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Ein glucosespezifischer molekularer Fluoreszenzsensor.

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ZUSCHRJFTEN
Ein glucosespezifischer molekularer
FIuoreszenzsensor**
i
Tony D. James, K. R. A. Samankumara Sandanayake
und Seiji Shinkai"
Der photoinduzierte Elektronentransfer (PET) ist bereits bei
fluoreszierenden molekularen Sensoren fur Protonen und MetallJonen angewendet worden"]. Fur kfeine, neutrale Molekiile gibt
es hingegen relativ wenige fluoreszierende molekulare Sensoren.
Unsere[2-111 und andere Arbeitsgruppen[12- "1 haben begonnen, die Wechselwirkungen zwischen Boronsluren und Kohlenhydraten" 1' zu erforschen, uin kiinstliche Rezeptoren fur Kohlenhydrate und letzlich Sensoren zu entwickeln. Unser Ziel ist es,
Kohlenhydrate selektiv nachzuweisen. Dafiir miissen wir die Ei-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
genschaften der Boronsaure verandern. Mit mei Erkennungsstellogc
len an einer DiboronsBure gelangt man am ziigigsten zum selektiven Nachweis von K~hlenhydraten[~-'I.Die raumliche AnordAbb. 1. Relative Fluoreszenzintensitlt I,., von 2 in Abhiingigkeit von der Kohlennung der beiden Boronsauregruppen bestimmt. welches Kohhydrat- oder Glykolkonrentration log r bei 25 "C: 1.0 x lW5M von 2 in 33.3%
= 423 nm. + D-Glucose, u-AlMeOH:H,O-Puffer bei pH 7.77. a,, = 370 nm,
lenhydrat bevorzugt gebunden wird. Mit Hilfe von Molekiilmolose. v u-Fructose, 0 o-Galactose, o Glykol.
fanden wir, da13
dellen und in Kenntnis des PET-Sensors lC1']
ein Glucosemolekul perfekt von dem spaltenformigen 9,lO-Bisaminomethylanthracenderivat 2 gebunden werden ~ o l l t e ~ ' ~ ] .
zeigt die Abhangigkeit der Fluoreszenzintensitat von 2 von der
Die beiden nach innen stehenden Boronsauregruppen sind ideal
Konzentration der Kohlenhydrate (,,Titrationskurven") bei pH
auf die 1,2- und 4,6-Hydroxygruppen der Glucose ausgerichtet.
7.77 (33.3"/o Methanolpuffer). Die Stabilitatskonstanten betragen: o-Ghcose (log K i = 3.6), ~-Allose(log K, = 2.8), o-Fructose (log K, = 2.5), n-Galactose (log K, = 2.2) und Glykol (log
K, = - 0.20).
Schema 2 stellt die wichtigsten hierbei auftretenden Teilchen
vor. Mit 2 ergeben sich unter den experimentellen Bedingungen
hauptsachlich vier Produkte, von denen 2a (ein nicht cyclischer
2 : 1-Komplex)und 2b (ein cyclischer 1 :I-Komplex) fluoreszieren.
Mit Glykol kann das fluoreszierende Teilchen nur der 2 : 1 -Komplex 2a sein. Bei D-Glucose zeigt die hohe Stabilitat an, daB das
Gleichgewicht zu dem intramolekularen 1: I-Komplex 2 b hin
verschoben ist.
Die Existenz des I :I-Komplexes 2b aus 2 und D-Glucose
1
2
wurde durch 'H- und 2D-COSY90-NMR-Messungen bestatigt.
Abbildung 2 zeigt das 'H-NMR-Spektrum des D-GlucoseDie Diboronsaure konnte in Form des Diesters ohne SchwieKomplexes 2 b (siehe auch Tabelle 1). Die starke Verschiebung
rigkeiten synthetisierl werden (Schema l)['
Abbildung 1
des Signals von H3 nach hohem Feld (6 = -0.3) zeigt, daB das
-
Q
/
pap
I), 2)
&yD-
w.'
+
NHMe
/
\
\
\
8,
j./J)
3)
8 P
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2H*Ho
Q@&
-
1I
.
