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Ein wasserlsliches Prodrug von Taxol mit der Fhigkeit zur Selbstorganisation.

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ZUSCHRIFTEN
Ein wasserlosliches Prodrug von Taxol rnit der
Fahigkeit zur Selbstorganisation**
Kyriacos Costa Nicolaou *, Rodney Kiplin Guy,
Emmanuel Nicolaou Pitsinos und Wolfgang Wrasidlo
Taxol 1 (Abb. l a ) ist ein neues Antitumormittel, das urspriinglich aus der Pazifischen Eibe (Taxus breviJolia)[" isoliert
wurde. Er hat infolge seiner erheblichen biologischen Aktivitlt
in vivor2I intensive Forschungsbemuhungen von Chemiund Medizinern['] ausgelost. Trotz seikernL3-'I> Biologen[2*61
ncs klinischen Einsatzes bei der Behandlung von Patientinnen
mit Eierstockkrebs und ungeachtet der Tatsache, daR es als
grol3erer Fortschritt in der Krebs-Chemotherapie gefeiert wird,
ist ein groRer Nachteil von Taxol seine extrem geringe Wasserloslichkeit ( < 5 x
M). Sie ist der Gruiid dafur, daR es in
einer Mischung mil Cremaphor (einem polyoxyethylierten Rizinusol) und Ethanol verabreicht wird. Diese Darreichungsform
lost haufig signifikante Nebenwirkungen aus, zu denen starke
U berempfindlichkeitsreaktionen gehoren"'. Obwohl einige dieser klinischen Probleme durch medikamentose Vorbehdndlung
und langsame Infusion des Medikaments iiber llngere Zeitabstande umgangen werden k o n n e ~ ~ [ist
~ ]es
. eher miihsam, das
vollstandige Behandlungsprotokoll zu erstellen; einc umfassende Ubenvachung der Prozeduren und der Patienten ist erforderlich['Ol. Die klinische Anwendung des Medikaments wurde wegen seiner beeindruckenden Wirksamkeit trotz dieser Mlngel
vorangetrieben. Mit einer wasserloslichen Form von Taxol
konnten diese Schwierigkeiten viillig vermieden werden und sowohl seine Anwendungsmoglichkeiten erweitert als auch sein
pharmakologisches Profil drastisch verbessert werden.
Es sind zahlreiche Versuche unternommen worden, die LBslichkeit und die pharmakologischen Eigenschaften des Taxols
zu verbessern[l - 'I. Zu den bemerkenswertesten Taxolderivaten, die bisher synthetisiert wurden, gehoren jene, bei denen die
C-2'- und die C-7-Hydroxygruppe des Molekiils funktionalisiert
sind und die bei In-vivo-Aktivierung unter Freisetzung von Taxol zerfallen. Verbindungen dieser Art, also solche, bei denen
der Wirkstoff erst im Korper freigesetzt wird, werden als Prodrugs bezeichnet. Infolge fortdauernder Schwierigkeiten rnit der
Loslichkeit und der Bioverfiugbarkeit konnte sich keines dieser
Prodrugs in der klinischen Anwendung durchsetzen. Um diese
Verbindungen mit Erfolg einsetzen zu konnen, mussen ihre Eigenschaften gleichsam auf Messers Schneide stehen: Einerseits
miissen sie fur die Vcrabreichung hydrophil sein, andererseits
miissen sie fur thcrapeutische Zwecke lipophil sein. Dariiber
hinaus miissen sie sich schnell von der hydrophilen in die Iipophile Form umwandeln, um eine Ausscheidung iiber die Nieren
zu vermeiden.
