisch labil und haben wegen der Hydrolyse durch unspezifische Phosphatasen haufig
kurze Halbwertszeiten. Es wurde deshalb versucht, die Stabilitat
der Inhibitoren durch Ersetzen des Phosphatesters rnit einer
isosteren, aber stabilen Monophosphonatgruppe zu erhohen.
Da myo-Inosit-1-methylenphosphonatnicht inhibierend wirkt,
wurde in der Suche nach Inhibitoren von Hydroxymethylenphosphonat ausgegangen, das ein schwacher Inhibitor ist. Unter mehreren Analoga war der Adamantylester 208 der wirksamste Inhibitor rnit Ki= 6.3 WM. Weitere Studien mit Hydroxymethylenbispho~phons~uren[~"~~
4041
ergaben, daB auch
Verbindungen wie das Tetralin 209, die sich nicht vom natiirlichen Substrat des Enzyms ableiten, sehr wirksame Monophosphatase-lnhibitoren sein konnen. Die 3-(3,4-Dichlorbenzamid0)benzylverbindung 210 ist der wirksamste, nichthydrolysierbare inhibitor der Inosit-Monophosphatase, der bisher beschrieben w ~ r d e [ ~Der
~ ~Befund,
].
daB das wirksame Bisphosphonat 21 1 1403] nur schlecht resorbiert wurde, fuhrte zur
Entwicklung des weniger polaren Prodrugs 212[4041.Die Forscher von Merck, Sharpe and Dohme haben ihre Synthese-Anstrengungen nun auf Derivate und Analoga von Adenosin-2monophosphat a u s g e ~ e i t e t [ ~und
~ ~ ~Molecular-modeling-,
,
kinetische und Mutagenese-Unter~uchungen[~~~~
sollen zur weiteren Aufklarung des Enzymmechanismus beitragen. Es sollte
hier auch auf einen Bericht uber die nichtkompetitive Hemmung
von Inosit-Monophosphatase durch den Pilzmetaboliten K-76Monocarbonsiure 213[4071hingewiesen werden.
4033
10. Struktur-Aktivitats-Untersuchungen
rnit Ins(l,4,5)P3-Analoga
In diesem Abschnitt werden die Konsequenzen von Strukturmodifikationen von Ins(1 ,4,5)P3 im Hinblick auf die drei Bindungsproteine. d. h. den Ins(1,4,5)P3-Rezeptor und die beiden
metabolischen Enzyme 5-Phosphatase und 3-Kinase, besprochen.
10.1. Strukturvoraussetzungen fur die Freisetzung von Ca2
+
Die Ins( 1,4,5)P3-Analogd mussen zur Auslosung der Ca2' Freisetzung durch den Ins( 3 ,4,5)P3-Rezeptor betrachtlichen stereo- und regiospezifischen Anforderungen geniigen. Von den
drei bedeutendsten Bindungsproteinen scheint die Ins(1 ,4,5)P33-Kinase das spezifischste in der Erkennung von Ins(1 ,4,5)P3 zu
sein, wahrend die ins(l,4,5)P3-5-Phosphatasewesentlich weniAngen. Chem. 1995. 107. 2085 2125
ger spezifisch ist. Die Spezifitat des Ins(1 ,4,5)P3-Rezeptors liegt
offensichtlich zwischen diesen beiden Extremen. Die Stereospezifitit des Rezeptors wird durch die Tatsache belegt, daR
~-lns(l,4,5)P,[= ~-Ins(3,5,6)P,]nicht in der Lage ist, Ca2+ zu
m ~ b i l i s i e r e n [ ' ~4081.
' ~ Die Rezeptorbindung dieses synthetischen Enantiomers ist ca. 2000mal schwacher als die von naturlichem D-Ins(l ,4,5)P3[328940y1. Die Enantiomere von 2-Desoxy2,2-difluor-Ins( 1,4,5)P3 weisen gleichfalls sehr unterschiedliche
Agonisteneigenschaften auf[33 3 3 2 1 . ~-2,2-F,-Ins(l,4,5)q, ist ein
voller Agonist und nur etwas weniger wirksam als Ins( 1.4,5)P3,
wihrend das L-Isomer ein sehr schlechter Agonist ist.
Ins(1: 2,4,5)P3, Ins(4,5)P2 und GroPtdIns(4,5)P2 waren um
den Faktor 13-15['0's 4101,650L4"] bzw. 3-10['0y, 3931 schwacher als Ins(1 ,4,5)P3; die meisten anderen natiirlich vorkommenden Inositphosphate einschlieRlich Ins(l)P, Ins( 1 :2)P,
4121
Ins(1,4)P2[' 'I, Ins( 1,3,4)P3[' 31, 3 2 8 1, In~(1,3,4,5,6)P,['~~.
und InsP, (Phytinsaure)[13'1 sind als Agonisten am Ins( 1,4,5)P3Rezeptor unwirksam. Zwar ist die genaue Rolle von
Ins( 1,3,4,5)P4 noch umstritten, doch wurde nachgewiesen, daB
~ ~ ~ zwar wahrscheinlich iiber den
es Ca2+ r n ~ b i l i s i e r t [ ' und
Ins(l,4,5)P3-Rezeptor[4131.
Ins(1,4,6)P3 ist iiberraschenderweise
ein voller Agonist des Ins( 1,4,5)P,-Re~eptors[~'~*
4141. Auf eindeutigem Wege hergestelltes D-IllS(1,3,6)P3 [ = L-Ins(1 .3,4)P3],
das in Limulus-Photorezeptoren Ca2+mobilisierend wirktI3I4],
und andere B e f ~ n d e [ ~ halfen
'~I
schlieBlich, eine lange herrschende Unklarheit zu beseitigen.
Mit einigen halbsynthetischen, I-substitutierten Ins(1 .4,5)P3A n a l ~ g a ~die
~ Ca2
~~'
] ,freisetzen, wurde nachgewiesen. daR sterisch anspruchsvolle Gruppen an C-1 die Aktivitit nicht wesentlich vermindern. Ahnliche Ergebnisse wurden mit diesen
Verbindungen als Inhibitoren von Aldolase A erhalten, einem
Enzym, das Inositpolyphosphate wirksam und isomerenselektiv
bindet[4151.Mit dem l-O-(3-Aminopropyl)ester von Ins( I ,4,5)P3
und mit einem davon abgeleiteten Photoaffinitats-Analogon[3R21
konnte ebenfalls die Freisetzung von Ca2 hervorgerufen werden, wobei beide Verbindungen etwa um den Faktor 8 schwicher waren als Ins(1 ,4,5)P3. Auch die Rezeptorbindung dieser
Ester war gut, und rnit dem Photoaffinitatsderivat wurden
Ins( 1,4,5)P3-Bindungsstellen erfolgreich markiert" "I.
Das
1-Phosphorothioat-Analogon von Ins( 1,4,5)P3 wie auch fluoreszenzmarkiertes Ins(1 ,4,5)P3-1-S sind ebenfalls K irksame
Ca2+-mobilisierende A g ~ n i s t e n [ ~ ~ ~ ] .
Wie in der 1-Position werden auch in der axialen 2-Position
grol3e Substituenten toleriert, ohne daB die Fahigkeit der Analogs, als volle Agonisten a m Ins(l,4,5)P3-Rezeptor zu agieren,
beeintrichtigt ~ i r d [ ~ 'Die
~ ] .Desoxygenierung fuhrt 7u einem
nur geringen A k t i v i t i t s ~ e r l u s t [ ~ und
' ~ ~ , die Inversion am hydroxysubstituierten C-Atom [ s c ~ ~ / ~ ~ - I n s ( l , 2r3331]
, 4 ) P 3liefert einen hochwirksamen A g ~ n i s t e n [ ~ '~~~] .- 2 - F - I n s,4,5)P3[3331
(l
ist
hinsichtlich der Mobilisierung von gespeichertem Ca2 ebenso
wirksam wie Ins(1,4,5)P3. Der Vergleich rnit 2-F-scylloIns(1 ,4,5)P3 und 2,2-F2-Ins(1 ,4,5)P3 (die ebenfalls volle AgonidaB sich die
sten am Ins(l,4,5)P3-Rezeptor ~ i n d ) [ ~4171
~ O zeigt,
,
groBere Ahnlichkeit der Strukturen von 2-F-Ins(l ,4,5)P3 und
Ins(1 ,4,5)P3 in der biologischen Aktivitiit widerspiegelt. Die
Vermutung, daD die 2-Hydroxygruppe von Ins(1 ,4,5)P3 eher als
Wasserstoffbruckenbindungsacceptor denn als -donor mit dem
Rezeptor w e c h ~ e l w i r k t [4171,
~ ~ ~wird
.
dadurch gestutzt, dal3 das
Fluoratom in 2-F-Ins( 1,4,5)P3 zwar keine Wasserstoffbriicken-
',
+
2111
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
bindung mehr bilden kann, das Analogon aber immer noch so
wirksam 1st wie Ins( 1,4,5)P3. DL-InS(l ,2,4,5)P4 wurde pharmakologisch untersucht und ist das wirksamste bisher beschriebene
Inosittetrakisphosphat[2561.
~-3-Desoxy-Ins(l,4,5)P3[3251, ~-3-F-Ins(1 ,4,5)P3[3341 und
~-3-C-(Trifluormethyl)-Ins(l
,4,5)P3[3221mobilisieren Ca2 als
volle Agonisten. Diese Verbindungen sind ahnlich wirksam wie
Ins( 1,4,5)P3. Analoga mit zunehmend sterisch anspruchsvollen Substituenten an C-3 (C1, Br und MeO) weisen eine abnehmende Aktivitat in Hinblick auf Rezeptorbindung und
Ca2+-Freisetzung aufr200.3 3 8 1 . ~-chiro-Ins(2,3,5)P,[~~~.
3361,
ein Ins(l.4,5)P3-Analogon mit einer axialen statt einer aquatorialen 3-Hydroxygruppe, ist ein wirksamer Agonist zur Mobilisierung von gespeichertem CaZt mit einem im Vergleich zu
Ins(1,4.5)P3 nur etwa 5- bis 1Ofach hoherem EC,,-Wert["'.
4171.
Die pharmakologischen Eigenschaften von ~ ~ - 6 - F - c h i r o I n ~ ( 2 , 3 , 5 ) P , [ ~wurden
~']
noch nicht bestimmt. Ins(1,3,4,5)P4,
das durch 3-Kinase aus Ins(l,4,5)P3 entsteht, hemmt die Bindung von [3H]Ins(l,4,5)P3 an Membranen im Kleinhirn. Die
Rezeptoraffinitlt dieses Tetrakisphosphates ist jedoch etwa um
den Faktor 60 niedriger als die von T n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [ ~Ahnlich
~~].
verringert ist die Ca2+-mobilisierende W i r k ~ n g ' ~Daruber
~~].
hinaus wird auch eine axiale Phosphatgruppe an C-3 nicht toleriert[3221.Diese Resultate zeigen, daD die 3-Hydroxygruppe
uberraschenderweise eine relativ unbedeutende Rolle in der Rezeptorbindung und der Ca2+-Freisetzungspielt. Erhohte sterische Anforderungen von Substituenten (wie einer zusitzlichen
Phosphatgruppe) in dieser Position verringern die Rezeptorbindungseigenschaften allerdings erheblich. Es wurde daher vorgeschlagen, daI3 die Phosphorylierung zu Ins(1 ,3,4,5)P4 der
Hauptmechanismus zur Regulation der Ins( I ,4,5)P3-Rezeptorbindung seir4'71. Wie eine vor kurzem veroffentlichte Studie
uber ~-3-Amino-3-desoxy-Ins(1,4,5)P~
ergab, ist diese Verbindung offensichtlich ein pH-abhangiger partieller Agonist["'].