.
z
N,
NHMe
f5
/N
%No
2
f5
Schema 1. Synthese des Boronsaurederivats 2. Reageiitien (Ausbeute): 1 N-Bromsuccinimid, A~obisisobutyronitril,CCI,. RiickfluD (60 Yo);2) 1.1 Aquiv. 2.2-Dimethgl-1.3propandiol, Toluol, azeotrope Destillation (Dean-Stark) (quant.); 3) 0.4 Aquiv. Diamin. 1 . 1 Aquiv. K,CO,. THF ( 5 % ) ; 4) 33.3% MeOH/H,O-Puffer bei pH 7.77 (quant.).
[*] Prof. S. Shinkai, Dr. T. D. James, Dr. K. R. A. S. Sandanayake
Shinkai Chemirecognics Project, EKATO
Aikawa 2432-3, Kurume
Fukuoka 830 (Japan)
Telefax: Int. 942137-6125
+
[**I T. D. .Iund
. K. R. A. S. S. danken Dr. F. Ohscto und Dr. M. Mikami (Research
Dcvelopinent Corporation of Japan, Chemirmognics Project) firRatschlage
und R. Iguchi fur technirche Unterstiitzung.
Anxew. t'hrm. 1994, 106. N r . 21
Proton direkt auf die n-Elektronen des Anthraceiis gerichtet ist.
Die Aufspaltung in anthrylische und benzylische Protonen weist
auch auf die starre Struktur eines 1:l-Koniplexes hin. Mit
D-A110se3D-Fructose
D-Galactose konnte lH-NMR-spektroskopisch kein 1:1 -Komplex nachgewiesen werden. Durch
Sekundarionen-Massenspektrometrie (positive Ionen) einer
Q VCH V'rlaxsgeseNsehafi mbH, 0-69451 Weinheim, 1994
0044-8249:94\2121-2257 $ 10.00+ .2S,l0
2287
ZUSCHRIFTEN
Q
Ho-cr
- HO'
OH
+2H20
l
9
Q
&Wert
Komplex
H1
H2
H3
n4
H5
H 6 und H 6
H a l und Ha2 odcr Ha3 und Ha4
H a l und Ha2 oder Ha3 und Ha4
H b l und Hb2 oder Hb3 und Hb4
H b l und Hb2 oder Hb3 und Hb4
NCH, oder H,CN
NCH, oder H,CN
Losungsmittel
CH,OH
CH,OH
Schutzgruppe [a]
(CHJ:C(CH:OW,
(CHAC(CH,OH),
(CH,),C(CH,OHI,
5.18
3.01
- 0.30
2.68 (verdeckt)
3.43
3.73
3.93 und 4.85 (verdeckl)
4.10 und 4.60
5.66 und 6.80
6.13 und 6.78
2.42
2.68
3.30
4x9
0.85
3.40
4.89
[a] Die Schutzgruppe wurde unter den Bedingungen der NMR-Mesiungen abgespalten.
2288
8
'
l
7
'
l
6
~
l
'
4
5
l
'
3
l
'
2
l
'
1
h
l
'
0
l
'
-1
Abb. 2. 'H-NMR-Spektrum des 1:1-Komplexes 2b aus D-Glucose und 2 . Die
Fonnel von 2b zcigt die Pyranoscform von D-Glucose. die Furanoseform
existiert moglichcrweise auch.
Schema 2. Das Anthracengerust ist durch eine Ellipse symbolisiert, die Zuckermolekiile durch Kreise mit vier OH-Gruppen.
Zuordnung
l
-6
2a
Tabelle 1. Zuordnung der 'H-NMR-Signale des D-Glucosckomplexes 2 b (siehe
aucb Abb. 2).
'
1 : 1-Mischung von 2 mit D-Glucose, D-AIlose, D-Fructose und
D-Galactose konnte jeweils das M+-Ion von 2 b nachgewiesen
werden; bei D-Fructose war dieses Signal schwach, und das
Spektrum enthielt au13erdem noch ein Signal des Mf-Ions von
2 a.