Im Rahmen eines Arbeitsprogramms. dessen Ziel der Entwurf
und die chemische Synthese neuer C-2'- und C-7-Derivate des
Taxols ist, stellten wir Taxol-2'-methylpyridiniumacetat,
Taxol-
[*I
Prof. Dr. K. C. Nicolaou, R. K. Guy, E. N. Pitsinos, W. Wrasidlo
Department of Chemistry, The Scripps Research Institute
10666 North Torrey Pines Road. La Jolla, CA 92037 (USA)
und
Department of Chemistry, University of California
San Diego, 9500 Gilrnan Drive, La Jolla. CA 92093 (USA)
Telefax: Int. + 619:554-6738
[**I Wir danken Dr. R. Milligan und Dr. X. Chan fur die TEM-Untersuchungen,
S. Mauch fiir die In-vivo-Tierverstiche, R. Merlock fur die Entwickluog und
Durchfuhrung der HPLC- und Tubuti-Exprimente, Gary Siuzdak fur die Hilfe bei der Massenspektrometric und D.-H. Huang f6r seine Unterstutzung bei
den NMR-Studien. Diese Arbeit wurde gefiirdert von den National Institutes
of Health (USA), einem Graduiertenstipendium des Office of Naval Rcsearch
(USA, fur R. K. G.) und dem Scripps Research Institute.
1672
6 L'CH
Vedagsgesellschafi inhH, D-69451 Weinhem, 1994
H
2:Taxol-2'-methylpyridiniurnacetat
(TaxoIB'-MPA)
Abb. 1. a) Fonneln von Tax01 1 und Taxol-2'-MPA 2 ; b) Synthese von Taxol-2'MPA 2; und c) miiglicher Mechanismus der Freisetrung von Taxol 1 aus Tdxol-2'MPA 2. Methode: Taxol(10.2 mg, 0.012 mmol) wurde in Dichlormethan (0.4 mL)
geliist und bei Raumtemperatur unter trockenem Argon nacheinander rnit frisch
destilliertem Triethylamin ( 5 pL, 0.036 mmol, 3 Aquiv.) und 2-Fluor-1methylpyridiniumtosylat (10.0 mg, 0.035 mmol, 2.9 Aquiv.) versetzt. Die klare. farblose Losung nahm schnell einc schwach gelbe Farbung an. Nach 30 min Riihren bei Raumtemperatur war die Reaktion vollstPndig (kein Taxol mehr vorhanden). Die
anschlieBende HPLC-Analyse (Vydak 22.5 mm x 250 mm CIB-SBule, Gradient aus
10 mM NH,OAc-Puffer (PH 6.0)/Methanol, 9 mlmin-', UV, R,: Taxol-2'-MPA,
26.2 min; Taxol, 28.2 min) zeigte uur eine Verbindung. Das Rohprodukt wurde mit
HPLC gereinigt und ergab nach Entfernung des Liisungsmittels im Vakuum Produkt 2 (11 mg) in 90% Ausbeute. 'H-NMR (CDCI,, SO0 MHzj: 6 = 1.07 (s, 3H,
C16-H), 1.11 (s. 3H, C17-H), 1.62 (s. 3H, Ci9-H), 1.76 (s, 3H, C18-H), 1.85 (m,
1H. C6-b-H), 2.00 (s, 3H. C10-OAc), 2.1-2.2 (bm, 2H. C14-H), 2.2 (s, 3H. C4OAc), 2.53 (sundm iiberlagert, 4H, C6-H, Gegenion OAc), 3.67 (d, 1H: J =7.0 Hr,
C~-H).~.O~(S,~H,N-CH~),~.IO(~,
lH.J=ESHz,C20-H,AvonAB),4.22(d,
1 H, J = 8.5, C20-H, R von AB). 4.31 (dd. I H , J = 8.7, 10.7 Hz, C7-H), 4.87 (dd,
1H,J=1.0.7.7,C5-H),5.50(d,lH,C2-H,J=7.0),5.70(bt,
I H , J=8.0,CZ-H).
5.95 (dd, I H , J = 1 . 0 , 8.0, C13-H), 6.20 (s, l H , CIO-H), 6.46 (bd, l H , J=10.0,
C Y H j , 7.08 (t, l H , N-H, J = 7 . 5 ) , 7.33 ~7.45(m. 7H, Ar-H), 7.57 (t. 2H, J = 8,
4r-H), 7.69 (d, 2H, J = 9.0, EL.Ar-H), 7.79 (d, 1H, J = 9.0Ar-H), 8.01 (dd, 2H.
