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Ein neues Phytohormon M-LMF 5 aus Mimosa pudica L.

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I
I
This manuscript is
to be cited as
Angew. Chem. Suppl.
1983,a~-a34
Dieses Manuskript ist
zu zitieren als
Angew. Chem. Suppl.
1983,818-834
0 Veriag Chemie GmbH, D6940 Weinhelm, 1983
0721 4227/83/0808081880250/0
Ein neues Phytohormon M-LMF 5 aus Mimosa pudica L. * *
Von Hermann Schildknecht und Wolfgang Bender
1. Einleitunq
In einem Extrakt der tropischen Sinnpflanze Mimosa pudica
L. konnten wir zwei Substanzen nachweisen, die auch als
Reinststoffe im Fiederblattest nach Fitting-Hesse-Schildknecht chemonastrsch wirksam sind. Diese in der Pflanze nur
in hormonellen Konzentrationen vorhandenen Phytohormone
pudica L. lanqe gestellen sehr wahrscheinlich das in
2. Strukturanalyse des M-LMF 5
2.1. Ergebnisse der Voruntersuchungen /1/
Die hereits bei der Isolierung des M-LMF 4 anfallenden
Reizstoffmengen wurden UV- und 'H-NMR-spektroskopisch charakterisiert. Wir konnten im Aromatenteil der beiden Wirkstoffe eine Ubereinstimmung feststellen und trotz der mengenbedingten schlechten Auflosung glycosidische Protonen i m
NWR erkennep. Die DC-Vergleiche auf Kieselgelplatten ergaben jedoch (leutliche Polaritatsunterschiede. Beim Wechsel
auf acide mbbile Phasen beobachteten w L r eine Umkehr im
Laufverhalten der Phytohormone. Dies weist auf eine protonierbare Gruppierung im M-LMF 5 hin, deren pKs-Wert im Bereich von Essiqsaure liegt. Das Bespruhen mit Thymol/Schwefelsxure erzeugte beim M-LMF 5 einen orangeroten Fleck,
wahrend der M-LMF 4 und weitere untersuchte Glycoside unter Rotfarbunq reagrerten. Der chemische Unterschied der
vom Aromatenteil her ahnlichen Reizstoffe muBte dfshalb
durch den Zuckerrest des M-LMF 5 bedingt sein.
z.
suchte chemische Prinzip der Erregungsleitung und schnellen
Blattbewequng dar. Einer der beiden Reizstoffe konnte durch
chromatoqraphische und spektroskopische Vergleiche als das
4-0-I3,5-Dihydroxyben~oes~ure]-glucosld-6'-sulfat(1) identifiziert werden (M-LMF 4) /l/.
Prof. Dr. f1. Schildknecht und Dip1.-Chem. W. Bender
Organisch-Chemisches Institut der Universitat Heidelberg
Im Neuenheimer Feld 270, D-6900 Heidelberg
* * Pflanzenabwehrstoffe, XIX. Mitteilung.- XVIII. Mitteilung siehe / l / .
Uher die bioloqische C!iemie der Mimosaceae, X. Mittellung. - IX. I'litteilung siehe /l/.
-
2.2. IR-Spektroskopie
Im Spektrum des M-LMF 5 (KBr-MikropreBling) flndet man
Siqnale der fur Phenolcarbonsaureglycoside typischen, durch
intra- und intermolekulare Wasserstoffbruckenwechselwirkungen verbreiterten yo-H-Schwlngungen 12500-3600 cm-l) und
der aromatischen yC=C-Schwingungen bei etwa 1520 und
1590 cm-l. Neben den YC-0-Schwingungen des Zuckertfiles
(1052 cm-') war vor allem die stark ausgepragte Carbonylbande zwischen 1660-1730 cm-' fur die weitere Strukturaufklarunq von Bedeutung. Da Arylcarhonsauren nur bis etwa
1700 cm-l, gesattigte Carbonsauren aber von 1700-1725 cm-'
absorbieren / 3 / , m u D demnach am Zuckerteil eine freie Car-
818 -
Den zweiten Mimosenwirkstoff konnten wir jetzt durch weitere Verbesserungen des bisherigen Trennungsganges in zur
Strukturaufklarung ausreichenden Mengen darstellen /2/. Das
Frischpflanzenmaterial wurde nach Extraktion, BuOH-Verteilung und MeOH-Fallung saulenchromatographisch aufgetrennt:
vgl. Fig. 1. Die gezielte Anreicherung erreichten wir dabei
durch cochromatographische DC- und HPLC-Analysen, da der
stark aktive M-LMF 4 infolqe von Fraktionsuberlaqerungen
die Erkennung des M-LMF 5 im Biotest erschwerte. Bei den
Saulentrennungen verwendete Laufmittel waren Wasser bei der
Gel- und MeOH/H20 96:4 bei der Verteilunqschromatographie.