Seit den fruhen Arbeiten von Berridge und I r ~ i n e [hielt
~~~]
man das 4,5-Bisphosphatmotiv als entscheidend fur die Ca2+ mobilisierende Aktivitat. Die Phosphatgruppe an C-4 scheint
fur die Erkennung durch den Ins(1 ,4,5)P3-Rezeptor wesentlich
zu sein: Alle Inositphosphate, denen diese Einheit fehlt, sind
inaktiv (fur Ausnahmen von diesem Verhalten siehe Jastorff
et al.[4201).Ins(1 ,4.5)P,-4,5-S2 ist ein wirksamer Ca2+-mobilisierender Agonist, was nahelegt, daI3 zumindest der Phosphorothioatsubstituent an C-4 toleriert ~ i r d ' ~ ~Selektiv
'].
an C-4 modifizierte Ins( 1,4,5)P,-Analogd sind allerdings bisher nicht
untersucht worden; hier bietet sich ein Feld fur zukiinftige Synthese-Aktivitaten.
Ins(I ,4,5)P3-5-S[24132421 wird rnit hoher Affnitat vom
Ins(1 ,4,5)P3-Rezeptor gebunden. Es ist ein voller Agonist zur
Mobilisierung von gespeichertem C a 2 + und dabei nur etwa um
den Faktor 7 weniger wirksam als Ins(1,4,5)P3. Wie das Trisphosphorothioat Ins(l,4,5)PS3wird Ins(1 ,4,5)P3-5-S nicht durch
5-Phosphatase dephosphoryliert und kann daher eine anhaltende FI-eisetzung von Ca2+ bewirken. Erste Studien rnit dem
5-Methylenphosphonat-Analogon 180 ergaben, dafi diese Verbindung wie andere nichthydrolysierbare Ins(1 ,4,5)P3-Analoga
aus Rindernebennierendrusen-Mikrosomen anhaltend Ca2'
f r e i ~ e t z t ~ " ~Das
] . 5-Methylphosphonat 187 ist ein pH-abhangiger Antagonist bei der Ins(1 ,4,5)P3-stimulierten Ca2+-Freisetzung und ein kompetitiver Inhibitor bei der Bindung von
+
2112
[3H]Ins(1,4,5)P3 an Mikrosomen aus Rindernebennierenrinden[360,3 6 'I. Die vollstandige Beschreibung der biologischen
Eigenschaften dieser Verbindung und des 5-Difluormethylphosphonat-Analogons, das auch ein schwacher Antagonist sein
~ o l l t e 3[6 1~1 , werden
~ ~ ~ rnit Interesse erwartet, da dies die ersten
niedermolekularen Antagonisten des Ins(l,4,5)P3-Rezeptors
waren. Durch eine Bestatigung dieser Ergebnisse wLre dann
eindeutig nachgewiesen, dalj die Phosphatgruppe an C-5 fur die
Aktivitat von Tns(1 ,4,5)P3 entscheidend ist.
~-6-Desoxy-Ins(1,4,5)P31st ein voller Agonist zur Freisetzung
von Ca2 in permeabilisierten menschlichen SH-SY5Y-Neuroblasten und etwa um den Faktor 70 weniger wirksam als
Ins(1,4,5)P3[2311.Andere an C-6 modifizierte Ins(l,4,5)P3-Analoga einschlieI3lich der Fluor-, Methyl- und Methoxyverbindungen wurden synthetisiert[2@1%
3 0 2 , 3 2 7 , 4211. Die biologischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind allerdings mit Ausnahme
von ~~-6-O-Methyl-Ins(l
,4,5)P3 noch nicht beschrieben worden. Diese Verbindung mobilisiert C a 2 + mit einem EC,,-Wert,
der mehr als 200fach hoher war als der von I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [ ' ~ ~ ~ ;
ahnliche Ergebnisse wurden fur andere 6-0-substituierte Analoga e r h a l t e r ~ [ ~ ~DL-InS(1,4,5,6)P4
l].
aktiviert die Ca2+-Freisetzung nicht und beeinflufit bei Konzentrdtionen von bis zu 10 PM
auch nicht die Ins(l,4,5)P3-vermittelteCa2+-Freiset~ung['"~.
Die 6-OH-Gruppe spielt also eindeutig eine wichtige Rolle bei
der Rezeptorbindung oder bei der Stabilisierung der Konformation der 5-Phosphatgruppe durch Wasserstoffbriickenbindungen. Die Substitution dieser Hydroxygruppe sowohl durch geladene als auch durch ungeladene Gruppen hebt die Aktivitat
vollstandig auf. Untersuchungen zur Wirksamkeit von 6-FIns(l,4,5)P3 stehen noch aus.
Die
nichtnaturlichen
Inositphosphate
I~S(~)P[~~~I
Ins(2,4)P2, I n ~ ( 1 , 2 , 6 ) P , [ ~ I~n~~] (, 1 , 3 , 5 ) P , [ ~und
~ ~ ]3-DesoxyI n ~ ( 1 , 5 , 6 ) P , [sind
~ ~ ~wie
~ Inosit nicht in der Lage, Ca2+ freizusetzen. Cyclisches Ins(1: 2,4,5)P3 wurde zunachst als ebenso
wirksam wie Ins(1 ,4,5)P3 b e ~ c h r i e b e n [ ' 4241,
~ ~ , und es gab Spekulationen, daD dieses cyclische Inositphosphat ein sekundarer
Botenstoff sein k o r ~ n t e [ ~ ~
Weitergehende
~].
Untersuchungen['''] ergaben allerdings, daI3 cyclisches Tns(1 :2,4,5)P3 nur ein
schwacher Agonist und um mehr als eine Grofienordnung weniger wirksam ist als Ins(1 ,4,5)P3. Ins(2,4,5)P3 bewirkt die Ca2'Freisetzung und ist etwa um den Faktor 12-68 weniger wirkals 1~~(1,4,5)p,[109.
3 2 8 , 410, 411, 4251. F"
ur D-InS(2,4,5)P3
+
und D-chiro-Ins(1 ,3,4)P3, einem Ins(2,4,5)P3-Analogon mit elner axialen l-Hydroxygruppe, wurden iihnlich groDe EC,,-Werte b e ~ t i m m t [4251,
~ ~ ~die
> etwa 30mal groI3er sind als der fur
Ins(1 ,4,5)P3. Der Unterschied zwischen den beiden Verbindungen, die Konfiguration an C-I, scheint daher in bezug auf die
Ca2+-mobilisierende Aktivitat unbedeutend zu sein. Die L-Enantiomere der beiden Verbindungen sind deutlich weniger aktiv
als die D-Isomere und etwa um den Faktor 800-960 weni' ~ ~ D-3-Azido-3-desoxyger wirksam als I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [ ~4251.
Ins(2,4,5)P3 ist bei der Ca2+-Freisetzung betrachtlich weniger
wirksam als I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [und
~ ~ ~wird
~ mit einer etwa um den
Faktor 2000 verminderten Affnitat an den Rezeptor gebunden.
Diese Verbindung mobilisiert in einer Konzentration von
100 PM 21 % des gespeicherten C a 2 + , wlhrend Ins(l,4,5)P3
bei 10 PM 53 YO freisetzt. Die Bindungsaffinitat von ~ - 2 , 3 Didesoxy-Ins( 1,4,5)P3 gegeniiber RindernebennierenrindenRezeptoren ist nur um den Faktor 6 niedriger als die von
Angm. Chem. 1995, 107.2085-2125
Inositlipide
Ins(1 ,4,5)P3 und seine Wirksamkeit beziiglich der
Ca2+-Freisetzungnur urn den Faktor 3.5. Wird dariiber hinaus allerdings die 6-Hydroxygruppe entfernt,
fuhrt dies zu einer Verringerung der Bindungsaffinitat
um den Faktor 100. ~-2,3,6-Tridesoxy-Ins(l,4,5)P,
ist
ebenfalls ein schlechter Rezeptoragonist : Der zugehorige EC,,-Wert ist mehr als 200mal hoher als der von
Ins(l,4,5)P3[3261.
Dies bestatigt Ergebnisse einer fruheren Untersuchung, in der gezeigt worden war, daD das
Tridesoxy-Analogon, allerdings in racemischer Form,
aus permeabilisierten Zellen der glatten Muskulatur
CaZf rnit einem EC,,-Wert freisetzt, der ca. 130mal
hoher ist als der mit I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [ ~ ~ ~ ~ .
AUFSATZE
~ths(l.4.5)f~kOmeneine
anhabnde ~ ~ r ~ ~ & ~ ~ @ n d , j e d o c h
b e l r W t i k h w e ~ rwlrksam ekrd ak
CaWun-Frek~
bewilken
hs(1.4.5)fQ
. -
Benzol-I ,2,4-trisphosphat blockiert die Bindung
Abb , 40. Struktur-Aktivitats-Beziehungenfur den Ins(1,4,5)P3-Reaeptor.
von Ins(1,4,5)P3 an Mikrosomen der Nebennierenrinde kompetitiv rnit einem IC,,-Wert von 34 PM. Die
10.2. Strukturerkennungs-Untersuchungen
Affinitiit fur den Rezeptor ist etwa um den Faktor 10000 niedriger als die von Ins(1,4,5)P3, und eine Ca'+-Freisetzung kann
mit Ins( 1,4,5)P3-3-Kinase
nicht ausgelost werdenC4,'1. Benzol-I ,2,4-tris(methylenphosphonat) sowie (1 R,2R,4R)-Cyclohexan-I,2,4-trismethylenDie Spezifitat der 3-Kinase ist in vielerlei Hinsicht groI3er
phosphat, -tris(methylenphosphonat), -tris(methylensulfonat)
wobei Ins(l,4,5)P3 und
als die des Ins(l,4,5)P3-Rezeptors[461,
und dessen (4s)-Isomer sind in Bindungs- und Ca2+-FreiIns(1 ,3,4,5)P4 die einzigen bekannten natiirlichen Inositsetzungsassays ebenfalls i n a k t i ~ [ ~ ' ~Racemische
].