~ = 1 . ~ , 8 . 0 , A r - H ) , 8 . 1 4 ( d , I H , J = 8 . 0 , A r - H ) , 8 . ~ ~ ~J=7.0,Ar-H),8.41
d,2H,
(t. 1H. J = 7.0, Py-H), 10.48 (d, 1 H, J =7.0, Py-H). 1R (in Snbstanz, KCI-PreWling)
t[cm-'] = 3640-3120 (bm), 3030-2870 (bm), 2320 (m), 1720 (s), 1630 (m). 1560
(m), 1500 (m). 1360 ( s ) , 1160 (m), 1070 (m), 700 (m). UVlVIS (CHCI,):
A,,,[nm] = 254, 280. FAB-HRMS: ber. fur M t C,,H,,O,,N,:
945.3810; gef.
945.3810.
2'-MPA 2, her (Abb. 1a), eine Verbindung, die ziemlich reaktiv
gegeniiber einem nucleophilen Austausch sein sollte['*]. Die
Synthese dieser Verbindung gelang nach der Methode von Mukaiyama et al. aus Taxol 1 und 1 -Fluor-1-methylpyridiniumtosylat (1.2 Aquiv.) in Dichlormethan (25"C, 0.5 h)1'91.Reinigung iiber Umkehrphasen-Hochdruckflussigkeitschromatographie (RP-HPLC) und nachfolgendes Lyophilisieren unter Austausch des Gegcnions (Tosylat gegen Acetat) ergab reines
Taxol-2'-MPA 2 als weiBen, amorphen Feststoff in einer Ausbeute von 90 Yo (Abb. 1 b). Spektroskopische und analytische
Daten stimmen mit Struktur 2 iiberein. Erste Untersuchungen,
die nachstehend beschrieben werden, zeigten, daB diese Verbindung eine Reihe von wichtigen Eigenschaften hat: Hydrolysestabilitat, hohe Wasserloslichkeit, die Fahigkeit, in menschlichem
Plasma schnell Tax01 freizusetzen, Cytotoxizitat und Antitumoreigenschaften iihnlich denen des Taxols sowie die Fahigkeit zur
Selbstorganisation.
Taxol-2'-MPA 2 ist sowohl in festem Zustand als auch in wll3rigen Losungen sehr stabil. Bei allen Untersuchungen wurden als
0044-K24Y:94:1515-1672 f 10.00+ .25/0
Angew. Cheni. 1994, 106, Nr. 15/16
ZUSCHRIFTEN
alleinige Zersetzungsprodukte Taxol 1 und das F‘yridinon, das bei
der Hydrolyse des Pyridiniumsalzes entsteht (Abb. 1c), nachgewiesen. Infolge der unterschiedlichen Retentionszeiten unter den
angewendeten HPLC-Bedingungen und der unterschiedlichen
UV-Absorptionsmaxima (A2s0/A254 = 1.6 fur 2 und 0.3 fur I),
konnte die Stabilitat von 2 leicht mit HPLC unter UV-Detektion gepruft werden. Taxol-2-MPA 2 ist in festem Zustand bei
Raumtemperatur mindestens 30 Tage vollig stabil. In Wasser,
5proz. Dextrose- oder 0.9proz. Salzlosung ist 2 bei Raumtemperatur einige Tage stabil (Abb. 2), eine langsame Zersetzung setzt
nach 4 Tagen ein. In Phosphat-gepufferter Salzlosung (PBS)
L
steriles Wasser oder
PBS (pH 6.2) oder
5 % Dextrose-Lbsung
0.90.9-
1
0.80.7-
2
0.6-
$
0.5-
a
f
-
CJ
0.4
8
0.3-
I-
rnenschlichesSerum
v)
.-
g
0.20.1-
0
0
60
,
,
120
180
\
240
t [SI
I
300
360
I
420
I
480
I
540
600
~
I
660