Mittel- und hochdruckchromatographisch reinigten wir mit
K O A c / M e O l i / H 2 0 - G e m i s c h e n verschiedener Zusammensetzungen.
2HOtHAXllVt BfRtltXt
\
/
820
-
-
boxylgruppe vorliegen. Im Bereich der Esterschwingungen
( 1 730-1 750 cm-l) lieqt keine Absorption, was indirekt die
0-glycosidische Verknupfung des Molekules belegt.
2.3. Das 13C-NMR-Spektrum des M-LMF 5
Beim 13C-Re~onanzspektrum(vgl. Tab. 1 1 des nach der
HPLC-Trennung in der H-Form vorliegenden M-LMF 5 diente als
innerer Standard das CH OD-Signal (-51,7 ppm rel. TMS; Losunqsmittel: D20).
Die beiden im Tieffeldbereich uber -170 ppm lieqendensignale helegen die bereits vom IR her erwartete zweite Carboxylqruppe im Molekul. Zwischen - 1 1 0 und -150 ppm lieqen
die Resonanzen des Aqlykons, die gut mit denen im M-LMF 4
korrelieren. Die 3,4,5-Trihydroxybenzoesaure konnte auch
nach Hydrolyse des Faktors diinnschicht-, hochdruckflussigkeits- und gaschromatographisch bestatigt werden.
Tab. 1 . 75,46 MHz-13C-Daten des M-LMF 5.
Natur 11.,2.)- und Syntheseprodukte (3.,4.) in D 0,
tieffeld gegen Trimethylsilylpropionsaure-Natriumsalz,
1.: 519716 scans, 2.: 510232 scans, 3.,4.: etwa 10000 scans
H-Form
2.. K-Salz
3 . . H-Form
4., K-Salz
1..
Fig. 1. Isolierungsschema des M-LMF 5
-
819
-
l.,
2..
3.,
4..
H-Form
K-Salz
H-Form
K-Salz
C-7
C-5.3
C-4
C-1
C-6,2
172.3
178.0
171.6
177.5
152.0
154.0
139.0
151,9
152,5
139,O
138,O
129.9
136.7
129,5
137,O
112.8
111,5
112,7
112.0
c-1'
c-2'
c-3'
C-4'
C-5'
C-6'
106.2
107.5
106.5
107,O
75,8
75.8
75.7
76.0
77.9
78.3
77.8
74.0
74.4
73.8
74,5
77.9
79,3
77,8
79,4
175,7
178,4
174.1
178p4
~
78,2
-
821 -
-
Die aufgrund der im Protonenresonanzspektrum beobachteten
Kopplungskonstante (J1,2 = 7,s Hz) vermutete B-glycosidische Verknupfung wurde durch die chemische Verschiebunq
Der
des C-1'-Siqnals von -106,2 ppm weiter abqesichert /4/.
M-LMF 5 muR in einer Pyranoseform vorlieqen, da furanoide
Zucker keine so groRen Anornerenkopplungen zeigen und auch
im 13C-Spektrum durch ihre bei tieferem Feld lregenden 514nalf erkennbar sinil / 5 / . Da das qleichzertrg aufgenomene
'H-NMR-Spektrum insgesamt funf nicht austauschbare Protonen mit einem fur B-Hexapyranosiduronsauren typischen Verschrebungs- und Kopplungsmuster zergte. muRte eines der
drei, zwischen -75 und -78 ppm gelegenen 13C-Siqnale von
zwei Zuckerkohlenstoffatomen herruhren
Nachdem der M-LMF 5 in die Salzform iiberfiihrt war, konnten wir auch tatsachlich vier getrennte Signale erhalten;
vql. Tab. 1 und Fig. 2 . Das Signal der H-Form be1 -77,9 ppm
entsprach den Resonanzen des C - 3 ' und C-5'. Die durch die
Salzbildung ionisierten Saureqruppen wurden urn -2,7 bls
-5,7 ppm tieffeld-verschoben. Dieser Effekt wlrkt sich vor
allem auf das a-standige C-5' des Uronsaurerestes aus und
bedingt eine Verschiebung urn -1.4 pprn auf -79.3 ppm. Die
C-1-Resonanz der 3.4.5-Trihydroxybenzoesaure wird sogar um
etwa -7 ppm verschoben.