Trissulfat-,
polyphosphate sind, die rnit hoher Affinitat erkannt werTrissulfonamid-, Triscarboxymethyl- und Trismethylphosphoden 13' sl.
nat-Analoga von I n ~ ( 1 , 4 , 5 ) P , [ ~
~ ~wie
, auch das 4,5-Dime3661
Die Entfernung der 1-Phosphatgruppe vermindert die Affinitat zur 3-Kinase erheblich, Ins(4,5)P2 und Ins(2,4,5)P3 sind sehr
thylenphosphonat-Analogon von I n ~ ( 4 , 5 ) P , [weisen
~ ~ ~ ~keine
biologische Aktivitat auf, Inosit-l-phosphat-4,5-pyrophos- schlechte Substrate fur das
4301, und cyclisches
phat[3491und das enantiomerenreine Hexadesoxy-l,4,5-tris(meIns(1: 2,4,5)P3 wird nicht p h ~ s p h o r y l i e r t [ ~Die
~ ~ ]I-Phosphat.
thylensu1fonsaure)-Analogon von Ins(1,4,5)P3[3951sind ebengruppe scheint daher fur die Substraterkennung wesentlich
falls inaktiv.
zu sein, was mit dem Befund ubereinstimmt, daD zwar
Ein Bericht von Schultz et al.'4201, daD cis,cis-CyclohexanI n ~ ( l , 4 , 5 ) P , - 5 - S '4321
~ ~ ~und
~ In~(l,4,5)P,-4,5-S,[~~~~
Substrate
1,3,5-trisphosphat und verwandte Analoga rnit einer 1,S-Bisder 3-Kinase sind, ein zusatzlicher Phosphorothioatsubstituent
phosphateinheit die Ca2+ -Freisetzung aus isolierten Neurospoan C-1 aber nicht toleriert wird: Ins(l,4,5)PS3 ist kein Substrat1434, 4351
ra-crassa-Vacuolen auslosen konnen, ist fragwiirdig, da gezeigt
wurde, daD Ins(1,3,5)P3 in Zellen aus der glatten Muskulatur
~~-2-Desoxy-Ins(l
,4,5)P3 inhibiert effektiv die Phosphorylieder Aorta von Rindern nicht als Agonist ~ i r k t ~Wenn
~ ~ diese
~ ] .
rung von [3H]Ins(1,4,5)P3 durch 3 - K i n a ~ e [ ~die
~ ~scheinbare
],
Inhibierungskonstante Ki entspricht der von Ins( 1,4,5)P3.
AnErgebnisse bestatigt werden sollten, wurde das bedeuten, daD
sich der Rezeptor aus Neurospora-crassa-Vacuolenvon Saugedere Analoga rnit sterisch anspruchsvollen Substituenten an C-2
tierrezeptoren unterscheidet. Dies ware bemerkenswert, da sich
werden ebenfalls gut vom Enzym erkannt. Es gibt allerdings
Ins(1 ,4,5)P3-Rezeptoren in unterschiedlichen Spezies nach biskeine Angaben daruber, ob diese Analoga als Substrate oder als
herigen Ergebnissen uberaus ahnlich sind. Moglichenveise ist
Inhibitoren wirken. Sowohl~~-2-F-scyllo-Ins(l
,4,5)P3 als auch
aber auch eine Verunreinigung der synthetischen Verbindung
1 ,4,5)P3 sind Substrate der 3 - K i n a ~ e ~ ~ ~Die
'I.
~~-2,2-F,-Ins(
rnit Ca2+ fur diesen Effekt verantwortlich.
Substrateigenschaften von D- und ~-2,2-F,-Ins(1,4,5)P3, die
Diese Ergebnisse legen nahe, daI3 die vicinale 4,5-Bisphosphatdurch Racematspaltung des gem-Difluorids erhalten wurden,
sind allerdings sehr unterschiedlich: Das D-Isomer ist ein Subeinheit fur die Rezeptorerkennung wesentlich ist und eine zustrat und das L-Isomer ein wirksamer Inhibitor dieses Ensatzliche Phosphatgruppe an C-1 die Ca2+-mobilisierende
Die Ursache fur die hemmende Aktivitat ist noch
Wirkung auDerordentlich steigert. Die Tatsache, daB auch
Ins(2,4,5)P3 ein voller und relativ wirksamer Agonist ist, kann
nicht geklart; ~-2,2-F,-Ins(l,4,5)P3 weist jedoch eine neuartige
moglicherweise mit einer Wechselwirkung zwischen der axialen
Leitstruktur fur die Entwicklung von weiteren effektiven Inhibi2-Phosphatgruppe und der Rezeptorstelle erklart werden, die
toren zur pharmakologischen Intervention im Polyphosphoinonormalerweise von der aquatorialen 1-Phosphatgruppe von
sitidweg auf und hat den Vorteil, daD es kein intrazellulares
Ins(1 ,4,5)P3 besetzt wird. Allerdings sind Analoga rnit raumfulCa2+ mobilisiert. 2-F-Ins(l ,4,5)P3 ist ebenfalls ein gutes Sublenden Substituenten an der 2-Hydroxy- und der 1-Phosphatstrat fur 3-Kinasel4l61 und ein wirksamer kompetitiver Inhibitor bei der Phosphorylierung von [3H]Ins(l,4,5)P3 durch diegruppe ebenfalls Agonisten, was darauf hindeutet, daB dieser
ses Enzym (scheinbare Inhibierungskonstante Ki = 3.0 p ~ ;
Bereich dem Losungsmittel zugewandt ist. Bleibt zu untersuchen, welche Gruppen in der 3-Position toleriert werden;
zum Vergleich: 2-F-scyflo-Ins(l,4,5)P3 : Ki = 8.8 PM, 2,2-F2doch ist diese Position wegen der geringen Aktivitat von
Ins(1,4,5)P3: Ki = 11.o p ~. )
Ins(1 ,3,4,5)P4 fur chemische Modifikationen wahrscheinlich
Wie von C-3-modifizierten Ins(1 ,4,5)P3-Analoga envartet
werden kann, sind sowohl ~-3-F-Ins(1,4,5)P,[~~~,
3341 als auch
nicht von groI3em Interesse (Abb. 40).
Angew. Chem. 1995, 107, 2085-2125
2113
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
~ - r h i r oIns(
- 2,3, 5)P3l35 *
UnukJtIg Mdie E h t m q j duch
An~rlIfspuddder Emyms: 3Desowy-hs(l,4.5)P3,
'I, ei n D - h ( 1,4,5)P, Analo3+-hP(l,4,5)P3 und L-ah/rPh6(2,3.5)P~
M i ~ . 2 D e c o ~ h S ( 1 , 4 , 5 ) Pund
3
gon mit invertierter Konfiguration an C-3, resistent
Mluor-Analogs rind olio Slbstrale.
sindwilksame Mibitoren
EirJoeAnaloga mit M g e n S&Witugegeniiber der Phosphorylierung durch die 3-Kinase und
~nzeigensogareimgrOBereAfflwirksame Inhibitoren dieses E t ~ z y m s [ ~Ins(
~ ~1 ,3,4,5)P4,
].
nitpt ab hS(l,4,5)P3
das Produkt der Ins(1 ,4,5)P3-Phosphorylierung durch
3-Kinase, ist ein schwacher Inhibitor (IC5,, = 90 p ~ ) .
Die l-Phosphab~nppescblcd
Mit Blick auf die IC,,-Daten ist es jedoch unwahrscheinwin: he(4,S)P~Ist ein schwaches
lich, daB sich geniigend Ins( 1,3,4,5)P4 anreichern kann,
h6(1.4.5)P3-5-5 wild phosphorylierl
s m t
um die Ins( 1,4,5)P,-Phosphorylierungsgeschwindigkeit
EnUeltemunp we In B-Desoxy-~l,4,5)P3
wild
signifikant zu beeintrlchtigen, was nahelegt, daB es
toleriert. speniga Subslnuentsntdeimn
keine Rolle in moglichen Ruckkopplungsmechanismen
Jedochdie Affinltatzu verrlqern
~ p i e l t [ ~Durch
~ ~ ] . die Phosphorylierung der 3-OH-GrupAbb 41 Struktur-Aktivicdts-Beziehuu~en
fur Ins(1.4,5)P,-3-Kinase
pe wird die Bindung an den Ins(1,4,5)P3-Rezeptor effektiv verhindert ; dies konnte ein Regulationsmechanismus
zur Modulation der Ins(1 ,4,5)P,-Bindung ~ e i n [ ~ ' ~So] . ist
10.3. Strukturerkennungs-Untersuchungen
Ins(1 ,3,4,5)P4-5-S ebenfalls ein kompetitiver Inhibitor der 3-Kirnit Ins( 1,4,5)P3-5-Phosphatase
nase~2531
Verbindungen mit selektiv modifizierter 4-Position sind bisIm Unterschied zum Ins( 1,4,5)P3-Rezeptor und der 3-Kinase
lang noch nicht pharmakologisch untersucht worden. Die A f f ist die Ins(l,4,5)P3-5-Phosphataserelativ unspezifisch. Doch
nitdt von Ins(1,4,5)P3-4,5-S2 fur 3-Kinase ist im Vergleich zu der
obwohl viele Analoga an die Phosphatase binden, sind nur
von Ins(l,4,5)P3-5-S etwa um den Faktor 10 n i e d r i g e ~ - [ ~was
~ ~ ] . wenige von ihnen Substrate des Enzyms.
Die 1-Phosphatgruppe ist wesentlich fur die Substraterkendarauf hindeutet, daR die 4Phosphatgruppe wichtig fur die
Substraterkennung ist.
nung durch 5-Phosphatase, d a Ins(4,5)P2 ein sehr schlechtes
Substrat ist[4331.Einige racemische, an der 2-Hydroxygruppe
Anders als Ins( 1,4,5)PS3 ist ~~-Ins(l,4,5)P,-5-S
ein Substrat
der 3 - K i n a ~ e [4321,
~ ~ ~aber
,
modifizierte Ins(l,4,5)P3-Analoga wurden auf ihre Flhigkeit
die Phosphorylierung dieser Verzur Wechselwirkung mit 5-Phosphatase B U S Erythrocytengeibindung verliiuft betrichtlich langsamer als die des natiirlichen Substrates. Das 5-Methylenphosphonat-Analogon von
sterzellen und aus Hirncytosol ~ n t e r s u c h t [ ~Die
~ ~Verbindun].
Ins(1 ,4.5)P3, das eine anhaltende Freisetzung von Ca2 ausgen sind kompetitive Inhibitoren des Enzyms und Substrate fur
die SPhosphatase, wobei die Hydrolyseeffizienz allerdings va3611, ist daher vermutlich kein Substrat der 3-Kinase;
riiert. 2-Desoxy-Ins(l,4,5)P, und die meisten der anderen an C-2
die vollstiindigen biologischen Eigenschaften dieser Verbindung
modifizierten Analoga weisen iiberraschenderweise eine grol3ere
miissen allerdings noch bestimmt werden. Wahrscheinlich werden in der 5-Position nur konservative Modifikationen toleriert.