hbb. 2. Geschwindigkeit der Freisetzung von Taxol aus Taxol-2’-MPA 2 in wa0rigen Losungen bei 25 ‘ C . In Wasser und wZBrigen Pufferlosungen (horizontale Linic)
1st 2 stabil. Dagegen beweist die Dichlormethan-Extraktionvon Plasma, das mit 2
behandelt worden war, daB 2 in diesem Medium innerhalh von 10 min vollstandig
in Taxol 1 umgewandelt wird (Kurve, 20% der Gesamtmenge wurde bei dieser
Extraktion mriickgewonnen). Methode: Taxol-2’-MPA 2 wurde mit ciner fiinfminiitigen Ultraschallbehandlung im wHBrigen System gelost. Zu den angegebenen
Zeiten wurden Prohen entnommen, in Dichlormethan gegeben (um die Reaktion
analysiert, das mit eiabzubrechen) und mit einem Waters-Maxima-HPLC-GerZt
nem Autoinjektor bestiickt war [3.9x 300mm C1X-Saule mit einer Vorsaule bestiickt; FlieBgeschwindigkeit 1.5 mLmin-’ ; Elutionsmittelgradient A-B iiber
30 min, wobei A 80% 80 mM Ammoniumacetat (pH 6.0) und B 100% Methanol;
UV-Dioden-Array-Detektor]. Das Verhaltnis von 2 (R, = I 6 2 min) zu Taxol (1,
R, = 16.8 min) wurde au5 den relativen Flichen der Signale bestimmt (nach Normierung mit zuvor bestimmten Eichkurven). Die Stahilitatsuntersuchungen in wanrigen Losungen wurden uber einen Zeitraum von iiber zwei Wochen fortgesetzt.
Dabei trat in den gepufferten Losungen geringfiigig Zersetzung auf.
oder Ammoniumacetat-Puffern mit pH 6.0 bis 7.3 ist 2 bei
Raumtemperatur mindestens 21 Tage stabil. In Sproz. HCI
(pH l.l), Kochsalzlosung (ca. 6 M waBrige NaC1-Losung),
ebenso wie in waBrigen ethanolischen Losungen ist Taxol-2’MPA 2 in unterschiedlichem MaDe begrenzt stabil. Am wichtigsten ist jedoch, daD 2 sich schnell in Taxol 1 umwandelt, wenn es
bei 37 “C rnit menschlichem Plasma behandelt wird (< 10 Minuten, Abb. 2 ) . Auch mit reinem Albumin wird schnell Taxol 1
freigesetzt. Dariiber hinaus wurden nach Verabreichung von
tritiiertem 2 an Mause nur 5 YOder Verbindung als Taxol iiber
die Nieren ausgeschieden, ein Ergebnis, das in volliger Ubereinstimmung rnit dem Verhalten von Taxol selbst stehtrZo1.Diese
Ergebnisse weisen nachdriicklich darauf hin, daB 2 in vivo als
ein Prodrug von Taxol fungiert. Es ist zu beachten, daD die
ausgezeichnete Bioverfiigbarkeit von 2 im Gegensatz zu einer
Reihe bekannter Protaxole[’61 steht, die schnell uber die Nieren
ausgeschieden werden[’’]. Die Freisetzung von Taxol aus 2 ist
Angens. Chem. 1994, 106, Nr. 15/16
vermutlich das Ergebnis eines nucleophilen Angriffs von Wasser
oder einem anderen Nucleophil auf die 2-Position der Pyridiniumeinheit, wie er in Abbildung 1c gezeigt ist. Unklar ist
noch, ob diese schnelle Reaktion in menschlichem Plasma
Enzym-unterstutzt verlauft.
