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Die enzymatische Ribonucleotid-Reduktion Biosyntheseweg der Desoxyribonucleotide.

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[57] W H. Rumsay. Mon. Not. Roy. Astron. SOC. 108. 406 (1948).
[S8] W H. Rumsay. Mon. Not. Roy. Astron. Soc. Geophys. Suppl. 5. 409
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Die enzymatische Ribonucleotid-Reduktion:
Biosyntheseweg der Desoxyribonucleotide
Von Hartmut Follmann[']
Ribonucleot id-Reduktasen sind Enzyme, die in teilungsfahigen Zellen die fur die DNA-Verdoppelung benotigten Desoxyribonucleotide synthetisieren. Sie besitzen damit eine Schliisselfunktion
fur das Wachstum von Mikroorganismen sowie aller pflanzlichen und tierischen Gewebe.
Die Enzyme reduzieren alle vier Purin- und Pyrimidinribonucleotide (als 5'-Di- oder -Triphosphate) unter direkter Substitution der 2'-Hydroxygruppe durch Wassentoff. Physiologische Reduktionsmittel sind die Mercaptogruppen der Thioredoxine, einer Gruppe kleiner Proteine, die
aus der oxidierten Form durch NADPH-abhangige Thioredoxin-Reduktasen regeneriert werden.
Man kennt zwei Typen von Ribonucleotid-Reduktasen (I und II), die die Wasserstoffiibertragung
mit Hilfe proteingebundener Eisen-lonen oder des 5'-Desoxyadenosylcobalamins (Coenzym
BI *) katalysieren; in beiden Fallen sind ferner Radikale nachweisbar. Zur Regulation der
Enzyme dienen Effektornucleotide. Moglicherweise liegt ein homoostatischer Mechanismus
vor, der die Versorgung der Zelle mit DNA-VorlHufern sicherstellt.
1. Desoxyribonucleotideals Bausteine der DNA
Bevor in einem Bakterium oder wachsendem Gewebe bei
der Zellteilung neue Desoxyribonucleinsaure (DNA), der makromolekulare TrPger der genetischen hformation in den
Chromosomen, synthetisiert werden kann, miissen ihre monomeren Bausteine als Substrate der replizierenden Enzyme in
der Zelle verfugbar sein. Diese Bedingung klingt selbstverstandlich, aber unter den zahlreichen Prozessen der Nucleinslure-Synthese[ll (Abb. 1) ist gerade die Bildung der vier Desoxyribonucleotide (Schritt b) erstaunlich wenig bekannt, ganz
im Gegensatzzur sehr gut untersuchten Biosynthese der Purinund Pyrimidinribonucleotide (Schritt a). Ebenso ist die Polymerisation der Desoxyribonucleotide (Schritt c) in vivo noch
nicht in allen wichtigen Einzelheiten gekllrt: Als unmittelbare
Vorlaufer der DNA gelten zwar allgemein die 5'-Triphosphate
des Desoxyadenosins, Desoxycytidins, Desoxyguanosins und
Thymidins - dATP, dCTP, dGTP bzw. dTTP[*'] - aber eine
[*I
Prof. Dr. H. Follrnann
Fachbereich Chemie der UniversilPt
Arbcitsgruppe Biochcmic
355 Marburg,'Lahn. Lahnberge
[**I Die S-Phosphateder Ribonucleoside Adenosin (A). Cytidin (C).Guanosin (G) und Uridin (U) sowie der Desoxyribonucleoside Desoxyadenosin
(dA). Desoxycytidin (dC). Desoxyguanosin (dG) und Thymidin (dT) sind
in iiblicher Wrise als -DP (Diphosphatl oder -TP (Triphosphat) abgekiirzt:
(d)N ist ein unspeziliziertes (Desoxy)Ribonucleosid. DNA: Desoxyribonucleinsaure. RNA: Ribonucleinsaure. FAD: Flavinadenindinucleotid.
NADPH bzw. NADP: reduziertes bzw. oxidiertes Nicotinamidadenindinucleotidphosphat. Zur Struktur dieser Verbindungen vgl. W Saenger. Angcw.
Chem. 35. 680 (1973):Angew. Chem. internat. Edit. 12, 591 (1973).
624
enzymatische Polymerisation der entsprechenden 5'-Diphosphate ist ebenfalls bekanntf2I,und eine DNA-Replikation auf
der Stufe noch andersartig aktivierter 5'-Monophosphate wird
in Betracht gezogen13!
Am inos au ren. Ammoniak,
F o r m i a t , Kohlendioxid, A T P
Hexosen
41
Ribose-5-phosphat
1"
RNA
+-
-
Ribonucleotide
lb
-
NucleotidCoenzyme
2 ' Desoxyribonucleotide
1.
DNA
Abb. I . Abhangigkeit der DNA-Replikation (Schritt c) von der Purin- und
Pyrimidin-Biosynthese (Schritt a ) und der Ribonucleotid-Reduktion (Schritt
bl im Verlauf der de-novo-Nucleinsaure-Biosynthese.
Alle diese Desoxyribonucleotide sind in der Zelle nur in verschwindend kleiner stationarer Konzentration vorhanden.
Durch direkte Analyse lassen sie sich neben den chemisch
ahnlichen. in 10- bis lOOfach hoherer Menge vorkommenden
Ribonucleotiden kaum erfassen. Erst kurzlich lernte mani4*'I,
mit Hilfe der DNA-Polymerase I und synthetischen Polynucleotid-Matrizen in vitro die in einem Gewebeextrakt enthalteAnguw. Chem. / 86. Jahrg. 1974 / Nr. 17
nen Desoxyribonucleosidtriphosphate in Mengen von weniger
als 1 pmol quantitativ zu bestimmen. In Zellkulturen der
Maus@*'I. des
und in Ascites-Tumorzelleni'O1
fanden sich Pools der GroDenordnung 10-100 pmol dNTP
pro lo6 Zellen, die auf Zellkern und Cytoplasrna verteilt
sind"']. Sie zeigen betrachtliche wachstumsabhangige
S c h w a n k ~ n g e n l ~doch
~ ' ~ konnen
~~,
sie die DNA-Replikation
stets nur etwa I-5min lang unterhalten. Nur Eizellen wie
die des Frosches Xcnopus laeois scheinen besser rnit DNA-VorIaufern ausgestattet zu sein, denn der hier gefundene Pool
von 12prnol dNTP pro Zelle['*l reicht fur die Synthese der
DNA von mehr als 2000 neuen Zellkernen.
Zur Aufiiillung der Desoxyribonucleotid-Poolskommen zwei
Wege in Frage: Die Wiederverwertung aus dem katabolen
Stoffwechsel stammender oder von auDen zugefiihrter DNABruchstucke wie Thymidin oder die vollige Neusynthese" '].
Der erste Weg (.,salvage paihway") ist fur auxotrophe Mikroorganismen essentiell; er benotigt eine Reihe von induzierbaren Enzymen wie Nucleosiddesoxyribosyl-Transferasen,
Nucleosid-Phosphorylasen und Nucleosid-Kinasen, die die
Basen, Zucker und Phosphatreste der Nucleotide voneinander
trennen und neu kombinieren konnen.
Da alle anderen Organismen ohne Zufuhr von Desoxyribonucleotiden DNA synthetisieren und auch die in der Nahrung
vorhandenen Nucleinsauren kaum verwerten, rnuD man bei
ihnen allen die Fahigkeit zur de-novo-Synthese voraussetzen.