Affinitat fur 5-Phosphatase auf als Ins( 1,4,5)P3. 2-F-scylloIns(1 ,4,5)P, wird vom Enzym erkannt, ist jedoch ein schwlche6-Desoxy-Ins(l,4,5)P3 ist eine der wenigen Verbindungen,
die von der hochselektiven 3-Kinase erkannt ~ e r d e n [ ' ~ l Die
].
res Substrat als Ins(1 ,4,5)P3[3301.Die 5-Phosphatase-SubstratKinetik ihres Metabolismus deutet darauf hin, daR sie ein
eigenschaften von D- und ~-2,2-F,-Ins(1,4,5)P, unterscheiden
Substrat fur dieses Enzyni ist, und die Phosphorylierung
sich deutlich. Wahrend ~-2,2-F,-Ins(l.4,5)P3 ein gutes Substrat
ist, inhibiert das L-Enantiomer das Enzym sehr ~ i r k s a m [ ~ ~ ~ ] .
von Ins( 1,4,5)P3 wird durch 6-Desoxy-Ins( 1 ,4,5)P, komD a die 5-Phosphatase eine hohe SpezifitHt fur das D-Isomer von
petitiv gehemmt. Die Entfernung einer von der AngriffsIns( 1,4,5)P3 aufweist und Analoga des L-Enantiomers normastelle der 3-Kinase entfernten Hydroxygruppe hat offensichtlerweise nicht sehr gut von diesem Enzym erkannt werden [z. B.
lich keinen groMen EinfluB auf die Bindungseigenschaften des
Substrates. Anders als das 6-Desoxy-Analogon ist die Affinitat
L-Ins(1 ,4,5)P3[43xI],uberrascht dieses Resultat. Einige 2-substivon u~-6-Methoxy-lns(1 ,4,5)P3 zur 3-Kinase deutlich vermintutierte Analoga sind allerdings ebenfalls 5-Phosphatase-residert (etwa um den Faktor 120)["']. Da in beiden Analoga keine
tent[^^^], und das L-Isomer von 2-Aminobenzoyl-Ins( 1,4,5)P3
Wasserstoffbriickenbindungen zur 6-Position gebildet werden
ist iiberraschenderweise ein wirksamer Inhibitor. DL-~-Fkonnen, ist moglicherweise der erhohte sterische Anspruch des
Ins(1 ,4,5)P, ist ein maBig wirksamer kompetitiver Inhibitor von
6-Substituenten von ~ ~ - 6 - M e t h o x y - I n s,4,5)P3
(l
der Grund fur
5-Phosphatase. Dabei kann vorliiufig angenommen werden,
die niedrige Affinitat dieses Analogons. Auch in diesem ZusamdaB wie beim Difluor-Analogon 2,2-F2-Ins(l ,4,5)P3 der hemmende Effekt von D L - ~ - F - I ~1 ,4,5)P,
s(
menhang ist eine Untersuchung rnit 6-Fluor-lns( 1,4,5)P,
auf das L-Isomer zuriickwiinschenswert.
zufiihren ist, wahrend das D-Isomer wie ri-2,2-F2-Ins(1,4,5)P3
DL-Cyclohexan-l,2,4-trisphosphatinhibiert die Phosphorywahrscheinlich ein Substrat dieses Enzyms ist. Dies bedeutet,
lierung von [3H]lns(l.4,5)P3 nur schwach (1C5"= 327 p ~ ) [ ~ ' ~ ] .dam die 2-Hydroxygruppe an der Substraterkennung durch
Benzol-I ,2,4-trisphosphat wird mit einer im Vergleich zu
Ins(1 ,4,5)P3-5-Phosphatase zwar beteiligt ist. aber keine wesentIns(l,4,5)P3 etwa urn den Faktor 10 niedrigeren Affinitat
liche Rolle spielt.
iiberraschenderweise gut von der 3-Kinase erkannt (1C5,, =
3-Desoxy-Ins(l ,4,5)P3 ist ein gutes Substrat, das mit einer
6.1 pM)[4271.~-2,3-Didesoxy-und ~-2,3,6-Tridesoxy-Ins(l,4,5)P, etwas hoheren Affinitat als Ins(1,4,5)P, gebunden
und 3-F-Ins(1,4,5)P3 ist ebenfalls ein Substrat der Erythroweisen Ki-Werte von 19 bzw. 36 p~ auf, wahrend mehrere andere mehrfach desoxygenierte Analoga nicht mit dem Enzym
~yten-5-Phosphatase[~~'].
~-chiro-Ins(2,3,5)P,, das man als
we~hselwirken[~'*~
(Abb. 41 ). Tnteressanterweise wird 3-Kinase
Ins( 1,4,5)P, rnit invertierter Konfiguration an C-3 beschrei ben
auch durch Adriamycin gehemmtl4"1.
kann, ist hingegen ein wirksamer Inhibitor[335*
3 3 6 , 4361.
Dies
+
21 14
Anxt+i. C'hem. 1995, 107.
2085-2125
AUFSATZE
Inositlipide
uberrascht, da die Hydroxygruppe an C-3 in diesem Molekul
Wahrend I n ~ ( 2 , 4 , 5 ) P , ~und
~ ~cyclisches
~]
Ins(1: 2,4,5 )P3[3101
weit von der Angriffsstelle des Enzyms entfert ist. Zwei Erkla5-Phosphatase-Substrate sind, ist DL-InS( 1,4,5)PS, gepenuber
dem Abbau durch das Enzym r e s i ~ t e n t [ ~DL-Cyclohexan~~'.
rungen wurden fur diesen Befund angefuhrt : Entweder sind die
1,2,4-trisphosphat ist ein schwacher, kompetetiver Inhibitor
Konformationen von ~-chiro-Ins(2,3,5)P, in Losung und/oder
gebunden an die 5-Phosphatase und von Ins(l,4,5)P3 so unter(Ki = 124 mM), und eine auf die Hydrolyse durch dieses Enzym
schiedlich, daI3 das Analogon zwar wie Ins( 1,4,5)P3 vom Enzym
zuruckzufuhrende Freisetzung von anorganischem Phosphat
gebunden wird, die katalytische Aktivitat des Enzyms durch
konnte nicht festgestellt ~ e r d e n [ ~ ~Benzol-1,2,4-trisphos'].
das Analogon aber erheblich beeintrachtigt wird, oder die
phat[4271und (1 R,2R,4S)-Cyclohexan-I ,2,4-tris(methylensulf ~ n a t ) 'hemmen
~ ~ ~ ] den [3H]Ins(1 ,4,5)P3-Abbau durch 5-PhosInhibierung ist das Resultat einer unproduktiven Anlagerung
des invertierten ~-chiro-Ins(2,3.5)P, in einer gedrehten Orienphatase uberraschend gut, was darauf hinweist, daD das Enzym
tierung. In dieser Anordnung wurde das Analogon drei
sogar drastische Strukturanderungen toleriert. Die TrisphosElemente von Ins(1 ,4,5)P, korrekt wiedergeben: die Ringphorothioate ~-Ins(l,4,5)PS,, Ins(1 ,3,5)PS3 und L-chirokonformation, die wichtige vicinale 4,5-Bisphosphateinheit
Ins(1,4,6)PS3 sind hochwirksame 5-Phosphatase-Inhibitoren
(in Form des 2,3-Bisphosphats) und die 3-Hydroxygruppe
rnit submikromolaren Ki-Werten von 0.50, 0.43 bzw.
0.3 p ~ [ Da~ die~ beiden
~ ~ letzteren
.
Verbindungen nicht rnit
(in Form der 4-Hydroxygruppe). Die 5-Phosphatgruppe von
~-chiro-Ins(2,3,5)P,ahmt dabei die aquatoriale 2-Phosphat3-Kinase wechselwirken und auch kein Ca2 mobilisieren[441*4421, eignen sie sich hervorragend als selektive Inhibitogruppe eines Ins( 1 ,4,5)P3-Analogons nach, und solch ein
Phosphatrest pafit vermutlich immer noch relativ gut in die
ren der 5-Phosphatase (Abb. 42).
hydrophile Tasche des Enzyms, die gewohnlich rnit der
aquatorialen I-Phosphatgruppe von Ins( 1,4,5)P, wechselwirkt. In dieser invertierten Bindungweise imitiert die axiaM&-dhmEhduch
3-Desory-b(l,4,5)f, 3-F-wl,4,5)f3
,,,, w19,4J)f, 5-PhDsphataoe:
2~~-gr-hs(l,4W3
le 1-Hydroxygruppe von ~-chiro-Ins(2,3,5)P,die axiale 6sind
ud andem 2-mdifide~
Alrebga
Hydroxygruppe eines Ins( 1,4,5)P3-Analogons. Wie im fol~
~
w
'
'
~
~ sind
~ Slbstrab
~
~
f
~
genden besprochen, konnte die aquatoriale 6-Hydroxygruppe von Ins(l,4,5)P3eine wichtige Rolle bei der 5-Phos~icht~rtlichm
phatase-katalysierten Hydrolyse spielen. Die hemmenden
Hem-:
Die PhDcPhpgnppeadmint
dieErkemqzuedcW!&mjeist ein thibitor
Eigenschaften von ~-chiro-Ins(2.3,5)P, konnen moglicherdoch k H wsedich zu min:
w4.5)p2ist ein B c h u p c k
weise der pseudo-axialen 6-Hydroxygruppe in der invertierAdoga mit modifiderter
slbsbat
ten Bindungskonformation zugeschrieben werden.
WosiSonvrieh(l,4J)f3-5-S md
Durch C-5-Substitution rnit Phosphorothioatgruppen
5-Me-rtat-h(1,4,5)f3
Entsrnen b r WmxyOnppe
5PmtaseMbilwen
ni' in &DeEoxy- md slbstitution
sind
wird ein wirksamer Inhibitor der Ins( 1,4,5)P3-5-Phosphavrie in EOA4eWhs(l,4,5)f3 Wesrt
tase, Ins(l,4,5)P3-5-S, e r h a l t e t ~ [ ~2421.
~ l . Das 5-Methylen5PhDcPhptnsembi1Jren
phosphonat-Analogon
D-lns(l ,4,5)P3 ist ein weiterer
Abb. 42. Struktur-Aktivitats-Beziehungenfur Ins(l,4,5)P3-5-Phosphatase.
langlebiger Ca2+-mobilisierender A g ~ n i s t I ~Die
~ ~anhal].
tende Freisetzung von Ca2 durch diese Verbindung deutet
darauf hin, da13 sie nicht durch die 5-Phosphatase dephosphoryliert und somit desaktiviert wird. Eine vollstandige Unter11. Partielle Agonisten und Antagonisten
suchung sowie Einzelheiten zu den Wechselwirkungen der 5von Ins( 1,4,5)&
Methylphosphonat- und 5-Difluormethylphosphonat-Analoga
von Ins(1,4,5)P3[360,3611 mit dem Enzym werden rnit Interesse
Nur wenige chemische Substanzen stehen fur Eingriffe in den
erwartet.