Nach Kalottenmodellen nimmt die Stabilitat des 1 :1-Komplexes 2b in der Reihenfolge D-Glucose % D-Altose > D-Gatactose > D-Fructose ab. Die Konfiguration von D-Glucose und
i>-Alloseunterscheidet sich an C 3 . Im D-Glucose-1: 1-Komplex
2b ist das C3-Proton auf die n-Elektronen des Anthracenteils
gerichtet (siehe oben) . Im entsprechenden D-Allose-Komplex
mu13 die C 3-Hydroxygruppe auf das n-System des Anthracens
gerichtet sein. Da der D-Allose-Komplex deutlich instabiler ist
(log K,) als der D-Glucose-Komplex mu13 die Wechselwirkung
zwischen den n-Elektronen und der Hydroxygruppe ungiinstig sein. Der Unterschied zwischen vorhergesagter und
beobachteter Reihenfolge bei D-Galactose und D-Fructose wird
wahrscheinlich eher durch die unterschiedliche Stabilitat der
2.1-Komplexe 2a als durch die der 1 :I-Komplexe 2 b verursacht. Die massenspektrometrischen Daten bestatigen diese
Vermutung, da irn Falle der D-Fructose auch das Mf-Ion
des 2 : 1-Komplexes 2a, bei der galactose aber nur
das M+-Ion des 1 :1-Komplexes 2 b nachgewiesen werden
kann.
:Q VCH V e r i u ~ , ~ ~ e s ~ i mbH,
l . ~ i . h0-59451
u~
Weinheim,1994
0044-8249j94/2121-2288$10.00+ .2jj0
Angew. Chem. 1994, 105. Nr. 21
l
ZUSCHRIFTEN
Die maximale Anderung der Fluoreszenz, die man bei der
Verbindung 2 beobachten kann, liegt in einem Bereich, der zur
Erfassung physiologischer Glucosespiegel geeignet ist. Drei Monosaccharide sind im wesentlichen in Blut vorhanden : D-GIUCOse (0.3-1.0 mM), D-Fructose (
0.1
I
mM) und D-Galactose
(
0.1
I
mM). Titriert man D-Glucose in Anwesenheit von 0.1 m M
D-Fructose oder D-Galactose, dann beobachtet man hierbei die
gleiche Stabilitiit wie mit D-Glucose allein (Abb. 3).
lo
1
[17] Ubersicht G. Wulff. Pure Appl. Chrm. 1982, -74, 2093.
[18] Von unsercn und anderen Arheiten 12-17] her ist hekannt. da13 sich der Boronsaureester schnell und reversihel im basischen Milieu bildet. Bei den orlhu-Aminohoronsauren stellt sich das Gleichgewichl bei neutralem pH-Wert ehenso
schnell ein [I 1, 161. Nichtkovalenle Wechselwirkungen werden mit Hilfe der
Audriicke ,,Erkennung", ,,Komplex" und ,,Bindungskonstantn" gekennzeichnet. Diese Ausdrucke werden henutzt, um das Gleichgewicht zwischcn
dem kovalenten Boronsaureester und der freien Boronsiure unter dieseu Bedingungen zu heschreihen.
1191 Spaltenfomige Rezeptoren wurden uuter anderem von J. Rebek, Jr., et al.
ausfuhrlich untersiicht: J. Rehek. Jr., Acc. Clzem. Res. 1990. 23, 399, zit. Lit.
[20] R. T. Hawkins. H. R. Snyder, J. Am. Chem. Sue. 1960,82,3863;H. R. Snyder,
R. T. Hawkins, W. J. Lennarz, ibid.1960,82,3053; H. R. Snyder, M. S. Konekky, W. J. Lennarz. ibid. 1958. 80, 3611.
t
Synthese eines GP1-Ankers der Hefe
(Succhuvomyces cerevisiue)**
Thomas G. Mayer, Bernd Kratzer
und Richard R. Schmidt *
-6
-5
-4
-3
log c
-
-2
-1
1_Lu
0
1
Abb. 3. Relative FluoreszenzintensitLt I,., von 2 in Abhangigkeit von der Glucosekonzentration log c mit und ohne 0.1 mM D-Galactose oder o-Fructose bei 25°C;
1.0~1O-~M
von 2 in 33.3% MeOH/H,O-Puffer bei pH 7.77. i..
=,370nm.
= 423 nm.
D-GdlactOSe/D-~lUcOse, D-Fructose!D-Glucose, 0 D-Glucose, 0
Glykol.