Dabei stammt der Pentoseanteil der Nucleinsauren aus dem
oxidativen und nicht-oxidativen Kohlenhydrat-Stoffwechsel
der Zelle, wie sich beispielsweise bei der Kultur von Eschcrichia
coliauf '"0-markierter Glucose oder Fructose am Isotopengehalt der RNA und DNA zeigen IaDtl"]. Auf keinem dieser
Wege wird freie 2-Desoxyribose gebildet und dann in Desoxyribonucleotide eingebaut; das im Prinzip zu ihrer Synthese
aus Gl yceraldehyd-3-phosphat und Acetaldehyd befihigte Enzym Desoxyribose-Aldolase" 51 katalysiert in vivo wohl nur
Die Biosynden Abbau von 2-Deso~yribose-5-phosphat~'~~.
these aller Nucleotide fuhrt vielmehr von Ribose-5-phosphat
unter Aufbau der heterocyclischen Basen (Abb. 1) zu Ribonucleotiden, aus denen erst in einer Folgereaktion - unter Erhaltung der N-Glykosidbindung zwischen Zucker und Base die Desoxyribonucleotide entstehen. Diesen Zusammenhang
dernonstrierte erstmals Reichard 1950 an der Verwertung von
IsN-haltigem Cytidin (nicht aber Cytosin) fur RNA rrnd DNA
irn Stoffwechsel der lebenden Rattell']. Ebenso lieI3 sich die
Umwandlung I 4C-markierter Ribonucleoside in Desoxyribonucleotide zuerst in Mikroorganismen-Kultureni' 'I uad spater
in zellfreien Extrakten (z. B. aus E. co/il'yl)nachweisen.
Enzyme, die Ribonucleosid-5'-phosphateunter Ersatz der 2'Hydroxygruppe durch Wasserstoff zu 2'-Desoxyribonucleotiden reduzieren, heiDen Ribonucleotid-Reduktasenlzol.
Reduktionsmittel sind in allen bekannten Fallen Dithiole, die dabei
ins Disulfid ubergehen und in einer weiteren Enzymreaktion
regeneriert werden. Diese Reaktionen sind nur selten zusammenhangend beschrieben wordenl'. L''. 2z1. Dieser Fortschrittsbericht befal3t sich rnit unseren gegenwartigen Kenntnissen vom Vorkommen und von der Struktur der Ribonucleotid-Reduktasen, ihrem Reaktionsmechanisrnus und ihren
ungewohnlichen Regulationsphanomenen. Zahlreiche Arbeitender letzten Jahre zeigen, daD diese bislang wenig beachteten
Enzyme von uberragender Bedeutung fur die Entwicklung
aller Lebewesen sind.
Ang1.w.
Chrm. J 86. Jahrg. 1974 1 Nr. 17
2. Die Ribonucleotid-Reduktasen
2.1. Vorkommen, Isolierung und Nachweis
Ribonucleotid-Reduktasen sind als induzierbare, auf das Engste rnit der Vermehrung von Zellen zusarnmenhangende Enzymeam besten in rasch wachsenden Zellkulturen und Geweben
zu finden; ihr Nachweis in ruhenden Geweben macht groDe
Schwierigkeiten. Bakteriophagen, Mikroorganisrnen in der exponentiellen Wachstumsphase, keimende Manzensamen, embryonale oder sich regenerierende tierische Organe und Tumoren sind typische Materialien fur die Isolierung von Ribonucleotid-Reduktasen (Tabelle 1). Die Mehrzahl der bekannten
Enzyme stammt aus Bakterien und Saugetiergeweben, wahrend beispielsweise die Ribonucleotid-Reduktion in Ptlanzen
noch sehr wenig untersucht ist. Die seit langem in den Arbeitskreisen .van Reichard (Stockholm), Blakley (Iowa City) und
Moore (Houston) studierten Reduktasen von Escherichia coli,
Lactobacillus leichmannii und aus Novikoff-Tumoren zeigen
einige fur alle Enzyme typische Eigenschaften, aber insgesamt
weist die Desoxyribonucleotid-Synthese in den meisten
Organismen viele artspezifische Eigenheiten auf.
Unsere bis vor kurzem noch sehr begrenzte Kenntnis der
Ribonucleotid-Reduktion zeugt von den Schwierigkeiten im
Umgang rnit den beteiligten Enzyrnen. Sie kommen stets nur
in geringer Menge vor und sind hPufig instabile Proteine,
so daD ihre Reinigung rnit klassischen Methoden (z.B. aus
Hefe13zloder W e i ~ e n I ~nicht
~ ' ) leicht gelingt. Eine erfolgreiche
Anwendung der Affnitltschromatographiernit traperfixiertem
Coenzym
oder dATp521zur Reinigung der Ribonucleotid-Reduktasen aus L. leichrnannii, E. coli und dem Bakteriophagen T4 verspricht hier Fortschritte. RibonucleotidReduktasen sind jedoch auch wesentlich muhsamer quantitativ zu bestimmen als die meisten anderen Enzyme. Fur
dievon ihnen katalysierte einfache Reaktion (1)gibt es namlich
keinen raschen Routinetest. Bei der gebrauchlichsten Methode
verwendet man ein radioaktives Substrat wie [S3H]CDP und
bestimmt nach einer papier-, s i i ~ 1 e n - II ~''I ~ .oder dunnschichtchromatographischen A b t r e n n ~ n g l ~das
~ 1gebildete markierte
Desoxyribonucleotid ; besonders in Rohextrakten wird dieser
Test durch andere nucleotid-umsetzende Enzyme gestort.
Weniger empfindlich ist der kolorimetrische Desoxyribosetest
mit Diphenylamin, wozu das gebildete Desoxyribonucleotid
zuerst sauer hydrolysiert werden mu01551.
n=z,3
HO
OH
+
s,
I. +
' 5
NADPH
<I
+
H20
H
HO
K
Ease
0
(' H03P)nO
+
HO
-
::R
:
+
NADPO
Eine auch fur kinetische Messungen geeignete Methode sirnuliert das physiologische Geschehen, indem sie Reaktion ( I )
rnit der Regeneration des Dithiols Thioredoxin durch Thioredoxin-Reduktase [Reaktion (2)] koppelt und den NADPHVerbrauch spektrometrisch verfolgtiSb1;dieser Enzymtest er625
Tabclle I . Rihonucleotid-Reduktase-Aktivit~t in Extrakten mehrercr Organismen und Gewebe.
-.
---
Hcrkunft
-
___
___ ___
--
Typ [a]
_--
__
I
I
II
I1
I1
.Micrucoccir.\ driiirrificans
Buc,illu\ mr'yutrrium
Thrrnrirs X - I /uqriuriciis)
I1
P'
-__
__-
Eukaryontcn
__
-__
..
I1
.
__ _
.
___
__-_ ___ I1
I
I
I
I
I
I
I
I
I
NTP
NDP
NDP
NDP
NDP
.
__
__
___
r191
[23. 241
r251
[261
r271
[281
[281
r2x1
c291
[30, 281
__
_--
.
___
.-
NTP
Lit.
___ .
__
I1
.
_-
Fe. ATP. Mg
Fe. ATP (Mg)
Coenzym Bi2
Coenzym B 1 2
Cwnzym B I 1
Coenzym B 1 2
Coenzym B I Z
Coenzym B ,
Coenzym B, z
Coenzym B,
NDP, NTP
NDP
I1
II
Errylmu qrac ilis. Asrusiu Irmyu (Algen)
Suwhuromyrrs crrecisiur ( Here)
Weizenkcimlinge
Sojabohne, Ackerbohne
Seeigeleier (Arbucia puncruluru)
Seidenfalterpuppen ( Hyulophoru crcropiu)
Hiihnerembryo
Rattenembryo
Thymusdriise (Kalb)
Niere (Maus)
L-Zellen (Maus)
Regenerierende Leber IRatte)
Knochenmark bei pernirioser Anamie (Mensch)
Knochenmark bei Reticulocytose (Kaninchen)
Leukiimievirus-inliziertc Milz (Maus)
Embryonales Gehim (Huhn, Ratte. Mensch)
Ehrlich-Asciteszellen
Novikoff-Ascitestumor (Rattc)
Yaba-Tumorvirus (Rhesusaffe)
Walker-. Morris- u. a. Rattentumoren
-
NDP
NDP
NTP
_-
.
E.dirrichicr coli
Bakteriophage T4 a u l E. roli
Locrohucillus lrichniunnii
Clostricliirm .sricklundii
Rhizohirrm nirlilori
Corvwhucrc,rium irrphr I
Psrirdomoncrs srrr!:t*ri
__
Colaktoren
---
Prokaryonten
- ..