Phosphatidylinosit-Signalubertragungswegzur Verfugung und
~-6-Desoxy-Ins(l,4,5)P3IZ3 hemmt die Dephosphorylierung
bislang ist kein einfacher niedermolekularer Ins( 1.4,5)P3von [32P]Ins(1 ,4,5)P3 durch Erythrocyten-5-Phosphatase und
Antagonist bekannt. Fur die Entwicklung eines solchen Antaist ein maI3ig wirksamer Inhibitor des Enzyms. Sowohl die im
gonisten sind umfangreiche Struktur-Aktivitats-UntersuchunVergleich zum naturlichen Substrat Ins(l,4,5)P3nur auf etwa die
gen erforderlich. Bei der planmaI3igen Suche nach einer VerbinHalfte verringerte Affinitat von ~-6-Desoxy-Ins(
1,4,5)P3 als
dung, die eine grol3e Rezeptor-Affinitat aufweist, aber kein
Ca2+ freisetzt, ist es notwendig, die Struktur-Eigenschaften
auch die um etwa den Faktor 4 niedrigere Affinitat von D L - ~ Methoxy-Ins(1 ,4,5)P3 fur die 5-Phosphatase aus den glatten
von Ins(1 ,4,5)P3, die die Bindungsaffinitat bestimmen, von
Muskeln der Aorta[3281
unterstreichen die Nichtselektivitat diedenen zu trennen, die zur Offnung des Ca2+-Ionen-Kanals
fiihren. Viele naturliche und synthetische Inositphosphate weises Enzyms. Die Resistenz dieser beiden Analoga gegenuber der
sen eine geringere Rezeptor-Bindungsaffinitat auf als InsDephosphorylierung bestatigt, daI3 als Strukturvoraussetzungen fur die Substrathydrolyse durch die 5-Phosphatase nur die
(1,4,5)P3; dies korreliert rnit einer entsprechend niedrigeren Favicinale 4,5-Bisphosphateinheit und eine freie 6-Hydroxygruppe
higkeit zur Freisetzung von Ca2+. Es ist jedoch noch keine
erforderlich sind. Moglicherweise ahnelt die Funktion der 6-HyD-konfigurierte Verbindung ohne vicinale 4,5-Bisphosphatdroxygruppe von Ins(1,4,5)P3 der der 6-Hydroxygruppe von
gruppe beschrieben worden, die Ca2+freisetzt. Modifikationen
Ins(1)P in dessen Dephosphorylierung durch Inosit-Monophosan dieser Stelle konnten zur Entwicklung eines niedermolephatase, d. h. diese Gruppe hat keinen wesentlichen Effekt auf
kularen Molekuls fuhren, das bei gleichbleibend hoher Bindie Anlagerung, ist aber notwendig, damit das Enzym rnit dem
dungaffinitat zum Enzym die Offnung des Kanals direkt beeinSubstrat reagieren kann.
fluljt.
+
'
+
Angew. Chem. 1995. 107,2085-2125
2115
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
11.1. Partielle Agonisten am Ins(l,4,5)P3-Rezeptor
Ins(1 ,4,5)P3-Bindungsstelleiilieferte der Befund, da13 die zuerst
von Worley et al.[4s41beschriebene Bindungsstelle im KleinhirnEinige partielle Agonisten am Ins(1,4,5)P3-Rezeptor sind
rezeptor heparinempfindlich ist[4431.Das diese Bindungsstelle
identifiziert worden : Ins( 1,3,4,6)P4 weist eine maRige Affinitat
bildende Protein konnte durch Heparin-Agarose-Affinitatszum Rezeptor auf und fuhrt zu einer maximalen Ca2+-Freisetchromatographie weitgehend gereinigt werden" 591. Heparin inzung, die rund 80 % der durch Insfl ,4,5)P3bewirkten entspricht.
hibiert auch die Ins(1 ,4,5)P3-induzierte Ca2+-Freisetzung in
Wenn Ins(1 ,3,4,6)P4 in der fur die Ca2+-Mobilisierung effektivH e p a t o ~ y t e n ~in
~ ~/I-Zellen
'~,
der Bauchspeicheldrii~e[~~~]
und
sten Konzentration zusammen mit Ins( 1,4,5)P3 verabreicht
in R a t t e n l e b e r - M i k r o ~ o m e n ~Der
~ ~ ~effiziente
].
Antagonismus
wird, erhoht sich dessen EC,o-Wert['381. Dies fuhrte zu der
von Heparin gegen die Ins( 1 ,4,5)P3-aktivierteCa2+-Freisetzung
1st sowohl kompetitiv als auch reversibel; die Affinitlt von HeSchluRfolgerung, dalj das freigesetzte Ca2+ aus dem gleichen
parin zur Bindungsstelle betrilgt ca. 3 nM[4441.Das Heparinintrazellularen Speicher stammt, und es ist zudem ein starkes
Tndiz dafur, daB 1ns(1,3,4,6)P4 und Ins(l,4,5)P3 um dieselbe
fragment TV 84558-51 (durchschnittliches M , = 5100) inhibiert
Rezeptorstelle konkurrieren" 38, ]'31 . D a Ins(1,3,4,6)P4 nomidie Bindung von [3H]Ins(1,4,5)P3ebenso wirksam wie Heparin,
nell nicht die normalerweise fur Agonistenaktivitat erforderwahrend kleinere Heparinfragmente und weniger oder nicht mit
Schwefelsaure veresterte Glycosaminoglycane (z. B. Chondroliche vicinale 4,5-Bisphosphateinheit aufweist, ist es nicht offensichtlich, warum dieses Tetrakisphosphat Ca2 freisetzen sollte.
itinsulfat und Hyaluronslure) die Bindung nicht beeinflusEs gibt zwei alternative Bindungskonformationen von Inssen[4431.Dies ist auch bei 0-und N-desulfoniertem, N-acetylier(1,3,4,6)P4 am Ins(l,4,5)P3-Rezeptor, in denen es die wichtigtem Heparin der Fall. N-Desulfoniertes Heparin weist eine versten Erkennungsmerkmale nachahmt, einschlieRlich der 4,5minderte hemmende Aktivitat am Ins( 1 ,4,5)P3-Rezeptor, aber
nicht an der Ins( 1 ,3,4,5)P4-Bindungsstelleauf, wahrend PentoBisphosphateinheit und der 1-Phosphatgruppe. Moglicherweise
sind eine oder beide dieser Bindungskonformationen der Gruiid
sanpolyphosphat ein weiterer wirksamer, aber unselektiver Infur die von Ins( 1,3,4,6)P4 gezeigten Eigenschaften als partieller
hibitor sowohl an Ins(l,4,5)P3- als auch Ins(l,3,4,5)P4-BinAgonist. Die chemische Modifikation von Ins(1,3,4,6)P4konnte
dungsstellen istc4''I. Wahrend Heparin und verwandte Substanhier zur Aufklarung beitragen.
zen in vielen Tier- und Pflanzenzellen inhibierend wirken, ist die
Schwachere partielle Agonisten sind 6-Desoxy-Ins(l ,4,5)PS3
Ins(1 ,4,5)P3-induzierte Ca2+-Mobilisierung in Pilzen heparinund ~-chiro-Ins(2,3,5)PS,".
3521. Sie mobilisieren nur 42 bzw.
~ n e m p f i i i d l i c h [ Heparin
~ ~ ~ ~ . inhibiert auch Ins(1 ,4,5)P3-3-Ki34% der Ca2+-Menge,die durch Ins(1 ,4,5)P3 freigesetzt wird.
nase (aber nicht Ins( 1,4,5)P,-5-Phosphata~e)[~~~~
sowie die speAls schwache partielle Agonisten konnen sie allerdings nur in
zifische Anlagerung von Ins(1,3,4,5)P4 an Membranen im
Kleinhirn[4181und die Ins(1,3,4,5)P4-vermittelte Freisetzung
relativ hohen Konzentrationen verwendet werden, urn einer
von Ca2+ aus Kleinhirnmikr~somen[~'~].
Ins( 1 ,4,5)P3-induzierten Ca' +-Freisetzung entgegenzuwirken.
Wahrscheinlich wechselwirken die negativ geladenen SulfatBeide Verbindungen siiid C-3- bzw. C-6-modifizierte
gruppen des Heparins mit den hydrophilen Taschen der RezepIns( 1.4,5)P3-Analoga und tragen statt Phosphat- Phosphorotorbindungstelle, die normalerweise die Phosphatgruppen von
thioatgruppen an C-I, C-4 und C-5. Als schwachste partielle
Agonisten weisen diese Verbindungen, besonders aber L-chiroIns(1 ,4,5)P3 aufnehmen. Es ist allerdings interessant, daR myoIns(2,3,5)PS3,Leitstrukturen fur die Suche nach einem niederInosit-l,4,5-trissulfat,obwohl es Sulfatgruppen an den Positiomolekularen Ins( 1,4,5)P3-Rezeptor-Antagonisten auf. Ein weinen tragt, die bei Insfl ,4,5)P3 von den Phosphatgruppen beterer partieller Agonist ist scyllo-Ins(1 ,2,4,5)PS4[4161.
setzt werden, keine antagonistischen Eigenschaften zu haben
scheint [3661. Zwar weisen einige niedermolekulare Heparinfragmente Inhibitor-Eigenschaften a ~ f [doch
~ ~ist~ihre
~ Effizienz
,
11.2. Antagonisten am lns(1,4,5)P3-Rezeptor
noch eine GroRenordnung von der herkommlicher Ins(1 ,4,5)P3Analoga entfernt. Eine genauere Untersuchung der HeparinGegenwartig weist keines der synthetisierten Ins(1 ,4,5)P3- Rezeptor-Wechselwirkung ist erforderlich, um die wesentlichen
Analoga, rnit Ausnahme des 5-Methylphosphonat-Analogons
Struktur-Besonderheiten zu bestimmen und dementsprechend
einen niedermolekularen Antagonisten zu konzipieren.
von Ins(1 ,4,5)P3[360,
3611 und ~-chiro-Ins(2,3,5)PS,[~~~],
antagonistische Eigenschaften auf. ~-chiro-Ins(2,3,5)PS,hat allerdings betrachtliche intrinsische Aktivitat. Die einzigen Verbin11.2.2. Decavanadat
dungen, von denen eindeutig nachgewiesen wurde, dalj sie die
Ins( 1,4,5)P3-Rezeptorbindung wirksam hemmen, sind HepaUnterschiedliche Vanadate wurden auf ihre Eignung zur Inhi,.in[443 -4491
und Decavanadat
bierung von Ins(l,4,5)P3-Rezeptorbindungund Ca2+-Freiset450 - 4 5 21., sie weisen jedoch
keine Spezifitat fur den Ins(l,4,5)P3-Rezeptor
4531 und
zung untersucht. Dabei wurden festgestellt, dalj Decavanadat
(V,,O$, bei pH 7)[4571die Ins(l,4,5)P3-induzierte Ca'+-Mobisind daher in pharmakologischer Hinsicht nur von begrenztem
N utzen.
lisierung in permeabilisierten Ratten-Insulinoma und PC12Zellen ( I c s 0 = 5 , U M ) [ ~ 'sowie
~]
in SH-SY5Y-Zellen ( K , =
1.2 J1M)[4s11
und auch die Anlagerung von [3H]Ins(l,4,5)P3 an
11.2.1. Heparin
seinen Rezeptor in Kleinhirn- und Nebennierenrinden-MemHeparin ist ein mehrfach mit Schwefelsaure verestertes Polybranen hemmt[45'I. Orthovanadat und Oligovanadat hingegen
saccharid mit einem von Herkuiift und Gewinnung abhangigen
inhibieren die Ins(1,4,5)P3-Rezeptorbindung ni~ht[~"I,wahrrelativen Molekulargewicht zwischen 6000 und 20000. Erste
scheinlich weil sie die von Meyer et al.[4581vorgeschlagenen
Anzeichen auf eine Wechselwirkung von Heparin mit
multiplen Ins(1 ,4,5)P3-Bindungsstellen nicht uberbrucken kon+
~
~
93
2116
Angew. Chem. 1995, 107.2085 -2125
Inositlipide
AUFSATZE
nen. Decavanadat unterdruckt auch die Ins( 1,3,4,5)P4-induzierte Ca2+-Freisetzung aus permeabilisierten SH-SY5Y-Zellen
und inhibiert Ins( 1,4,5)P3-5-Phosphatase, Ins( 3 ,4,5)P3-3-Kinase
und Ins(I,3,4,5)P,-5-Ph0sphatase~~~~l.