Die Loslichkeiten und Verteilungskoeffizienten von Taxol-2’MPA 2 und Taxol 1 wurden rnit HPLC bestimmt. In 100 mM
Phosphat-gepufferter Kochsalzlosung (PBS) betrug die Loslichkeit von 2 1.5 mM, und der Verteilungskoeffizient (Octanol/
Wasser) betrug 50 (Taxol: <0.0015 m~ bzw. 10000). Die Loslichkeit von Taxol liegt an der Nachweisgrenze des verwendeten
HPLC-Gerhts und bildet somit einen oberen Grenzwert. Die
Loslichkeit von 2 dagegen reprasentiert einen unteren Grenzwert, weil eine Konzentration gewahlt wurde, bei der die Losung
klar und nicht kolloidal war. Verbindung 2 zeigt in mehreren
Puffersystemen im pH-Bereich von 6.2 bis 7.4 ahnliche Loslichkeiten. In reinem Wasser scheint die Loslichkeit nur durch die
Bildung klarer, farbloser Gele bei hohen Konzentrationen
(>20 mM) begrenzt zu sein. Diese Daten zeigen deutlich, daB 2
in Wasser um GroBenordnungen besser loslich ist als die
Stammverbindung Taxol 1. Die Loslichkeiten von 2 in einer
Reihe von waBrigen Systemen sind betrachtlich hoher als die
) Taxol.
klinisch relevanten Dosen (3-30 p ~ von
Mikrotubuli-Polymerisation/Depolymerisations-Experimente[”] mit Taxol-2’-MPA 2 zeigten Effekte, die denen sehr i h neln, die mit Guanosin-5’-triphosphat(GTP)-Kochsalzlosungen
in Kontrollversuchen beobachtet wurden. Sie unterscheiden
sich aber drastisch von den Effekten, die von Taxol hervorgerufen werden. So stabilisierte 2 die Mikrotobuli bei Zugabe von
CaCI, nicht, was die fehlende intrinsische Aktivitat der Verbindung und ihre chemische Stabilitat im Versuchsmedium widerspiegelt. Dieser Befund stimmt mit dem Verhalten anderer 2’substituierter Derivate iiberein[23-251.Taxol 1, das aus menschlichem Plasma zuruckgewonnen wurde, zu dem Verbindung 2
zugegeben worden war, zeigte die erwartete Stabilisierung der
Mikrotubuli, was beweist, daB 2 als Prodrug fur Taxol fungiert.
Taxol-2’-MPA 2 wurde auf seine Cytotoxizitat gegenuber einer
Auswahl von Zellinien gepruft, zu denen Leukamie-, Eierstock-,
Lungen- und Brustcarcinome und Melanomzellen gehorten
(Abb. 3 ) . Die Cytotoxizitltsprofile von 2 wurden mit denen von
Taxol verglichen. Sie sind recht ihnlich, obgleich einige Unterschiede zu erkennen sind. Beide Verbindungen zeigten I C 0 Werte im Bereich von
bis lo-’’ M und Mittelwerte nahe
I nM. Extrem hohe Cytotoxizitat wurde fur menschliche Leukamie, metastasierende Melanome und cervicale Carcinome verzeichnet. Insgesamt - und wie fur ein Taxol-Prodrug zu envarten - zeigt 2 die gleiche bemerkenswerte Tumorzellenselektivitat
und Zellinienspezifitit wie Taxol.
Die vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und das Loslichkeitsprofil von Taxol-T-MPA 2 veranlaBten uns, sein In-vivoVerhalten zu untersuchen und es rnit dem von Taxol zu vergleichen. Dazu wurden nackte Mause mit menschlichen Prostatacarcinom-Xenotransplantatenverwendet (Abb. 4). Im Gegensatz zu Taxol 1 wurde Verbindung 2 ohne Cremaphor in steriler
Sproz. waiDriger Dextroselosung verabreicht. Damit wurde bewiesen, daD die Verbindung einfach in Form einer Pille verabreicht
werden kann und somit ein erster Vorteil gegenuber der Stammverbindung aufgezeigt. Mehrere Experimente mit Mausen belegen, daB Taxol-2’-MPA die gleiche wachstumshemmende Wirkung auf Tumore hat wie Tax01 bei gleicher molarer Konzentration ; dabei haben beide Verbindungen deutliche Antitumor-Eigenschaften, wie der Vergleich rnit Kontrollversuchen zeigt
(Abb. 4). Am beeindruckendsten ist ein Befund aus Untersuchungen mit aquimolaren Dosierungen bei der maximal tolerierten Dosis (MTD) Taxol: Wahrend die Taxolgruppe deutlich
(0VCH Verlagr~esellsrhaftmbH, 0-69451 Wrinheim,i994
0044-8249i94/15i5-i673
$10.00f .25/0
1673
ZUSCHRIFTEN
toxisch war (vier von acht Tieren am Ende
der Studie tot), zeigte Taxol-2'-MPA keine sichtbare Toxizitat (vier von acht Tieren dieser Gruppe waren am Ende dieser
Studie zusltzlich tumorfrei).