Die pH-induzierten Verschiebunqen zeiqen, daB beide Carboxylqruppen frei vorliegen und schlieBen elne esterartige
Verkniipfung im Molekiil aus- Die Zuordnung des C-5'-Srgnals
wurde durch eine selektive 1H-13C-Entkopplung im off-Resonanz-Spektrum des Syntheseproduktes bestatiqt. Das synthezeigt
tische 4 - 0 - [ 3 , 5 - D i h y d r o x y b e n z o e s a u r e l - D - D - g l u c u r o n i d
sowohl in der H- a15 auch in der K-Form die qleichen chemlschen Verschiebungen wie das Naturprodukt; vql. Tab. 1.
3,4,5-Trihydroxybenzoesaure erkannt wurde. Das Singulett
der Protonen 14-2 und H-6 spricht fur eine symmetrische Substitution "her die 4-OH-Gruppe des Aglykons. Die bereits im
"C-Spektrum beobachteten pH-Effekte konnten auch bei den
Protonensignalen erhalten werden. Beim Wechsel von der Salzauf dic Saureform erfahren sowohl die aromatischen H-Atome
( i . = 0,17 ppm) wic auch das Dublett be1 6 = 3,83 I L = 0.14
ppm) eine Tieffeldverschiebung. was wrederum die freien
Sauregruppen im Naturstoff belegt.
Die im Vergleich zu den drei anderen Zuckerprotonen deutlich abgesetzte Resonanz bei 6 = 3,97 pprn wurde dern zur
Carboxylgruppe a-standrgen H-5' zuqeordnet, so daB der Zukkerrest des M-LXF 5 als l'-O-O-glycosidisch qebundene Hexapyranuronsaure vorliegen mulite. Theoretische Betrachtungen
der vom Diederwinkel abhangiqen Kopplungskonstanten crlaubten eine weitere Prazisierung der Struktur. Aufgrund der in
den Siqnalen des H-5' beobachteten diaxialen Kopplungen
konnten wir alle von der Threose ableitbaren Uronsauren
ausschlielien. Durch die qleichzeitiqe groRe Aufspaltung
des anomeren Protons konnte die D-D-Glucuronsaure als Zukkerteil des M-LMF 5 erkannt werden. Virtuelle Kopplunqen
/7/, die vor allem in der K-Form des Stoffes zu einer weiteren Aufspaltung der H-1'- und H-5'-Dubletts fiihrten,
sprechen qegen die hypothetische Alluronsaure, in der das
H-3' aquatorial steht.
Tab. 2. 3 0 0 MHz-lH-NMR-Daten des M-LMF 5 ,
Natur 11.,2.)- und Syntheseprodukte 13.,4.) in D20, Standard: HDO = 4,847 ppm (20-C); s = Singulett, d = Dublett,
d+ = virtuell gekoppeltes Dublett, m = Multiplett
1.. H-Form
2., K-Salz
3., Ij-Form
4.. K-Salz
-
822 -
H-2,6
H-1'
7,075
6,90s
7.06s
6,995
5,08
4.94
5,09
4,99
d
d+
d
d+
-
H-5'
H-2',3',4' J,'
3,97 d
3 . 8 3 d+
4.04 d
3.80 d+
3,69
3,154
3,71
3,72
m
m
m
m
7 8 JA, q,
7,s HZ
6 , 6 HZ
7,s HZ
7,5 liz
8 , s HZ
8 , s HZ
9 , 3 HZ
7,3 HZ
824 -
2.5. GC- und GC/MS-Untersuchungen des Hydrolysates
I
Zum Nachweis des Aglykons und des Zuckerteils wurde der
M-LMF 5 in 2 N Salzsaure 1 . 5 Stunden bei l0O'C hydrolysiert.
Die einrotierte Probe wurde nach SWeeleY et al. / 8 / silyliert. Die Verglezchssubstanzen wurden ebenfalls mit Salzsaure erhitzt und analog derivatisiert. Getrennt wurde mit
einer 3% OV 101-Glassaule; vgl. Tab. 3. Die Retentlonszeiten von 3,4,5-Trihydroxybenzoesaure-TMS,a- und D-D-Glucurono-3,6-lacton-TMS und den drei Peaks des persilylierten
Hydrolysates waren nahezu gleich. Die cochromatographische
Einspritzung mit der 3.4.5-Trihydroxybenzoes&iure bzw. dem
Lactongemisch ergab eine Verstarkung des entsprechenden
Peaks im Hydrolysat.
zdo
iio
'
160
'
110
120
inn
80
'
m
10
'
20 ~ p p mo~
2. 75,46 MH~-'~C-NMR-Spektrurndes M-LMF 5 ,
Dikaliumsalz in D20 (510 232 scans), breitbandentkoppelt,
Referenz: CH30D - 5 1 , 7 ppm
Flq.