Substrate
__
-
.
Coenzym B I Z
Mg. ATP
Fe. ATP
Mg. ATP
NDP
I
NDP
Fe. ATP. Mg
I
I
I
I
I
I
I
NDP
NDP
NDP
NDP
NDP
NDP
NDP
Fe. ATP. M g
Mg
Me
____ . .._ _ _
Fe, ATP, Mg
-
[a] Siche dazu Abschnitt 2.2.1 und 2.2.2.
fordert aber gereinigte Enzyme und Thioredoxin passender
Spezifitat. SchlieBlich konnen die coenzym-B, 2-abhiingigen
Ribonucleotid-Reduktasen (Enzyme vom Typ 11 in Tabelle
1 )an der Freisetzung von Tritium aus [5'--'H]-5'-Desoxyadenosylcobalamin (Coenzym B,2 , s. u.) wahrend der Reduktion
bestimmt yerden. Das entstehende radioaktive Wasser wird
dazu aus der Reaktionslosung absublirniertlz6V571.
2.2. Spezititat der Enzyme
Alle gereinigten Ribonucleotid-Reduktasen katalysieren die
Reduktion der vier natiirlichen Ribonucleotide - und auch
solcher mit unnatiirlichen Basen - durch das gleiche Enzymprotein; es gibt keine Anhaltspunkte dafur. daR die anderen
Systeme mchrere, fur einzelne Nucleotide spezifische Enzyme
enthalten. Ferner gleichen sich alle Ribonucleotid-Reduktasen
darin. daR sie in vitro niedermolekulare Dithiole wie Dithioerythrit oder reduzierte Liponsaure als Reduktionsmittel akzeptieren und die 5'-Di- oder -Triphosphate der Ribonucleoside
als Substrate benotigen. Eine Reduktion auf der 5'-Monophosphatstufe scheint nicht vorzukommen, kann allerdings in ungereinigten Extrakten durch Nucleotid-Kinasen vorgetiiuscht
werden. Dariiberhinaus aber mu6 man die Ribonucleotid-Reduktasen nach Cofaktorbediirfnis und Proteinnatur in zwei
sehr verschicdene Gruppen ordnen.
2.2. I . Ribonucleosiddiphosphat-Reduktasen(EC 1.17.4.1)
Enzyme vom Typ I (Tabelle I ) - reprasentiert durch das
BUS E. coli - linden sich bei Mikroorganismen, Pflanzen und
Tieren bis hin zum Menschen. Soweit bekannt. reduzieren
sie stetsdie Diphosphate ADP, CDP, G D P und UDP. Charakteristisch fur diese Gruppe ist, daO sie die Redoxreaktion
(Wasserstoff-Ubertragung) zwischen Dithiol und Ribose nicht
mit Hilfe eines der klassischen Coenzyme katalysieren, sondern proteingebundene Eisen-Ionen enthalten. die fur die Enzym-Aktivitat essentiell sind. Die Existenz eines solchen Enzyms wird daher oft an einer Stirnulierung der RibonucleotidReduktion durch niedrige Konzentrationen von Eisensalzen
oder an einer lnhibierung durch Eisen-Komplexbildner erkannt. Besondcrs spezilisch hemmen HydroxyharnstofTfs81
oder I-Formylisochinolin-thiosemicarbazon~59~
die Enzymreaktion; allerdings ist diese Hemmung nur teilweise reversibel
und fuhrt wahrscheinlich auch zu weiteren Veriinderungen
an den Proteinen. Viele dieser Enzyme benotigen ferner Magnesium-lonen und ATP (als Effektor, nicht als Energiequelle)
zur Aktivitat. Es laBt sich noch nicht erkennen, ob dies fur
alle Reduktasen vom Typ I gilt.
2.2.2. Ribonucleosidtriphospha/-Reduktasen(EC 1.17.4.2)
Der Typ I1 (Tabelle 1) umfaBt Enzyme, an deren Wasserstoffubertragung 5'-Desoxyadenosylcobalamin beteiligt ist. Diese
Coenzymform des Vitamins Bt katalysiert iiber die 5'-Methylengruppe des Adenosylrestes (vgl. Abb. 3) mehrere enzymatische Wasserstoff-Verschiebungen'b0';ihre Beteiligung an der
Ribonucleotid-Reduktion wurde in einem zellfreien Extrakt
von Lactohacillits zuerst von Blakley und Barker erkannt[2sl.
Anstelle der Triphosphate ATP. CTP, G T P und UTP konnen
einige Enzyme offenbar auch Diphosphate als Substrate umsetAngnv. Chem. 1 86.Jahrg. 1974 J Nr. 17
Zen. Durch Metall-Ionen werden sie wenig beeinfluDt. Mit
Ausnahme der niederen Alge Euglena scheinen die coenzymB, *-abhangigen Ribonucleotid-Reduktsen nur in Prokaryonten (Organismen ohne Zellkern) vorzukommen. Mit dem sehr
empfindlichen Test mit radioaktivem Coenzym ist ihre Verbreitung in vielen Mikroorganismen untersucht wordedL8I,
doch gibt es hier selbst bei nahe verwandten Arten kein gesetzmaDiges Vorkommen. Viele vergebliche Versuche hat man
darauf verwandt, die Teilnahme BI 2-abhangiger Reduktasen
an der DNA-Synthese von Saugern, insbesondere bei der ungeregelten DNA-Bildung in den Megaloblasten des Knvhenmarks bei pernizioser Anamie, zu zeigen, doch ist die Wirkung
von Vitamin B l r in diesen Systemen mit Sicherheit nicht
rnit der Ribonucleotid-Reduktion in Verbindung zu bringen14*'.
23. Proteinstruktur
Nur wenige der in Tabelle 1 verzeichneten Ribonucleotid-Reduktasen wurden weit genug gereinigt, um Details ihrer
Proteinstruktur und der Bindung von Substraten und Effektoren zu analysieren. Ein Blick auf Tabelle 2 erlaubt noch keine
weitgehenden Vergleiche. lmmerhin fallt auf, daD mehrere
eisenabhangige Reduktasen gqoDe Proteine rnit zwei ungleichen, fur sich allein inaktiven Komponenten sind, die man
als eine regulatorische und eine katalytische Untereinheit auffassen kann. So besitzt von den getrennten, reinen Untereinheiten des Enzyms aus E. co/i["') Protein B1 mindestens vier
verschiedenartige Nucle~tidbindungsstellen~~~~,
wahrend B2
zwei Eisen-Atome. aber keine Nucleotide bindet. Ihr enzymatisch aktiver 1 : 1-Komplex bildet sich in Gegenwart von Magnesium-lonen und des positiven Effektors dTTP: Bindung
tisch inaktiven Apoproteins rnit Eisen(Il)-ascorbat wieder zu
einem voll funktionsfahigen B2 r e k ~ n s t i t u i e r e n ~ ~ ' ~ .
Das UV-Absorptionsspektrum des Metalloproteins wie das
MoDbauer-Spektrum (gemessen am ["Fel-Protein BZ)lh7I
deuten auf eine nahe strukturelle Verwandtschaft rnit den
Hamerythrinen hin; in diesen sauerstoff-transportierenden
Proteinen meeresbewohnender Wurmer und ArmfuBer liegen
zwei ,,high-spin"-Eisen( iir)-Ionen in einem antiferromagnetisch
gekoppelten (d. h. insgesamt diamagnetischen) zweikernigen
Komplex vor, dessen Proteinliganden allerdings unbekannt
sind. Die Funktion des Eisens im €32 ist offenbar weder Sauerstoff- noch Elektronentransport, sondern es dient zur Erzeugung und Stabilisierung eines ebenfalls in der Untereinheit
B2 nachweisbaren organischen Radikals. das seinerseits wahrscheinlich an der Reduktion beteiligt ist (s. Abschnitt 3:l).
Das T4-Phagenenzymlhz1ist dem von E. cob in all diesen
Eigenschaften sehr ahnlich.