Die ungewohnliche Struktur von Taxol-2'-MPA und seine hohe Loslichkeit in
wal3rigen Medien veranlaDte uns, zu untersuchen, ob diese Verbindung die Fahigfaxol-2'-MPA
keit zur Selbstorganisation hat. Molekulare Selbstorganisation ist ein Phanomen
von betrachtlichem aktuellen Tnterecse.
Ein erheblicher Reiz riihrt von der Miiglichkeit
her, rnit diesem ProzeB NanoI
I
I
I
I
I
I
strukturen rnit potentiellen Anwendungen
-4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 '
in der Materialforschung und in der Mekl IC50
dizin aufzubauen[26-281.Inmitten dieser
Abb. 3. Cytotoxizitaten von Taxol-2'-MPA 2 und Taxol 1 gegeniiber einer Reihe von Zellinien. Methode: Die
Untersuchungen stehen die Beitrage der
Zcllcn wurden auf Gewebekulturplatten (96 Vertiefungen) mit den folgenden Kontrollen aufgebracht : keine
Chemie, die den Entwurf und die Synthese
M Natrium-dodecylsulfat(SDS).Der Wirkstoffwurde in die erste Reihe
Zellen und toxische Kontrolle (1 x
der Vertiefungen gegeben und nach Standardverdiinnungmethode ausgehend von diesen Vertiefungen verselbstorganisierender Molekiile beinhaldiinnr. Die Triger wurden 72 h bei 3 7 T , unter 5% Kohlendioxid in steriler LuR, in einem feuchtgehahencn
ten, zu denen auf Lipiden basierendel'"]
Brutschrank bclassen. AnschlieDend wurde in jede Vertiefung eine L6sung (50 pL) yon 2.3-Bis(methoxy-4-nitround H-verbriickte Strukturen geho5-sulfophenyl)-~-[(plienylaminojcarbonyl]-2~-tetrazoliumh~droxid
XTT. 1 mgmL-') in PBS (100 mM) gegerenL3'I. Auch lebende Systeme bedienen
hen. In Anwcscnheit von IebensfZhigen Zellen wird diese farblose klare Losung enzymatisch umgewandelt, wab
LU einer Rosafarbung fiihrt. Die Gewebekulturplatten wurden bei 450 nm rnit einem Mikroplattenleser (Molecusich zum Aufbau von Nanostrukturen in
lar Devices Themomax) gelescn
weitreichendem AusmaB der Selbstorganisation. Ein bekanntes Beispiel sind die
Mikrotubuli, das Ziel von Tax01 in dcr
ZeIle L3 '1.
Taxol-2'-MPA 2 organisiert sich - abhangig von der Natur
250
des Mediums - zu mehreren Arten von Molekiilverbanden, darunter regulare Helices und Micellen. Dieser eher zufallige Refund iiberrascht nicht, denn die molekulare Struktur von 2 ist
200
idcal zur Selbstorganisation g e e i g r ~ e t-341.
[ ~ ~ Sie verbindet ein
stark hydrophobes Segment (Taxolgeriist) rnit einem polaren
Teil (Pyridiniumeinheit), eine charakteristische Eigenschaft
mehrerer selbstaggregierender Molekiile. Dieses Verhalten
kennt man von planaren Amphiphilen wie dem antiasthmatisch
100
wirkenden Dinatriurncromoglycat ; bei kugelformigen Molekiilen wie dem hier diskutierten ist es unseres Wissens nach unbeV[rnm3]
kannt. Dariiber hinaus induziert die Chiralitat der Struktur al50
lern Anschein nach eine Helicitat in den langen Nanostrukturen,
die aus diesem Bauelement aufgebaut ~ e r d e n [ ~ ' - ~ Wahrcnd
'].