Tab. 3 . GC-Messungen des derivatisierten M-LMF-5-Hydrolysates und authentischer TMS-Substanzen.
Bedingungen: 3 % OV 101, 25 ml N2, 2m. 10 x 16, I und D 225'C,
Temperaturprogramm: 60-(6"/min)-220eC; Gerat: Carlo Erba
2150.
Retentionszeiten [mlnl
2.4. Protonenresonanzspektroskopre
Die Integration der nicht austauschbaren Protonen ergibt
ein Aromaten/Zucker-Verhaltnis von 2:5; vgl. Tab. 2. Das
Signal bei 6 = 5.08 ist aufqrund seiner Lage und der grossen Kopplungskonstante (J,,2 = 7,5 Hz) eindeutig dem anomeren Proton einer R-D-Hexapyranose zuzuordnen. Die Pyranoseform wird weiterhin durch ein Dublett bei 6 = 3.97 mit
einer Aufspaltung Yon J = 8,5 HZ bestatigt. Kopplungen dieser Grdnenordnungen kdnnen nur durch diaxiale Wechselwirkungen zweier benachbarter Protonen in einem pyranoiden
zucker auftreten / 6 / .
Die Resonanz bei 6 = 7.07 wird durch die Protonen der aromatischen Phenolcarbonsaure verursacht, die 3C-spektroskopisch und nach Hydrolyse auch GC- und GC/MS-analytisch als
'
-
823 -
Hydrolysat
3,4,5-Trihydroxybenzoesaure
Hydrolysat + 3.4.5-Trihydroxybenzoesaure
Glucuronolacton
Hydrolysat + Glucuronolacton
20.31
20,52
20,36
20.55
22.60
22,70
22,60
20.40
20,25
20.60
20,50
22,56
Bei den GC/MS-Kopplungsuntersuchungen IFINNIGAN 3200) gaben die Substanzpeaks des Hydrolysates und der Verglerchssubstanzen erwartunqsgemaR identische Massenspektren.
Wahrend bei der ElektronenstoRionisation der Molpeak der
3,4,5-Trihydroxybenzoesaure-TMS (m/z 458) erhalten wurde,
erfaBte das Datensystem als hochste Masse beim a-Glucuronolacton nur das Signal m/z 319 und beim B-Glucuronolacton
-
825
-
den M-CIIJ ( m i 2 377). Nach der chemischen Ionisation der Fro
ben mit NH3 als Reaktionsgas konnten wir in den Spektren
beider Anomeren das Signal des M+NH4 (m/z 410) identifizieren; zusatzlich war bei den D-Lactonen noch ein Mil
l m / z 393) zu sehcn.
2.6.
1
Xassenspektrometrische Analyse der M-LMF 5
Die Identitat des Naturstoffes und des Syntheseproduktes
konnte durch die Analyse des underivatisierten Molekules
(Fast Atomic Bombardment mit Argon als StoByas) bzw. persilylrerten Molekules (hochauflosende MS) bestetiyt werden.
In den nicderaufyelosten FAB-Spektren der negativen Ionen
waren nach Abzug des Glycerinmatrixuntergrundes nur die
Siynale [M-11- + Gly. (m/z 437). [M-11- (rn/z 345) und r3.4,
5-Trihydroxybcnzoesaure-11- Im/z 169) zu sehen.
Die uber den DirekteinlaD des hochauflBsenden ZAB Massenspektrometers aufgenommenen EI-Spektren der beiden Froben
waren ebenfalls identisch. Das Molekiilion des persilylierten
4-0-[3,5-Dihydroxybenzoesaurel-D-D-glucuronides
(m/z 850,
elem. Z u s . C341170011Si7) konnte nicht erhalten werden. Das
bei beiden Spektren intensive Signal m/z 835 entsteht aus
dein Molpeak durch den Verlust einer Methylgruppe. Die exakte
Masse dieses Ions ( b e m Naturstoff 835,3065, Fehler 0,3 m m u
und beim Syntheseprodukt 835,3049, Fehler 1.9 m u ) wurde
durch Variation der Beschleunigungsspannung geyen PFK als
Referenz bestimmt und entspricht der elementaren Zusammensetzung C33H67011Si7. Durch TMSOH-Abspaltung entstehen daraus die Ionen m / z 745 und m/z 655. Die Serie IM-151+, [M-15
-901' und [M-15-12 x 90)l' 1st fiir silylierte Glycoside
charakteristisch. Weitere typrsche Bruchstucke der Verbindung sind das Radikalkation der persilylierten 3,4,5-Trihydroxybenzoesaure lm/z 4581 und das Glykonfraqment m/z 375;
vgl. Tab. 4.