Die coenzym-B I 2-abhangigen Reduktasen scheinen etwas einfacher gebaut zu sein. Das relativ kleine Lacroboci/lus-Enzym
vereinigt alle katalytischen und regulatorischen Bindungsstellen - mindestens vier f i r Substrat, Coenzym und Effektoren
- in einer einzigen Polypeptidkette von nicht aukrgewohnlicher L a r ~ g e i ~Ihre
~ I . Aminosaureanalyse und erste Versuche
zur Darstellung groDerer Proteinfragmente wurden beschrieben ; kinetische und mechanistische Untersuchungen sind an
diesem Enzym besonders weit fortgeschritten.
2.4. Subzellulare Lokalisation
Die Lokalisation der Ribonucleotid-Reduktasen in der Zelle
ist noch nicht systematisch untersucht worden. Im allgemeinen
Tabelle 2. Proteinslruktur gereinigter Ribonucleotid-Reduktasen
~- .
Herkunfl und
Reinigungsgrad
~
.-
__-
Escherichiu coli
-----
Mol.-Gew. und/oder
Scdimentationskonstante
.
245000 9.7-10.1 S
(homogent
Phage T4 (homogen)
225000
Rattenlebcr 1300 x )
Knochenmark (50 x 1
6.6 S
NovikolT-Tumor (1 50 x )
L. Irichntuniiii (homogrn)
76000
7.hrrmuc X-1
x0ooo
.
Eigenschaften
.
_.___ .
..----_
-. Durch Chromatographie trennbar in B I ~Mol.-Gcw t6oooO. 2 Pcptidketten)
und 82 (Mol.-Gew. 78000. Z Peptidketten): B1 bindet Nucleotide. B2 mthllt
2 Afome Fe flichtabs. 360. 410nm);81 : B2-Komplex durch Mg stabilisiert:
in d AT P-Gegenwart ina kt ives Di mercs
I Protein mii 2 Atomen Fe (Lichtabs. 360. 4IOnm). wenig durch Mg
stabilisiert: denalurierende Elektrophoresc crgiht Z Peptidkcttenpaare
vom Mol.-Gcw. 80000 brw. 35000
Aggrrgiurt und insktivicrt in dATP-Gcgcnuarl
Durch ihromatographie trennbar in 2 ungleiche Proteine SI und S2.
getrehnt inaktiv
2 ungleiche Proteine PI und P2
I Polypeptidketle (ca. 690 AminosBuren), nicht dissoriier- oder
aggregierbar
Aktivitltsmaximum bei 70 C. stabil bis 80 C. Erfektorenwirkung nur
bei hoher Temperatur I Konlormationslnderung'!)
- -
des Inhibitors dATP fuhrt zu einem inaktiven. aggregierten
Protein. Aminosiiureanalyse und andere Eigenschaften dieses
Enzymsystems wurden beschriebent6').
Von besonderem Interesse ist an diesen Proteinen naturlich
die Bindungsart der Eisen-Atome. Im E.-coli-Protein B2 sind
sie gegen Reduktions- und Oxidationsmittel inert und auch
nicht (wie in anderen ,,Nicht-Ham-Eisen"-Verbindungen)an
anorganischen Schwefel gebunden, lassen sich durch vorsichtiund Imidazol
ge Dialyse gegen 8-Hydroxychinolin-5-sulfonat
aus dem Protein entfernen und durch Behandeln des enzymaAngew. Chem. / 86.Jahrg. I974
/ Nr. 17
--
halt man sie fur cytoplasmatische Enzyme, denn in Zellkernen,
Mitochondrien und Mikrosomen der Rattenleberr421oder der
Novikoff-Tumore[6*1ist nur geringe oder keine Reduktase-Aktivitat festzustellen. Neuerdings haben sich Anhaltspunkte dafur ergeben, daO in diesen Geweben Ribonucleotid-Reduktase
zusammen rnit weiteren Enzymen der DNA-Biosynthese Thymidylat-Synthetase, Thymidylat-Kinase und DNA-PolyDiese
merase I1 - als ein Enzymkomplex vorkommt~68~6y1.
Enzym-Aktivitaten sedimentierten in der Ultrazentrifuge rnit
einer postmikrosomalen Membranfraktion unbekannter Her627
kunft und- waren nach Zerstorung der Membranfragmente
als Partikeln von 8.5-12 nm GroBe elektronenoptisch sichtbar.
Die Membrankomponente scheint fur Aktivitat und Zusammenhang der Enzyme nicht essentiell zu sein. Ahnliches Material mit hoher Reduktase-Aktivitat war auch aus Thymus,
Milz und HeLa-Zellen zu isolieren.
3. Wirkungsweise und Regulation
3.1. Die Reduktion der Hydroxygruppe
Wie wird eine der beiden sekundaren Hydroxygruppen der
Ribose bei p H = 7 und Korpertemperatur selektiv zur Methylengruppe reduziert ? Als nicht-enzymatische Parallelen lassen
sich Desoxygenierungen bei hoher Temperatur oder katalytiNHz
HO
OH
Hb
OTos
(3)
NH2
sche Hydrierungen fur Nucleotid-Molekule kaum anfuhren,
und die einzige bekannte chemische uberfuhrung eines Ribonucleotids (AMP) in das entsprechende Desoxyribonucleotid
durch Verkniipfung der 2’-Hydroxygruppe und der Adeninbase ,und anschlieBende Entschwefelung’des intermediaren 8,2’Anhydroadenosinthioathers [Reaktion (3)][’01 verlauft auch
keineswegs unter physiologischen Bedingungen. Die hohe Spezifitat der Enzymreaktion fur Ribonucleotide mit ungestorter
2‘,3’-ci~-Diolgruppierung~~~]
IaBt sich mit einer mehrfachen
Fixierung der Substrate am Protein uber die Phosphat-Ionen,
die Nucleobase und die 3’-Hydroxygruppe deuten (vgl. Abb.
4), aber die Aufklarung der Redoxreaktion selbst erweist sich
fur den Chemiker und Enzymologen als ein gleichermaBen
schwieriges wie interessantes Problem.
Das Schicksal der beteiligten Atome und Gruppen ist in den
Enzymen aus E. coli und L. leichmannii mit isotopen-substituierten Modellnucleotiden und spektroskopischen Techniken
so griindlich studiert worden, daB man trotz der sehr unterschiedlichen Proteinstruktur und Cofaktoren an eine prinzipiell ahnliche Wirkungsweise dieser beiden bakteriellen Reduktasen denken kann. Es darf als sicher gelten, daB die
2’-Hydroxygruppe auf direktem Wege ohne Durchlaufen von
Zwischenstufen reduziert wird [(Abb. 2 (a)]. Die im folgenden
genannten Experimente schliekn Reaktionsfolgen wie Dehydratisierung-Hydrierung (b) oder Oxidation-Reduktion (c) aus,
und auch eine Aktivierung der Hydroxygruppe durch Phosphorylierung (d) ist nicht nachzuweisen, da synthetisches Cytidin-2-phosphat-5’-diphosphat
kein Reduktase-Substrat i ~ t l ” ~ .
In beiden Systemen tritt nur ein neues Wasserstoff-Atom unter
Konfigurationerhaltung (Retention) am asymmetrischen C2’
in das Molekiil ein. Dies folgt aus c h e m i s ~ h e nund
~~~~~~~
kernresonanzspektroskopischen A n a l y ~ e n [ ~ ~ der
. ” ] erhaltenen monodeuterierten (oder -tritiierten) 2’-Desoxyribonucleotide, wenn die enzymatische Reduktion in z H z O oder ” 2 0
und folglich mit deuteriertem oder tritiiertem Dithiol R(S*H),
als Reduktionsmittel ausgefuhrt wird. Die Zuordnung der
enzymatisch gebildeten Produkte wurde auch durch unabhangige Synthese der beiden epimeren [2’-(u- oder p-)Deuterio]-2‘desoxycytidine gesi~hert[~’].Diese Ergebnisse sind nur mit
dem direkten Weg (a) vereinbar und widerlegen zugleich eine
- am Furanosering ohnehin unwahrscheinliche - unter Inversion verlaufende SN2-Substitutionder Hydroxygruppe.