w2Drige Losungen von 2 bei allen untersuchten Konzentrationcn
n
(< 1 x 10-3 M) optisch klar waren, zeigten gepufferte Losungcn
0
5
10
15
20
25
30
M rnit dem bloDen Auge bemit Konzentrationen iiber 1 x
t [dl
trachtet einen blauen Schimmer und eine diffuse Streuung moAbb. 4. In-vivo-Wirksamkeit von Taxol-2'-MPA 2 im Model1 rnit nackten Miusen
nochromatischen Lichts, beides charakteristische Eigenschaftcn
mit Prostatatumor-Xenotransplantaten: 5 % Dextrose (e), Taxol (A) und Taxol-2'von Kolloiden. Bei hoheren Konzentrationen bilden sich kolloMPA ( 0 ) . Methode: Das Tumormodell wurde aus einer ATTC-PC-3-Prostalaluidale Gele. UV-Absorptionsrnessungen bei 340 nrn, einer Wclmorzellinie erzeugt, die unter Standard-Zellvermehrungsbedingungen gehalten
wurde (37"C, 5 % Kohlendioxid in sterilrr Luft). Jede Gruppe bestand aus acht
lenlange, bei der 2 nicht absorbiert, zeigten einen exponentiellen
rufillig ausgewihlten weiblichen nackten Mausen, $0daD sich eine GesamtpopulaM.Auch dieser
Anstieg der optischen Dichte (OD) iiber 4 x
tion von 24 ergibt. Mit einem Hamocytometer geldhlte Zellen, die in Hanks MeBefund ist charakteristisch fur die Bildung eines Kolloids.
dium (Gibco, Grand Island,NY) suspendiert wurden. wurden subkutan implantiert
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestatigte die
(10' Zellen in 0.4 mL je Maus). Das Wachstum der festen Tumore wurde jeden
dritten Tag kontroUiert und das Volumen gemfD der Gleichung (Langex
Anwesenheit von supramolekularen Strukturen in diesen LoBreite)*(0.5) bestimmt. Aquimolare Mengen der Testverbindungen (1.0 pM) wurden
sungen. So zeigten 1 mM Losungen von 2 in PBS bei TEM-Unan den Tagen 1, 3, 5 , 7, 9 und 11 intraperitoneal iujiziert, wobei folgende Medien
tersuchungen einheitliche Aggregate von fibrillirer Struktur
benutzt wurden: Kontrolle, 5 % Dextrose in Wassrr (DSW); Taxol, suspendiert in
(Abb. 5 A) rnit helicalen Konformationen. Diese NanostruktuCramaphorIDSW (5/95, 18.0 mgkg-' Korpergewicht des Tieres): Taxol-2'-MPA,
gelost in DSW (23.9 mg/kg Korpergewicht des Tieresj. Die Verfahren ZUI Aufrechtren waren unterschiedlich lang (his zu 80 nm), wiesen aber einen
erhaltung von Tumoren und experimentelle Einzelheiten entsprachen den Protokoikonsistenten Durchmesser von ca. 8 nm rnit einer helicalen Drclen. die vom Developmental Therapeutics Program des National Cancer Institute
hung von etwa sieben Einheiten pro Windung (Abb. 5, Ein(NCI) veroffentlicht werden. Folgerungen iiber die Wirksamkeit wurden mit ANOVA (Varianzanalyse) gezogen, gefolgt vom t-Test (statistisches Verfahrenj. Zum
schub). Zusatzlich enthielten frisch beschallte wXDrige LosunBeispiel: Tag 9 (schlimmster Fall): Nachdem ANOVA auf 0.06-Nivcau eine signifigen von 2 (1 mM) spharische Strukturen (Abb. 5B) rnit einem
kante Varianz zeigt, ergibt der t-Test, daB Taxol und Taxol-2'-MPA sich auf 0.04-Nib
einheitlichen Durchmesser von etwa 5 nm, wahrend hochkonveau deutlich von den Kontrollen unterscheiden. Nach Tag 9 ist jeder Datensatz hei
zentrierte Losungen (kolloidal, ca. 2 x
M) eine kompliziereiner Vertrauensgrenze von iiber 0.05 deutlich verschieden von den anderen. Die
Daten sind als Mittelwert mit Standardabweichung dargestellt.