v-4
2
0
4
--
"
0
I
r-,g
I
~ i g .3. Syitheseweg des M-LMF 5
-
826 -
-
Tab. 4. Fragmentionen des persilylierten M-LMF 5 (Naturprodukt) : Gerat: ZAB; Bedinyungen: DirekteinlaD; 'Probentemperatur 8O'C; Quellentemperatur 220'C; 70 eV; 7 kV.
Fragment
elementare
Zusammensetzung
Masse
Theorie
Messung
M-15
C33H67011Si7
835.3068
M- 105
C30H57010Sr6
745,2567
745,2591
2,4
M-195
C27H470gSi5
655,2066
655,2044
2.2
C19H3805Si4
458,1796
458,1769
2.7
C15113105Sij
375,1479
375,1498
1.9
828 -
tausch- und Mitteldruckchromatographie eryab das qewiinschte
Produkt in der H-Form. Das Kaliumsalz wurde durch frneuten
Kationenaustausch dargestellt: vgl. Fig. 3.
Abweichung
(Millimassen)
4. Ergebnisse und Diskussion
Aglykon
Glykon
-179
3.
835,3065
0.3
Synthese des M-LMF 5
Die aufgrund aller chromatographischen und spektroskopischen Daten fur den Naturstoff vorgeschlagene Struktur
eines 4-0-~3,5-D~hydroxybenzoesaurel-B-D-y1ucuronides( 2 )
sollte durch Synthese beleyt werden. AuBerdem erhofften wir
uns vom Verhalten des Syntheseproduktes im Biotest AufschluB
auch tatsachlrch einen neuen
dariiber, ob die Struktur 1);
Leaf Movement Factor darstellt oder oh eine bisher noch
nicht erkannte MxnoritBtskornponente fur die Reizreaktion
verantwortlich ist.
Ausgehend vom D-Glucurono-3.6-lacton stellten w1r den
Brom-2,3,4-tri-O-acetyl-a-D-glucopyranuronsaure-methy1ester
12) in der be1 Bollenback et al./ 9 / beschriebenen Weise
dar. Das yeschbtzte Aglykon des M-LMF 5, der 3.5-Di-0-acetyl-[4-hydroxybenzoeshure]-methylester
( $ 1 wurde nach
Schildknecht und Milde /lo/ hergestellt. Die Glycosidierung
in Chinolin mit Silberoxid /11/ ergab den peracetylierten
Dimethylester ( 5 ) des M-LMF 5. Eine anschlieaende Schutzgruppenabspaltung mit Ba(OHj2 /12/, gefolgt von Ionenaus-
-
827
-
Das synthetische 4-0-[3,5-Dihydroxybenzoesau~el-B-D-glucuronid (2) ist rn allen chromatogranhischen und spektroskopischen Eiqenschaften mit dem Naturprodukt identisch. Im
Fiederblattest, bei dem die Substanz uber der. Transpirationsstrom appliziert wird, lost der M-LMF 5 die spez. Mirnosenreaktion unter optimalen Bedingunyen noch in einer
moKonzentration von etwa 1 ug/ml aus, was einer 3 x
laren Losuny entspricht.
Die chemonastische Aktivitat des ebenfalls in Mimosa pu&. gefundenen M-LMF 4 ist noch in einer 2 x
molaren Losung feststellbar, d.h. das 4-0-[3,5-Dihydroxybenzoesaurel-~-D-glucosid-6~-sulfatist bei diesem Test etwa
15mal reaktiver.