Das coenzym-BIZ-abhangigeEnzym Diol-Dehydrase aus Aerohacrer aerogenes katalysiert eine der Ribonucleotid-Reduktion verwandt erscheinende Oxidoreduktion von Propandiol
zu Propionaldehyd. die unter Sauerstoff-Wanderung uber eine
Epoxid-Zwischenstufe verlauft [Reaktion (4)][77’.Durch Umsetzung spezifisch “0-markierter Adenosintripho~phateI~~~
mit Lactohacillus-Ribonucleotid-Reduktasehaben wir bewiesen, daB in diesem System keine intramolekulare Wanderung
der Sauerstoffatome 2’ und 3‘ erfolgt, sondern 02’vollig aus
Abb. 2. Miigliche Reaktionswege f i r den Austausch der Ribose-2’-hydroxygruppegegen Wasserstoll: a) Dirrkte
Substitution, b) Dehydratisierung-Hydrierungc)Oxidation-Reduktion.d)AktivierungdurchATP. P = Phosphatrest. B = Nucleobase.
628
Angew. Chum.
1 86. Jahrg. 1974 Nr. 17
dem Molekul verschwindet und 0'' in [3'-I80]ATP von der
Reduktion unberuhrt bleibt. lnkubiert man jedoch [2'"O]ATP mit Enzym und Coenzym ohne Reduktionsmittel,
so erfolgt auch keine Aquilibrierung des Isotopengehaltes an
BH
H-C-b-CH,
H1) *AH
+
v
H
H\
I
C-C-CH3
HO'*g
HO-F-Y-CH,
HO* n
H\
-t
4
H
(4)
I
C-Y-CH!,
H
%o"
eine Anderung des Coenzymspektrums (mit dreiwertigem Kobalt als Zentralatom) zu einem Spektrum des reduzierten Cob(1r)alamins und das Auftreten eines ESR-Signals bei g = 2.1 19,
das mit einem enzymfixierten Komplex der Radikale
[>to2' <] und [Y-Desoxyadenosyl-] zu vereinbaren 1st. In
Substratgegenwart nimmt die Konzentration dieser Zwischenstufe rasch wieder ab. In langsamer, irreversibler Reaktion bilden sich daneben 5'-Desoxyadenosin und Aquocob(rr)alamin,
wobei andere ESR-Signale auftreten'8"1. Man darf annehmen, daB das durch homolytische, reversible Spaltung der
Co-C-Bindung im Coenzym entstehende DesoxyadenosylRadikal im Zusammenwirken mit einer oder mehreren Thiolgruppen sowohi fur den Wasserstoff-Austausch als auch fur
die Reduktion der Ribose verantwortlich ist (Abb. 3).
02'mit H2'"0, d.h. eine klassische SN1-Reaktionunter Ionisierung a n c*'findet auf Weg (a) ebenfalls nicht ~ t a t t ~ " ~ .
Das bis auf Oz iibereinstimmende lsotopenmuster der RNA
und DNA von E. coli in '80-haltigem Mediumtt4]zeigt, daD
auch hier der 2'-Sauerstoff in ganz analoger Weise reduktiv
entfernt wird.
Nucleotide, in denen die freie 2'-OH-Gruppe durch einen
Pho~phatrest~"~,
durch einen Methoxy-18'1, Amino-, Azidooder Chlorsubstituentenisol oder durch eine OH-Gruppe in
der arabino-Konfiguration ersetzt ist[*'I, werden durch Ribonucleotid-Reduktase nicht umgesetzt ; aber auch 3'-Xylonucleotide, 3 ' - D e ~ o x y - l8~3 1~und
. 3'-O-Methylribonucleotide werden nicht reduziertlR1].Da die meisten dieser Verbindungen
auch keine wirkungsvollen lnhibitoren sind, nehmen wir an,
daf3 die 3'-Hydroxygruppe eine Bindungsstelle zum Enzym
ist und Substrat-Eindung (an 3'-OH) sowie Substrat-Redukfion
(an 2'-OH) konzertiert ablaufen. Alle diese Befunde lassen
sich formal mit einer SNi-Reaktion vergleichen, bei der sich
der Austausch der Hydroxygruppe in einem vorfixierten Komplex mit mehreren Reaktionspartnern (Enzymgruppen und
reduzierendem Agens) unter Konfigurationserhaltung vollzieht.
Weit weniger Klarheit herrscht uber die Wasserstoff-ubertragung zwischen Thioredoxin oder einem anderen Dithiol und
der Ribose-2'-Position. Es mehren sich experimentelle Hinweise dafur, daD in diesem ProzeD radikalische Zwischenstufen
auftreten, die durch die Cofaktoren - Eisen-Atome bei E.
coli, 5'-Desoxyadenosylcobalaminbei L. leichmannii - stabilisiert sind. So beobachtet man im Metalloprotein B2 em organisches Radikal, das durch eine Lichtabsorption bei 410nm
und ein ESR-Signal bei g = 2.0047 charakterisiert ist und dessen
Zerstorung (z. B. durch Hydroxylamin) ein Verlust der EnzymAktivitat genau parallel gehtlc7I.
Noch direkter ist eine wasserstoff-ubertragende Funktion des
Coenzyms im Lactobacillrrs-Reduktasesystem nachzuweisen.
Seit langerem weiD man, daD dieses Enzym in Gegenwart
von Dithiolen und eines Effektors wie d G T P einen Tritiumaustausch zwischen synthetischem [5'-3H]-5'-Desoxyadenosylcobalamin und Wasser - der als Aktivitatstest genutzt wird
- oder umgekehrt zwischen 3 H , 0 und unmarkiertem Coenzym katalysiert und daD dieser Tritiumaustausch sowie die
Substratreduktion durch Proteinreagentien wie N-Bromsuccinimid in gleicher Weise gehemmt werded2". 'I.
Das reaktive Zwischenprodukt, indem drei Wasserstoff-Atome
an Cs' des Coenzyms gleichwertig sein mugsen, IieD sich kurz~.
lich mit Techniken schneller Reaktionen a u f f ~ n d e n*'I;~ ~mit
einer Halbwertszeit im Bereich 10-100 ms beobachtet man
ARQCW. Chrm. 1 116. Johrg. 1974
1 Nr: 17
5 ' - Desoxyadenosylcobalamin
Enzym
pcmetzung
Q
H- 7-H
H
5 ' - Desoxyadenosin
Cob( 11)alamin
Abb. 3. Slruktur und Funktion von 5'-Desonyadenosylcobalamin (Coenzym
B,2 ) bei der Ribonucleotid-Reduklase aus L. kfchmunnii (modifiziert nach
1841). Der Obergang eines Wasserstoffisotops (*) von markiertem Coenzym
auf Wasser oder vom Wasser auf das Coenzym oder das Substrat wird
deutlich. A =Adenosin -C3'. B=Nucleobase. P = Phosphaireste. R =Thioredoxin odcr Dithiol. Corrinringsystem und unterer axialer Ligand dcs
Kobalts sind nur angedeutet.
Es durfte schwierig sein, in solchen Enzym-Radikal-ThiolKomplexen die Art des Wasserstoff-Transfers als letzten
Schritt der Substrat-Reduktion getrennt zu analysieren. Ein
einem Nucleotid-Radikal zuzuschreibendes ESR-Signal lief3
sich bisher nicht beobachten. Es muD daher offenbleiben, ob
die Hydroxygruppe letztlich durch ein Wasserstoff-Atom oder
ein Hydrid-Ion ersetzt wird. Zur Beantwortung dieser Frage
bedarf es auch genauerer Kenntnis der Aminosaureseitenketten im katalytischen Zentrum der Proteine, denn die Hydroxygruppe konnte beispielsweise von dort spezifisch protoniert
und als Wasser ubernommen werden. (Bisher wurde lediglich
629
die Beteiligung von Cysteinresten an der Aktivitat beider bakterieller Reduktasen wahrscheinlich gemachtlb6.871.)