Obwohl Decavanadat ein wirksamer und kompetitiver
Ins(1 ,4,5)P3-Rezeptor-Antagonistist, ist es wegen seiner geringen Spezifitat wahrscheinlich wenig brauchbar, um die Rolle
von Ins( 1,4,5)P3 als sekundarer Botenstoff zu untersuchen.
Allerdings konnten Molecular-modeling-Untersuchungen rnit
Decavanadat und auch mit Heparin wichtige Leitstrukturen
liefern.
12. Anwendungen yon Inositphosphat-Analoga
AuRer maskierten und Photoaffinitats-Analoga von
Ins( 1,4,5)P3 mit naheliegenden Anwendungen ist Ins(l,4,5)PS3
das bisher vielseitigste Ins(l,4,5)P3-Analogon.Ins(1,4,5)P3-Rezeptoren in Hirn[409,4401 und Leberr4591
erkennen Ins(l,4,5)PS3
mit hoher Affinitat. Das Analogon ist ein voller intrazellularer
Ca2+-freisetzenderAgonist, der in einer Reihe von Zellen, wie
Xenopus-O~cyten[~~*,
4601, permeabilisierten
Swiss-3T3-Zellen" 3 1 '
GH,-Zellen[' 3 1 1 , H e p a t ~ c y t e n ' ~ ~ Acinuszellen
'],
der B a ~ c h - [- 4~6 3~1 *und der O h r ~ p e i c h e l d r i i s e lSkelettmus~~~~,
kel-Triaden'46S1, Mau~e-Tranendriisenzellen[~~~~
und SHSY5Y-Ne~roblasten[~~],
nur etwa um den Faktor 3-4 weniger
effektiv ist als Ins(1,4,5)P3. Ins(l,4,5)PS3 ist resistent gegenuber
Dephosphorylierung durch 5 - P h o ~ p h a t a s e4401
~ ~ ~und
~ . kann
einen anhaltenden zellularen Ca2+-Ausstrom hervorrufen[46,4 3 5 1 . Ins(1,4,5)PS3 war der erste beschriebene kompetitive 5-Phosphata~e-Inhibitor'~~~~
4381; es wird jedoch von 3-Kinase nicht gebunden und konkurriert nicht rnit Ins(l,4,5)P3 um
dieses
4351. I ns(1,4,5)PS3, das gegenuber allen bekannten Ins( 1,4,5)P3-abbauenden Enzymen resistent ist, ist inzwischen kommerziell erhaltlich und wird zunehmend biologisch angewendet, wie im folgenden illustriert wird.
Die Moglichkeit synergistischer Wechselwirkungen zwischen
Ins(1 ,4,5)P3und seinem Metaboliten Ins(1,3,4,5)P4 bei der Vermittlung des Einstroms von Ca2 durch die Plasmamembran
war vor kurzem Gegenstand einer heftigen Debatte['23*l Z 4 , l Z 6 ] .
Bei der Aufzeichnung eines Ca2+-aktivierten K+-Stromes in
einfach intern perfusierten Acinuszellen der Mause-Tranendruse unter Messung des Zellgesamtstromes rnit einer Patch-clampTechnik fuhrte die Zugabe von Ins(l,4,5)PS3 zu einer einzelnen,
vorubergehenden Antwort, die unabhangig von externem
Ca2+ und typisch fur Ins(1,4,5)P3 war. In Gegenwart von
Ins(1 ,3,4,5)P4gab dieses Analogon jedoch eine anhaltende, von
externem Ca2+ abhangige Reaktion. Es wird daher angenommen, daI3 die voriibergehende Antwort auf Ins(1 ,4,5)P3nicht die
Folge eines schnellen Abbaus ist und daB Ins(1,3,4,5)P4 nicht
wirkt, indem es Ins(1,4,5)P3 vor einer Dephosphorylierung
durch 5-Phosphatase schiitzt, fur die es ebenfalls ein Substrat
ist[4661,
+
Intrazellulare Ca2 -0szillationen treten haufig in Zellen auf,
die durch extrazellulare Agonisten, die die Hydrolyse von Inositphospholipiden bewirken, stimuliert wurden. Funktion und
Bildungsmechanismen solcher Oszillationen sind gegenwartig
von betrachtlichem Interesse und werden kontrovers diskutiertt4'. 4671. Modelle fur die diesen Oszillationen zugrunde+
Ange". Chem. 1995, 107, 2085-2125
liegenden Prozesse sind entwickelt w ~ r d e n [ ~4681.
~ ' . Bei der
Zugabe von Ins(l,4,5)PS3 [oder Ins(1,4,5)P3] zu einfach perfusierten Mausepankreas-Acinuszellen rnit einer Patch-Pipette
wurden wiederholte StoI3e eines Ca2+-aktivierten CI--Stroms
festgestellt, die in Amplitude und Frequenz der Antwort von
muskarinischen Rezeptoren auf Acetylcholin ahneln. Die stoI3weise Ca2+-Freisetzung ist somit auch bei einer konstanten
Konzentration des Analogons - und daher vermutlich auch von
Ins(1 ,4,5)P3 - moglich, was gegen eine rezeptorkontrollierte Oszillation und auch gegen eine periodische Phosphorylierung
oder Abbau von Ins(l,4,5)P3 s p r i ~ h t [ ~Unterschiedliche
~~].
Fluktuationsmuster der cytosolischen Ca2+-Konzentration,die
den durch den naturlichen Agonisten hervorgerufenen Ihneln,
konnen mit Ins(l,4,5)PS3 in Abhangigkeit von dessen Konzentration erzeugt werden[4631.Niedrige Ins( l,4,5)PS3-Konzentrationen fuhren zu wiederholten lokalen Ca' +-Konzentrationsmaxima, wahrend bei hohen Konzentrationen repetitive Ca2
Konzentrationswellen erzeugt werden.
In den Photorezeptoren der Mikrovilli von wirbellosen Tieren
wird bei Bestrahlung mit Licht durch die Vermittlung von
Ins(1,4,5)P3 uber einen Ins(1 ,4,5)P3-Rezeptor Ca2 aus dem
ER freigesetzt. Mit Ins(l,4,5)PS3 wurden die Mechanismen
untersucht, die in den ventralen Photorezeptoren des Zyklopenkrebses Limulus die Ins( l,4,5)P3-induzierte Ca2+-Mobilisierung beenden. In diesen Zellen ist nur das D-Isomer von
Ins(1 ,4,5)P3 wirksam, und der sekundare Botenstoff wird normalerweise schnell metabolisch desaktiviert. Im Limulus-Photorezeptor fuhrt Ins(l,4,5)PS3 zu wiederholten Oszillationen des
Ca2+-abhangigen Membranpotentials, die zehn Minuten und
langer anhalten konnen[4691.Oszillationen des Membranpotential~I~~
und
* l ein Ca2+-abhangiger C l F - S t r ~ m ' ~konnen
~~]
durch Mikroinjektion von Ins(1 ,4,5)PS3 in Xenopus-Oocyten
hervorgerufen werden. In diesem Fall treten die Oszillationen
allerdings nicht uber einen Iangeren Zeitraum auf, was darauf
hindeutet, daI3 aul3er rnetabolischen noch andere Faktoren fur
das Abschalten der Antwort wichtig sind. Die durch
Ins(l,4,5)PS3ausgelosten Oszillationen des Membranpotentials
unterscheiden sich von denen rnit Ins(l,4,5)P3und ahneln denen
rnit Ins(2,4,5)P3. Der Grund hierfiir ist nicht klar; moglicherweise gibt es unterschiedliche Mechanismen zur Auslosung der
Ca' +-Oszillationen['261.Die Ins(l,4,5)PS3-induziertenOszillationen des Ca2+-abhangigen CI --Stroms entsprechen eher den
durch Ins(1,3,4,5)P4 als den durch Ins(1,4,5)P3 hervorgerufenen [4701.
Die durch stimulusinduziertes Ins(1 ,4,5)P3 ortlich erhohte intrazellulare freie Ca2 -Konzentration kann zur Entstehung von
sich aktiv ausbreitenden Ca'+-KonzentrationsweIlen fuhren,
wodurch dieses Signal in andere Bereiche der Zelle ubermittelt
wird. Mit Ins(1,4,5)PS3 wurde die Ausbreitung der Ca2+-Wellen im Cytoplasma von Xenopus-Oocyten ~ntersucht1"~
'I. Die
hs(1 ,4,5)PS3-induzierten Ca2+-Wellen sind den durch Stimulation des Acetylcholin-Rezeptors hervorgerufenen sehr ahnlich
und daher wahrscheinlich eine Folge desselben intrazellularen
Mechanismus. Da Ins(1 ,4,5)PS3 nicht hydrolysierbar ist und in
Xenopus-Oocyten nicht unmittelbar abgebaut
ist anzunehmen, daR die Ca2+-Wellen nicht durch Fluktuationen der
Ins(1,4,5)P3-Konzentration, sondern durch eine Cazf-Stimulation der Ins(1 ,4,5)P3-induzierten Ca2+-Freisetzung hervorgerufen werden.
+ -
+
+
2117
B. V. L. Potter und D. Lampe
AUFSATZE
In Xenopus-Oocyten konnen nach der Aktivierung des Rezeptors komplexe riumliche und zeitliche Muster der Ca2+-Freisetzung in Form von regenerativen kreis- und spiralformigen Wellen festgestellt werden. Solche spiralforinigen Wellen konnten
durch Injektion von nichtmetabolisierbarem Ins(l,4,5)PS3 hervorgerufen werden und waren von rezeptorinduzierten Ca2
Mustern nicht zu u n t e r s ~ h e i d e n [ ~Die
' ~ ~ Stimulation
.
der Ca2+Freisetzung durch eine solche Verbindung resultierte allerdings
nicht in einer Anderung des Ca2 '-Freisetzungsweges. Dieses
und ahnliches Verhalten deutet darauf hin, daR das Nachlassen
der Ca2+-Aktivitiit nicht auf den Ins( 1,4,5)P,-Stoffwechsel zuriickzufiihren ist. Die Ins(1.4,5)P3-Konzentration bleibt wahrend der regenerativen Wellenstimulation weitgehend konstant.