Dieser Wirksamkeitsunterschied konnte im chemischen Aufbau der beiden natiirlichen Phytohormone begriindet sein. Der
weyen des glaichen Aglykons dem M-LMF 4 nur scheinbar ahnliche M-LMF 5 besitzt wegen der rm Vergleich zur Zuckersulfat wesentlich schwacher sauren Carboxyl-Gruppe deutliche
Polaritatsunterschrede, die vor allem be1 pH-Xnderunqen
ins Gewicht fallen. Da beim Fiederblattest die Stoffe uber
den Transpirationsstrom der Pflanze zugefuhrt werden, konnten besonders die Galacturonane der Xylemleitbahnen mit dem
ahnlich polaren M-LMF 5 in Wechselwirkung treten. iiierdurch
kann der Zum Blattgelenk erfolgende Transport verzoyert,
bzw. die ursprunyliche lokale Konzentration des applizierten M-LMF 5 unter die Rerzschwelle herabgesetzt werden.
Beim M-LMF 4 hinyegen uberwiegen die hydrophilen Eigenschaf-
-
829
-
ten der Sulfatgruppe, wie das auch schon bci den chromatographischen Trennungen zum Ausdruck kam. Der Wirkstoff
bleibt wahrscheinlich in der urspriinglichen zugefuhrten
Konzentration in den Wasserfaden des Xylems, in denen cr
unverzdqert zum Blattgelenk transportiert wird und dort die
schnelle Blattbewegung auslost.
Es scheint, dail wir nach den 4-0-[3,5-Dihydroxybenzoesaure]-D-D-glucosid-6'-mono- bzw. 3'.6'-disulfaten /i3/ in
dem ebenfalls paraverknupften 4 - 0 - [ 3 , 5 - D ~ h j y d r o x y b e n z o e s d u r e l
-8-D-glucuronid eLn weiteres nyctinastisches Prinzip der
Pflanzen entdeckt haben. Man darf deshalb gespannt sein, ob
diese zweite natlirliche Variation in der Nyctinastenstruktur auch in anderen Pflanzen gefunden wird oder auf die Mimose beschrankt bleibt.
Interessant ist, dail auch das 4-0-Benzoesaure-B-D-glucuronid bis etwa 500 & q / m l aktiv ist. Solche Wirkungsvermin-
Spektroskopische Daten:
( 3 0 0 NHZ, CDC13, 293 K. 6-Werte in ppm, rel. int.
TMS I
7.71.s.2H:
-
830
Synthese von 4-0-~3,5-Di-0-acetyl-benzoesaure-methylesterI(51
2',3',4'-0-acetyl-0-D-glucopyranuronsaure-methylester
In einem Morser werden 4 g (15 mM1 3,5-Di-O-acetyl-(4-hy(15 mM1 Brom2,3,4-trr-0-acetyl-a-D-glucopyranuronsaure-methylester
(2)
/a/, 2 g durch 12stundiges Erhitzen auf 120'C aktiviertes
Drierite und 1.9 g frisch gefalltes, getrocknetes Silberoxid homogen verrieben. AnschlieBend wird das Pulver mit
10 ml dest. Chinolrn versetzt und 20 h In einen dunklen EXsikkator uber CaC12 gestellt.
Die erstarrte Masse wird mrt 250 ml Ether 1/2 h bei Raumtemperatur ausgeruhrt. Das Etherfiltrat enthllt (60 MHz 'HNMR, DC-Vergleichl unumgesetzten Bromzucker. Der Ruckstand
wird analog rnit 250 ml CHC13 extrahiert und vom Unloslichen
abfiltriert. Die o r g . Phase wird zur Entfernung des Chinolins 3 x mit eisgekuhlter 1 0 %iger HC1 und nach dem Zwischenwaschen mit H20 zum Entfernen des Aglykones 5x rnit 10 %Iger
NaOH ausgeschuttelt. Nach dem Nachwaschen mit H20 wird die
CHC13-Losung mit NaSOd getrocknet, filtriert und das Losungsdroxybenz0esaure)-methylester ( 4 ) /lo/, 6 g
H-2',3'.4';
5.07.d,
gegen int. TMSI
170.07, 169.26, 169.14: OCOCH3, Glykon: 168.21:
OC_OCHJ,Aqlykon; 166.41: C00CH3, Glykon; 164.91:
COOCH3, Aglykon; 143.77: C-3.5; 143.64: C-4; 126.96:
C-1; 122.97: C-2,6; 100.84: C-1'; (77.56, 77.14,
76.72: CDC13); 72.93: C-5'; 71.93: C-3'; 71.27: C-2';
69.20: C-4'; 52.87: COOCH3, Glykon; 52.48: COOCH,,
Aqlykon; 20.67, 20.55. 20.41: OCOCH,, Glykon und
Aglykon.