Alle Beobachtungen zusammengenommen lassen einen hochgeordneten U bergangszustand aus Substrat, Aminosauregruppen des Enzyms und einer reduzierenden Spezies aus Cofaktoren und SH-Gruppen erwarten, den ich als Momentaufnahme in Abbildung 4 zu beschreiben versuche. Die dynamische
beobachtet wirdtS9’;selbst ganz unnaturliche und langsam reagierende Nucleotide wie (N-Ribofuranosylbenzimidazol)-5’triPhoSPhat u n t e r k e n der Stimulation‘*
Uber die Wirkungsweiseder Effektoren ist - wie in den meisten
derartigen Fallen - wenig bekannt. Einige Beobachtungen
weisen auf Konformationsanderungen am Protein hin. wie
sie das Modell einer allosterischen Regulation vor-
Abb. 4. Hypothetisches Modell des aktiven Zentrumseiner Ribonucleotid-Reduktase.Das Substrat ICylidindiphosphat) wird am Protein iiber die terminalen Phosphatrestesowiedie 3’-HydroxygruppeBxierl ;die Giitc
der Bindung an der Nucleobax hingt von einem allosterischen E f f e k t o r a ab. Die Reduktion an C“ wird
durch andere Effektoren @ stimuliert, die die Bindung des wasserstoff-liefernden Systems optimieren. X ist
der Eisenkomplex bzw. das Cobliijalamin-Radikal der Typ-I- bzw. Typ-11-Reduktasen. Pfeile am Protein
symbolisieren Wechselwirkunpn unbekannter Natur. B = basischer Aminossureresl. P = Phosphate.
R.R’ = H oder OH.
Tabelle 4. Relative Reaktionspschwindigkeitender Ribonucleotid-Reduktion
durch Lcrc.fohori//us-Reduktase[XI. 891.
Situation wird jedoch in Wirklichkeit durch die Bindung allosterischer Effektoren am Enzym noch wesentlich schwerer
durchschaubar.
--
-.
-~
Effektor
-
-
ohnc
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
araATP
3.2. Regulation der Enzym-Aktivitat
__
.-
GTP
ATP
100
86
20
UTP
__
-.
CTP
ITP[a]
-_ _
BzTP [b]
~
14
36
37
31
I02
6
._
0.2
z
103
IS
Die Beeinflussung des Substratumsatzes durch Effektoren oder
38
II
36
Modifizierer ist fur Ribonucleotid-Reduktasen so charakteri.
.
-.
- - -.
-.
.stisch. daB ihre Beschreibung viele Seiten f i i l l t ~ 3 0 ~ s 7 ~ b -2 ~ h s ~ n[a]
’ ~nosintriphosphdt.
[b] (N-RiboTuranosylbenzimidazol)-S‘-triphosphdt.
8 3 . 8 H - u IIn
I . erster Linie greifen Desoxyribonucleosidtriphosphate und ATP, aber auch modilizierte NucleotideI8’ --wbeschleunigend oder hemmend in die Enzymkatalyse ein, wobei
sowohl K,-Werte als auch Geschwindigkeitskonstanten der
sieht[3(>.4 2 . 6 5 . h h l . M an kann sich vorstellen, daD hierbei das
Substrate verandert werden. Tabelle 3 zeigt, daD es unter
katalytische Zentrum einer Reduktase besonders optimal oder
den Typ-I-Enzymen in dieser Hinsicht Ahnlichkeiten, aber
weniger gut geordnet wird (Abb. 4). Umfangreiche Bindungsauch groBe artspezifische Unterschiede gibt. Anders ist das
studien[’ i . h s l belegen, daD es zwei Klassen von regulatorischen
Wirkungsmuster im Fall der Lactobacillus-Reduktase (Tabelle
Tabelle 3. Wirkung von Nucleosidtriphosphaten auf die Ribonucleotid-Reduktion : Stirnulierung ( + ) und Hemmung I - ).
. ..___.
...
_ _ _ _ _- .-__- .- ... __- .
__ .
. __
E. c o l i [65. 901
T4-Phage [62]
Novikoff-Tumor [XS]
Elkktor
UDP C D P G D P ADP
UDP C D P G D P ADP
UDP C D P G D P ADP
_.
dTTP
dCTP
dGTP
dATP
ATP
.
.
+
+
-
_
+
+
+
+
-
+
+
-
_____ .
.
+
+
+
+
+
+
+
+
-__--
. .- -
+
.. .
+
+
+
.
4), bei der neben geringfugiger Produkthemmung eine ausge-
pragte spezifische Stimulierung der Reduktion von ATP durch
dGTP, von CTP durch dATP und von UTP durch dCTP
630
-
-
-
-
+
+
___ ___ -
+
-
+
+
-
-
+
-
__
Zentren an den E.-coli-Untereinheiten gibt, die einerseits die
Substratspezifitat ‘und andererseits die Gesamtaktivitat des
Enzyms steuern.
Awew. Chem. 186. Jahrg. 1974
1 Nr. 17
dUDP) entstehen mussen, ehe.sie eine Kontrolle durch Ruckkopplung (,,Feedback") ausuben kOnnen1l3! Veranderungen
der Desoxyribonucleotid-Poolsin Gewebekulturen unter dem
EinfluD von Thymidin und anderen Nucleosiden im Medium
sprechen fur die allosterische Regulation auch in intakten
ZeIIen" "1.
Auch die Lac.tobacillrts-Reduktase reagiert auf zwei Gruppen
von Effektornucleotiden, von denen eine wiederum die Substratspezifhat und die andere die Enzym-Coenzym-WechseIwirkung einschlieDlichdes Tritiumaustausches betrifftI8' I . Eine
regulierende Wirkung der Coenzymkonzentration auf Substrat- und Effektorbindung wird ebenfalls be~bachtetl~'~.
Die
starke Basenspezifitat all dieser Effekte laDt in den katalytischen wie regulatorischen Zentren erhebliche Bindungsanteile
durch die Amino- und Ketosubstituenten der Nucleobasen
erwarten, die noch kaum analysiert sind.
4. Das wasserstoff-liefernde Thioredoxinsystem
Der zur Ribonucleotid-Reduktion benotigte Wasserstoff
stammt letztlich aus dem fur synthetische Zwecke verfugbaren
NADPH-Poolder Zelle, doch wird er nur unter Zwischenschaltung eines spezifischen ,,Redoxins" verwendet. Das Thioredoxinsystem - zuerst in E. coli aufgefunden - besteht, wie bereits
erwlhnt (Abschnitt 2.1), aus dem kleinen Protein Thioredoxin,
dessen Cysteinreste reversibel zwischen Dithiol- und Disulfidform wechseln, und aus dem Flavoenzym Thioredoxin-Reduktase, das fur die Ruck-Reduktion des oxidierten Thioredoxins
sorgt. Unter Einbeziehung der (wahrscheinlichen) Vorgange
an Enzymen und Coenzymen ergibt sich damit ein vielstufiger
Es liegt nahe, aus den in Tabelle 3 und 4 zusanimengestellten
Regulationsphanomenen einen homoostatischen Mechanismus zu konstruieren, der eine ausgewogene Versorgung der
Zelle mit allen vier Desoxyribonucleotiden sicherstelit: HPuR
sich ein einzelnes Nucleotid wahrend der DNA-Synthese an,
so stimuliert es die Produktion der anderen; wird dagegen
keine DNA mehr gebildet, dann hemmt eine Anhaufung bestimmter Nucleotide auch die weitere Ribonucleotid-Reduktion. Detaillierte derartige Modelle wurden vorgeschlagenina - 9 t i
NADPH
FAD(ox)
Enzymfixiertes
Radikal
Thioredoxin(red)
Desoxyribonucleotid
[H&]
I
EA
E' = -0.31
FAD( red)
NADP@
= -0.25
V
X X
Enzym-SH
'I'hioredoxin(ox)
Thioredoxin-Reduktase
Ribonucleotid
(7)
I
Ribonucleotid- Reduktase
Abb. 5. Zwischenstufen der WasserstoN-Ubertragung von NADPH aufRibonucleotide durch Thioredoxin-Reduktase und RibonucleotidReduktase In der vorletzten Stufe is1 die Struktur des 5'-Desoxyadenosylrestes (Typ-11-Reduktasen)angedeutet (vgl. Abb. 3). P = Phosphatreste. B = Nucleobase
In welchem AusmaB diese Regulation in vivo tatsachlich verwirklicht ist, l2Bt sich freilich aus dem Verhalten der isolierten
Ribonucleotid-Reduktasen bei zum Teil unphysiologischen
Konzentrationsverhaltnissen schwer beurteilen. Eine andere
Unbekannte ist die Geschwindigkeit und Kontrolle der Biosynthesewege, auf denen Effektornucleotide (insbesondere
d m p ) erst a ~ Sden Primaren RduktionsProdukten (z. B.