Die regenerative Aktivitiit ist wahrscheinlich auf die cyclische,
durch die cytoplasmischen Ca2+-Konzentrdtion regulierte Stimulierung und Tnhibierung des Ins( 1,4,5)P3-Rezeptor-Kanals
zuriickzufiihren. Mit Ins(l,4,5)PS, wurde ferner der EinfluR des
Zustroms von C a 2 +a u f Ca2--Wellen untersucht, die durch Mikroinjektion dieses Analogons hervorgerufen werden. Dabei
wurde festgestellt, dal3 der rezeptoraktivierte CaZ+-Zustrom die
Frequenz und Geschwindigkeit von Ins( 1 ,4.5)P3-abhangigen
Ca2+-Wellen in Xenopus-Oocyten m o d ~ l i e r t 1 ~ ~ ~ 1 .
Die Mikroinjektion von cGMP in unbefruchtete Seeigeleier
fiihrt zu einer Aktivierung, indem die intrazelluliire freie Ca2'Konzentration durch einen unbekannten Mechanismus erhoht
wird. Die CaZi -Freisetzung und die Aktivierung sind in Eiern.
in denen die Ins( 1,4,5)P,-empfindlichen Ca2+-Speicher durch
vorherige Injektion von Ins( 1 ,4,5)P, geleert wurden, nicht moglich. Injektionen von Ins( 1 ,4.5)PS3 in Seeigeleiern fiihren tatslchlich zu einem Ca2 -Strom, der dem durch Ins( 1,4,5)P3 ausgelosten in GroRe und Dauer iihnelt. Weitere Injektionen von
Ins( 1,4.5)PS, resultieren allerdings nur in geringen nachfolgenden sich wiederholenden Ca2+-Stromen,im Unterschied zu den
sehr vie1 groReren, die mit Ins(l,4,5)P3 erhalten werden. Der
Grund hierfiir ist, daR die Ca' '-Ruhekonzentration in Eiern, in
die Ins( 1,4,5)PS, injiziert wurde. hoher ist, da Ins(l,4,5)PS3
nicht hydrolysiert werden kann, und die Ca2+-Speicher somit
durch aufeinanderfolgende Ins( 1 .4.5)PS3-Injektionen fortschreitend geleert werden i4741.
Mit Ins(l,4,5)PS3 wurden die Ins( 1,4,5)P3-empfindlichenund
-unempGndlichen nichtmitochondrialen Mg/ATP-abhiingigen
Ca2+-Speicher in den Pankreas-Acinuszellen von Ratten hinsichtlich ihrer Funktion ~nterschieden[~'
' I . Der Ins(1 ,4,5)P3empfindliche Ca' +-Speicher wird dabei mit Ins( 1.4,5)PS3 leer
gehalten, und das Ca2 i n den Ins( 1,4,5)P,-unempfindIichen
Speicher aufgenommen.
Ins( 1,4,5)PS, und das verwandte MonophosphorothioatAnalogon Ins(1 .4.5)P3-5-S sind wirksame 5-Phosphatase-Hemmer[432.4381. Sie wurden eingesetzt, um den Tns(1,4,5)P,-Abbau
in elektrisch permeabilisierten rnenschlichen SH-SY 5Y -Neuroblasten zu i n h i b i e r e r ~ [ ~ Die
~ ~ ' . Inhibierung des Abbaus von
exogen zugefiigtem [5-32P]Ins(I ,4.5)P3 durch 5-Phosphatase
war ca. zehnmal groI3er als die von [3H]Ins(l.4,5)P, aus der
Zellmembran. Dies deutet auf eine Aufteilung des Ins(1 ,4.5)P3
auf Kompartimente hin, so daI3 eine homogene Durchmischung
von exogen zugefiigtem und endogen gebildetem Ins(1 ,4,5)P3
nicht eintritt. Ins(1 ,4,5)P3-5-S 1st ein Ins(l,4,5)P3-3-Kinase-Substrat und hemmt die Phosphorylierung von [3H]Ins(1,4,5)P3
durch dieses E n z y ~ n ~ ~ " ~ .
+ -
+
+
2118
Die intrazellulare Ca2 +-Freisetzung kann portionsweise eifolgen. wobei die GroRe des Ins(l,4,5)P,-empfindlichen Ca2
Speichers von der Ins(1 ,4.5)P3-Konzentration abhingt['241. Mit
Ins(l,4,5)PS3 wurde die portionsweise Ca2 -Freisetzung in permeabilisierten Hepatocyten u n t e r ~ u c h t [ ~ ~ 'Dan
'.
die CaZ
Speicher bei submaximalen Konzentrationen von Ins( I ,4,5)P,
oder Ins(l,4,5)PS3 nicht vollstiindig geleert werden, ist nicht
auf eine Stimulus-Desaktivierung oder eine Rezeptor-Desensibilisierung zuriickzufiihren. Mit metabolisch stabilem
Ins( 1,4,5)PS, wurden Ca2+-Ausstrom-Experimente bei hohen
Zelldichten durchgefiihrt, bei denen der metabolische Ins(1 ,4,5)P3-Abbau normalerweise betrachtliche Probleme bereitet
hiitte.
Ins( 1,4,5)P3 aktiviert eine neuartige. spannungsabhgngige
K+-Leitfahigkeit in CAI Hippocampus-Pyramidenzellen von
ratter^'^^^]. In diese Zellen injiziert. hemmt Ins( 1,4,5)PS, die
Auslosung des Aktionspotentialpulses. Die metabolische Stabilitiit von Ins(l,4,5)PS3 ist hierbei wesentlich. Mit Ins(l,4,5)P3
wurde die Leitfiihigkeit vermutlich wegen seines schnellen enzymatischen Abbaus nicht hervorgerufen. So kann man init
1ns(l,4,5)PS3Wirkungen von Ins(1 ,4,5)P, entdecken, die mit
dem natiirlichen Botenstoff wegen dessen schnellen Abbaus
oder wegen der Iangsamen Verteilung von extern zugefiigtem
Agonisten experimentell nicht erfd3t werden konnen.
In Kaninchenskelettmuskel-Triaden fiihrt Ins(l,4,5)PS3 zur
Freisetzung von bis zu 20% des Ca2+aus einem aktiv geladenen
Speicher, obwohl die Ca2+-Kanale des Ryanodin-Rezeptors
nicht oder nur minimal aktiviert ~ a r e n ~Demzufolge
~ ~ ~ ] . konnte
die Ca2'-mobilisierende Aktivitat iiber andere Kanile oder
durch andere Mechanismen vermittelt werden. Es gibt Hinweise
fur zwei Arten von intrazellularen Ca2+-empfindlichen Kanalen, die schnell aktiviert werden konnen : Ins( 1,4,5)P,- und
Ca2+-empfindliche Kanlle. In Kaninchenskelettmuskel SR
wird Ca2+durch Ins(l,4,5)PS3 iiberraschend schnell freigesetzt
(20-150 ms, in Abhiingigkeit von der Agonistenkonzentration), was darauf hindeutet, dal3 Ins(1 ,4,5)P,-Rezeptoren im
Skelettmuskel kinetisch in der Lage sein konnten, die rdsante
Erhohung der cytosolischen Ca2+-Konzentration, die einer
Muskelkontraktion vorausgeht, zu s i g n a l i ~ i e r e n [ ~ ~ ~ ' .
Die Umsetzung von Polyphosphoinositiden in roten Blutkiirperchen ist bekannt; die genaue Funktion von tns(1,4.5)P3 muR
allerdings noch geklart werden. In permeabilisierten menschlichen Erythrocyten fiihrt Ins( 1,4,5)P, zu einer voriibergehenden
Freisetzung von Ca2+,zur Auflosung des Spektrin-Netzes und
zu reversiblen F o r m a n d e r ~ n g e n ' die
~ ~ durch
~ ~ , Immunofluoreszenz gemessen werden konnen. Ins(1 ,4.5)PS3 induziert eine anhaltende Freisetzung von Ca2+sowie irreversible Gestaltsinderungen und die Auflosung des Spektrin-Netzes. Der Polyphosphoinositid-Signaliibertragungsweg spielt offensichtlich eine
wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Form von roten
Blutkorperchen.
+
-
A
+ -
13. Synthesen von Inositlipiden und Analoga
Die meisten friiheren Arbeiten iiber Synthesen von Phosphatidylinositlipiden und deren Analoga sind in einem Ubersichtsartikel zusammengefaot w o r d e t ~ I ~ *Die
~ ] . vier Stereoisomere
von Dipalmitoylphosphatidylinosit wurden fur Untersuchun-
AUFSATZE
Inositlipide
gen zur Substratstereospezifizitat von PtdIns-4-Kinase hergedie diastereomeren, ungeladenen Methylphosphonat-Analoga
~ t e l l t ’ ~4821.
~ ’ Das PtdIns(4,5)P2-Phospholipid-Analogon1-0von PtdIns syntheti~iert[~”I.Das Phosphonat-Analopon von
PtdIns ist ein wirksames entziindungshemmendes Analgeti(1,2-Di-O-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho)-~-Ins(4,5)P~
wurde
iiber die P”’-Verbindungen synthetisiert126h1.(Das Di-Okum[4941.Phosphonatderivate von PtdIns mit einer Alkylkette
stearoylphospholipid ist zuvor von einer russischen Arbeitsstatt der Diacylglycerineinheit wurden ebenso beschrieben[4951
gruppe hergestellt ~ o r d e n [ ” 4~8 3, 3 4841., d’ie Arbeiten dieser
wie isostere Methylenphosphonat- und isopolare Difluormethylenphosphonat-Analoga,
die zur Verbesserung der WasserlosGruppe auf diesem Gebiet wurden z u ~ a m m e n g e f a l j t [4~8 5~1 .)~ .
Uber eine Synthese von optisch aktivem 1-0-(1,2-Di-Olichkeit an den sn-I - und sn-2-0-Atomen der Glycerineinheit
stearoyl-sn-glycero-3-phospho)-~-Ins(3,4,5)P,
aus (- )-Chinastatt mit langen Acylketten rnit kurzkettigen Alkylketten substiund eine kurze Synthese dieses PtdIns(3,4,5)P3-Anatuiert ~ i n d [ ~ ~ ~ ] .
logons in racemischer Form wurde b e r i ~ h t e t [ ~ ~ ’ I .
Die erste Synthese eines Fluor-Analogons eines Inositlipids
wurde bereits 1982 be~chrieben[”~].