Synthese von 4 - 0 - ( 3 , 5 - D i h y d r o x y b e n z o e a u r e ) - B - D - g l u c u r o n i d
(21
1,16 g (2 mM1 der Verbindung 5 werden in einer Losung von
3.6 g Ba(OHIZ in 60 ml H20 suspendiert und unter N2 28 h qeriihrt. Durch Zugabe von 500 mq Oxalsaure wird 90% des Bariums gefallt und nach dem Auffullen auf das doppelte Volumen
mit H20 abfiltriert. Die Losung wird auf einen sauren Kationenaustauscher geqeben (Amberlite CG-120, H+-Form1 und das
Eluat bei einer Tcrnperatur von max. 32'C eingeengt. 3ie Weiterreinigunq erfolgt mitteldruckchromatographisch an einer
LOBAR Fertigsaule RP-8 (Merck) mit 0,5% HOAc als Eluens.
-
Experimenteller Teil
:
'13C-NMR (75.46 MHZ, COCL3, 293 K, 6-Werte in ppm, tieffeld
derungen um zwei Zehnerpotenzen beim Ersatz der 3,4,5-Trrhydroxybenzoesaure durch die 4-Hydroxybenzoesaure konnten
wir auch schon beim entsprechenden 4-O-Benzoesaure-!-D-glucosid-6'-sulfat /14/ feststellen. Dies unterstreicht nicht
nur die oben erwlhnten moglichen Einflusse auf die chemonastische Reizaktivitat der Glucuronide im Biotest. sondern
laBt auch erste StrukturIWirkungsprinzipien der Phytohormone erkennen. Wir erhoffen uns nicht nur von den be1 uns
durchgefuhrten synthetischen, sondern auch von den analytischen Arbeiten weitere interessante Hinweise. die zur
Klarung der biologisch-chemischen Ursachen pflanzlicher Bewegungen beitragen.
H-2.6; 5.28,m,3H
1H: H-l', J1,2 = 7.1 Hz: 3.98,d,lH: H-5'. J4,5 =
9.3 Hz; 3.89,s,3H: C00CH3 (Aglykonl; 3.72.s,3H:
COOCH3 (Glykon); 2.34,s.6H: OCOCH) (Aglykonl; 2.05,
s.2.04.s. 2.02 .s. je 3H: OC0CH3 (Glykonl.
-
832
-
Das bis ]etzt nicht kristallisierte Produkt ( 2 1 wird zut
Analyse aus iso-PrOH umgefallt. Die Substanz enthalt 1 Molekul Kristallwasser, das unter normalen Bedingungen ( ? 0
2 5'
3 0 h, Vakuum, 3OoC) nicht entfernt werden kann. Nur unter
scharfen Trocknungsbedingunqen (P205, 7d, Hochvakuum, 60°C)
wird die BuBerst hygroskopische Verbindung wasserfrei erhalten.
Ausbeute: 477 mg amorphes Pulver = 6 9 %
Schmelzpunkt: 151-C Zersetzung (umgefallt aus iso-PrOH)
Analyse: C13H14011(346.24) Ber. C 45.10
H 4,08%
C13H160;2 (364.26)
Gef. C 44,83
BET. C 42,87
Gef. C 43,OO
H 4,15%
H 4,43%
H 4.71%
Spektroskopische Daten:
'H-NMR: Tab. 2
13C-NMR: Tab. 1
MS und FAB: Kap. 2.6
mittel abdestilliert. Das erhaltene olige Rohprodukt wird
mehrmals mit MeOH abrotiert und aus MeOH umkristallisiert.
Diese Arbeit wurde im Rahmen des Schwerpunktprograms der
Deutschen Forschungsgemeinschaft .,Chemieniedermolekularer
naturlicher Wirkstoffe" unterscutzt, wofur wir auch an
dieser Stelle herzlich danken. Dem Fonds der Chemischen Industrie danken wir ebenfalls fur die uns zugedachte finan-
Ausbeute: 2,55 g weiBe Nadeln = 29%
Ein grBBerer Ansatz mit einer Variation der molaren
Verhlltnisse lAglykon/Glykon 0,14 M/0,07 M) ergab
mit 32% Ausbeute bzgl. $ nur eine geringe Verbesserung .
Schmelzpunkt: 171 - 172,5"C (2x aus MeOH)
Analyse: C25H28016 (584,481 Ber. C 51.38
H 4.83%
Gef. C 51,65
H 4.57%
ziolle Unterstutzung, fierrn D r . Karl Friedrich (Brasilienl
fur dre Hrlfe bei der Beschaffunq des Pflanzenmaterials und
Herrn Dr. Jaggy (Firma Schwabe, Karlsruhe) fur die Extraktion der Pflanzen. Wir danken Herrn Dr. P. Kunzelmann und
Frau Rissmann fur die Aufnahme der Kernresonanzspektren:
be1 der Aufnahme und Diskussion der Massenspektren waren
Uns Frau Dr. 0 . Krauil und Frl. E. Wallenwein behilflrch.