Wasserstoff- und Elektronentransport von NADPH bis zur
Ribose (Abb. 5).
Thioredoxine sind hitzestabile, aus etwa 100 ~
~
aufgebaute polypept,de mit einem Molekulargewicht
12000, die auS dem Phagen T4,
Bakterien, ~~f~ und
Leber isoliert worden sind (Tabelle 5). Sie besitzen selbst
keine Enzym-AktivitPt, sondern enthalten als aktives Zentrum
Tabelle 5. Molekulargcwichte und anderc Eigenschaften von Thioredoxin und Thiorcdoxin-Reduktasen.
__
--
Herkunft
__ _ _
E.whrrichiu d
i
-__
.
___ .
TCPhage
Lac~ohacillurLichmnonnii
Hcfe
Rattenlcber
Kalhsleber
NovikoN-Tumor
Angew. Chem. 86. JahrQ. 1974
Thioredoxin
--
___
Thioredoxin-Reduktase
---.. -
.-
__
__
.
I 1651. 108 Aminosiuren. 2 Cys
660M)- 73000. 2 Peptidkelten. 2 FAD
87 Aminosiuren. 2 Cys
I2000
12600. ca. 120 Aminosauren. 4 Cys
noch nicht bis zur Hornogenitat gereinigt
12000. 103 Aminosiuren. 4 Cys
I2 100, 109 Aminosiiuren, 6 Cys
nicht nachgewiesen
__
1 Nr. 17
__
55000
75000.2 Untcreinheitcn, 2 FAD
66 700
-
Llt
__
__
-
r92.99. 101. 1041
r931
P I
[95. 102.1191
"96. 1001
P I
__
__
~981
_631
zwei Cysteine, die durch zwei andere Aminosauren voneinander getrennt sind ;in E. coli und Hefeflo'. '02) hat dieser Bereich
jeweils die Sequenz -Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys-,beim TCPhagen heiBt sie -Lys-Cy~-Val-Tyr-Cys-Asp-[~~~.
Die Oxidation
zum Disulfid unter Bildung eines 14gliedrigen Ringes ist von
betrachtlichen lokalen Konformationsanderungen begleitet,
die von der wechselnden Tryptophan-Fluoreszenz der Molekule direkt angezeigt werden[lo3! Die NADPH-spezifischen
Thioredoxin-Reduktasen,deren Existenz ebenfalls in mehreren
Geweben nachgewiesen wurde (Tabelle S), enthalten - ahnlich
wie Glutathion-Reduktase - FAD als prosthetische Gruppe;
daneben nimmt im E.-coli-Enzym wiederum eine Disulfidgruppierung der Sequenz
-Ala-Cys-Ala-Thr-Cys-Asp-
u
Pools stark Z U ~ ' ~ ' ~Im
. Gehirn von Huhner- und Rattenembryonen fallt ein ausgepragtes Maximum dieser Enzym-Aktivitat zeitlich ungefahr rnit der starksten Vermehrung von Neuroblasten z~sammen1~'l.
Noch deutlicher wird die Schlusselfunktion der RibonucleotidReduktase fur das Zellwachstum, wenn man ihre Aktivitat
(oder die GroBe der dNTP-Pools) wahrend des Teilungscyclus
in Kulturen synchronisierter Zellen verfolgt und mit der DNASynthese vergleicht. In L-Zellen der Mausf4I1und - besonders
~ ~ ~ l die Ribonugut sichtbar (Abb. 6) - in H e f e ~ e l l e n [erreicht
cleotid-Reduktase ihren Gipfel kurz vor der starksten DNAProduktion wahrend der S-Phase (das ist die Synthesephase
nvischen zwei Zellteilungen). Die Menge der in synchronisierten Saugerzellen (Maus, H a r n ~ t e r ) I ~vorhandenen
-~]
vier Desoxyribonucleotide steigt ebenfalls erst wahrend der S-Phase
etwa lOfach an und fillt in der fruhen G2-Phase, wlhrend
oder kurz nach dem DNA-Synthesemaximum wieder ab.
am Redoxvorgang teil[loJ'.
Thioredoxine. Thioredoxin-Reduktasen und RibonucleotidReduktasen verschiedener Arten sind in heterologen Mischungen von wechselnder Aktivitat, ohne daB sich bisher eine
Systematik ihrer Austauschbarkeit erkennen IieRe. Das leicht
zugangliche E.-coli-Thioredoxin hat sich als Wasserstoffdonor
fur die Luctohuciilrcs-und Hefe-Ribonucleotid-Redu ktasen bewahrt[10S.322], aber ist fur die Reduktasen des TCPhagen und
des Weizens inaktiv["* 331.Wahrend die E.-coli-RibonucleotidReduktase alle bekannten Thioredoxine akzeptiert, ist die
Thioredoxin-Reduktase des gleichen Bakteriums streng spezifisch fur das eigene oxidierte Thioredoxin und das des T4-Phagen'y3-ys
Ribonucleotid- und Thioredoxin-Reduktion stehen mit andercn Stoffwechselwegen der Zelle kaum in Zusammenhang.
Lediglich eine Beteiligung des Thioredoxinsystems an der Reduktion von Methioninsulfoxid und Sulfat in Hefe wurde
nachgewiesen' I"'! und in anaeroben Mikroorganismen konnten Nitrat-Reduktion und Ribonucleotid-Redukti'on ein gemeinsames wasserstoff-lieferndes System haben12". Die Ribonucleotid-Reduktion nach Abbildung 5 ist nicht reversibel;
nach dem eingangs Gesagten ist ein allgemeiner Biosyntheseweg von Desoxyribonucleotiden zu Ribonucleotiden auch
nicht zu crwarten. Eine enzymatische Hydroxylierung von
Thymidin oder 2'-Desoxyuridin zu Ribothymidin bzw. Uridin
kommt jedoch vor, und zwar als erster Schritt der oxidativen
Umwandlung von Thymidin in Uracil["'71. Eine aus dem
Schimmelpilz Neirrosporu c r a w isolierte Pyrimidin-2'-desoxyribonucleosid-2'-Hydroxylase katalysiert diese Reaktion mit
Sauerstoff, Ketoglutarat, Eisen(lr)-Ionen und Ascorbat als Substraten und Cofaktoren.
5. Ribonucleotid-Reduktion und Wachstum
Ribonucleotid-Reduktase ist in trockenen Weizenkornern
oder in unbefruchteten Seeigeleiern nicht nachzuweisen, aber
binnen weniger Stunden nach dem Beginn der Keimung bzw.
nach der Befruchtung zeigen Extrakte dieser Gewebe die Fahigkeit zur Ribonucle~tid-Reduktion~~~~
352].Entfernt man Ratten einen Teil der Leber, so steigt zwischen 20 und 50 h nach
der Operation die Ribonucleotid-Reduktase-Aktivitiitdes sich
repenerierenden Gewebes auf das 20fache des normalen Wer,I'.'
und gleichzeitig nehmen die DesoxyribonucleotidtesIA2.