2-Desoxy-2-fluor-I-phos14. Glycosyl-Phosphatidylinosit-Anker
phatidyl-sc$lo-inosit wurde durch Kondensation von 3,4,5,6Tetra-O-benzyl-2-desoxy-2-fluor-~cyl~o-inosit
mit dem NatriumVide Proteine sind an biologische Membranen gebunden.
salz der Dipalmitoyl-L-a-phosphatidsaure und anschlieljende
Wahrend integrierte Membranproteine eine oder mehrere hydrophobe Domanen haben und groDtenteils in die LipiddoppelHydrogenolyse erhalten. Spater wurden Synthesen von D-3schicht eingebettet sind, sind sndere Proteine kovalent an Lipide
Desoxy-3-fluor-l-phosphatidyl-myo-inosit,
das cytostatische
Eigenschaften aufweist und das Wachstum von NIH-3T3-Zellen
gebunden, die sie so in der Zellmembran verankern. Es wurde
gezeigt, dalj vide dieser Proteine durch Phosphatidylinosit-Anin Konzentrationen von ca. 100 p~ hemmt, sowie der entspreker, die iiber ein Glycan [Glycosyl-Phosphatidylinosit(GP1)chenden 3-Chlorverbindung v e r o f f e n t l i ~ h-4901.
t~~~~
Zur Synthese von 2 - D e s o ~ y - P t d I n s [wurde
~ ~ ~ ] racemisches
Anker][497- ’O0] mit der C-terminalen Aminosaure des Proteins
verkniipft sind, an die Membran gebunden sind. Mehr als
3,4,5,6-Tetra-O-benzyl-myo-inosit
selektiv an der I-OH-Gruppe
dreiljig Zelloberflachen-Proteine rnit einem GPI-Anker sind
acetyliert. Die anschlieknde Desoxygenierung wurde durch die
identifiziert worden (zur Biosynthese von GPI-Ankern siehe
Robins-Variante der Barton-McCoinbie-Sequenz - ThioxocarLit.[5o1]),darunter hydrolytische Enzyme (z. B. alkalische Phosbonatbildung und radikalische Reduktion - erreicht. Verseifung
und Racematspaltung des resultierenden Alkohols iiber den
phatase und A c e t y l c h o l i n - E ~ t e r a s e ~ ~
Saugetier-Antigene
~~~),
Camphansaureester lieferten ~-3,4,5,6-Tetra-O-benzyl-2-de-(z. B. Thy-I r5031) und Zelladhasionsproteine. Die allgemeine
Struktur von GPI-Ankern ist PtdIns-Glucosamin-Mannose,soxy-my-inosit, das niit dem neuen Kupplungsreagens Bis(diPhosphoethanolamin-Protein; Modifikationen der Mannosylisopropylamino)(2-tritnethylsilylethoxy)phosphan phosphityeinheit durch zusatzliche Seitenketten sind jedoch nicht ungeliert wurde. Reaktion mit Dipalmitoylglycerin und Oxidation
wohnlich, und andere Variationen (z. B. in der Fettsaurezusamdes Phosphittriester lieferten das geschiitzte Desoxy-PtdInsrnensetzung von PtdIns) treten ebenfalls auf.
Analogon als Diastereomerengemisch. Durch stufenweises EntDie Entdeckung von GPI-Ankern weckte das Interesse von
schiitzen wurde 2-Desoxy-PtdIns erhalten, das zur UntersuBioorganikern, und schon bald wurde der GPT-Anker des variachung der Spezifizitat von Phospholipase C (PLC) verwendet
blen Oberflachen-Glycoproteins (variant surface glycoprotein.
wurde.
Synthesen des PtdIns-Analogons 1,2-Dipalmitoyl-sn-glyceroVSG) des parasitaren Protozoons Trypanosoma hrucei[”4] synthetisiert (Abb. 43)[505,5061. Das Uberleben der afrikanischen
3-thiophospho-myo-inosit (DPPsI) wurden von zwei Arbeitsgruppen b e s c h r i e b e ~ i- ’2 6~5 1~: ~ Im ersten an sat^['^^, 2641 wurde
Trypanosomen hangt von der Unversehrtheit der Oberflache
1D-2.3 : 5,6-Di-O-cyclohexyliden-4-O-methoxymethyl-n~~o-inosit mit Methoxy(diisopropy1amino)chlorphosphan 61 phosphityliert und dann mit 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerinund durch
Sulfoxidation direkt zum geschutzten 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-thiophospho-myo-inositumgesetzt. Entschiitzen mit
a-LGalPa$q
a-D-Manp
SCure und Demethylierung mit Trimethylamin lieferten
(R, + S,)-DPPsI als Diastereomerengemisch, das zur Untersuchung des stereochemischen Verlaufs der Substratspaltung
H
durch PtdIns-spezifische PLCs verwendet wurde. Im zweiten
a-PGalp OH
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycerinmit 61 zum
A n s a t ~ [ ’ ~wurde
~]
Phosphoramidit umgesetzt, das mit 1~-2,3,4,5,6-Penta-O-bena-PManp
zyl-myo-inosit kondensiert wurde. Das Produkt wurde zu den
Phosphorothioat-Diastereomeren sulfoxidiert, die chromatographisch getrennt und zu den 1,2-DipalmitoyI-sn-glycero-31P~lnoSit
thiophospho-I -rnyo-inosit-Diastereomeren entschiitzt wurden.
Die Synthesen von PtdIns-Analoga, die Thiophosphoesterbindungen enthalten und zur Inhibierung von PtdIns-PLC verwendet wurden, wurden ebenfalls b e ~ c h r i e b e n [ ~ ~ ~ ] .
0
Mit dem Phosphonylierungsreagens 185 wurden optisch aktiAhb 43 Der GPI-Anker des variahlen Oberflichenglycoproteins von Trypanosomu hrucei.
ve Phosphonat-Analoga von PtdIns und P t d I n ~ ( 4 ) P ‘ sowie
~~~l
4
,.y,~THzCHzNHz
B
P
Angew Chem 1995, 107, 2085-2125
21 19
AUFSATZE
ihrer Zellhulle ab, die aus dicht gepackten Monoschichten von
VSGs besteht und die den Parasiten vor lysierenden Faktoren
im Serum des Wirtorganismus schiitzt. Dadurch, daD zu verschiedenen Zei ten unterschiedliche VSGs exprimiert werden,
kann der Parasit der Immunantwort des Wirtorganismus ausweichen. Diese Antigen-Variation erschwert es dem Immunsystem, die richtigen Antikorper zur rechten Zeit bereitzustellen,
und macht dariiber hinaus Wirkstoffe gegen spezifische VSGs
nutzlos. Wirkstoffe, die die Biosynthese des VSG-GPI-Ankers
inhibieren oder die auf spezifische Merkmale dieses GPI-Ankers
zielen, konnten hingegen Erfolg versprechen. Dies erkliirt das
Interesse, das dieser GPI-Anker auf sich gezogen hat. Wahrend
die Struktur des Riickgrats des VSG-GPI-Ankers dem anderer
GPI-Anker ahnelt, scheint die a-Galactose-Seitenkette des
VSG-GPI-Ankers parasitenspezifisch zu sein, weshalb die Entwicklung von Wirkstoffen, die auf diese Seitenkette zielen, erfolgversprechend ist.
Einige metabolische Frdginente des Protein-GPI-Komplexes,
die durch spezifische endogene Proteasen und einer GlycosylPhosphatidylinosit-spezifischen PhospholipaseC (GPI-PLC)
gebildet werden, weisen biochemische Eigenschaften auf, die
zuvor nur bei Rohpraparaten von mutmaDlichen Insulin-Mediatoren (putative insulin mediators, PIMs) festgestellt worden
sind. GPI-PLC unterscheidet sich von PtdIns-PLC, die PtdIns,
PtdIns(4)P sowie PtdIns(4,5)P2 hydrolysiert und nicht an der
Zelloberflache, sondern an der inneren Membran lokalisiert ist.
PIMs sind phosphorylierte Inosit-Glycane, die nach der Stimulation von Zelloberfllchenrezeptoren durch Insulin gebildet
werden und einige der biochemische Wirkungen von Insulin in
Es ist allerdings vervitro hervorrufen konnen[sOO,
fruht, Inositphosphat-Glycane als sekundare Botenstoffe der
Insulindktioii zu bezeichnen. Synthesen von P I M s [ ' ~ ~s.0 9 - s 1 2 1
und verwandten GPIs sowie von Fragmenten mycobakterieller
Inositphospholipide wurden b e s ~ h r i e b e n ~ 31.
~~~,
15. Zusammenfassung und Ausblick
Die ersten Hinweise auf eine Rolle von Ins(1 ,4,5)P3 als sekundarer B o t e n ~ t o f f [ 4191
' ~ ~ machten die Forschung zum Polyphosphoinositid-Stoffwechsel und zu dessen Konsequenzen zu einem
der am intensivsten bearbeiteten Gebiete der moderen Biologie.
Der daraus resultierende Aufschwung in der Cyclitol- und Inositphosphatchemie 1113t auch gegenwiirtig noch nicht nach. Im
Gegenteil, es ist wahrscheinlich, daD ein bedeutender Anteil des
zukiinftigen Fortschritts in der Biologie der Inositphosphate auf
die gegenwartigen Anstrengungen in der Inositphosphatchemie
zuriickzufiihren sein wird. Weitere Entwicklungen von synthetischen Inositphosphat-Analoga mit neuartigen biologischen Eigenschaften konnen vorausgesehen werden, darunter RezeptorAntagonisten, maskierte Derivate, zellpermeable Verbindungen, Affinitlts-, Photoaffini tats- und spininarkierte Inositphosphat-Aiialoga, Fluoreszcnzsonden und an Affinitatssiiulen gebundene Tnositphosphate zur Reinigung von Rezeptoren und
Enzymen. Die Aussicht w f einen vollstiindig neuen, auf
PtdIns(3,4,5)P3 basierenden Signalubertragungsweg, auf die
Charakterisierung der Struktur des noch nicht erfanten Ca2+Einstrom-Faktors ( C I F ) , die Entdeckung von neuen, wirksamen Ins(1 ,4.5)P3-Rezeptorliganden,
die sich wie die Adenopho21 20
B. V. L. Potter und D. Lampe
RO.
Abb. 44. AdenophostinA (R = H) und B (R
=
Y
COCH,)
stine (Abb. 44) nicht von Ins(l,4,5)P3 ableiten, sowie die greifbare Moglichkeit, moderne Wirkstoffe fur pharmakologische
Interventionen in Signalubertragungswege zu entwickeln, bedeutet, daD die interdisziplinare Zusammenarbeit von Chemikern, Zellbiologen, Biochemikern und Pharmakologen entscheidend sein wird, um sich diesen neuen Herausforderungen
zu stellen und die Ergebnisse zu nutzen.
Wir danken dem Wellcome Trust ,fiir ein Prize Fellowship (fur
D. L.) und S. J. Millsf u r die kritische Duvchsicht des Manuskriptes. B . % L. P. ist Pin Lister Institute Research Professor.
Eingegangen am 10. Juni 1994 [A691
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