Fur ein FAB-Spektrum danken W L T Herrn Dr. Seidl (BASF, Ludwigshafenl .
-
831
-
-
833
-
5. Literatur
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H.
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2, 2501-2514
P u r e and Applied Chem.
131 and e x c e s s ketene
-2
and
-5 were
assigned on their spectral data. The
same irradiation at higher temperature gave che rearranged addurt
7.
8.
2.
2-
diethyl acetai in acetonitrile wirh a high-pressure mercury lamp (Pyrex
(23%).
filter) at -25 'C gave cycloadduct 2 ( 4 0 % ) and rearranged adduct
5.
preponderantly
as
described prrviously 141.
9
The formation o f rearranged
was already demonstrated in our laboratory in the
adducts such a s
photoaddition of 2
- to other olefins 141. Conversion of 2 to 2 was
readily accomplished by treatment with potassium &-butoxide m dimethylfomamide ( 8 0 % ) . Treatment of ketal 2 with 90% trifluoroacetic acid
- (77%). The spectral data of - are fully
(TFA) gave cyclobutenone 1
consistent with the cyclobutenone structure.
(1982).
14. R . Iyuley. Diplomarbeit. Universitat Heidelberg 1982.
3
2
4
R
Eingegangen a m 23. M l r z 1983
/
Z
318 S /
5
-
834 -
-
836
-
Cyclobutenone 1 is stable at ambient temperature in ordinary o r g a n i c
This manuscript is
to be cited as
Angew. Chem. Suppl.
1983,835-839
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zu zitieren als
Angew. Chem. Suppl.
1983,835-839
Q Verlag Chernie GmbH. 0-6940Weinhem. 1983
0721-4227/83/0808-0835S
025010
PhotocycloaddJtion of 6-Cyanouracil to Ketene Diethyl Acetal:
A Uracil Derivative Possessing Cyclobutenone Framework**
.. -
solvents including alcohols. However, irradiation of methanolic solution
of 1 resulted in rapid formation of 6 (55%) and 2 ( 2 1 2 ) . Product 1 was
confirmed to form by further irradiation of 6 under the conditions,
whereas 6 was thought to originate from the trapping of vinylketene 8
with methanol.
Synthesis
~~
of
6
I s m Saito,* Fuyuhiko Kubota, Koji Shimomno, and T e r m Matsuura*
1
Dedicated to Professor G. 0. Schenck on the occasion of his 70th
Unexpectedly, cyclobutenone 1
- reacts smoothly with primary amines
without irradiation at ambient temperature to give 5-substituted uracil
anniversary
derivatives in high yields. For example, treatment of
The synthesis of pyrimidine bases of high photochemical reactivity is of
special importance for photochemical modification of nucieic acids I l l .
Pyrimidine b a s e s possessing cyclobutenone framework within the molecules
are expected to exhibit high reactivity toward nucleophiles upon
irradiation, since photochemical ring-opening of cyclobutenone may
produce highly reactive vinylketene derivatives / 2 / . We describe herein
the synthesis of 2,4-diarabicyclo[4.2.Olocc-1(6)-en-3.5.8-t~i~"e
1. the
-
first u r a c i l derivative possessing cyclobutenone framework by utilizing
gave 9
-
quantitatively. When a solution of
1
and
-
with 5-butylamine
tryptophan methyl ester
in acetonitrile was stirred at room temperature, the adduct - was
precipitated ( 7 6 % ) . Thus the cyclobutenone 1 can be used a s a synthon
for the preparation of 5-substituted uracil derivatives under neutral
In view of the high reactivity of carbon carbon double bond
conditions.
of cyclobutenones toward nucleophiles 1 2 1 ,
ring-opening of the mine adduct - 151.
is assumed to
photocycloaddition a s a key step.
*
**
Ass. Prof. Dr. I. Saito, F. Kubota, K. Shimozono, Prof. Dr. T. Matsuura
Deparmrnt of Synthetic Chemistry, Faculty of Engineering, Kyoto
University. Kyoto 606 (Japan)
9, R = L-Bu
11
Photoinduced Reactions. 155
-
835
-
-
837
-
ar168
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