632
L
20
LO
60
t
80,
100
120
' I 0.05
[minl-
Ahh. 6. Ribonucleotid-Reduktasc-Aktivitat
- ) und DNA-Produktion
( 0 - n ) in synchronisierten Hefezellen (nach [IOY]).
Linke Ordinate: nmol
umgcsetztes Substrat pro mg Protein pro min: rechte Ordinate: rng DNA
pro IOOml Kultur; Abszisse: Inkubationszcit der Hefckultur.
Die Wirkung von Hemmstoffen der Proteinbiosynthese wie
A~tinomycinl'~~,
P~romycin["~oder C y ~ l o h e x i m i d lo'J1
f ~ ~ in
.
vielen dieser Gewebe macht es uberaus wahrscheinlich, daB
die Zu- und Abnahme der Ribonucleotid-Reduktion tatsachlich auf Induktion bzw. Fehlen der Enzymneusynthese beruht.
Der friihe Zeitpunkt des Auftretens von Ribonucleotid-Reduktasen in wachsenden Zellen ist mit dem stufenweisen Start
von rnRNA-, Protein- und DNA-Produktionfltol gut zu
vereinbaren. Keine derart ausgepragten wachstumsabhangigen Schwankungen wurden dagegen fur vor- und nachgeschaltete Enzyme wie Thioredoxin-Reduktase[""I und DNA-Polyr n e r a ~ e ~beobachtet.
~~~'~~
Fur das Bakterium Escherichia coli ist Ribonucleotid-Reduktase ebenso essentiell wie fur eukaryotische Zellen. Kurzlich
wurden zwei Mutanten EIO1llltl und LD195['l21 isoliert.
in denen die Proteine B1 bzw. B2 der Reduktase nur einen
kleinen Bruchteil der Aktivitat des Wildtyps aufweisen und
temperaturempfindlich sind. Damit wurde der Genlocus dnuF
(einer von sieben fur die DNA-Synthese verantwortlichen)
als Strukturgen fur Ribonucleotid-Reduktase identifiziert. DieAnQrW. C h m . jU6. Johrg. 1974 J
Nr. 17
se Bakterien konnen sich bei 37-42"C nur noch vermehren,
wenn man ihnen Desoxyribonucleoside im Medium anbietet,
und werden auI3erdem durch H y d r o x y h a r n s t ~ f F2Omal
~ ~ ~ starker im Wachstum gehemmt als der Wildtyp. Ebenso kann
Coenzym B I 2 fur die Typ-11-Reduktasen limitierend sein: Das
Knollchenbakterium Rhizobirrm meliloti zeigt Wuchsstorungen
und verringerten DNA-Gehalt der Zellen, wenn ihm Kobalt,
das zentrale Metall-Atom des Desoxyadenosylcobalamins,
fehlt11131.
Ihre bedeutsame Mitwirkung bei DNA-Synthese und Zellvermehrung macht die Ribonucleotid-Reduktasen(und ihre Hemmung) schlieI3lich zu einem aktuellen Studienobjekt in virusinlizierten und in Tumorgeweben. T4-Phagen enthalten drei
Gene nrdA, B und C , als deren Produkte in der Wirtszelle
phagen-spezifische Ribonucleotid-Reduktase und Thioredoxin
(aber keine Thioredoxin-Reduktase) gebildet werden, die mit
den Bakterienproteinen nur entfernte Ahnlichkeit habed2" 24. ". ' l4]. In polyomavirus-infiziertenN i e r e n ~ e l l e d ~ ~ ' ,
in Y a b a v i r u s - T u m ~ r e nund
~ ~ ~in~ der mit Leuklmieviren inlizierten Maus14" stellt man zwar erhohte spezifische Reduktase-AktivitTten fest, aber i. a. keine qualitativen Unterschiede
gegenuber normalen Slugerenzymen. O b pflanzliche und tierische pathogene Viren und insbesondere die onkogenen RNAWren spezifische Ribonucleotid-Redu ktasen besitzen, IaI3t sich
demnach nicht rnit Sicherheit sagen. solange nicht reine Enzyme aus normalen und infizierten Geweben verfugbar sind.
In Rattentumoren und gesunder Rattenleber haben sich ebenfalls noch keine offensichtlichen Unterschiede der Reduktasesysteme ergeben. Dennoch verdient die Ribonucleotid-Reduktion in Tumoren schon im Hinblick auf diagnostische und
chemotherapeutische Zwecke groI3e Beachtung, seit Elford einen eklatanten Zusammenhang der Wachstumsgeschwindigkeit zahlreicher Rattenhepatome und dieser Enzym-Aktivitat
nachweisen k~nntel'')~:Die sehr rasch wuchernden Novikoffund Walker-Tumoren zeigen bis 500mal hohere ReduktaseAktivitlt als die am langsamsten wachsenden Tumoren. Zusammenhange werden denkbar zwischen der cytotoxischen
Wirkung von Hydroxyharnstoff und Arabinonucleosiden fur
maligne und normale Gewebe in vivo und ihrem inhibierenden
Effekt auf Ribonucleotid-Reduktasen in vitro[3h.SR.81.i's1;
durch beide Substanzen wird am stlrksten die DNA-Synthese,
weniger die RNA- und Proteinsynthese gehemmt. Andererseits
darf man nicht ubersehen, daI3 am Nuclein'saure-Stoffwechsel
einer Zelle zwei Dutzend Nucleotide und nicht vie1 weniger
Enzyme teilnehmen, so daI3 die Rolle eines einzelnen Enzyms
zwar wichtig, aber kaum alleinbestimmend fur ein komplexes
Geschehen wie die DNA-Replikation sein kann.
6. Ausblick
Zahlreiche chemisch und biologisch interessante Aspekte der
Ribonucleotid-Reduktion bedurfen der weiteren AufklPrung:
Reaktionsmechanismus, Struktur der aktiven Zentren und
Wirkungsweise der Effektor-Molekiile am Protein, Initiation
und Repression der Enzym-Biosynthese. Wenn auch heute
uber die auslosenden Faktoren der Enzym-lnduktion noch
vollige Unklarheit herrscht, so sind doch fur die Zukunft
regulierende Eingriffe in normales wie pathologisches Zellwachstum iiber diese Schliisselenzyme denkbar. Die Existenz
zweier ganz verschiedener Ribonucleotid-Reduktasesysteme
Angnv. Chrm. 186. Jahrg. IY74 1 Nr. 17
zur Katalyse einer grundlegenden Stoffwechselreaktion ist bemerkenswert. Eine umfassende Charakterisierung von Ribonucleotid-Reduktion und Thioredoxinsystem in weiteren
Organismen unterschiedlicher Entwicklungshohe scheint uns
vordringlich, um die Verbreitung der Enzymtypen und Regulationsmuster deutlich zu machen. Nicht zuletzt sind hieraus
neue Kenntnisse uber die Evolution und Phylogenie der Lebewesen zu erwarten, denn es fallt auf, dal3 die meisten Modelle
zur Entstehung des Lebens den fhergang von Ribonucleotiden oder RNA zu DNA als selbstvermehrungsfiihigem Material - ein nicht-enzymatisch kaum vorstellbarer Schritt - gar
nicht in Rechnung setzen["6! SchlieBlich ist die Suche nach
neuen, moglicherweise einfacher zu handhabenden Ribonucleotid-Reduktasen vom Standpunkt der praparativen Nucleotidchemieaus interessant, weil sie den Zugang zu modifizierten
Desoxyribonucleotiden aus den vie1 besser zuganglichen Ribonucleotiden erleichtern konnten. Das in letzter Zeit rasch
zunehmende Interesse an der Ribonucleotid-Reduktion verspricht Antwort auf einige dieser Fragen.
Die in diesem Bericht erwahnten eiyenen Arbeiten werden oon
der Drcrtschen Forschunysyemeinschaft gefdrdert. Ich danke
arrch Hurry Hoyenkamp und Ray Blakley ( l o w o City) f i r
ihre gropziiyige Unterstiitzung und zahlrcichen anderen Kolleyenfur diefreundliche Mitteiltrng neuerer Forschungsergebnisse.
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