tere molekulare Architektur offenbarten. Die urspriinglichen
Human T-cell leukemia (MOLT)
Metastatic melanoma (M24-MET)
Human promyelomomlc leukemia (HL-60)
Human squamous carcinoma. cervix (SIHA)
Human ovarlan carcinoma (OVCAR-3)
Lung adenocarclnoma (UCLA-P3)
Pancreatic carcinoma (CAPAN 1)
Human neumblastoma (SK-N-SH)
Human colon adenocarclnoma (HT-29)
Human breast ductal carclnoma (BT-549)
Human CNS cancer (U251)
Lung adenocarcinoma (H322)
Human perlrenal cell carcinoma (786-0)
Mouse leukemia (L1210)
Melanoma (816-FO)
Melanoma EK-Mel28)
Normal mammary epithllial cells (HMEC)
Normal human dermal fibroblast (NHDF)
Chinese hamster ovary cells (CHO)
Normal human PBL (RPMI 7666)
1
-
1674
0 VCH
V e r l u ~ s g e s e l k h r fmbH,
t
0-69451 Weinheim. 1994
0044-8~49/94;1515-1674S 10.00+ .25/0
Angew. Chem. 1994, 106, Nr. 15/f6
ZUSCHRIFTEN
der Taxane eingefiihrt werden, um die neuen Einheiten mit solchen Eigenschaften auszustatten. Die beeindruckenden Eigenschaften dieses Wirkstoffs konnten seiner Fahigkeit zugeschrieben werden, sich in waIJrigem Medium selbst zu Nanostrukturen zu organisieren. Momentan versuchen wir, den Zusammenhang zwischen Nanostruktur und Wirkstoffaktivitit
aufzuklaren.
Eingegangen am 11. April 3994 [Z 6x381
Abb. 5. A) Die TEM-Aufnahme von Taxol-2'-MPA 2 (1 mM in 100 mM PBS) bei
25 OOOfacher VergraDcrung (Negativfarbungen mit Phosphowolframat) zeigt die
helicalen fibrillaren Nanostrukturen. die in gepufferten Losungen dieser Verbindung obcrhalb dcr kririschcn Aggregationskonzentration (CAC) vorliegen. U) Die
TEM-Aufnahmc von Taxol-2'-MPA 2 (1 mM in H,O) bei 45000facher VergroRerung (Ncgativfarbung mit Uranylacetat,! zeigt die sphirischen Nanostrukturen; die
in nicht-gepufferten Losungen dieser Verbindung uber der CAC vorliegen. Einschub: Die VergroBerungeiner der Fibrillen von Teilbild A &I die helicale Verdrillung.
Flden hatten sich zu weiteren Uberstrukturen zusainmengelagert (Abb. 6).
Wir habcn die ncuen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften von Taxol-2'-MPA 2 beschrieben, einer
Verbindung, die in einem Schritt in hoher Ausbeute aus Taxol 1
zuganglich ist. Diese Verbindung 2 ist, sowohl i n Bezug auf die
Loslichkeit in wal3rigen Medien als auch bezuglich des In-vivo-
Abb 6 TkM-Aufnahme von Taxol-2-MPA 2 (2mM
10 000facher VergroRerung
in
l 0 0 m v PBS) bei
Verhaltens gegeniiber Tumor-Xenotransplantatcn, der Stammverbindung Taxol I als Antitumormittel iiberlegen. Die hier
prasentierten Daten lassen vermuten, daB Taxol-2'-MPA 2 ein
Hauptkandidat fur die Entwicklung zum Antitumormittel ist.
Andere Taxane, z.B. TaxotereL""', konnten analog inodifiziert
werden, um zu effektiveren Wirkstoffen 7u gelangen. Daruber
hinaus konnten andere fuiiktionclle Gruppen ahnlich der Pyridiniumeinheit an den 2'-, 7- oder anderen geeigneten Positionen
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