Glycosylphosphatidylinosite (GPIs) sind cine vor ca. zehn
Jahren"] entdeckte Naturstoffklasse von Glycophospholipiden,
die Proteine und Glycoproteine C-terminal in den Membranen
eukaryontischer Zellen verankern[']. Analysen der GPIAnker des ~~panosoma-brucci-,,Variant-sur€ace"-Glycoproteins
(VSG)[', 'I, von ,,Rat-brain"-Thy-1 [jl, der Leishmania-rnujor,,Promastigate-sur€ace"-Protea~e[~~,
des Tqvpanosoma-cruzi1G7-Antigens[j1 und der menschlichen Erythrocyten-Acetylcholinesterase[61lieferten die in Schema 1 gezeigte allgemeine
Struktur (eingerahmt) ,
Es ist also moglich, einen PET-Sensor zu konstruieren, der fur
Glucose spezifisch ist. Wir sind der Ansicht, daB man andere
kohlenhydratspezifische Sensoren entwickeln kann, wenn man
die beiden Boronsluregruppen passend fur die Hydroxygruppen der Zielverbindungen anordnet.
I
RB
Eingegangen am 5. April,
veranderte Fassung am 2. Juli 1994 [Z 68231
[l] Ubersichtsartikel: A. J. Bryan, A. P. de Silva, S. A. de Silva, R. A. D. Rupasingha, K. R. A. S. Sandanayake, Biosensors 1989. 4, 169: R. Bissel, A. P. de
Silva, H. Q. N. Gunaratna. P. L. M. Lynch, G. E. M. Maguire, K. R. A. S.
Sandanayake, Cheni. Soc. Rev., 1992.21, 187.
I
Chem. Soc. Chem.
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[71 G . Deng, T. D. James, S. Shinkai, J. A m . Chem. Soc. 1994, 116, 4567-4572.
[8] T.D. James, T. Harada, S. Shinkai, J. Chem. SOC.Chem. Commun. 1993,857.
1176 (Corrigendum).
I91 T. D. James, K. Murata, T.Harada, K . Ueda, S. Shinka
[I01 R. Ludwig, T. Harada, K. Ueda, T. D. James, S. Shink
Trans. 2 1994, 4 , 697.
[Ill T. D. James, K. R. A. S. Sandanayake, S. Shinkai, 1 Chem. Sor. Chrm. Cummun. 1994, 477.
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[I41 L. K. Mohler, A. W Czamik, J. Am. Chem. Sac. 1993, 1f5, 2998.
[is] G. Wulff, B. Heide, G. Helfmeier. J. Am. Chem. Soc. 1987, 108, 10x9.
[161 G. Wulff, H.-G. Poll, Makromol. Chem. 1987, 188. 741.
Angew Chem
1994, 106, Nr 21
/
R5
I R4 \
R3
I
Palmitoylierung
Schema 1. Struktur von GPI-Ankern
Das Auftreten von zusltzlichen Kohlenhydrat- (R4- R6) oder
Ethanolaminphosphat-Seitenketten(R3) ist art~pezifisch['~,
und
die Membran-verankernden Lipidstrukturen unterscheiden sich
je nach Spezies und Zelltyp deutlich. Sie bestehen bei Glycerinlipiden (Variation von R' und R2) aus sn-l,2-Dimyristoylglycerin
in T-brucei-VSGsrsl,sn-1-Stearoyl-2-lyso-glycerinbeim T-brucei-,,Procyclic-acidic-repititive"-Protein~gl,
sn-I-Alkyl-2-acylglycerin in Rinder- und Menschen-Erythrocyten-Acetylcholinesterase"'] und in menschlichem Folat-Bindeprotein" 'I sowie
aus sn-l,2-Diacylglycerin in der Torpedo-Acetylcholinesterase["]. Des weiteren kann der Tnositrest zusatzlich palmitoyliert
sein. Statt Glycerinlipiden wurden bei GPI-Ankern von Hefen
(Saccharomyces cerevisiae) auch Ceramide aus Phytosphingosin
als Membrananker gefunden" 3. 14]. Die typische Struktur eines
solchen GPT-Ankers ist in Schema 2 dargestellt (1).
[*I Prof. Dr. R. R. Schmidt, Dip].-Chem. T. G. Mayer, Dipl.-Chem. B. Kratzer
Fakultat Chemie der Universitat
Postfach 5560 M 725, D-78434 Konstanz
Telefax: Int. +7531/88-3135
[**I Dime Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft und vom
Fonds der Chemischen Industrie unterstutzt.
CC; VCH Verlagsgesellschaft mhH, D-6Y451 Weinhelm, I994
0044-8249:94/212t-2289 $10 00+ 25/0
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